Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) aiheuttama EGF edistää kohdunkaulan syövän etenemisen; kuitenkin, mekanismeista EGF aiheuttama EMT jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa raportoimme että miR155 yli-ilmentyminen tukahdutetaan EGF aiheuttama EMT, vähentynyt muuttoliike /invaasio valmiuksia, esti solujen lisääntymistä ja lisäsi Chemo-herkkyys DDP ihmisen CaSki- kohdunkaulan syöpäsoluja. Lisäksi yliekspressio miR155 lisääntynyt TP53 ilmentymistä, mutta vähentää Smad2, ja CCND1 ekspressiotasot. Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR155 säätelee negatiivisesti EGF-indusoitu EMT. Voimme päätellä, että miR155 ei toimi onkogeeni vaan tuumorisuppressori CaSki-soluissa.

Citation: Lei C, Wang Y, Huang Y, Yu H, Huang Y, Wu L, et ai. (2012) Up-säännelty miR155 Kääntää epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon aiheuttama EGF ja Lisäykset Chemo-herkkyys Sisplatiini Human CaSki- kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 7 (12): e52310. doi: 10,1371 /journal.pone.0052310

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 elokuu 2012; Hyväksytty: 16 marraskuu 2012; Julkaistu: 20 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Lei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki tämän työn tarjosi Natural Science Foundation of Hubein maakunnassa (Grant no. 2011CDB181), Independent Research Fund, Wuhan University (no. 201130302020016). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä exsit.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on toiseksi suurin luokka pahanlaatuisia kasvaimia naisille, ja se vaarantaa naisten terveyden, erityisesti kehitysmaissa. Etäpesäke ja invaasio ovat tärkeimmät syyt kuolemaan kohdunkaulansyövistä, joten on tärkeää selvittää molekyylitason mekanismeja näiden ilmiöiden. On raportoitu, että epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) on tärkeä prosessi mukana tuumorimetastaasissa ja invaasio [1]. Pääpiirteet EMT kuuluu purkamisesta epiteelin tiukka liittymissä, remontin solun tukirangan, menetys apikaalisella-pohjapinta päin, ja hankinta mesenkymaalisten markkereita, kuten N-kadheriinin ja vimentiinista. EMT hankkii kasvainsolut, joilla on korkeampi invasiivisen /metastaattinen kapasiteetti, kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia, resistenssin apoptoosia, ja immuunijärjestelmän toleranssi [2].

EGF: ää (epiteelisolujen kasvutekijää) on yksi tärkeimmistä EMT sääntelyn tekijät laukaisee EMT erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien kohdunkaulan syöpä. On raportoitu, että kasvainten suuren EGF-reseptorin ilmentyminen on huono kliininen ennuste, ja EGF aiheuttama EMT voi olla yksi syy tähän [3] – [5]. Siten estetään EGF aiheuttama EMT voisi olla sopiva keino estää ja metastaasit.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA tärkeä rooli säätelyssä EMT [6], [7]. miRNA ovat 18- 25-nukleotidin mittainen ei-koodaavaa RNA: ita, jotka voivat säädellä geeniekspressiota nopeuttamalla hajoamisen ja estämällä translaation kohde mRNA: iden. Niistä miRNA Tähän mennessä tunnistetut miR155 liittyy kasvaimen leviämisen ja yli-ilmennetään monissa ihmisen kasvaimissa [8]. Eräs tutkimus osoitti, että epänormaali ilmentyminen miR155 oli varhainen tapahtuma haimasyövän ja läheistä sukua alhainen eloonjäämisaste [9]. Endometriumin syöpä, esiintyminen EMT liittyi kohonnut miR155 ekspressiotasot [10]. Ei ole vielä selvää, miR155 on mukana esiintyminen EMT kohdunkaulan syöpä. Tässä tutkimuksessa käytetään EGR EMT-indusoivan tekijän ihmisen kohdunkaulan syövän solujen, selvitimme sääntelyn roolit miR155 että EMT prosessissa, soluproliferaatioon solujen herkkyyttä kemoterapeuttisten, ja arvioidaan mahdollinen arvo miR155 kuin molekyylikohteessa varhaiseen ehkäisyyn kohdunkaulan syövän eteneminen ja metastaasit.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

CaSki- solut ostettiin Cell Bank of China (Wuhan) ja viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO2: RPMI-1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä.

RNA: n eristäminen ja miRNA Detection

RNA viljellyistä soluista eristettiin Trizol-reagenssia (Invitrogen), ja käytettiin sitten valmistamaan ensimmäisen juosteen cDNA. Havaitseminen kypsynyt miRNA suoritettiin PCR käyttämällä SYBR Esisekoite Ex Taq

tm (TAKARA). U6 käytettiin sisäisenä kontrollina. Alukkeet, joita käytetään tässä kokeessa on esitetty taulukossa S1.

Plasmidin rakentaminen ja Stable /ohimenevää transfektio miR155

Ihmisen genomi-DNA-fragmentin noin 400 ep: n, joka sisältää miR155 sekvenssi kloonattiin pcDNA3.1-GFP-vektorilla. Saatu plasmidi pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 kantaa yhdistelmä-DNA-sekvenssi GFP ja miR155 sisältävä fragmentti. Luoda solulinja, joka ekspressoi stabiilisti miR155, CaSki-solut transfektoitiin pcDNA3.1-GFP-miR155 käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen). Seuraavat valinta G418, yhden kloonin, joka yli-ilmaisi miR155 tunnistettiin. Sillä miR155 ohimenevä yli-ilmentyminen, miR155 matkii (RIBOBRO) käytettiin transfektoimaan CaSki soluja.

In vitro

Migration and Invasion Analyysit

matrigeelin-pohjainen siirtokuoppaan määritystä käytettiin määritystä solujen vaeltamiseen ja invaasiota

in vitro

kuten aiemmin on kuvattu [11]. Analysoida invasiivisen ominaisuuksia, 2 x 10

4-solut ympättiin päälle Matrigel päällystetyn soluviljelmän insertit 200 ui RPMI-1640-elatusaineessa ilman FBS: ää ja inkuboitiin 24 tuntia. Insertit pestiin sitten fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Oltuaan värjätään haematin, invasiivista solut laskettiin mikroskoopin alla. Migraatiokokeessa suoritettiin samalla tavalla edellä on kuvattu, paitsi että Matrigel ei ole päällystetty osaksi insertit.

Western Blot (WB) B

Yhteensä proteiini uutettiin soluista käyttäen soluhajotuspuskurin (0,5 % NP-40, 0,5% SDS, 1,5 mM Tris-HCI, pH 7,4, ja 15 mM NaCl). Proteiininäytteet (20 ug /kaista) ajettiin elektroforeesissa, siirrettiin PVDF-kalvoille ja inkuboitiin yön yli, joilla on primaarinen vasta-aineita E-kadheriinin (sc-7870, Santa Cruz Biotechnology), N-kadheriinin (BA0637, Boster), MMP-1 (130-1- 16, RayBiotech) ja anneksiini A2 (A2485, Sigma). Membraanit käsiteltiin vuohen anti-kani-HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Invitrogen). Kohdeproteiinin bändejä määritettiin käyttäen reagensseja annetaan ECL + plus kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA).

Immuno fl uorescence Analyysi

Immuno fl uorescence analyysiä käytettiin määrittämään ekspressiotasoja E-kadheriinin vasta-aineilla E-kadheriinin (sc-7558, Santa Cruz Biotechnology), ja ekspressio N-kadheriinin, jossa vasta-aineiden N-kadheriinin (BA0637, Boster) kuten aiemmin on kuvattu [12].

proliferaatiomääritystä

CaSki ja CaSki-miR155 ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille ja kasvatettiin 70% konfluenssiin. Solut käsiteltiin DDP (cis-diamminedichloroplatinum, DDP) ja 0-3 päivää RPMI-1640-väliaine. Väliaine kussakin kuopassa oli poistettu, ja 100 ui (metyyli tiatsolyyli tetratsolium MTT) liuosta (0,25 g /l RPMI-1640-väliaine) lisättiin. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 4 tunnin ajan, väliaine poistettiin ja 200 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssi (A) 570 nm: ssä rekisteröitiin. Solun kasvu ja estäjä korko laskettiin seuraavasti:

virtaussytometria

CaSki- ja CaSki-miR155 solut kerättiin logaritmisessa kasvuvaiheessa ja kiinteiden yön yli 80% etanolia. Solut pestiin sitten kylmällä PBS: llä, värjättiin propidiumjodidilla (PI, 0,05 mg /ml) ja RNaasi A: ta (0,5 mg /ml). Virtaussytometria-analyysiä käytettiin määrittämään solujen jakauma solukierron sub-vaiheet ja mitata apoptoosin piikin indusoiman DDP (10 umol /ml) 24 tuntia.

Tilastollinen analyysi

kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastollinen analyysi ryhmien välillä arvioitiin Studentin kaksisuuntaisella t-testi ja ANOVA. P-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

EGF indusoi EMT vuonna CaSki- Solut

On raportoitu, että EGF-reseptorin on erittäin koholla kohdunkaulan syöpäsolut, mikä viittaa siihen, että EGF altistuminen voi aiheuttaa EMT kohdunkaulan solulinjoissa [13], [14], [15]. Tässä kokeessa CaSki-soluja viljeltiin rutiininomaisesti olosuhteissa tai ilman EGF: ää (50 ng /ml) 1, 3 tai 5 päivää, ja EMT liittyvät muutokset määritettiin. Morfologiset muutokset ensin visualisoida tässä prosessissa. Jälkeen EGF stimulaatio, CaSki-solut tuli fusiform ja yhteys solujen vähentynyt (kuvio 1A). Kun E-kadheriinin (E-cad) ilmentyminen määritettiin WB, tulokset on esitetty että EGF altistuminen vaimentua E-cad ilmentymisen kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 1 B). Samanlainen downregulation E-cad ilmentyminen varmistettiin IF määritys, jossa CaSki-soluja käsiteltiin EGF: llä (50 ng /ml) 3 päivää (kuvio 1C). Samaan aikaan vaiheessa myös havaittu ekspression muiden EMT liittyvät tekijät (N-kadheriinin, MMP-1 ja anneksiini A2) WB ja todettiin, että kaikki kolme tekijää ilmentyivät (kuvio 1 D). Nämä tiedot osoittavat, että EGF voi aiheuttaa EMT, että CaSki-soluissa.

CaSki-soluja viljeltiin tavanomaisissa kanssa tai ilman EGF: ää (50 ng /ml) 1-5 päivää. A. Morfologiset muutokset aiheuttama EGF havaittu mikroskoopilla. B. alassäätely E-kadheriinin EGF käsittely määritettiin western blot. Densitomet- analyysi kolmesta itsenäisestä kolmena Western blotit. C. E-kadheriinin downregulation vastauksena EGF: ää (50 ng /ml) käsittely 3 päivää varmistettiin IF. D. lisääntymisen merkkejä N-cad, MMP-1 ja anneksiini A2 EMT prosessissa tutkittiin western blot. Densitomet- analyysi kolmesta itsenäisestä kolmena Western blotit. Arvot ovat keskiarvoja kolmen määrityksen kanssa S.D. osoitetaan virhepalkeilla. * P 0,05, ** P 0,01, verrattuna kontrolliin.

miR155 on yliaktiivista EGF-indusoitu EMT

Kokonais-RNA puhdistettiin EGF-indusoitu mesenchymal- kuten CaSki- soluja ja normaaleja CaSki soluissa. Ilmentymistasojen miR155 tai miR200c havaittiin suorittamalla real-time PCR näistä yhteensä RNA: ita. Tulokset osoittivat, että verrattuna normaaliin CaSki-soluja, miR155 oli ilmentymistä lisätään suuresti mesenkymaaliset CaSki-soluissa, mutta ei muutosta ekspressiotason havaittiin miR200c, jonka havaittiin vaimentua aikana EMT prosessia monin kiinteitä kasvaimia muissa tutkimuksissa [ ,,,0],16], [17] (kuvio 2).

. Suhteellinen ekspressiotasot miR155 ja miR200c havaittiin reaaliaikaisella PCR: llä. miR155 oli voimistunut 3 päivää EGF hoidon (50 ng /ml), ja mitään muutosta ei havaittu miR200c ekspressiotaso alle EGF stimulaatiota. Suhteellinen miR155 ilmaisun suhteen EGF hoito /ohjaus on 12,21. Kokeet toistettiin 3 kertaa. T-testiä käytettiin tilastollista analyysiä; ** P 0,01. B. voimistunut miR155 ekspressiotaso varmistettiin Käänteiskopiointia PCR. U6 käytettiin sisäisenä kontrollina, kaista 1 ja 2 ovat EGF hoito, kaista 3 on negatiivinen kontrolli, 4 kaista on merkki, kaista 5 ja 6 ovat kontrolli (ilman EGR).

yli-ilmentyminen miR155 Estää EMT

Vaikka miR155 suuresti voimistussäädellään EGF aiheuttama EMT prosessi, on mahdollista, että tämä on vain korvaava tapahtuma tai liity ilmiö. Selventää edelleen roolia miRNA155 vuonna EMT prosessissa, joka on CaSki- solulinja, jossa on yli-ilmentynyt miR155 (CaSki–miR155) luotiin transfektoimalla pcDNA3.1-GFP-miR155 plasmidin CaSki soluihin, joissa miR155 ilme todennettavissa todellisilla -aika PCR (kuvio 3A). Käyttämällä tätä solulinjaa mallina, huomasimme, että yli-ilmentyminen miR155 esti solun kasvua ja häiritsi solusyklin vähentämällä solusuhteen S vaiheessa (17% CaSki- ohjaus soluissa, 5,4% CaSki–miR155) mutta yhä solun suhde G1 vaiheessa (63,7% vuonna CaSki- ohjaus soluissa, 81,4% vuonna CaSki–miR155), kuten kuvassa 3B. EGF-indusoitu downregulation E-kadheriinin ilmentymisen osittain kumota transfektoitiin ohimenevästi miR155 jäljittelee (kuvio 3C). Jossa miR155 yli-ilmentyminen, morfologia solujen tuli cuboidal. 3 päivän kuluttua hoidon EGF: n (50 ng /ml), vain pieni osa CaSki-miR155 solut transformoitiin sukkulamainen soluihin (kuvio 3D). Nämä tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen miR155 inhiboi EGF-indusoitu EMT.

. Jälkeen pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 transfektion miR155 ekspressiotaso kasvoi yli 12-kertaiseksi, mutta mitään merkittävää eroa ei havaittu miR200c ilmaisua. Koe toistettiin itsenäisesti 3 kertaa. ** P 0,01 kontrolliin verrattuna soluihin. B. Solujen proliferaatio testattiin MTT. Tulokset osoittavat, että miR155 yliekspressio inhiboi merkittävästi solujen kasvua. P 0,05 kontrolliin verrattuna soluihin. Virtaussytometria käytettiin testaamaan vaikutukset miR155 ilmentymisen vaikutus solusykliin. Tulokset osoittavat alentunutta solujen suhteen S-vaiheessa (17% CaSki- ohjaus soluissa, 5,4% CaSki–miR155), mutta lisääntynyt solujen suhde G1 vaiheessa (63,7% vuonna CaSki- ohjaus soluissa, 81,4% vuonna CaSki–miR155). Koe toistettiin 3 kertaa itsenäisesti. P 0,01 kontrolliin verrattuna soluihin. C. E-cad ilmentymistä testattiin Western blot. E-kadheriinin ilmentymisen taso oli huomattavasti vähentynyt 3 päivää EGF (50 ng /ml) altistusta CaSki soluissa. Densitomet- analyysi kolmesta itsenäisestä kolmena Western blotit. Arvot ovat keskiarvoja kolmen määrityksen kanssa S.D. osoitetaan virhepalkeilla. * P 0,05. Tämä vaikutus esti osittain transfektiolla miR155 jäljittelee. D. Morfologiset muutokset aiheuttamat miR155 yli-ilmentymisen. CaSki-miR155 solut ovat tilavuuden kuin normaalit CaSki-soluja. Kun käsiteltiin EGF: ää (50 ng /ml) 3 päivää, vain pieni murto-osa CaSki-miR155 solut transformoitiin fusiform kaltaisia ​​soluja.

TP53 ja Smad2 on liitetty EMT sääntely polku [18], [19]. Seulomalla Targetscan (https://www.targetscan.org), TCF4, CCND1 ja Smad2 ennustettiin olevan kohdegeenien miR155. Näin ollen tutkimme TP53, Smad2, TCF4, CMYC ja CCND1 mRNA: n ilmentymisen tasot CaSki-soluissa käsiteltiin EGF: ää (50 ng /ml) 3 päivää tai ilman transfektiota miR155 jäljittelee (kuvio 4). Tulokset osoittivat, että TP53 säädeltiin vähentävästi EGR aiheuttama EMT prosessi ja voimistuvan miR155 yli-ilmentyminen, mutta TP53 ilmaisun aiheuttama miR155 perusteellisesti päinvastaiseksi EGF hoitoa. miR155 yliekspressio vähentynyt Smad2 ilme. Vaikka TCF4 varmistettiin kuin miR155 kohdeproteiinin toinen ryhmä [20], ei tilastollisesti merkittäviä muutoksia havaittiin meidän kokeiden TCF4 mRNA: n ekspression EGF-indusoitu ja miR155 jäljittele transfektoiduista soluista. Lisäksi mitään muutoksia ei havaittu CMYC, joka on alavirtaan tavoite ja säätelee TCF4. CCND1 (solusykliä säätelyproteiini ja toinen alavirtaan tavoite TCF4) mRNA: n ilmentymisen tasoa säädeltiin vähentävästi mukaan miR155 yli-ilmentyminen ja voidaan osittain päinvastaiseksi EGF hoitoa. Niinpä oletetaan, että miR155 käänteinen EGF aiheuttama EMT säätelemällä TP53, vähen- tämisessä Smad2 ekspressiotasot, ja hillitsemiseksi solujen kasvua estämällä CCND1 ilme.

. Ennakoitu miR155-sitoutumiskohdat 3’UTR Smad2, TCF4 ja CCND1 mRNA: t. B. TP53, Smad2, TCF4, CMYC ja CCND1 mRNA ekspressiotasoja analysoitiin reaaliaikaisella PCR CaSki soluissa käsiteltiin EGF (50 ng /ml) 3 päivän, tai ilman transfektiota miR155 jäljittelee. TP53 säädeltiin vähentävästi EGF hoitoa, mutta merkitsevästi voimistuvan miR155 yli-ilmentymisen. Tämä lisääntynyt TP53 ilmentymistä purettiin EGF hoitoa. Smad2 säädeltiin vähentävästi sekä EGF käsittely ja miR155 yli-ilmentymisen. Hoitoon miR155 yli-ilmentäviä soluja EGF johti vähentyneen vielä Smad2. Ei merkittäviä muutoksia TCF4 tai CMYC mRNA havaittiin välillä EGF-käsiteltyjen ja miR155 matkivat-transfektoiduissa soluissa. CCND1-mRNA vaimentua by miR155 yli-ilmentymisen, ja downregulation osittain päinvastaiseksi EGF hoitoon.

yli-ilmentyminen miR155 estää Migration ja Invasion kyvyt CaSki Cells

valaista vaikutukset miR155 siirtolaisuudesta ja hyökkäyksen CaSki soluissa

in vitro

, siirtokuoppaan invaasio /muuttoliike määritykset suoritettiin (kuva 5). CaSki-miR155 ja normaali CaSki-soluja siirrostettiin inserttejä. 24 tunnin jälkeen, lukumäärä soluja, jotka oli siirretty alemmalle puolelle kalvon laskettiin määrällisesti hyökkäyksen ja muuttoliike kapasiteettia. Solujen lukumäärä, jotka mennyt kalvon läpi, oli merkitsevästi pienempi CaSki-miR155 soluja kuin normaalissa CaSki-soluja. Niinpä oletetaan, että miR155 estää invasiivisia ja muuttoliike kykyjä CaSki- soluissa

in vitro

.

CaSki–miR155 ja CaSki solut ympättiin TranswellTM lisää tai ilman Matrigel. Insertit kiinnitettiin ja värjättiin 24 tunnin kuluttua, ja sen jälkeen vaeltavat /hyökkääviä solut laskettiin mikroskoopilla. Määrä CaSki-miR155 solujen kulkee kalvon läpi oli huomattavasti pienempi kuin normaalissa CaSki solut, joko havaita kulkeutumista tai invaasio määrityksissä. Arvot ovat keskiarvoja kolmen määrityksen kanssa S.D. osoitetaan virhepalkeilla. * P 0,05.

miR155 lisäsi Chemo-herkkyys CaSki-solujen DDP

MTT menetelmää käytettiin havaitsemaan vaikutuksen miR155 ilmentymisen vaikutus kemiallis-herkkyyttä CaSki solujen DDP. Tulokset osoittivat, että inhibitio määrä CaSki-miR155 kun käsitellään DDP olivat paljon suurempia kuin normaalin CaSki-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Lisääntyminen määrä CaSki-miR155 soluja käsitellään DDP oli paljon hitaampi kuin normaali CaSki solujen ajasta riippuva tavalla (kuva 6 A, B). Käsittely DDP (10 mikromol /l) 24 tuntia johti paljon suurempi apoptoottisten solujen suhde CaSki-miR155 soluja kuin normaalissa CaSki solut (kuvio 6C). Ilmaisu taso anneksiini A2, proteiini mukana apoptoosin vastus, määritettiin WB. Nämä tulokset eivät osoittaneet, että anneksiini A2 vaimentua mukaan miR155 yli-ilmentyminen (kuvio 6D).

. CaSki ja CaSki-miR155 soluja käsiteltiin eri annoksilla DDP 24 tunnin ajan, ja määrä inhibitio arvioitiin MTT-määritys. Mean ± SD, n = 4, P 0,05 ANOVA. B. Solujen proliferaatio arvioitiin MTT-määritys. CaSki- ja CaSki-miR155 soluja käsiteltiin DDP (10 mikromol /l) 0-3 päivän ajan. Mean ± SD, n = 4, P 0,05 ANOVA. C. Mikroskopia käytettiin tarkkailla apoptoosin CaSki ja CaSki-miR155 indusoiman DDP (10 umol /l) ja 1 päivä. Solut kerättiin, ja FCM käytettiin määrittämään apoptoosin. Nuolet osoittavat sijainnin apoptoosin huippu. D. anneksiini A2 ilmentyminen määritettiin western blot. Anneksiini A2 ilmentymistä ei säännellä miR155 yli-ilmentyminen ja voisi voimistuvan EGF hoitoa. Densitomet- analyysi kolmesta itsenäisestä kolmena Western blots.P 0,05, miR155- verrattuna miR155 +, * P 0,05, EGF- verrattuna EGF +.

Keskustelu

EMT on dynaaminen prosessi, jota voidaan säännellä ja kääntyy monet tekijät, kuten miRNA. Tässä tutkimuksessa käytimme ihmisen CaSki kohdunkaulan syövän solulinja kuin malli tutkia roolia miR155 EGF aiheuttama EMT ja yritti vastata kysymykseen, onko miR155 säätelee EMT ja on rooli etäpesäke ja Chemo-herkkyys.

ensin käytettiin EGF aiheuttavan EMT vuonna CaSki soluja, jotka varmistettiin E-kadheriinin, N-kadheriinin, ilmaisun ja solujen morfologia. MiR155 ekspressiotaso määritettiin RT-PCR: llä. 12-kertainen miR155 ekspressiotason havaittiin seuraavat EGF hoitoa, mutta mitään muutosta ei löytynyt miR200c, joka oli raportoitu vaimentua haiman syöpää ja muita kiinteitä kasvaimia [16], [17]. Niinpä me päätellä, että miR155, mutta ei miR200c, on mukana EGF aiheuttaman EMT in CaSki soluissa. Samanlaisia ​​julkaisemien tietojen toinen ryhmä osoittavat myös, että miR155 on yliaktiivista EMT havaittu kohdun limakalvon karsinosarkooma [10].

Valaistaan ​​roolin miR155 vuonna EMT, CaSki- solulinjat yli-ilmentävät miR155 yliekspressio rakennettiin vakaa ja lyhytaikaisissa transfektioissa . Mielenkiintoista, poikkeava yliekspressio miR155 dramaattisesti estivät solujen lisääntymistä, esti muuttoliike /invaasion ja edistänyt Chemo-herkkyyttä CaSki- solujen DDP

in vitro

. Samaan aikaan havaittiin, että solut yli-ilmentävät miR155 tuli tilavuuden, ja vain pieni osa soluista oli muuttunut fusiform soluissa, sen jälkeen 3 päivää EGF: n hoitoon. Vaimennussäätely E-kadheriinin aiheuttama EGF hoito myös osittain päinvastaiseksi miR155 jäljittelee in CaSki soluissa.

Edellinen tutkimus oli ehdottanut, että miR-155 oli onkopsykologista miR ja että se yli-ilmentynyt useissa ihmisen maligniteettien mukaan lukien B-solujen lymfooma, ja rinta-, koolon-, keuhko-, ja munasarjojen [8], [9]. On raportoitu, että miR-155 tukahdutettu P53-indusoidun tumaproteiini 1 (TP53NP1) ja johti haiman kasvainten kehittymiseen [21]. Rintasyövän, miR155 parannettu JAK2 /STATS signalointireittiä ja transfektio miR155 jäljittelee edistää MDA-MB-231 ja MCF-7-solujen proliferaatiota [22]. Tuloksemme osoittavat kuitenkin, että miR155 yliekspressio inhiboi soluproliferaatiota CaSki- soluissa ja estää EMT. Samanlaisia ​​asenne miR155 toiminto hyväksyttiin toinen ryhmä [20], he osoittivat, että miR155 esti EMT vähentämällä TCF-4 ekspressiotaso 4T1 rintasyöpäsoluja.

Valaistaan ​​tarkkaa mekanismia miR155 soluproliferaatioon ja EMT CaSki-soluissa, olemme määritettiin ilmentymistasojen joitakin tekijöitä, jotka liittyvät solujen kasvuun ja EMT (kuvio 7). Tulokset osoittivat, että TP53 ilmentyminen voimistuvan miR155 yli-ilmentymisen ja vaimentua EGF. Mielenkiintoista, EGF-indusoitu E-kadheriinin downregulation perusteellisesti päinvastaiseksi transfektiolla miR155 jäljittelee. Tuore tutkimus ehdotti, että villi TP53 kontrolloi tehokkuutta joka nisäepiteelisoluissa läpi EMT vastauksena TGFli [23]. Niinpä meidän pitäisi miR155 päinvastaiseksi EMT kautta upregulating TP53 ilme.

Smad2 signalointireitin osallistuu säätelyyn lisääntymistä, erilaistumista, apoptoosin ja EMT [23]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että, jossa miR155 yliekspressio, Smad2 ilmentyminen säädeltiin vähentävästi. Koska on olemassa kaksi miR155 sitoutumiskohdista sisällä 3’UTR Smad2 mRNA, ehdotamme, että miR155 säätelee negatiivisesti EMT kautta estämällä Smad2 ilmaisun.

Tuloksemme osoittavat, että miR155 tukahdutti muuttoliike ja hyökkäys kyvyt CaSki solut

vitro

. Samanlainen tulos on raportoitu toisessa tutkimuksessa 4T1 rintasyöpäsoluja, jossa miR155 todettiin suoraan tukahduttaa ilmaus TCF4 ja säädellä negatiivisesti EMT [20]. Tutkimuksessamme ole tilastollisesti merkittäviä muutoksia TCF4 ilmentymistaso havaittiin CaSki käsiteltyjen solujen kanssa tai ilman EGF: ää ja miR155 jäljittelee. Tuore tutkimus ehdotti, että CCND1 lisäsi leviämiskyky ja aiheuttavat EMT rintasyövässä [24]. CMYC ja CCND1 ovat loppupään geenejä säätelee TCF4 transkriptiotekijän. Toisin CMYC, on miR155 sitova sivusto CCND1 3’UTR. Tämän mukaisesti havainnon, miR155 yliekspressio ilmeisesti vaimentua CCND1 tasolla, mutta ei vaikuttanut CMYC ilme. Tämä havainto osoitti, että lisäksi TCF4 koulutusjakson, CCND1 voidaan myös suoraan säädellä miR155.

anneksiini A2 pidettiin mahdollisena tekijä solukasvun säätelyssä, invaasio ja Chemo-vastus [25 ]. Tuloksemme osoittivat, että EGF hoito johtavat kasvuun anneksiini A2 ilme. Eikä ole muutosta anneksiini A2 ilmentymistä miR155 yli-ilmentymisen. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään mekanismia anneksiini A2 sääntelyä EGF.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että CaSki- soluissa, miR155 ei toiminut onkogeeni vaan tuumorisuppressorina. miR155 säätelee negatiivisesti EGF aiheuttama EMT, vähentynyt proliferaatio, esti muuttoliike /invaasion ja lisääntynyt Chemo-herkkyyttä CaSki- soluissa in vitro. In EGF aiheuttama EMT, ylössäätelyyn miR155 on tapahtuma, joka solut voivat kompensoida. Tutkimuksemme osoittaa uusi näkökohta miR155 ja sen roolit kasvaimen leviämisen ja etäpesäkkeiden kohdunkaulan syövän.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Alukkeet Reaaliaikainen PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0052310.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Changbai Liu ja Zhaoqi Liu niiden teknisiä neuvoja ja teknistä tukea suorittamista reaaliaikainen PCR. Kiitämme myös Ms Ma Jielan hänen apua suorittamisessa plasmidissa transfektioissa ja tarjoamalla GFP DNA-fragmentti. Kiitämme henkilöstön Institute of Molecular Biology of Three Gorges yliopisto.