Krooninen sairaus

tiivistelmä

Wnt5a on yksi niin sanotuista ei-kanoninen Wnt ligandeja, jotka eivät toimi läpi β-kateniinin. Normaalissa kehitys, Wnt5a erittyy ja ohjaa migraatio kohdesolujen pitkin pitoisuusgradientit. Vaikutus Wnt5a kohdesoluihin säätelevät monet tekijät, mukaan lukien ekspressiotaso estäjien ja reseptorit. Säädeltyyn Wnt5a signalointi mahdollistaa hyökkäyksen useita kasvaintyypeille viereiseen kudokseen. Ilmaisulla ja jakelu Wnt5a in ihon levyepiteelisyöpä (SCC) ja tyvisolusyöpä (BCC), samoin kuin vaikutus Wnt5a keratinosyyttien liikkumiseen ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti tasalla. Me täällä raportoivat, että Wnt5a ylössäädellään SCC ja BCC ja paikannettu etureunan kasvainten sekä kasvaimeen liittyvät fibroblasteissa. Wnt5a laukaisema niputtaminen sen reseptorin Fzd3 antaa näyttöä Wnt5a pitoisuusgradientit työntyy kasvain. In vitro muuttoliike määritykset osoittavat, että Wnt5a pitoisuusgradientteja määrittää sen vaikutus keratinoctye siirto: Kun kemotaktinen siirtymä estyy Wnt5a läsnä homogeeninen pitoisuuksina, se on parannettu läsnäollessa Wnt5a kaltevuus. Expression profilointi Wnt reitin osoittaa, että säätelyä Wnt5a SCC on kytketty tukahduttamisen kanoninen Wnt signalointia. Tämän vahvistaa immunohistokemiallisesti osoittaa puute ydin- β-kateniinin, sekä poissa kertymistä Axin2. Koska molemmat Wnt signalointia toimen keskenään antogonistically useilla tasoilla, samanaikainen tukahduttaminen kanoninen Wnt signalointia ehdottaa hyper-aktiivinen Wnt5a signaalitransduktion. Merkittävää on, tämä yhdistelmä geenin säätelyhäiriötä ei havaittu hyvänlaatuista hyperproliferatiivinen tulehduksellinen ihosairaus psoriasis. Yhdessä meidän tiedot viittaavat vahvasti siihen, että Wnt5a signalointi edistää kudosinvaasio ei-melanooma ihosyöpä.

Citation: Pourreyron C, Reilly L, Proby C, Panteleyev A, Fleming C, McLean K, et al. (2012) Wnt5a ilmentyy voimakkaasti kärjessä Non-melanooma ihosyöpä, Forming Active Gradiaaneissa vaikka Canonical Wnt Signalling on tukahdutettu. PLoS ONE 7 (2): e31827. doi: 10,1371 /journal.pone.0031827

Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 lokakuu 2011; Hyväksytty: 12 tammikuu 2012; Julkaistu: 22 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Pourreyron et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Cancer Research UK (C. Pourreyron, APS). C. Pourreyron rahoittivat Debra International (Humuspitoiset rakkulaihotauti Research Association) ja Euroopan tutkimusneuvoston (ERC) (APS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Wingless-tyyppi (Wnt) ligandit ovat molekyylejä tärkeitä kehittämiseen. Wnt ligandit luokitellaan ”kanoninen” tai ”ei-kanoninen” [1]. Canonical Wnts, esimerkkeinä Wnt3a, sitoutuvat FZD-tyypin reseptoreihin sekä LRP5: stä /6 koreseptorit, jonka jälkeen rekrytointi heteromeeristä proteiinin monimutkainen lukien Dishevelled, ak- siini, ja GSK3p reseptoriin monimutkainen. Tämä johtaa fosforylaatioon LRP5: stä /6, vapautumista ja ydinvoima translokaatio β-kateniinin, joka huipentui induktio kohdegeenien. Sitä vastoin ei-kanoninen Wnts, mukaan lukien Wnt5a, sitoutuvat FZD reseptorit yhdessä vaihtoehtoisessa co-reseptoreihin, mukaan lukien ROR1 /2 tai Ryk aiheuttaen β-kateniinin riippumaton muutoksia, kuten PKC aktivointi ja solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä [2]. Tärkeää on, sitoutumalla yhteisiin FZD reseptoreihin, kanoninen ja ei-kanoninen Wnts toimivat kilpailukykyinen antagonisteina jaettu reseptoreihin [3].

kehittämiseen, eritys kaikki Wnt ligandien myös Wnt5a on asetettu tarkat ajan ja tilan valvonta jolloin pitoisuusgradientit saavutetaan [4]. Nämä gradientit suoraan morfogeneettisen liikkuvuus kohdesolujen sekä järjestely epäsymmetrisen polarisaation epiteelisolujen [5]. Siten Wnt5a olennaisesti ohjaa solujen kulkeutumista ympäröivään kudokseen, esimerkiksi raajojen kehitystä. Yksi keskeinen tekijä määritettäessä vaikutusta Wnt kohdesoluihin on läsnä eritettyjen inhiboivia proteiineja. Näitä ovat Dickkopf (DKK) perhe, jotka sitoutuvat spesifisesti LRP5: stä /6, mikä palvelee erityisinä estäjinä kanoninen Wnts. Muut inhibiittorit ovat WIF ja eritetty Frizzled liittyvät proteiinit (SFRP), jotka sitovat molempia Wnt-ligandien sekä FZD reseptoreihin, estäen siten sekä kanoninen ja kanoninen Wnts [6]. Alueellista jakautumista SFRP, FZD, DKK, ja Wnt on minutely järjestettyjä kehitteillä (esim [7], tehokkaasti luoda diffuusio väylät Wnt toimintaan.

Ei ole yllättävää ottaen huomioon sen sääntelytehtävässä solumigraation viereiseen kudokseen sääntelemätön aktivointi Wnt5a on liittynyt invasiivisuus ja useita kasvaimen tyypit, mukaan lukien melanooma [8], [9], rintasyöpä [10], mahasyöpä [11], haimasyöpä [12], ja osteosarkooma [13] . Wnt5a liittyvät kasvaimen invaasio voidaan myös välittää kasvaimeen liittyvien soluissa. Siten, rintasyöpä solut indusoivat Wnt5a ilmentymistä kasvaimeen infiltroituvien makrofagien, jolloin synteesi matriksimetalloproteinaasi (MMP) 7 [10].

Wnt5a voi sitoa useita frizzled reseptoreihin, mukaan lukien Fzd2, Fzd5, Fzd3, Fzd4. näistä olemme aiemmin osoittaneet, että Fzd5 ja Fzd3 ilmaistaan ​​vanhempien kudosten sekä okasolusyöpä (SCC), orvaskeden ja tyvisolusyöpä (BCC ), karvatupen vastaavasti [14]. Nämä FZD reseptorin isoformia on myös osoitettu välittävän Wnt5a aiheuttama suuntaava potevilla melanooman [15], sekä invasiivisen muuttoliikkeen rintasyövän [16]. Tärkeää on, Fzd3 on äskettäin osoitettu kertyy polarisoitua polttoväli aggregaatit, kun solut altistetaan Wnt5a gradientti in vitro [15]. Vaikka Wnt5a gradientteja ei voida havaita suoraan ensisijainen kudoksessa, tämä löytö avaa mahdollisuuden hyödyntää solunsisäistä jakelua Fzd3 indikaattorina toiminnallisten Wnt5a kaltevuudet toimivat soluissa

in vitro

.

Ei-melanooma ihosyöpä käsittää BCC: n ja SCC on yleisin ihmisen syövän ja kasvaa edelleen esiintyvyys yli 100000 tapausta diagnosoidaan vuosittain Britanniassa. Vaikka vain SCC metastasizes immunokompetenteilla yksilöitä, SCC ovat erittäin paikallisesti invasiivisia, joten ne helposti saatavilla luonnollista malleja tutkia kudosinvaasio. Ilmentyminen Wnt5a ja sukulais-reseptorien ei ole tutkittu proteiinin tasolla näissä kasvaimissa ja muutamat tiedot ovat olemassa vaikutuksesta Wnt5a on vaeltamista SCC soluissa tai keratinosyyteissä in vitro.

Kirjoittajat raportoivat jakelu Wnt5a ja reseptorit Fzd5 ja Fzd3 SCC ja BCC. Käytämme Fzd3 lokalisointi tunnistaa Wnt5a kaltevuudet operatiivinen aikuisten ihon sekä SCC /BCC. Olemme lisäksi tarjota toiminnallista näyttöä siitä Wnt5a kaltevuudet tehostavat suunnattu motiliteettia keratinosyyttien. Expression profilointi osoittaa invasiivisia SCC, toisin kuin hyvänlaatuinen tulehduksellinen hyperproliferaatio keratinosyyttien, on merkitty samanaikaisen säätelyä kaanoniin ja tukahduttaminen kanonisen Wnt signalointia. Tuloksemme mahdollistavat formulaation toimiva malli siitä, miten Wnt5a voi toimia parantaa liikkuvuutta ja invasiivisuus näissä kasvaimissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Ennen koepala, potilaat antoivat kirjallisen suostumuksensa varastointiin ja analysointiin biopsianäytteissä. Varastointi ja käyttö kaikkiin kudoksiin sisältyvät työssä esitetään tässä tehtiin mukaisesti Helsingin julistuksen ja hyväksytty Tayside komitea lääketieteellinen tutkimuseettinen B (REC viite. Nr. 07 /S1402 /90).

Tuumorinäytteet

SCC tutkituissa tässä leikattiin immunokompetenteilla potilailla pään (n = 7) tai käsien /jalkojen (n = 4), kussakin tapauksessa näytteille ympäröivän merkkejä auringon vaurioita ja luokiteltu hyvin eriytetty (n = 8) tai kohtalaisen /huonosti eriytetty (n = 3). BCC (n = 9) olivat kaikki pään, lukuun ottamatta yhtä BCC leikattiin käsi.

immunohistokemia

Käytetyt vasta olivat anti Wnt5a (R taulukko 1). Kuten Fzd3, kasvaimia, jotka ilmaisivat Fzd5 näytteillä Fzd5-positiiviset alueet vuorottelevat Fzd5-negatiivinen alueilla (kuva 3a). Sen sijaan, kasvaimeen – liittyy endoteelisolujen johdonmukaisesti osoitti vahvaa Fzd5 lauseke (kuva 3c, h). Kasvaimeen liittyvät fibroblastit olivat heikkoja kohtalaisen positiivisia Fzd5 (kuva 3c, upotus). Näin ollen, vaikka Fzd5 ilme vaihtelee ei-melanooma ihosyöpä solujen, sen ilmentymistaso kasvaimia aluksilla on sopusoinnussa rooli tämän reseptorin välittämisessä Wnt5a riippuvaisten tulehdussairauksien kulkuväylillä yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [20], [21].

immunohistokemia SCC (a-d), tai BCC (e-h), kulloinkin esittää esimerkkiä kasvainten näytteille korkea (SCC: a, c, BCC: e, g) tai matala (SCC : b, d, BCC: f, h) Fzd5 ilme. Värjäytymisvoimakkuuksia kasvaimissa voidaan suoraan verrata värjäystä intensiteettejä Fzd5 rakeisen kerroksen orvaskeden (mustat nuolenpäät). Paneelit a, b, e, f on esitetty 40 x ja c, d, g, h 200-kertaisella suurennuksella. Insertti alemmassa oikeassa (c) esittää kasvaimeen liittyvää fibroblastien. Punaiset nuolet tarkoittavat verisuonia.

Wnt5a ja FZD reseptorit ilmentyvät ei-päällekkäisiä kasvain solualaryhmiä

vieressä tutkineet spatiaalista suhdetta Wnt5a, Fzd3, ja Fzd5 yksittäisissä kasvain näytteet. Tämän vuoksi päätimme värjäytymisvoimakkuuksia näiden proteiinien leikesarjojen yksittäisten kasvainten, vastaavasti, koska vasta-aineet soveltuvat yhteistyön immunofluoresenssilla parafinoidut näytteet olivat käytettävissä. Kuten kuviossa 4, Wnt5a oli pääasiassa ilmaistiin kasvaimen katteet SCC (sekä kasvaimeen liittyvien strooman). Sitä vastoin, Fzd3 lokalisoitu soluihin tuumorimassan sisällä, muodostaen joskus pesä-like Fzd3-positiivinen kasvain-domeeneja (keskimmäinen paneeli, valkoisen nuolen pää) ja, kuten edellä on kuvattu, esillä fokaalisesti polarisoidun intrasellulaarisen jakeluun. Fzd5 näytteillä heterogeeninen sisäinen kasvain jakelu, on lokalisoitu sisäistä kasvain klusterit (ylhäällä), heikko /hajanaisesti reunalla (alhaalla), tai homogeenisesti koko (keskellä). Analogisia järjestelyt havaittiin BCC, jossa Wnt5a on voimakkaimmin ilmaisivat kärjessä, sekä kasvaimeen liittyvä stroman (kuva 5, vasen paneeli), kun taas Fzd3 osoitti polarisoitunut ilme sisällä kasvain (kuva 5, ylhäältä keskellä), tai Fzd3-positiivisten pesiä (valkoinen nuoli päätä). Fzd5 oli heikko tai puuttuu useimmista BCC (alhaalla oikealla, katso taulukko 1). Jos ilmaistaan, Fzd5 näytteillä hajanainen sisäistä kasvainpaikantumisen (ylhäällä oikealla), tai kasvain reunassa (keskellä oikealla). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että Wnt5a ja sen reseptorit ilmentyvät ei-päällekkäisiä osapopulaatiosta. Voimakas ilmentyminen Wnt5a kärjessä, sekä kasvaimen ympäröivä stroomasoluilla, yhdessä polarisoitunut ilmaus Fzd3 sisällä kasvain massa mukaan Wnt5a kaltevuudet työntyä kasvain parantaa potevilla selvä osapopulaatioiden.

Serial osiin kolmen parafiiniin SCC kasvainnäytteet (ylä-, keski- alarivissä, vastaavasti) värjättiin Wnt5a, Fzd5, Fzd3 vastaavasti menetelmät kuvatulla tavalla, ja esitetty 200-kertaisella suurennuksella. Punaisella tähdellä tarkoittaa keinotekoisia tumavärjäystä johtuen mahdollisesti antigeenin haku olosuhteissa. Punaiset nuolet tarkoittavat rajoja kasvaimia, osoittaa kohti strooman.

immunohistokemia sarjaan leikataan näytteistä värjättiin Wnt5a, Fzd5 tai Fzd3 kuten, suurennus: 100 × (ylärivi), 200 x (keskellä, alariveihin).

Wnt5a pitoisuusgradientit parantaa suuntaava motiliteettia keratinosyyttien

tiedot edellä yhteenvetona ehdotetaan Wnt5a pitoisuusgradientit voivat olla tärkeitä sen vaikutus solun liikkuvuus. Tämän hypoteesin testaamiseksi toiminnallisesti, käytimme ihmisen HaCat keratinosyyttien mallina. Olemme vakaasti transfektoidut HaCat solut Wnt5a ilmentävien vektori, tai tyhjä kontrollivektorille (kutsutaan HaCat pcDNA). Rekombinantin Wnt5a varmistettiin western-blot (kuva 6A). Ensin arvioimme suunnattu soluvaelluksen kaksikamarinen Transwell määrityksessä. Kuten kuviossa 6B, jolloin yhdistelmä-Wnt5a lisättiin suoraan HaCat-pcDNA keratinosyyttien ylemmässä kammiossa, siten läsnä homogeeninen pitoisuus noin vaeltavien solujen, se esti kemotaktinen muuttoliikkeen kohti 5% FCS läsnä pohjassa hyvin. Samoin, kemotaktinen muuttoliike väheni merkittävästi soluissa, jotka yliekspressoivat Wnt5a nähden ei yli-ilmentäviä soluja (kuva 6C). Vastaava tulos saatiin lyhyen aikavälin (6 tuntia) migraatiokokeessa käyttämällä joko 5% FCS tai EGR kemoatrak- (kuva S2A). Lisäksi tyhjästä määrityksissä, migraation Wnt5a yliekspressoivia HaCat soluja 10% FCS DMEM (kuva 6D) kohti alusta reunaa väheni suuresti verrattuna HaCat-pcDNA soluja (samanlaiset tulokset havaittiin, kun käytetään 1% FCS kuin kemoattraktanttia, kuva S2A). Siten keratinosyyttien liikkumiseen on estetty, kun Wnt5a ympäröi solujen homogeeninen pitoisuus. Sitä vastoin, kun Wnt5a erittävät HaCat-soluja ympättiin alareunassa Transwell kammion, ja muodostaa siten ylöspäin Wnt5a pitoisuusgradientti, migraation ei-Wnt5a yli-ilmentävät HaCaT-soluja siirrostettiin yläkammiossa kohti Wnt5a lähde on merkittävästi parannettu (kuva 6e). Nämä tiedot osoittavat, että ihmisen keratinosyytit indusoidaan siirtyä kohti Wnt5a-gradientilla, mutta ei-gradientti Wnt5a pienenee liikkuvuutta kohti muita kemoattraktantteja.

. Endogeenisen ja rekombinanttisen Wnt5a kokonaan solulysaateista stabiilisti transfektoitujen Wnt5a yli-ilmentäviä HaCat tai ohjaus (HaCat-pcDNA) soluissa varmistettiin western blot. B. Ei-Wnt5a yli-ilmentävät HaCat-pcDNA-soluja ympättiin ylemmässä kammiossa Transwell 0,1% BSA DMEM puuttuessa tai läsnä rekombinantti Wnt5a 1 ug /ml, kuten on esitetty kuvassa. Alempi kammio täytettiin 600 ui DMEM, joka sisälsi 5% FCS kuin kemoatrak-. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina vaeltavien solujen kun HaCat-pcDNA ympättiin 0,1% BSA DMEM vain. Tulokset esitetään edustavat keskiarvoa ± S.D. kahden itsenäisen kokeen, kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena, * p≤0.05. C. Vertailu Wnt5a-yliekspressoivassa ja pcDNA säätökennotyyppi muuttoliikettä. Solut suspendoitiin 0,1% BSA DMEM ympättiin ylemmässä kammiossa. Alempi kammio täytettiin 600 ui DMEM, joka sisälsi 5% FCS kuin kemoatrak-. Muuttoliike arvioitiin 18 tuntia käyttäen kolorimetristä määritystä. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina HaCat-pcDNA vaeltavat solut. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. n = 4 erillisellä kokeella, kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena, *** p≤0.001. D. Scratch haavan määritys suoritettiin mitomysiini-C käsitellyt solut. Siirron aikana, HaCat-pcDNA (a, b, c), tai Wnt5a yli-ilmentäviä soluja (d, e, f) pidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FCS: ää. Kuvat otettiin heti alusta tehtiin (0 h) (a ja d) sekä 18 h (b ja e) ja 24 tuntia myöhemmin (c ja f). E. kulkeutuminen HaCat-pcDNA ohjaus solujen läsnä ollessa Wnt5a konsentraatiogradientin. Wnt5a yliekspressoiva tai pcDNA HaCat-soluja siirrostettiin pohjalle kuoppiin Transwell levyt. Välittömästi ennen lisäämällä insertit sisältävä HaCat-pcDNA solut ylemmässä kammiossa, media pohjassa kuoppiin korvattiin poistamiseksi ennalta erittyy Wnt5a. Muuttoliike arvioitiin 18 tuntia. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina HaCat-pcDNA vaeltavat solut. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. n = 3 itsenäisestä kokeesta, kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena, *** p≤0.001.

Lisääntynyt Wnt5a ilmentymistä ihon SCC mukana tukahduttamisen kanonisen Wnt signalointia ja downregulation signaloinnin inhibiittorit

Koska kanoninen ja ei-kanoninen väyliä rajat estävät toisiaan, vaikutus Wnt5a signaloinnin

in vitro

riippuu suhteellinen runsaus muut ligandit, modulaattorit, reseptorit, ja loppupään efektoreina Wnt signalointia verkkoon. Siksi suoritetaan kattava analyysi ilmentymisen Wnt-signalointi komponenttien ensisijainen invasiivisia ihon okasolusyöpä. Kuten taulukosta 2, Wnt5a oli kaikkein merkittävästi voimistunut kaikista Wnt ligandien (nelinkertaisesti, p = 8 x 10

-6), independenly vahvistaa immunohistokemian tiedot. Sitä vastoin pisimmälle ilmaisi kanoninen Wnt jäsen, Wnt3a, on merkittävästi alassäädetty ja lievittää kilpailukykyinen antagonismi varten Wnt5a reseptoriin tasolla. (Toinen kanoninen Wnt-ligandi, Wnt8b, on muodollisesti ilmentyminen lisääntyy, mutta se näyttää ekspressoituvan paljon pienempi koko tasossa, taulukko 2). Niistä tunnustettu Wnt5a sitova frizzled reseptoreihin, Fzd2 ja Fzd5 on voimistunut, vaikkakin vähäistä tilastollista merkitystä (taulukko 3). Niistä solunulkoinen Wnt antagonistien SFRP1 ylössäädellään, jotka edelleen tukahduttaminen kanoninen Wnt signalointia (katso alla, keskustelu). DKK2, spesifinen kanoninen Wnt jäsenille, on myös tukahduttaa, mutta ilmentymistä paljon korkeampi ilmaistuna DKK1 on muuttumaton. Sitä vastoin antagonistit kohteena sekä kanoninen ja ei-kanoninen Wnts, WIF ja SFRP2 /3, sekä avain solunsisäinen signalointi antagonisti Axin2, ovat kaikki merkittävästi vaimentua. Nämä muutokset graafisesti yhteenvetona kuvassa. 7 a. Yhdessä ne viittaavat siihen, että säätelyä Wnt5a invasiivisessa SCC on osa joukko muutoksia toimivat synergistisesti lisätä ei-kanoninen, mutta tukahduttamiseksi kanoninen Wnt signalointia (katso alla, keskustelu).

(a) Cartoon havainnollistaa toiminnallinen suhteet Wnt signalointi komponenttien lueteltu taulukoissa 2 ja 3. Punainen: voimistunut, Green: alassäädetty. Suuri katkoviivat esittävät proteiineihin. (B) erityiset häiriöstä SFRP1 ja SFRP2 in invasiivisia SCC, mutta ei psoriasis. Fold-häiriöstä transkriptien psoriaasiläiskille laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [19] ja tasataan SCC datasarja kuvattu taulukoissa 2 ja 3. Värikoodaus ja lihavoitu asetettu taulukossa 2. ”ns”: ei merkittävää.

samanaikainen käänteisen transkription säätelyyn Wnt5a ja Wnt3a erottaa SCC peräisin ei-invasiivisia hyvänlaatuinen liikauudiskasvun

transkription säätelyä Wnt5a itsessään ei todennäköisesti aiheuta invasiivisuus, koska se on myös voimakkaasti yliaktiivista psoriasis, hyperproliferatiivisesta mutta ei-invasiivisia häiriö [14]. Siksi pyrittiin määrittämään lisätekijöitä kääntämällä fysiologista Wnt5a toimien yhdistäminen tehostamiseen invasiivisia muuttoliikettä. Tämän vuoksi vertasimme geenin ilmentymistä Wnt signalointia komponenttien SCC psoriaasiin. Molemmissa olosuhteissa, vastaavien patologinen tila verrattuna terveisiin iholle. Suhteellisen geeni-ilmentymisen, ilmaistuna sijoitus tasolla havaittiin korreloivan hyvin välillä ohjaus ihon näytteet sekä aineistoja, vastaavasti, mikä osoittaa, että säätely- geenien havaittiin joko tila ilmenee suhteessa samanlainen kontrolli (Fig. S3). Kuvio 7b esittää värikoodattu dysregulation lämpöä kartta Wnt-signalointi komponenttien lueteltu taulukoissa 2 ja 3 SCC vs. psoriasis. Vuonna vahvistus aiempien havaintojen [14], Wnt5a ja Fzd5 myös yläreguloituja psoriasis. Samoin downregulation kanonisen wnt estäjä DKK2, CTNNBIP1 (ICAT), Axin2 sekä FRZB (SFRP3) on yhteinen SCC: n ja psoriaasin. Kuitenkin tukahduttaminen Wnt3 sekä dysregulaatio SFRP1 ja SFRP2 löytyy vain invasiivisia ihon SCC, mutta ei psoriasis.

puute ydin- β-kateniinin värjäys ja heikko Axin2 proteiinin ilmentymiseen vahvistavat alassäädetty kanoninen Wnt-signalointi SCC ja BCC

jotta saataisiin edelleen riippumatonta näyttöä aktivointistatuksen kanonisen Wnt-signalointi suoritimme immunohistokemia of β-aktiini, käyttäen spesifistä vasta-ainetta aktivoituna (Ser38 /Thr41 defosforyloitiin) β – aktiini. Kuten kuviossa 8 on esitetty, ydin- β-kateniinin oli runsaasti rakeinen kerros orvaskeden, mutta poissa joko SCC tai BCC kasvaimia. Tämä todettiin kaikissa SCC (n = 12) ja BCC (n = 7) näytteet tutkittiin. Olemme lisäksi käytti julkisesti saatavilla kudoksen array arkiston saatavilla ProteinAtlas verkkosivuilla. Tämä tietokanta sisältää immunohistokemiallisesti tietojen vaihteleva laatu riippuen käytettävien reagenssien. Kun kyseessä on β-kateniinin, sivusto sisältää sarjan värjätään neljä erilaista vasta, joista kolme on validoitu laajasti (katso Data S1). IHC syntyneitä kuvia käyttäen joko samaa spesifistä vasta-ainetta aktivoitu β-kateniinin tai vasta-aineiden havaitsemiseksi koko β-kateniinin paljasti kalvoon sijaitsee β-kateniinin mutta johdonmukainen puuttuminen ydin- β-kateniinin 12/12 SCC ja 11 /BCC käyttäen neljää eri vasta-aineita (kuva 9, Data S1). Lopuksi myös louhittu dataa ProteinAtlas saatavilla Axin2. Vaikka validoinnin tasoa tämä vasta-aine ei ole aivan yhtä vankka kuin, että β-kateniinin vasta, käytettävissä olevat tiedot viittaavat vahvasti siihen, että Axin2 ei kerääntyä joko SCC tai BCC (kuva S6). Siten proteiini tason tiedot ovat yhdenmukaisia ​​ilme profilointitiedot, mikä viittaa tukahduttaminen kanonisen Wnt signalointia.

immunohistokemia kolme BCC (a-c) ja SCC (d-f) näytteet värjättiin vasta-aineen spesifinen aktivoitu p-kateniinin. Huomautus vahva ydinvoima β-kateniinin rajoittuu rakeinen kerros orvaskeden kussakin näytteessä, samoin kuin suurennettuna karvatupen välittömästi alapuolella SCC soluja (upotettuihin d). Kaikki näytteet on esitetty 100-kertaisella suurennuksella, upotettu 400 x.

Näytteet värjättiin joko vasta-aineen kanssa, joka on spesifinen aktivoitu ei-fosforyloitua β-kateniinin (ylhäällä) tai pan-β-kateniinin (alhaalla) . Kuvat (a) ja (d) esittävät β-kateniinin jakelu havaittu vastaavan vasta-aineen. Huomaa, että vahva ydinvoima β-kateniinin rajoittuu rakeinen kerros orvaskeden.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat osoittaneet roolin Wnt5a syövän invaasio (esim [16], [22] – [25]. Siitä huolimatta roolia Wnt5a syövässä on kiistanalainen, joidenkin raporttien mukaan, että Wnt5a voi toimia tuumorisuppressoriproteiinia vastavaikuttamalla kanoninen Wnt signalointia (tarkistetaan [26]). Toisaalta, sekä kanoninen ja