Krooninen sairaus

tiivistelmä

antiapoptoottisten Bcl-2-perheen jäsen Mcl-1 on PEST proteiinia (sekvenssit sisältävän rikastettu proliini, glutamiinihappo, seriini ja treoniini) ja edellyttää nopeaa hajoamista kautta useita reittejä. Heikentynyt hajoaminen johtaa ylläpitoon Mcl-1 ilme on tärkeä tekijä lääkeresistenssin syöpään. Fosforylaation Thr 163 tuholaisen alueella, stimuloida 12-O-tetradekanoyyliforboli etikkahappoa (TPA) aiheuttaman aktivaation ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi (ERK), liittyy Mcl-1 vakauttamista BL41-3 Burkittin lymfooman soluissa. Tämä on ristiriidassa sen havainnon kanssa, että Thr 163 fosforylaatio normaalissa fibroblasteissa pohjustaa glykogeenisyntaasikinaasi (GSK3) aiheuttaman fosforylaation Ser 159, tuottaa phosphodegron että tavoitteet Mcl-1 hajoamista. Esillä seurantatutkimukset vuonna BL41-3 soluissa, Mcl-1 hajoamisen havaittiin olevan riippumaton GSK3-välitteisen reitin, joka tarjoaa rinnakkain syntymässä havainnot osoittavat, että Mcl-1 hajoaminen kautta tämän reitin on menetetty monia erilaisia syövän. Löydökset Mcl-1-transfektoitujen CHO-solujen vahvistusta kuin BL41-3 soluissa, että GSK3 kohdistetut phosphodegron ei pelata merkittävä rooli Mcl-1 hajoamista, ja phosphomimetic T163E mutaatio johti merkitty Mcl-1 vakauttaminen. TPA-käsiteltyjen BL41-3 soluja, lisäksi esillä Thr 163 fosforylaation ja Mcl-1 vakauttaminen, osoittivat -10-kertainen resistenssi useita kemoterapeuttisia aineita, mukaan lukien Ara-C, etoposidi, vinblastiini, tai sisplatiinia. Näissä syöpäsoluja, joissa Mcl-1 hajoaminen ei ole riippuvainen GSK3 /phosphodegron kohdistetun reitin, ERK aktivointi ja Thr 163 fosforylaatio liittyy lausutaan Mcl-1 vakautus- ja lääkeresistensseihin – vaikutuksia voidaan estää estämällä ERK aktivointi .

Citation: Nifoussi SK, Vrana JA, Domina AM, De Biasio A, Gui J, Gregory MA, et al. (2012) Thr 163 fosforylaatio Syyt Mcl-1 vakauttaminen kun hajoaminen on riippumaton vieressä GSK3-Kohdennettu Phosphodegron, edistäminen Drug Resistance in Cancer. PLoS ONE 7 (10): e47060. doi: 10,1371 /journal.pone.0047060

Editor: Justin L. Mott, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 07 syyskuu 2012; Julkaistu: 09 lokakuu 2012

Copyright: © Nifoussi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat National Institutes of Health (R01 CA 057359 ja RWC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lisääntynyt ilmentyminen Mcl-1, stimuloivat kasvutekijät ja muut ympäristötekijät signaaleja, edistää elinkelpoisuus ja mahdollistaa vahvistusta ja toiminta solutyyppien ja suvusta tarvitaan organismin [1] – [4]. MCL-1 downregulation puolestaan ​​hillitsee näitä prosesseja ja indusoi kuoleman vaurioitunut, funktionaalinen tai senescent solut [1], [5] – [7]. Huolto kohonnut Mcl-1: n ilmentyminen liittyy lääkeresistenssin ja huonon ennusteen erilaisia ​​syöpiä [8] – [15]. Aineet, jotka aiheuttavat Mcl-1 liikevaihdon ja inhibiittorit on suunniteltu kohdistamaan proteiiniin, voi edistää kasvainten solukuolemaa [16] – [20].

Mcl-1 tunnistettiin perustuen lisääntynyt transkriptio in ML-1 ihmisen myeloblastinen leukemiasolujen indusoida erilaistumaan altistettaessa TPA [21], [22]. MCL-1 säätelee myös translaation jälkeen (Kuva. 1A), kuten havaittiin BL41-3 Burkittin lymfooman solulinjassa, jossa endogeenisen MCL-1 vahvistetaan ja yli-ilmentynyt [1], [23], [24]. MCL-1 on PEST proteiini ja on yleensä luonteenomaista nopea vaihtuvuus. Kuitenkin altistus BL41-3 solujen TPA johtaa aktivointi mitogeeniaktivoidun proteiini (MAP) kinaasi ERK, sekä ERK-riippuvainen lisäys Mcl-1 fosforylaation Thr 163 ja selvästi hidastunut hajoamista Mcl-1-proteiini [25], [26].

fosforylaatiopaikat kohdissa Thr 163 ja Ser 159 ihmisen Mcl-1-proteiinin kaaviona. Thr 163 edellyttää fosforylaation MAP kinaasien, kuten nähdään kun TPA aiheuttamaa ERK aktivaation BL41-3 soluissa. Ser 159 edellyttää fosforylaatiota GSK3. MCL-1 on PEST proteiini kohteena nopeasta kierrosta, puoliintumisaika rappeutuminen on ~ 3 tuntia BL41-3 soluissa (stippling halvempaa verrattuna suurempi tiheys osoittaa huono PEST ja mahdollisten PEST sekvenssit; PESTFIND). Kuitenkin Mcl-1 näyttelyitä merkittävää stabiiliutta kun TPA aiheuttamaa ERK aktivointi ja Thr 163 fosforylaatio näissä soluissa. MCL-1 sovelletaan myös toiseen posttranslational muutokseen liittyy katkaisu äärimmäisestä N-pään ([28] merkitty nuolenpää). Tämä johtaa lähekkäin 42/40 kd dubletti, jossa alempi 40 kD: n vyöhyke puuttuu noin 16 aminohappotähdettä, ja se on yleisin kaistalla läsnä BL41-3 soluissa. Jakku parhaiten visualisoidaan isokokoisia elektroforeesi geelejä (Fig. S1B), mutta voidaan joskus havaita standardi geelejä (Fig. 1 C). Kuten Thr 163 fosforylaatio ei estä N-päästään typistetyn, Mcl-1 stabiiliutta tämän fosforylaation nähdään hidastunut rappeutuminen 40 kd bändi. B: BL41-3 solut joko jätettiin käsittelemättä tai altistunut TPA (5 nM) ja osoitetut ajat, ja seurataan ilmentymistä Thr 163 fosforyloitu Mcl-1 (Mcl-1 pT163), yhteensä Mcl-1, fosforyloitu ERK (Perk ), ja GAPDH (ChemiDoc). Kaikki näytteet ajettiin samaan aikaan, ja saatettiin samaan autoradiografinen valotus, jossa musta pystyviiva tässä ja myöhemmissä kuvioissa osoittaa, että kaistat on järjestetty uudelleen vertailun helpottamiseksi. Thr 163 fosforylaatio indusoitui myös pienempiä pitoisuuksia TPA (esim., 1 nM, Fig. S1C), ja estyi U0126 (Fig. S1D). m C: BL41-3 solut joko jätettiin käsittelemättä tai altistuu TPA (1 nM). Joitakin soluja altistetaan välittömästi CHX seurata Mcl-1-proteiini rappeutuminen päivänä 0. Muihin TPA-käsiteltyjä soluja inkuboitiin 24 tuntia (päivänä 1, kun TPA Lisäys), ja sitten altistettiin CHX, jossa osa näistä soluista vetäytyi TPA tällä hetkellä. Käsittelemätön solujen näyte (aika 0) on sama jokaisen parin Western blotteja. Blotti alaosassa vahvisti, että Perk väheni 24 tuntia.

Mcl-1 sovelletaan myös fosforylaatio GSK3 [20], [27] – [34]. Itse asiassa, MAP-kinaasin aiheuttama fosforylaation Thr 163 tarjoaa pohjustus sivuston GSK3-indusoitua fosforylaatiota Ser 159, kuten on esitetty normaalin hiiren fibroblasteissa altistetaan ultraviolettivalolle (UV) [27]. Tässä järjestelmässä, fosforylaatio on MAP-kinaasin fosforylaatiota päällä (Thr 163) suoritetaan c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK); Syntyneessä fosforylaatio on GSK3 fosforylaatiokohdan (Ser 159) johtaa tuotannon phosphodegron että tavoitteet Mcl-1 hajoamista E3 ubikitiinipromoottori ligaasit sisältävä F-box proteiinit [28], [32] – [34]. Mcl-1 voidaan myös hajottaa monia muita reittejä, kuten kautta BH3 sisältävä E3 ubikitiini-ligaasia MULE (kutsutaan myös Arf-BP /Lasu1 /Huwe1 [35], [36]), anafaasia edistää kompleksin [37 ], ja ubikitiinistä riippumattomien mekanismien [38].

Kehittyvät havainnot osoittavat, että vähentäminen Mcl-1 hajoamisen kautta yllä GSK3 aiheuttama polku edistää lääkeresistenssin syövän. Esimerkiksi GSK3 inaktivaatiomenetelmät Rintasyöpäpotilas näytteitä liittyy runsas Mcl-1 ilmentymisen ja huono tulos [20], [32]. Samoin vähennetään Mcl-1 hajoamisen kautta GSK3 /phosphodegron kohdistettujen polku on liitetty krooninen lymfaattinen leukemia [13], [39], [40]. Erilaisia ​​lääkeresistenttien syövät osoittavat inaktivointi F-box-proteiini FBW7, joka sijaitsee alavirtaan fosforylaation tapahtumia, kuten ne, indusoi GSK3 [33], [34]. Muissa tapauksissa, syöpäsolut osoittavat lisääntynyttä ilmentymistä deubiquitinase [41].

Koska on tärkeää Mcl-1 in cancer, olemme edelleen tutkineet Mcl-1 stabilointi, joka tapahtuu, kun TPA-indusoidun ERK aktivaation BL41-3 soluja. Tarkoituksenamme oli ymmärtää paremmin havainto, että Thr 163 fosforylaatio liittyy Mcl-1 vakauttamista näissä ja muissa syöpäsolut [42], mutta pohjustaa Mcl-1 GSK3 /phosphodegron kohdistettuja hajoamista normaaleissa fibroblasteissa [27]. Vaikka fosforylaation lisää sivustot voisivat olla mukana (esim Thr 92 [20]), tämä ei näytä olevan asianlaita BL41-3 soluissa [25]. Tulokset tutkimuksemme osoittivat, että GSK3-välitteisten koulutusjakson ei olla merkittävä rooli Mcl-1 hajoamista BL41-3 soluissa. Tämä poikkeaa siitä, mitä havaitaan normaaleissa fibroblasteissa, mutta yhtäläisyyksiä kehittyvillä havainnot osoittavat, että Mcl-1 hajoamisen kautta tämän reitin on usein heikentynyt syövässä. Yhdistyksen Thr 163 fosforylaatiomallissa Mcl-1 vakauttaminen tässä tilanteessa oli toisteta transfektoiduissa CHO-soluissa, joissa Mcl-1 hajoamista ei vaikuttanut ei-fosforyloitavissa T163A-mutaatio, mutta oli lähes täysin estetty phosphomimetic T163E mutaatio. Yhdessä ERK aktivointi, Thr 163 fosforylaatio, ja Mcl-1 vakauttaminen, TPA-käsiteltyjen BL41-3 solut osoittivat huomattavasti suurentunut vastustuskyky apoptoosin induktion altistettaessa kemoterapeuttisten. Kuitenkin huumeiden herkkyys oli osittain palautettu estäjä ERK aktivointia. Toisin kuin normaalit solut, joissa Thr 163 fosforylaatio voi edistää GSK3 /Ser 159 phosphodegron kohdistettuja Mcl-1 hajoamisen ja kuoleman syöpäsoluissa, joissa Mcl-1 ei hajoa läpi tämän reitin, ERK aktivointi ja Thr 163 fosforylaatio liittyy alentunut MCL-1 hajoamista ja silmiinpistävää lääkeresistenssin. Inhibitio ERK aktivaation /Thr 163 fosforylaation edustaa lupaava lähestymistapa edistää Mcl-1 hajoamisen ja lääkeaineen herkkyys näissä syöpäsoluissa.

Methods

Solulinjat ja Hoidot

BL41 -3-solut olivat peräisin niin alalinja BL41 Burkittin lymfooma-soluja, kuten on kuvattu [23], ja niitä pidettiin RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 7,5% FBS: ää. 5A-HSmyc CHO solujohdannaiset [43], [44] pidettiin alfaMEM alustalla, joka sisälsi 5% FBS. Hiiren AKR-2B alkion fibroblastien linja oli M. J. Getz (Mayo Foundation, Rochester, MN) [45], ja kasvatettiin McCoyn 5A alustalla, joka sisälsi 5% FBS. TPA oli Alexis Biochemicals, LiCI: n, sykloheksimidi, LY294002, etoposidi, vinblastiini, cis-diamminedichloroplatinum (II) (sisplatiini), Wortmanniini, ja sytosiiniarabinosidi (Ara-C) olivat Sigma, U0126 oli EMD Chemicals, ja NaCl Fisher Scientific.

Mcl-1 konstruktiot ja transfektio

Mcl-1 ekspressiorakenteiksi olivat pcDNA 3.1 vektorin [25], joka sisältää neo resistenssimarkkeri. WT-Mcl-1, Mcl-1-T163A, ja Mcl-1-T162A konstrukteja on kuvattu, ja Mcl-1-T163E ja Mcl-1-S159A valmistettiin käyttäen samoja menetelmiä [25], kanssa seuraavia alukkeita . For MCL-1-T163E (ylempi aluke) 5′- GGTCACTACCCTCGGAGCCGCCGCCAGCAG-3 ’ja (alempi aluke) 5′-CTGCTGGCGGCGGCTCCGAGGGTAGTGACC-3′, ja MCL-1-S159A (ylempi aluke) 5’-CGGACGGGGCACTACCCTCGACGCCGCCGC-3 ’ja ( alempi pohjamaali) 5’-GCGGCGGCGTCGAGGGTAGTGCCCCGTCCG-3 ’. Transfektio suoritettiin Effectene (Qiagen) tai Lipofectectamine 2000 (Invitrogen), käyttäen soluja maljattiin edellisenä päivänä.

Western-analyysi

Western blotting olosuhteissa, jotka tunnistavat ihmisen Mcl-1-proteiini on on kuvattu [25], [43], jossa ei ole ristireaktiivisuutta kiinalaisen hamsterin proteiinin nähdään. Vakiokoko elektroforeesigeelejä käytettiin lukuun ottamatta missä suurikokoinen geelejä, jotka erottavat Mcl-1 doublet käytettiin. Seurantaan Mcl-1 rappeutuminen CHO-soluissa, solut maljattiin uudelleen tuoreeseen elatusaineeseen päivänä transfektion jälkeen ja altistettiin CHX (20-25 mikrogrammaa /ml) 24 tuntia myöhemmin [30]. Sillä BL41-3 solujen pitoisuus 2,5 mikrogrammaa /ml CHX käytettiin [25]. ChemiDoc molekyylikuvantamisen järjestelmä (BioRad) tuli saataville ja käytettiin joissakin kokeissa, mikä mahdollisti arviointi muutosten Mcl-1 ilme. Nämä muutokset laskettiin väheneminen Mcl-1 ilmentymisen suhteen rinnakkain käsittelemättömiin kontrollisoluihin. Vaikka käyttökelpoisia vasta-ainetta vastaan ​​suunnattu Mcl-1 phosphoThr 163 ei ole kaupallisesti saatavilla, pieni määrä vasta-ainetta on kuvattu aikaisemmin ollut saatavilla [46].

Pulse /Chase

35S-Met Labeling

Aiemmin kuvattu menetelmiä käytettiin [24] – [26]. Lyhyesti, yksi päivä sen jälkeen, kun pinnoitus, solut pestiin 3 kertaa ja niitä inkuboitiin metioniini-free RPMI, joka sisälsi 5% dialysoitua FBS: ää ja 25 mM HEPES-puskuria. Soluja pulssi-leimattiin siirty-

35S-Met: ssa 2 tuntia, ja sitten pyydystettiin alfaMEM alustalla, joka sisälsi 5% FBS: ää ja lisäksi 15 mg /ml L-metioniinia. Sadonkorjuun jälkeen ja pesemällä kahdesti PBS: llä jään päällä, pelletti hajotettiin läpi ruiskun lyysipuskuria [pesupuskuria (142,5 mM KCI, 5 mM MgCI

2, 1 mM EGTA: ta 20 mM Tris-Cl, pH 7,4 ), joka sisälsi 0,2% Nonidet P-40 ja Sigma proteaasi ja fosfataasinestäjällä cocktaileja]. Pelletti inkuboitiin yli yön kylmässä, jossa antiMcl-1-vasta-ainetta (Santa Cruz S-19) konjugoituna Dynabeads (Dynal, Norja), pestiin kahdesti hajotuspuskurilla, kerran pesupuskurilla, ja alistettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Geeli kiinnitettiin 10% etikkahappoa: 30% metanolia, kastettu NAAMP 100 Amplify (Amersham Biosciences, UK), kuivattiin ja altistettiin röntgenfilmille ja Phosphorlmager näyttö, joista jälkimmäinen analysoidaan ImageQuant ohjelmistoa.

virtaussytometria

Virtaussytometria suoritettiin käyttäen FITC-konjugoitua antiMcl-1-vasta-aineen kanssa, Caltag Fix Perm -kittiä (10000 solut määritettiin jokaisesta näytteestä).

Cell Death Analyysit

apoptoottiset solut kuten alun perin on määritelty morfologisesti oli pisteytetty Wrightin Giemsa värjättiin sytospin (Shandon) Objektilasipreparaattien [17], [47], [48]. PARP pilkkominen määritettiin Western blot-analyysi käyttämällä kokonais-PARP-vasta-ainetta (Cell Signaling), ja kemiluminesenssi skannaus kalvoja käyttäen ChemiDoc järjestelmää. Kaistaintensiteettejä kvantitoitiin käyttäen Fidži (NIH-ImageJ).

Tilastollinen analyysi

puoliintumisaika rappeutuminen Mcl-1 koodattuja proteiineja (määritettiin käyttäen ChemiDoc järjestelmä) arvioitiin non -linear regressiolla käyttämällä Prism 5 (GraphPad Software). Muut tilastolliset analyysit tehtiin käyttämällä SigmaStat ohjelmistoa.

Tulokset

ERK Aktivointi, Thr 163 fosforylaatio, ja stabilointi endogeenisen Mcl-1 Protein Esiintyy Varhainen jälkeen altistaminen BL41-3 Cells kohteeseen TPA ja jälkeen vaimentua

BL41-3 soluilla runsas konstitutiivinen ilmentyminen endogeenisen Mcl-1 (-5-kertaa suurempi kuin ML-1-soluja stimuloitiin TPA [23]), ja ne ovat osoittautuneet erittäin hyödyllinen tutkimuksia sen posttranslationaalinen sääntelyä. TPA-indusoidun ERK aktivaatio johtaa hieman kasvaa edelleen Mcl-1 ilmentymisen näissä soluissa (kuvio. S1A, B), toisin kuin ML-1 ja muiden solujen [17], [21], [22], [25], [26]. BL41-3 solut ovat näin ollen erityisen käyttökelpoisia tutkimuksissa TPA /ERK-indusoidun Thr 163 fosforylaatio [24], koska vaikutukset proteiinin stabiilisuutta voidaan tarkastella ilman merkittäviä Mcl-1 induktio.

alkukokeet edelleen tunnettu siitä, ajoitus aiheuttamia vaikutuksia TPA, koska ERK aktivointi on usein ohimenevä [17], [49]. ERK aktivointi ja lisääntynyt Thr 163 fosforylaatioon oli havaittavissa 0,5 tunnin kuluttua TPA lisäksi [24], [25] ja pidettiin noin 6 tuntia, vähentynyt sen jälkeen kun tarkkailtiin jopa 24 tuntia (Fig. 1 B ja kuviossa. S1A). Sen määrittämiseksi, onko lasku ERK aktivointi ja Thr 163 fosforylaatio nähdään pitkäaikaisessa TPA altistuksen näkyisi laskuun Mcl-1 vakauttaminen, me seurataan Mcl-1 rappeutuminen sekä välittömästi sen jälkeen, kun TPA lisäksi ja 24 tuntia myöhemmin. Kun CHX levitettiin estävän proteiinisynteesiä, Mcl-1 hajoaminen oli lähes täydellinen 7 tuntia (Fig. 1 C, ylhäällä vasemmalla), mutta hidasti kun samanaikaista soveltamista TPA (Fig. 1 C, ylhäällä oikealla), kuten aikaisemmissa tutkimuksissa [ ,,,0],25]. Kuitenkin kun CHX käytettiin 24 tunnin kuluttua TPA, Mcl-1 vakauttamista heikennetty (Fig. 1 C, alhaalla vasemmalla), vaikka se voitaisiin palauttaa soveltamalla ylimääräistä TPA tällä hetkellä (Fig. 1 C, alhaalla oikealla). Kaiken ERK aktivointi, Thr 163 fosforylaatio, ja Mcl-1 vakauttamista esiintyä jo tapahtumia altistettaessa BL41-3 solujen TPA, ja kaikki sen jälkeen vaimentua. Nämä tulokset vahvistettiin aiempien tulosten, jotka olivat ehdottaneet tiiviissä näiden TPA aiheuttamaa vaikutuksia, koska kaikki olivat inhiboi ERK estäjä U0126 ([25] ja Fig. S1D).

Mcl-1 Hajoaminen BL41-3 solut on LiCl-herkkä

Mcl-1 voidaan suunnattu hajoamista GSK3, ja altistuminen TPA johtaa GSK3 inaktivaatioon joissakin soluissa [29], [31], [32], [50 ], [51]. Siksi tuntui mahdollista, että TPA aiheuttama GSK3 inaktivoitumista ja eston Mcl-1 hajoaminen kautta tämä toteutustapa voisi selittää vakauttaminen nähdään BL41-3 soluissa. Keinona tutkia tätä mahdollisuutta, me koestettiin vaikutusta TPA: n ekspressioon GSK3 kohde beeta-kateniinia. Vaikutus GSK3 inhibiittorin LiCl-seurattiin samanaikaisesti. Jälkimmäinen aine toimi positiivisena kontrollina voi aiheuttaa kasvua beeta-kateniinin ilmentymisen (Fig. 2A kaista 3, keskimmäinen valokuva). Tarkoituksenamme oli selvittää TPA matkia vaikutus LiCI tuottamaan kasvuun beeta-kateniinin ilmaisua, koska tämä olisi viittaavia vaikutusta GSK3. Kuitenkin, TPA ei näytä olevan sellainen vaikutus, että se ei lisännyt beeta-kateniinin ilmentymistä puuttuessa LiCl (Fig. 2A kaista 2, keskimmäinen valokuva).

V: BL41-3 soluja joko jätetään hoitamatta tai altistunut TPA (20 nM) ja /tai LiCI: n (20 mM, tai NaCl kontrollina). 18 tunnin kuluttua, ilmentyminen Mcl-1, beta-kateniinin, ja GAPDH ja analysoitiin Western-blottauksella. Vastaavia tuloksia havaittiin, kun solut altistettiin TPA 30 minuutin sijasta 18 tuntia (ei esitetty). B: BL41-3 solut altistettiin ilmoitetut pitoisuudet LiCl (tai KCl tai NaCl verrokkeina), ja siitä määritettiin ilmentymisen Mcl-1 ja beeta-kateniini 24 tunnin kuluttua. Suuri muoto geeli, joka erottaa Mcl-1 doublet bändejä käytettiin. Lievä solujen kasvun esto nähtiin 10-20 mM LiCl: ää (13 ja 27%, vastaavasti verrattuna 5%: lla 20 mM NaCl). Samanlaisia ​​tuloksia kuin kuviossa saatiin altistuksen aika 12 tuntia tai LiCl konsentraatio 40 mM (ei esitetty). C: BL41-3 soluja inkuboitiin ilman tai LiCl: n (20 mM) 0,5 tuntia, jolloin CHX on sovellettu. Expression of Mcl-1, beeta-kateniinin, ja GAPDH määritettiin jälkeen ilmoitetun kertaa. Ei merkittävää eroa ei havaittu rinnan soluja altistetaan NaCl (20 mM, ei kuvassa) sijasta LiCl.

Mcl-1 ilmentymisen seurattiin myös edellä kokeessa ja ei todettu lisätä läsnä LiCl (Fig. 2A, ylempi valokuva). Mitään muutosta Mcl-1 ilmentymisen nähtiin jopa LiCl pitoisuuksina joka aiheutti maksimaalinen lisäys beeta-kateniinin ilmentymistä ja jossa tutkittiin käyttäen isokokoisia geelejä (Fig. 2B). Tämä havainto oli kiinnostava, koska LiCI: n stabiloi Mcl-1 eri soluja, ja meidän oli alun perin oletetaan, että GSK3-välitteisten LiCl-herkkä reitin saattaa olla mukana BL41-3 soluissa. Kuitenkin edelleen havaintoja olivat myös yhdenmukaisia ​​puute rooli tämän reitin MCLn-1 hajoamista BL41-3 soluissa. Näin ollen, näiden solujen altistaminen on Wortmanniini tai LY294002, PI3K-inhibiittorit, jotka voivat estää inhibitorisen fosforylaatiota GSK3 ja siten parantaa hajoamista sen tavoitteita, ei huomattavasti vaikuta ilmentymisen Mcl-1 ja samalla vähentää, että beeta-kateniinin (Fig. S2A ). Lisäksi, LiCl: a ei todettu vaikuttavan Mcl-1 hajoamista läsnä CHX (Fig. 2C). Yhteenvetona voidaan todeta, Mcl-1 hajoamista BL41-3 solut näyttivät olevan suurelta osin LiCI:-herkkä, ja TPA ei toiminut matkimalla vaikutus tämän GSK3 estäjä. Nämä tulokset, yhdessä aikaisempien havaintojen (Fig. 1 ja [25]) ehdotti, että Thr 163 fosforylaatio saattaa liittyä Mcl-1 vakauttaminen soluissa, joissa GSK3 kohdistetuissa hajoamista ei merkittävä rooli. Tätä seikkaa käsitellään tarkemmin jäljempänä, käyttäen transfektoitavissa CHO-solu järjestelmä, jossa fosforylaatiokohdan mutanttien voitaisiin tutkia.

Mcl-1 Hajoaminen ei riipu GSK3 kohdistetun Phosphodegron ja on selvästi hidastanut T163E Mutaatio Transfektoituja CHO-soluissa

CHO-solut tarjoavat helposti transfektoitavissa käyttökelpoinen tutkimiseen mutaatioita paikoissa havaittiin läpi translaation jälkeisen modifikaation endogeenisesti BL41-3 soluihin [24], [25], [30], [43] . CHO-solut sisältävät pohjapinta aktivoitu ERK toisin BL41-3 soluja. Niinpä Thr 163 fosforylaatio tapahtuu kun transfektio WT-Mcl-1, eikä entisestään lisäämällä TPA [25]. Siksi esitetään tutkia vaikutusta ei-fosforyloitavissa T163A-mutaatio, sekä phosphomimetic T163E mutaatio, kun transfektio mutantti konstruktien CHO-soluihin. Mielenkiintoista, alustavat tulokset osoittivat, että LiCl eivät vaikuttaneet ilmaisua tai hajoaminen WT-Mcl-1 CHO-soluissa, vaikkakin beeta-kateniinin ilmentymistä lisättiin (Fig. 3A ja kuvio. S2B). Tämä tarjosi yhdensuuntaisesti havaintoja endogeenisesti ilmentäviä BL41-3 soluja (Fig. 2C), ja ehdotti, että Mcl-1 hajoamista ehkä myöskään välittyvän GSK3 transfektoiduissa CHO-soluissa. Tässä tapauksessa T163A-mutaatio ei odoteta vaikuttavan Mcl-1 hajoamista. Näin poiketa nähdään normaaleissa fibroblasteissa, joissa T163A mutaatio hidastaa Mcl-1 hajoaminen koska Thr 163 fosforylaatio pohjustaa GSK3 aiheuttama Ser 159 fosforylaatio ja hajoaminen [27]. Todellakin, Mcl-1-T163A-koodatun proteiinin tehtiin nopea hajoaminen altistettaessa transfektoitujen CHO-solujen CHX (Fig. 3B), samoin kuin WT-Mcl-1, Mcl-1-S162A- ja Mcl-1-S159A -koodattua proteiineja (Fig. 3B, C). MCL-1-S162A edustaa myös valvonnan fosforylaatio ei ole havaittu tällä sivustolla [25]. Toteamme, että aiemmissa raporteissa [27], joka on S159A /T163A kaksinkertainen mutantti ei tutkittu, koska lähes täydellinen menetys Mcl-1 fosforylaatio on nähty T163A-mutaatio CHO-soluissa [25] ja tämä pohjamaalaus mutaatio ehkäisee Ser 159 fosforylaatio fibroblasteissa [27]. Yhdessä nämä tulokset ei-fosforyloitavissa mutaatiot sekä LiCl viittaavat siihen, että GSK3 kohdistetut phosphodegron ei olla merkittävä rooli Mcl-1 hajoaminen transfektoiduissa CHO-soluissa. Tässä tilanteessa, Mcl-1-T163E koodaama proteiini osoitti merkittävää stabiiliutta [Fig. 3B (katso vaaleampi altistus mukana alareunassa takia laaja vakauttamisen nähnyt tämän konstrukti) ja Fig. 3C]. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin AKR-2B-soluja (Fig. 3d).

: CHO-solut transfektoitiin WT-Mcl-1 ja inkuboitiin, kun läsnä on LiCI: n (+ LiCl-; 20 mM), tai sen Koska (-LiCl), jossa 20 mM NaCl, lisättiin viimeksi mainitussa tapauksessa. 10 tunnin kuluttua, CHX on sovellettu ja ilmentymisen käyttöön WT-Mcl-1-geenin tuote, ja endogeenisen beeta-kateniinin ja GAPDH, määritettiin sen jälkeen, kun ilmoitettu ajat (ChemiDoc). Puoliintumisaika MCL-1 hajoaminen arvioitiin olevan ~ 4 tuntia altistuneiden solujen LiCl, ja 3,7 tuntia valvonnan altistuu NaCl. Ei merkittävää eroa ei havaittu rinnan soluja ei altistettu NaCl tai LiCl. Blot esitetty edustaa kolmen erillisen kokeen. B-C: CHO-solut transfektoitiin ilmoitetuilla konstruktioita, maljattiin uudelleen seuraavana päivänä, ja inkuboitiin 24 tunnin ajan, jotta annetaan ilmaisu. CHX lisättiin sitten ja ilmentymisen käyttöön Mcl-1-geenin tuote ja endogeenisen beeta-tubuliinia määritettiin sen jälkeen, kun osoitettu kertaa Western-blottauksella. Ruudussa B, lasku Mcl-1 ilmentymisen 3 tuntia 2 itsenäisessä kokeessa vaihteli 53-66% WT-Mcl-1, 25-54% kanssa Mcl-1-S162A, ja 25-50% kanssa Mcl- 1-T163A. Vaikka lasku lauseketta WT-Mcl-1 näytti olevan hieman suurempi kuin mitä havaittiin Mcl-1-T163A, tämä ei ollut yleinen löydös. Lyhyt autoradiografisten valotus näkyy myös siksi muita bändejä havaittiin korkealla tasolla ilmaisun saatu Mcl-1-T163E. Lopussa 12 tunnin tarkkailujakson aikana, ilmentyminen Mcl-1-T163E väheni -15% vuonna paneeli B ja ~27% vuonna paneeli C, kuten on arvioitu lyhyestä autoradiografisten vastuita. D: AKR-2B transfektoitu ilmaistuilla konstruktit maljattiin uudelleen seuraavana päivänä, jolloin solujen elinkykyä (trypaanisini- syrjäytyminen) oli 88-92% transfektoimattomissa sekä transfektoiduissa kulttuureissa. Yksi päivä myöhemmin solut altistettiin 25 ug /ml CHX ja määritettiin sen jälkeen, kun osoitettu kertaa ilmentymisen käyttöön Mcl-1-geenin tuote tai endogeenisen aktiini Western-blottauksella. Monista levyt näkyvät viereisillä kaistoilla.

Mcl-1-T163E Näytteillä Kohonneita keskittymisen ja Estää ulokekasvun Stabiilin G418-resistenttien Transfektantit

Edellä kokeessa Mcl-1- T163E näytteillä kohonnut kertymistä ilmentymisaikana ennen soveltamista CHX (Fig. 3B, aika 0). Tutkiminen ajankul- kertymistä vahvisti, että dramaattinen kasvu tapahtui transfektion jälkeen Mcl-1-T163E verrattuna WT-Mcl-1 (Fig. 4A, kaistat 4-5 vs. kaistat 1-2).

V: CHO-solut ko-transfektoitiin joko WT-Mcl-1 tai Mcl-1-T163E yhdessä pEGFP, ja määritettiin osoitettuina aikoina ilmentymisen käyttöön Mcl-1-geenin tuote ja EGFP Western-blottauksella. Kasvuvauhti on Mcl-1-T163E-proteiinin arvioitiin olevan ainakin 10 kertaa suurempi kuin WT-Mcl-1. Noin vastaava ilmaisu EGFP WT-Mcl-1 ja Mcl-1-T163E-transfektoiduissa viljelmissä havaittiin myös, kun määritys virtaussytometrillä (ei esitetty). B: CHO-solut transfektoitiin WT-Mcl-1 tai Mcl-1-T163E ja altistettiin 2 tunnin pulssi altistuminen

35SMet, jona aikana ”aika 0” näyte otettiin talteen. Juoksuvalojen alustalla, joka sisälsi ei-radioaktiivista metioniinia suoritettiin sitten ja

35SMet- merkitty Mcl-1-proteiinit testattiin jälkeen ilmoitettu ajat (ylempi valokuva). Ei-spesifinen kaista ~32 kd on mukana luku (*) vertailua varten ja erillinen Kunkin näytteen määritettiin yhteensä Mcl-1 ilmentymisen Western-blottauksella (alempi valokuva). Puoliintumisaika rappeutuminen arvioitiin Phosphorlmager olevan, 2,5-kertainen pidempään

35S-Met- Mcl-1-T163E kuin

35S-Met-WT-Mcl-1.

Kun pulssi /chase metabolinen leimaus,

35S-Met-Mcl-1-T163E ja

35S-Met-WT-Mcl-1 vastaavaksi osoitettu synteesin aikana alkuperäisen pulssin (Fig. 4B, aika 0 ). Kun Chase, rappeutuminen

35S-Met-Mcl-1-T163E oli hidastunut verrattuna

35S-Met-WT-Mcl-1 (Fig. 4B), vaikka hidastaa täällä ei ollut yhtä merkitään oli nähty, kun seurataan koko Mcl-1-T163E proteiinin Western blottauksella (kuvio. 3B). Tämä saattaa johtua siitä, että pulssi /Chase merkintöjä määrityksissä juuri syntetisoidun proteiinin (yleensä murto-osa kokonaismäärästä), tai muita eroja näiden menetelmien [52], [53]. Kokonaisuutena edellä havainnot vahvistetaan ja laajennetaan kuin BL41-3 soluissa, jotka osoittavat, että T163E mutaatio johti Mcl-1 vakauttaminen CHO-soluissa, joissa hajoaminen oli pitkälti riippumaton GSK3 kohdistetun phosphodegron S

159LPST

163P.

laaja vakautta ja kohonnut kertymistä nähdään Mcl-1-T163E voi liittyä vielä havainto oli se, että emme voineet johtaa pysyvästi transfektoituja solulinjoja tällä konstruktilla. Tämä havainto oli aluksi hieman odottamatonta, koska jatkuvasti kasvava transfektoituja solulinjoja aiemmin saatu WT-Mcl-1 valinnan jälkeen G418 (johtuen neo

R markkeri [43]) ja se voisi myös saada aikaan Mcl-1- T163A. Mcl-1 ilmentymisen näissä stabiilisti transfektoituja solulinjoja oli välillä nähdään soluissa, jotka ilmentävät pl-1 endogeenisesti, kuten BL41-3 soluja ja TPA-käsiteltyjen ML-1-soluja ([43], ja ylempi paneeli ja selite).

edellä esitetyn havainnon, tutkimme Mcl-1-T163E-transfektoituja viljelmiä varhaisessa aikoina transfektion jälkeen ja valinta G418. Suoraan transfektion jälkeen, erilaisia ​​Mcl-1 ekspressiotasot havaittiin (Fig. S3A alempi paneeli). Kun G418 levitettiin sitten poistaa transfektoimattomiin soluihin, eläviä soluja ei kasva ulos Mcl-1-T163E-transfektoituja viljelmiä, toisin kuin on tapahtunut WT-Mcl-1 [Fig. S3B (täytetyt symbolit oikeaan versus keskellä paneeli), jossa solut kasvoivat ilman G418 molemmissa tapauksissa, mutta hävisi Mcl-1 ilmentymisen (avoimet symbolit)]. G418-resistenttien solujen, jotka kasvoivat ulos WT-Mcl-1 näytteillä paljon alhaisempi ilmaisun kuin alkuperäisen pääosa transfektoiduissa väestöstä (Fig. S3C, kaistat 10-12). Sen sijaan, runsas ilmentyminen pidettiin Mcl-1-T163E-transfektoiduissa viljelmissä (kuvio. S3C, kaistat 16-18). Kaiken valinta G418 johti uloskasvamisen transfektantin linjojen esillä ilmaisua endogeeninen valikoimaa WT-Mcl-1 sekä Mcl-1-T163A, mutta ei Mcl-1-T163E.

Lisäksi sen antiapoptoottisten vaikutus, Mcl-1: n on raportoitu inhiboivan solujen lisääntymistä joissakin järjestelmissä [54], [55]. Tätä vaikutusta ei havaittu ekspressoivat stabiilit transfektantit proteiinin tasot endogeenisen välillä [56]. Kuitenkin proliferaation esto on nähty, kun väliaikaisen transfektion tai muita lähestymistapoja, jotka kykenevät tuottamaan suuria määriä ilmentymisen. Se, että WT-Mcl-1-transfektoitujen CHO-solulinjat osoittivat ekspressiota endogeenisen alueella (Fig. S3A ylempi paneeli), viittaa siihen, että tällaiset solut voivat ollut kasvua niihin nähden, joilla on korkeampi ilmentymistasot. Vakaa transfektantteja toisen vastaanottajan linja samoin esillä ilmaisua endogeeninen alue, mutta ei korkeampi [56]. Kaiken kaikkiaan vaikka WT-Mcl-1 edistää elinkelpoisuus stabiilisti transfektoidut kloonit ilmentävät tasot endogeenisen alueella, on vielä selvitettävä, onko korkeampia ekspressiotasoja aiheuttaa ylimääräisiä vaikutuksia, kuten soluproliferaation inhibointi.

Ottaen edellä esitettyjen seikkojen, se ei ehkä ole yllättävää, että stabiilisti transfektoidut linjat eivät saatu Mcl-1-T163E. Toteamme, että endogeenistä tubuliinin väheni viljelmissä, jotka oli transfektoitu tämä rakenne (Kuva. S3C), joka voi liittyä kohonnut ekspressio transfektoitujen proteiinien ja /tai läsnä on ei-irrotettava Glu mutaatio. Toteamme myös, että jotkut solut alkuperäisen bulk Mcl-1-T163E-transfektoitujen väestön näytteillä alempi lauseke (Fig. S3A alempi paneeli).