Krooninen sairaus

tiivistelmä

Me täällä näyttää uutta suhdetta ihmisen p14ARF oncosuppressor ja MDM2 onkoproteiini. MDM2 yli-ilmentyminen erilaisissa syöpäsolulinjoissa aiheuttaa p14ARF vähentäminen asiakkuutta sen hajoamisen kautta proteasomin. Vaikutus ei vaadi ubikitiinipromoottori ligaasilla toimintaa MDM2 ja edullisesti tapahtuu sytoplasmassa. Mielenkiintoista, hoito inhibiittorit PKC (proteiinikinaasi C) reitin ja käyttö p14ARF fosforylaation mutantteja mukaan ARF fosforylaatio voisi olla rooli MDM2 välittämän ARF hajoamisen vahvistamalla aiempien havaintojen ARF fosforylaatio vaikuttaa sen vakaus ja biologista aktiivisuutta. Tutkimuksemme paljastaa uuden potentiaalisesti tärkeä mekanismi, jonka avulla ARF ja MDM2 voi tasapainottavat toisensa aikana kasvaimia prosessin.

Citation: Vivo M, Matarese M, Sepe M, Di Martino R, Festa L, Calabrossa V, et al. (2015) MDM2 välittämää hajoaminen p14ARF: uudella mekanismilla Control ARF tasot syöpäsoluissa. PLoS ONE 10 (2): e0117252. doi: 10,1371 /journal.pone.0117252

Academic Editor: Thomas G. Hofmann, Saksan Cancer Research Center, SAKSA

vastaanotettu: 23 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 19 joulukuu 2014; Julkaistu: 27 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Vivo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia Legge Regionale (Regione Campania) no 5/2007 AP ja GLM ja Progetto ”Campania Research in Experimental Medicine” (CREME). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tieto joilla säännellään epätasapaino tuumorisuppressorien ja onkogeenien on kriittinen ymmärtäminen synnyssä ja kehityksessä syövän.

tärkeimpiä tuumorisuppressorien, p14ARF (hiiri p19ARF) (Alternative Reading Frame) näyttää olevan tärkeä rooli, on sen suora vaikutus syövän pitkälti osoittanut viime vuosina [1,2].

ARF osallistuu kasvaimia synnyttävän tarkistuspiste herkistämällä alkavaa syöpäsolujen niiden kasvu pysähtyy tai apoptoosin. On yhä enemmän todisteita siitä, että ARF signalointi on monimutkainen, ja siihen liittyy p53-riippuvainen tai riippumaton reittejä, joilla pyritään pääasiassa hillitsemällä epänormaalia solujen kasvua ja säilyttämään genomista vakautta. Löytö lukuisia ARF interactors ja havainto, että myös viruksen, genotoksinen, hypoksinen ja oksidatiivista stressiä aktivoi ARF vaste, mukaan ARF on laajempi rooli suojella solun [3]. Ensiöparit normaaliolosuhteissa säilyttää ARF matalalla tasolla; kuitenkin, kun soluja stimuloidaan onkogeeninen traumojen sen pitoisuus solussa merkittävästi kasvaa. Tämä ilmiö liittyy yleensä rinnakkain häiriöitä estävää vuorovaikutusta MDM2 ja p53, jolloin kertyminen transkriptionaalisesti aktiivisen p53, joka stimuloi joko apoptoosin tai solusyklin pysähtymiseen [4, 5]. Vahva ARF vaikutus soluproliferaatioon edellyttää, että solut olisi ovat kehittäneet mekanismeja, jotka voivat nopeasti vähentää ARF solunsisäisiä tasoja, kun sen toiminta ei ole enää vaadittu. Kuitenkin mekanismit, jotka säätelevät ARF liikevaihdon ovat vasta äskettäin aiotaan selvitetty. ARF hajoaminen riippuu ainakin osittain, proteasomin, ja vaikka ARF puuttuu lysiinijäämien sen järjestyksessä, se voi käydä läpi N-terminaalista ubikinaa- riippumatta MDM2 ja p53 [6]. Melko äskettäin, erityisen ubikitiini-ligaasia ARF kutsutaan ULF identifioitiin [7]. Toisaalta, on olemassa todisteita siitä, että ARF voi hajota

in vitro

jonka 20S proteasomin ilman ubikinaation ja että tämä prosessi voidaan torjua TBP-1 (Tat Binding Protein 1), monitoiminen komponentti säätelyalayksikön proteasomin [8]. Lisäksi REG γ proteasomin on liitetty ubikitiinipromoottori riippumaton sääntely p19ARF liikevaihdon, joka tukee käsitystä siitä, että ubikinaa- voitaisiin ei välttämättä osallinen ARF liikevaihdon [9].

Mielenkiintoista, me ja muut äskettäin osoittaneet, että jälkeen PKC (proteiinikinaasi C alfa) aktivointi, ARF nousevat [10, 11]. Lisäksi pistemutaatio, joka jäljittelee fosforylaatio konservoituneen Thr8 indusoi ARF kertyminen pääasiassa sytoplasmassa ja estää sen biologista aktiivisuutta [11].

Toistaiseksi ARF solunosasijaintia näyttää olevan tärkeä rooli sen vakauden ja biologisia toimintoja, vaikka ei yksiselitteisesti. Näyttää siltä, ​​että nucleolar lokalisointi ARF voi palvella sen varastointiin tai stabilointi [12,13]. Vuonna nucleolus, ARF olettaa stabiilin rakenteen ansiosta yhdistys B23 /NPM, kun taas nucleoplasm se altistetaan nopeampaan liikevaihdon. Joissakin tapauksissa kasvu ARF tasoilla aiheuttaa MDM2 muuttamaan tumajyväseen [14, 15], ja tämä on yhdistetty p53 vakauttamiseen. Muut raportoitu, että vaikka nucleolar lokalisointi ARF aiheuttaa sen stabilointi, tämä ei ole välttämätöntä säädellä ARF: n aktiivisuutta p53 [16, 17]. Mielenkiintoista, se on raportoitu, että ei-nucleolar muotoja ARF altistetaan nopeaan hajoamista proteasomin, jossa MDM2 pelissä rooli modulaatioon ilmiön vaikka mekanismeja läheskään selvitetty [18]. MDM2 on monipuolinen rooleja proteiinien hajoaminen. Itse asiassa, syrjään sen hyvin kuvattu rooli E3-ubikitiinipromoottori ligaasilla MDM2 voi shuttle p63 sytoplasmaan välittävä sen vuorovaikutusta proteiinien nimenomaisesti osallistu liikevaihdon [19]. Lisäksi MDM2 on osoitettu välittävän proteasomin-riippuvainen, mutta ubikitiini-riippumaton hajoamisesta p21Waf1 /CIP1 [20] ja Retinoblastooma proteiinien [21]. Viime aikoina on raportoitu, että MDM2 voi vuorovaikutuksessa komponenttien 19S-proteasomin [22] väittää laajempi näkemys sen vaikutusmekanismia. Olemme täällä tutkia uuden välisen suhteen ARF ja MDM2 jossa MDM2 näyttää olevan osallisena säätelyssä ARF liikevaihdon välittämisessä sen hajoamisen kautta proteasomin.

Tulokset

MDM2 yliekspressio aiheuttaa p14ARF hajoamista kautta proteasomista

analysoitava mahdollisia osallistumista MDM2 säätelyssä p14ARF proteiinin vakauden me yli-ilmentyy MDM2 ilmentämisplasmidin eri ihmisen ja hiiren solulinjoja että läsnä tai puuttuu havaittavia määriä p53 ja /tai MDM2. Kuten Fig. 1 osoittaa, p14ARF endogeeniset tasot sekä H1299 ja HeLa-solut lineaarisesti pienentyä, kun kasvavia määriä MDM2 ekspressioplasmidin transfektoitiin (Fig. 1, A ja B). Real-Time PCR-analyysi RNA uutetaan MDM2 transfektoiduista HeLa ja H1299 solujen osoita mitään merkittäviä muutoksia suhteellisen määrän ARF mRNA (Fig. 1 C) osoittaa, että MDM2 vaikutus kohdistuu klo transkription jälkeisellä tasolla. Lisäksi MDM2 yliekspressio tuloksia myös vähentäminen eksogeenisesti ilmaistuna ARF proteiinin useissa ihmisen ja hiiren solulinjoja (Fig. 1 D, E ja F) riippumatta p53 status, joka osoittaa, että MDM2 vaikuttaa ARF proteiinin stabiiliuden p53-riippumattomalla tavalla. Tärkeää on, vähentäminen endogeenisen MDM2 solunsisäisiä tasoja siRNA aiheuttaa lisää ARF endogeenisten tasojen sekä HeLa ja H1299-solujen, joka edelleen varmistaa, että endogeeniset MDM2 voi ohjata p14ARF runsautta (Fig. 2). Meillä on siis tutkittu ARF proteiinin stabiiliuden läsnä ollessa tai puuttuessa MDM2 yliekspression altistumisen jälkeen sykloheksimidille estää proteiinisynteesiä. Ilmoitettuina aikoina altistuksen jälkeen lääkkeen, solut kerättiin ja uutteet analysoitiin Western Blot. Kuva. 3A ja B osoittaa, että endogeeninen p14ARF puoliintumisaika alenee seuraavan MDM2 yli-ilmentymisen.

H1299 solut valetransfektoidut (ensimmäinen kaista) tai transfektoitu kasvavia määriä MDM2 ekspressioplasmidin (0.3-0.6-0.9 ug). Vaikutus p14ARF solunsisäisiä tasoja arvioitiin Western blot on koko proteiini lysaatit tutkittiin anti-ARF ja, kuten ohjaus, anti-MDM2 ja anti-aktiini. B HeLa-solut valetransfektoidut tai transfektoitu MDM2 ekspressioplasmidilla (0,3-0,6 ug) ja analysoitiin kuten

. C Real Time suhteelliseksi kvantitoimiseksi ARF ilmaisun H1299 ja HeLa-soluissa. Solut transfektoitiin elektroporaatiolla käyttäen MDM2-plasmidia (4×10

6 solua /2,5 ug MDM2-ekspressioplasmidin) ja saatettiin RNA ja qRT-PCR-analyysillä. ARF RNA-tasot normalisoitiin suhteessa 18s RNA. Arvot kaaviossa edustaa keskiarvoa kolmen erillisen kokeen. Keskihajonta on esitetty. D U2OS, E H1299 ja F MEF p53

– /- MDM2

– /- solut transfektoitiin kiinteän määrän p14ARF ilmentävien plasmidin (0,3 ug ensimmäinen kaista) yksin tai kasvavia määriä MDM2 ilmentävien plasmidin (0,3 -0,6-0,9 ug). Vaikutus p14ARF tasolla arvioitiin Western blot on koko proteiini lysaatit, tutkittiin anti-ARF tai anti-Xpress (havaita ulkoisesti ilmaistaan ​​ARF) ja, kuten ohjaus, anti-MDM2 ja anti-aktiini. Western Blot Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. ARF kaistaintensiteettejä kvantitoitiin Image J ohjelmisto, aktiini normalisoitu ja ilmaistiin kertainen rikastus suhteessa käsittelemättömien näytteiden mielivaltaisesti asetettu 1 (katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja).

H1299 ja HeLa soluja käsiteltiin joko MDM2 tai Negative Control suunnattu siRNA (10 nM lopullinen konsentraatio) ja sen jälkeen 72 tunnin inkubaation, kerättiin ja analysoitiin Western blot ja ja qRT-PCR kuvatulla Materiaalit ja menetelmät.

Half -Life analyysi läsnä ollessa tai ilman MDM2 yliekspression. HeLa-solut valetransfektoidut tai transfektoitu MDM2 ekspressioplasmidilla (0,6 ug). 24 tunnin kuluttua, sykloheksimidiä lisättiin ja solut kerättiin osoitetuissa aikapisteissä. Lysaatit analysoitiin Western blot anti-ARF, anti-aktiini ja anti-MDM2. B Juoni edustaa puoliintumisaika analyysi ARF läsnä tai poissa MDM2 yli-ilmentymisen. Kaistaintensiteettejä kvantitoitiin Image J ohjelmisto ja aktiini normalisoida ennen piirretty kuvaaja. Proteiinin määrä eri ajankohtina ilmaistaan ​​prosentteina kokonaisproteiinista, eli proteiinin määrä on t0. Kukin profiili edustaa keskiarvoa kolmen itsenäisen transfektioista ja Western Blot kokeiluja. Standardipoikkeamat on myös esitetty. C U2OS solut transfektoitiin kiinteän määrän p14ARF ekspressioplasmidin (0,3 ug) ja yhä enemmän MDM2 ekspressioplasmidin, jossa osoitetaan (0,3-0,6 ug). 24 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 10 uM MG132 (kaistat 4-6) tai DMSO (kaistat 1-3). Tasot p14ARF analysoitiin Western Blot on koko proteiini lysaatit, tutkittiin anti-ARF ja, kuten ohjaus, anti-MDM2 ja anti-aktiini.

vieressä kysyttiin proteasomin osallistuu MDM2 välittämä p14ARF hajoamista. Tutustua hypoteesin, transfektoimme U2OS solut kiinteän määrän p14ARF ja kasvavia määriä MDM2 ja käsiteltyjen solujen kanssa proteasomin inhibiittoria MG132. Western Blot kuvassa. 3C johdonmukaisesti osoittaa, että hoito proteasomin estäjä ehkäisee MDM2 vaikutus, mikä osoittaa proteasomin lopulliseksi efektori MDM2 toimia ARF.

ARF hajoamista MDM2 vaatii proteiini-proteiini vuorovaikutukseen

fyysinen vuorovaikutus p14ARF ja MDM2 on ollut kohteena intensiivisiä tutkimuksia ja useita vuorovaikutuksessa domeenit on tunnistettu p14ARF, jotka edistävät sitoutumista MDM2 [14, 17, 23, 24]. Siksi päätimme analysoida, mitkä alueet ARF tarvitaan tarkkailla MDM2 vaikutusta p14ARF. Meillä on siis käytti kahta erilaista ARF häviämämutantteja, ARF

1-65, käsittää eksonin 1β of p14ARF ja ARF

65-132, joka vastaa ARF eksoni 2. samanaikainen immunosaostus in U2OS soluista osoitti, että ARF

1-65 mutantti kykenee vuorovaikutuksessa MDM2 kun taas säilyttäen eksonin 2 (ARF

65-132) ei (Fig. 4A), vahvistaa tärkeä rooli eksonista 1β sitoutumisessa MDM2 [23, 24]. Kaksi ARF deleetiomutantit transfektoitiin sitten yhdessä kasvavia määriä MDM2. Kuten Fig. 4B ja C osoittavat selvästi, aminoterminaalinen puoliskon p14ARF (ARF

1-65) ilmestyy hajottaa MDM2 yli-ilmentyminen, kun taas C-terminaalinen puolikas (ARF

65-132) ei vaikuta, joka tukee rooli sitoutumisen välillä proteiinit MDM2-välitteisen ARF hajoamista.

U2OS solut transfektoitiin yhtä suuri määrä (1 ug) MDM2 ja joko 3xFlagARF

1-65 tai 3xFlagARF

65-132 ilmentävät plasmidit, kuten on osoitettu. Yhtä suuret määrät proteiinia uutetta immunosaostettiin anti-MDM2-vasta-aineen ja paljasti Western Blot anti-MDM2 ja anti-Flag paljastaa ARF. B U2OS solut transfektoitiin 0,3 ug: 3xFlagARF

1-65 (ilmentävät eksoni 1β of p14ARF) (ensimmäinen kaista) yksin tai yhdessä kasvavien määrien MDM2 ekspressioplasmidin (0.3-0.6-0.9 ug). Tasot p14ARF analysoitiin Western Blot on koko proteiini lysaatit, tutkittiin anti-ARF ja, kontrollina, anti-MDM2 ja anti-aktiini. C U2OS solut transfektoitiin 0,3 ug: 3xFlag ARF

65-132-plasmidi (joka ilmaisee eksonin 2 p14ARF) (ensimmäinen kaista) yksin tai yhdessä kasvavien määrien MDM2 ekspressioplasmidin (0.3-0.6-0.9 ug). Tasot p14ARF analysoitiin Western Blot on koko proteiini lysaatit tutkittiin anti-ARF ja, kontrollina, anti-MDM2 ja anti-aktiini. D U2OS solut transfektoitiin 1 ug: lla sekä ARFΔ

2-14 /82-101 ja MDM2-ekspressioplasmidin kuten on osoitettu. Yhtä suuret määrät proteiinia uutetta immunosaostettiin anti-ARF-vasta-aineen ja paljasti Western Blot anti-MDM2 ja anti-ARF. E U2OS solut transfektoitiin 0,3 ug: ARFΔ

2-14 /82-101 ja kasvavia määriä MDM2 ekspressioplasmidin, jossa osoitetaan (0,6-0,9 ug). Tasot endogeenisen p14ARF analysoitiin Western Blot on koko proteiini lysaatit tutkittiin anti-ARF ja, kuten ohjaus, anti-MDM2 ja anti-aktiini.

Lisäksi olemme analysoineet kyky MDM2 ja aiheuttaa hajoamista koskevan ARF deleetiomutantin (ARFΔ

2-14 /82-101) puuttuu ydin- /nucleolar lokalisaatiosignaaleja [14]. Kiinnostavaa kyllä, tämä mutantti näyttää vallalla sytoplasmisen lokalisointi [14] ja säilyttää kyky sitoa (Fig. 4D) ja hajoavan MDM2 (Fig. 4E).

Paitsi vakiintunut rooliaan ubikitiinipromoottori ligaasilla, MDM2 voi vaikuttaa proteiinin liikevaihdon myös läpi ubikitiinipromoottori riippumaton mekanismi, joka indusoi suoran yhdistys kohde- proteiinien proteasomista [22]. Erotella näitä mahdollisuuksia, olemme analysoineet vaikutus MDM2 mutantti, josta puuttuu ubikitiinipromoottori ligaasilla nimetön sormi domain (MDM2

1-441) (Kuva. 5A) [25] ulkoisesti ilmaistaan ​​ARF tasoja. Kiinnostavaa kyllä, tämä mutantti kykenee indusoimaan ARF hajoamista yliekspressoidaan (Fig. 5B), mikä osoittaa, että MDM2 ubikitiinipromoottori ligaasilla verkkotunnus MDM2 on tarpeeton havaitun vaikutuksen ARF. Seuraavaksi analysoimme vaikutus MDM2 Deleetiomutantin (MDM2Δ

150-230) (Kuva. 5A), että puuttuu sekä tuonnin (MML) ja vienti (NES) ydinvoiman lokalisointi signaaleja, osoittaa vallalla sytoplasmisen lokalisointi [25 ]. Kun yli-ilmennetään U2OS soluissa, tämä mutantti indusoi hajoamista ulkoisesti ilmaistaan ​​ARF (Fig. 5C) osoittaa, että ARF hajoaminen ei vaadi MDM2 sijoittuu tumaan. Co-immuunisaostuskokeissa osoittavat, että sekä MDM2 mutantit pystyvät sitomaan ARF, vahvistavat käsitystä, että sitoutuminen kahden proteiinien voisi olla rooli havaittu vaikutus (Kuva. 5D).

Järjestelmä ilmoittaa MDM2 mutantteja on kuvattu tässä kuviossa [25]. B U2OS solut transfektoitiin kiinteän määrän p14ARF ilmentävien plasmidin (0,3 ug) ja yhä enemmän MDM2

1-441 ilmentävät plasmidi (0.3-0.6-0.9 ug). Tasot p14ARF analysoitiin Western Blot on koko proteiini lysaatit tutkittiin anti-ARF ja, kontrollina, anti-MDM2 ja anti-aktiini. C U2OS solut transfektoitiin kiinteän määrän p14ARF ilmentävien plasmidin (0,1 ug) ja yhä enemmän MDM2Δ

150-230 ilmentävät plasmidi (0.5-1-1.5-2-2,5-3 ug). Tasot p14ARF analysoitiin Western Blot on koko proteiini lysaatit tutkittiin anti-ARF ja, kontrollina, anti-MDM2 ja anti-aktiini. D U2OS solut transfektoitiin yhtä suuri määrä (1 ug) p14ARF ilmentävien plasmidin ja MDM2

1-441 tai MDM2Δ

150-230 ilmentävät plasmidi. Yhtä suuret määrät proteiinia uutetta immunosaostettiin anti-ARF-vasta-aineen ja paljasti Western Blot anti-MDM2 ja anti-ARF.

Euroopan MDM2-välitteinen ARF hajoamista tapahtuu pääasiassa sytoplasmassa

todisteet siitä, että MDM2 mutantti, voi paikallistaa tumassa, indusoi ARF hajoaminen yhdessä havainnon, että ARF mutantti näyttämällä hallitseva sytoplasmisen lokalisointi (ARFΔ

2-14 /82-101) on altis MDM2 -välitteisen hajoamisen, johtaneet siihen ehdotukseen, että MDM2 aiheuttama ARF hajoamisen yhteydessä MDM2 yliekspressio voi esiintyä sytoplasmassa. Tämä sai meidät tarkistaa kyky MDM2 hajota ARF käsitellyissä soluissa Leptomycin B (LMB), jonka tiedetään estävän MDM2 shuttling sytoplasmaan [26]. Tätä varten U2OS transfektoitujen solujen kiinteän määrän ARF käsiteltiin tai ei ole Leptomycin B läsnä ollessa tai ilman ektooppisen MDM2. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, Leptomycin B kohtelu ei vain määrittää kertymistä ARF, mutta mikä tärkeämpää, ehkäisee MDM2 vaikutus ARF vahvasti osoittaa, että pakko ydinvoiman MDM2 lokalisointi estää sen kykyä vaikuttaa p14ARF liikevaihtoon.

U2OS transfektoitiin 0,5 ug ARF ekspressioplasmidin yksinään (kaistat 1, 2) tai yhdessä 1 ug: n MDM2 ekspressioplasmidin (kaistat 3, 4). 24 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin Leptomycin B (kaistat 1 ja 3) tai Metanoli (kaistat 2 ja 4). Yhteensä solu-uutteita ovat joutuneet Western Blot ja analysoitiin anti-ARF, anti-MDM2 ja anti-aktiini vasta-aineita. B HeLa-solut transfektoitiin lisääntyvien määrien kanssa MDM2 ekspressioplasmidin (1 ja 1,5 ug). 24 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin joko DMSO: ta, TPA tai Bisindolylmalemide ja analysoitiin anti-ARF, anti-MDM2 ja anti-aktiini-vasta-aineiden Western blot. C HeLa-solut transfektoitiin PKC-a-siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA (siRNActrl). 48 tuntia myöhemmin, solut valetransfektoidut tai transfektoitu kasvavia määriä MDM2 ilmentävien plasmidin, jossa osoitetaan (0,6 ja 0,8 ug plasmidi-DNA: ta). Yhteensä solu-uutteet analysoitiin Western blot anti ARF, anti-MDM2 ja anti-aktiini-vasta-aineita. D U2OS solut transfektoitiin 0,3 ug: lla joko ARFT8A tai ARFT8D yksinään (ensimmäinen kaistat) tai yhdessä kasvavia määriä MDM2 ekspressioplasmidien (0.3-0.6-0.9 ug). 24 tuntia transfektion jälkeen solu- uutteita alistettiin Western Blot anti ARF, anti-MDM2 ja anti-aktiini.

MDM2 välittämä ARF hajoamista on estetty kun PKC aktivoinnin.

Olemme hiljattain osoittivat, että TPA (tunnettu aktivaattori signaalin transduktion entsyymi PKC-a) käsittely johtaa kasvua ARF sytoplasmisen altaan [11]. Täällä osoitettu onko PKC aktivointi voisi vaikuttaa MDM2 välittämän ARF hajoamista. Tätä varten me käsiteltyjen HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu kasvavia määriä MDM2, joko TPA tai Bisindolylmalemide (Bim, inhibiittori PKC aktivointi). Kuva. Kuvio 6B esittää, että Bim hoito, kuten odotettua, indusoi laskua ARF. Mielenkiintoista, MDM2 yliekspressio edelleen alentaa ARF tasoja kontrolleihin verrattuna. Toisaalta, TPA hoito enimmäkseen ehkäisee MDM2 indusoimaa hajoamista p14ARF, mikä viittaa siihen, että PKC reitti ei pitäisi aktivoida, jolloin saadaan tehokas MDM2-välitteisen ARF hajoamista. Analysoida edelleen PKC rooli MDM2 välittämän ARF hajoamista, U2OS solut käsiteltiin joko PKC α erityisiä siRNA tai kontrolloida siRNA ja transfektoitiin lisääntyvien määrien kanssa MDM2 (Fig. 6C). N yli-ilmentyminen MDM2 in si-ctr köyhdytettyä soluissa indusoi ARF hajoamista odotetusti. Mielenkiintoista, havaitsemme laskua ARF tasojen päälle PKC ehtyminen puuttuessa MDM2 yli-ilmentymisen (vertaa kaista 5 kaista 2). Tämä on yhtäpitävä sen havainnon kanssa, että PKC aktivaatio indusoi kasvua ARF proteiinin tasot ja PKC inaktivointi aiheuttaa laskua ARF tasojen (Vivo et al., 2013 ja Fig. 6B). Me itse asiassa havaittu, että myös MDM2 tasoja säätelee negatiivisesti PKC ehtymisestä, (vertaa kaista 5 kaista 2). Mikä tärkeintä, kanssa edellisessä kokeita, MDM2 yliekspressio PKC köyhdytetyn solut voidaan edelleen vähentää ARF proteiinin tasot (vertaa kaista 5 kaistaa 6 ja 7).

Voit siirtyä syvemmälle mahdollinen rooli ARF fosforylaation MDM2 välittämän ARF hajoaminen, olemme käyttäneet kahden pisteen mutanttien ARFT8D ja ARFT8A jossa Treoniini 8 on korvattu, jotta matkia vastaavasti fosforyloidun ja ei fosforyloitua muotoa ARF [11]. Mielenkiintoista, defosforyloitiin muoto ARF (T8A mutantti) on hyvin epävakaa, jossa on suhteellisen lyhyt puoliintumisaika, kun taas T8D näkyy johdonmukaisesti rikastettu sytoplasman osastossa [11].

Molemmat mutantit transfektoitiin U2OS soluissa yhdessä kasvavia määriä MDM2. Mielenkiintoista, fosfo jäljittelevää T8D mutantti näyttää vastustuskykyisempi MDM2 välittämän hajoamisen, kun taas T8A mutantti näyttää järkevämpää kuin MDM2 vaikutusta (kuviot. 6D ja 1 D), joka vahvistaa, että fosforylaatio kykenee suojaava rooli ARF.

Tämä tulos nosti esiin hypoteesi, että vallalla ydinvoiman lokalisoinnin ARF (T8A ja WT proteiinit) voivat olla seurausta tehokas puhdistuma Defosforyloitujen, ja siten epävakaa, ARF proteiinin sytoplasmaan. Tutustua hypoteesin, U2OS soluja, jotka on transfektoitu villin tyypin tai mutantti proteiinit hoidettiin MG132 ja ARF subcellular jakelu analysoitiin immunofluoresenssilla. Kuten on esitetty kuviossa. 7A ja B havaitsimme, kun MG132 hoito, johdonmukaista lisäystä ARF sytoplasmista värjäytymistä sekä WT ja T8A transfektoituja soluja, edelleen viittaa siihen, että ARF hajoaminen vallitsevasti tapahtuu sytoplasmassa. Samoin Western Blot ydin- ja sytoplasman otteita U20S soluja, transfektoitu ja käsiteltiin kuten edellä, osoittaa jatkuva kasvu sekä p- ARF ja ARFT8A proteiinin tasot sytoplasman osastossa upon proteasomin esto (Fig. 7C).

U2OS solut transfektoitiin 1,5 ug: lla joko p- tai mutantit ARF ekspressoivien plasmidien. 16 tuntia, kun transfektiosta solut käsiteltiin joko DMSO: ssa tai 10 uM MG132: ssa 5 tuntia ja saatettiin IF anti-ARF-vasta-ainetta. Edustavia kuvat osoittavat ARF ja ARF mutanttien solunosasijaintia in U2OS soluissa tai ilman MG132 hoitoa näkyvät. Kuvat on otettu Nikon fluoresenssimikroskoopilla samanlaisissa altistumisolosuhteet. B Histogrammi, joka edustaa keskiarvo kolmen erillisen kokeen, raportoi prosenttiosuus transfektoitujen solujen näyttää kussakin lokalisaatio. Standardipoikkeamat on myös esitetty. C Western blot-analyysi on yhtä suuret määrät sekä sytoplasman (30 ug) ja ydin- (6 ug) teiiniuutteissa transfektoitujen U2OS käsiteltyjen solujen kanssa tai ilman MG132. Tehokkuus huokoista fraktioinnin tarkistettiin anti-Lamin A /C ja anti-tubuliinia vasta-aineita. Normalisoitu ARF kaistaintensiteettejä, alla jokainen vastaa bändi, ilmaistaan ​​kertainen rikastus suhteessa käsittelemättömien näytteiden mielivaltaisesti asetettu 1 (katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja).

Keskustelu

merkityksen välisen funktionaalisen vuorovaikutuksen ARF ja MDM2 tuli ulos alkuperäisen havaintoon, että ARF on potentiaalia toimia tuumorisuppressorina sitoutumalla ja estämällä p53-antagonisti MDM2. Tämä tieto vahvistettiin ja puhdistettu yli vuoden joskin ristiriitoja roolista ARF nucleolar lokalisointi tässä prosessissa [16, 17, 27]. Toisaalta, kuinka tärkeä tämä vuorovaikutus ilmenee havainnosta, että inaktivointi /vapauttaminen p53-MDM2-ARF akseli on ratkaisevan tärkeää kehityksessä eniten ihmisen syövissä. Kiehtovan, MDM2 yliekspressio ja p14ARF menetys korreloi aggressiivisemman fenotyypin ensisijainen ihmisen keuhko- kasvainten taustalla käänteinen suhde kahden ihmisen kasvaimissa [28]. Toisaalta, aikaisemmat havainnot viittasivat kiistanalainen vaikutus MDM2 toimia p14ARF: on osoitettu, että menetys MDM2 voi joko tukahduttaa [29] tai palauta [14] kykyä hiiren p19 ARF aiheuttaa p53-riippumattoman solukierron pysähtymisen . Siten asiayhteydestä riippuen (cellular tyypit, ylävirran signaalit, ekspressiotaso), MDM2 voisi käyttäytyä joko välittäjänä tai estäjä p14ARF toiminnon päälle soluproliferaatiota [28]. Joka tapauksessa, ensimmäinen ”nousu” meidän tapa tarkastella MDM2 /ARF suhde lähtenyt havainto, että lyhyt ARF mutantti (aa2-29) ilmestyi merkittävästi vakiintunut jälkeen hiljentäminen MDM2 tai yliekspressio MDMX (a MDM2 liittyvä, häiritseviä proteiini), mikä johtaa malliin, jossa ARF sitoutumalla MDM2 aiheuttaa, jollakin tavalla, sen itsemurhan koska tuo itse hajoaminen ( ”syyllisyyttä kumppanuuden malli”) [18]. Tutkimuksemme hyvin sovi näiden havaintojen, jotka osoittavat, että MDM2 solunsisäinen kasvu voikin aiheuttaa ARF tuholta proteasomin. Osoitamme, että fyysinen vuorovaikutus ARF ja MDM2 on välttämätön, joskaan ei riittävä, jotta tarkkailla vaikutus, koska ARFT8D mutantti kykenee vuorovaikutuksessa MDM2 [11], mutta ei hajoa. Se, että alue vuorovaikutuksen MDM2 kanssa MDMX (ts nimetön sormi domain) on tarpeeton tämän vaikutuksen viittaa siihen, että todellakin, tämä proteiini ei ole mukana. Toisaalta, havainto, että nimetön sormi /Ubiquitin ligaasilla verkkotunnus MDM2 on tarpeeton vaikuttaa ARF tasolle, viittaa siihen, että vaikka tämä ei virallisesti sulkea pois, ARF ubikitinaa- ei tarvita [8, 9]. Toisaalta, Rodway et ai. [18] oletettu rooli MDM2 välittämisessä ARF toimitettavaksi proteasomin ilman vaatimusta ubikitinaation. Tämä voisi ehkä välittyvän MDM2 suora vuorovaikutus proteasomista [22]. Erityisesti, MDM2 on osoitettu olevan suorassa vuorovaikutuksessa useiden proteasomin alayksiköiden kautta sekä N-terminaaliset ja C-terminaaliset alueet, kun taas sen keskiosa (aa200-300) tulee kohdistaa negatiivinen säätelevä valvontaa sitova [22]. Meidän MDM2 mutantit (MDM2

1-441 ja MDM2Δ

150-230) säilyy ainakin yksi alueista tarvitaan vuorovaikutusta proteasomin ja molemmat kykenevät indusoimaan ARF hajoamista. Kiehtovan, myös tarkkailla tehokkaampi ARF pelkistetty MDM2Δ

150-230 mutantti, josta puuttuu keskustasolle.

Kuten ARF ubikinaa- ei ole suoraan käsitelty tässä tutkimuksessa, emme voi sulje pois väliintuloa ULF [7] tai mitä tahansa muuta vielä tunnistamattomia ubikitiinipromoottori ligaasia havaittu vaikutus. Vaikka ULF välittämä ARF hajoaminen näyttää kohdistuessa nucleoplasm, eri havainnot tässä asiakirjassa osoittavat, että MDM2 vaikutus ilmenee solulimassa. Ensinnäkin mutaatiot sekä ARF ja MDM2 että pakottaa lokalisointi sytoplasmassa, eivät vaikuta MDM2 välittämää ARF hajoamista. Lisäksi Leptomycin B hoito, joka estää MDM2 tumasta, aiheuttaa ARF keskittymisen ja ehkäisee MDM2 hajoaminen vaikutus ARF. Lopuksi immunofluoresenssilla kokeet osoittavat selvästi, että MG132 hoito aiheuttaisi kasvua ARF solulimassa, mikä viittaa vahvasti siihen, että todellakin, miksi ARF ei yleensä havaita tämän subsellulaarisessa asuu nopeammin liikevaihdon.

on huomioitavaa, että koska sen alkuperäisen löytö, ARF kuvattiin vallalla nucleo /nucleolar lokalisointi. Näin ollen on raportoitu, että suojaava rooli ARF tasoilla kohdistuu siinä nucleolus by B23 /NPM. Lisäksi vuorovaikutus Tbp1 joka suojaa ARF peräisin proteasomin hajoamista, esiintyy tumassa [8].

Äskettäin ARF on raportoitu paikallistaa myös sytoplasmassa tosin pääasiassa liittyvät mitokondrioita, koska sen rooli in autophagy [30]. Mielenkiintoista on, että sytoplasminen p14ARF värjäys on kuvattu joidenkin syöpien [28].

Lisäksi olemme hiljattain raportoitu, että aktivoinnin jälkeen PKC, ARF-proteiini on fosforyloitu ja kerääntyy sytoplasmaan [11].

Tässä osoitamme, että aktivointi PKC reitin TPA ehkäisee MDM2 toimintaa pitäen inhibition reitin joko Bisindolylmalemide hoitoon tai PKC-a suunnattu siRNA, aiheuttaa laskua ARF tasoja ja lisää MDM2 välittämän ARF hajoamista. Näin ollen T8D ARF mutantin, joka jäljittelee fosforyloitua tilaa proteiinin, vaikkakin läsnä solulimassa, näyttää olevan vähemmän herkkä MG132 hoitoon ja MDM2 yli-ilmentymisen. Nämä tiedot vahvistavat aiemmat ehdotus, että fosforylaatio kiinnostavuus suojaava vaikutus ARF. Näyttää siltä, ​​että useampi kuin yksi transkription riippumattomien mekanismien osallistuvat säätelyyn ARF proteiinin eli proteasomin välittämän hajoamisen [6-8] ja fosforylaatio.

Kaiken havaintojemme johtaa hypoteesia, että onkogeenisessä ympäristössä joka MDM2 yli-ilmennetään, ARF tasot on pidettävä pienenä johtuen nopeasta liikevaihdon aiheuttama MDM2 laukaisi hajoamista. Lisääntyvä ARF hajoaminen ja /tai fosforylaatio voisi siis olla yhteisiä strategioita, että solu orchestrate viipymättä paeta ARF kasvun hidastuminen toiminnot joko fysiologisia tiloja tai kun solut on pakko lisääntyä aikana syövän etenemisen. Lisäkokeita tarvitaan selvittämään molekyylitason mekanismeja korostaa näistä havainnoista ja niiden merkitystä syövän kehityksen

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Constructs

pcDNARF , 3xFlag ARF

1-65, 3xFlagARF

65-132, ARFΔ

2-14 /82-101 kuvattiin [8]. pcDNAARFT8A ja T8D plasmidit on kuvattu [11]. pCMVMDM2 p-, pCMVMDM2

1-441, pCMVMDM2Δ

150-230 kuvattiin [31].

Soluviljelmät transfektiot

U2OS, H1299, Hela solulinjoja ostettiin Solun Lines Service (CLS).

MEF

p53 – /- MDM2 – /-

solulinja on kuvattu [32]. Kaikki solulinjat kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (Euroclone, Life Science) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% (v /v) CO2 ilmassa.

Solut transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Life Technology) [33] tai RNAiMAX (Life Technology) [34] mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti.

kuvattujen kokeiden kuviossa.