Krooninen sairaus

tiivistelmä

havaitseminen harvinaisia ​​mutantteja käyttäen seuraavan sukupolven sekvensointi on huomattavaa potentiaalia diagnostisiin sovelluksiin . Havaitsemiseksi verenkierrossa kasvain DNA on tärkein Tämän lähestymistavan soveltamista. Suurimmat este sen käytölle on korkea lukea virhemarginaali seuraavan sukupolven sekvenssereitä. Sen sijaan lisäämällä tarkkuutta lopullinen sekvenssit, havaitsimme harvinainen mutaatioita käyttämällä puolijohde- sekvensserin ja joukko poikkeamien ilmaisuun kriteerit perustuvat tilastolliseen malliin lukuvirhe nopeus jokaisessa virhe asemassa. Tilastolliset mallit olivat päätelty sekvenssitiedot normaalista näytteistä. Olemme havainneet, epidermaalisen kasvutekijän reseptori (

EGFR

) mutaatioita plasman DNA keuhkosyöpäpotilaiden. Single-pass syvä sekvensointi ( 100000 lukee) pystyi havaitsemaan yhden aktivoivan mutantti alleeli 10000 normaalissa alleeleista. Me vahvisti, jossa käytetään 22 mahdollisille ja 155 retrospektiivinen näytteitä, enimmäkseen koostuu DNA puhdistettu plasmasta. Ajallinen analyysi ehdotti sovellusmahdollisuuksia tautienhallinnassa ja terapeuttista päätöksenteko valita kasvutekijän reseptori tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI).

Citation: Kukita Y, Uchida J, Oba S, Nishino K, Kumagai T, Taniguchi K, et ai. (2013) Quantitative tunnistaminen Mutanttialleelit Johdettu Lung Cancer in Plasma Cell-Free DNA kautta poikkeamien ilmaisuun käyttäminen Deep Sequencing Data. PLoS ONE 8 (11): e81468. doi: 10,1371 /journal.pone.0081468

Editor: Raya Khanin, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 13 lokakuu 2013; Julkaistu: 21 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Kukita et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Osaka Medical Center for Cancer ja Sydän- ja verisuonitaudit. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

joidenkin molekyylien kohdennettuja lääkkeitä syövän, tutkimisen genomista muutosten kohdegeenien on tullut vianmääritysrutiini ja se on välttämätön hoitopäätöksiä. Esimerkiksi voimakas vaikutus kasvutekijän reseptori tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI, eli gefitinibi ja erlotinibi) ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) korreloivat aktivoivat somaattisia mutaatioita

EGFR

[1,2]. Potilaat, joilla annetaan näitä lääkkeitä valittuna perustuvat läsnäoloa aktivoivia mutaatioita. Tunnistaminen mutaatioista perustuu koepalojen; menettely on invasiivinen ja usein vaikea suorittaa. Ei-invasiivinen diagnostinen menetelmä on toivottavaa.

Cell-free-DNA veressä koostuu DNA on peräisin syövän kudoksista ja sitä on tutkittu ei-invasiivisia diagnostisia menetelmiä [3]. Tämä DNA, nimeltään verenkierrossa kasvaimen DNA (ctDNA), on harvinainen veren, ja sen havaitseminen on tekninen haaste. Useita menetelmiä on tutkittu, mutta useimmat niistä ovat rajoitukset herkkyys ja kestävyys. Säteilevä (helmet, emulsio, vahvistus ja magnetismi) [4] on todennäköisesti herkin menetelmä. Vuonna säteilevä, monistetut PCR-tuotteet yhdestä molekyylistä on kiinnitetty yksi magneettinen helmi käyttäen emulsiota PCR. Mutaation on leimattu fluoresoiva koetin tai primer extension, ja mutatoitu alleeli on kvantitatiivisesti laskemalla fluoresoivasti leimattu helmiä. Beaming menestyksekkäästi kvantitatiivinen

APC

ja

KRAS

mutaatioita ctDNA paksusuolen syövän potilaiden [5,6] ja

EGFR

mutaatioita ctDNA keuhkosyöpäpotilaiden [7] . Huolimatta sen suuri herkkyys ja kvantifiointiin kyky, säteilevä ei ole saavuttanut suosiota, koska se on työläs tekniikka ja vaatii oligonukleotideja kunkin mutaation asemaa.

Koska säteilevä ja seuraavan sukupolven sekvenssereitä, ts massiivisesti rinnakkaisia ​​sekvensseri käyttää samaa tai hyvin samanlainen malli valmistustekniikka, on mahdollista soveltaa seuraavan sukupolven sekvensserit samaan tarkoitukseen. On ollut useita tutkimuksia syvä sekvensointi soluttoman DNA [8,9]. Nämä tutkimukset ehdotti mahdollisuutta lähestymistavan mutta puuttui kriittinen arviointi havaitsemisjärjestelmä. Erityisesti ne eivät puututtava useiden testaus, joka on luonnostaan ​​diagnostisia sovelluksia.

Tässä raportissa perustimme menetelmän kehittämiseen

EGFR

mutaatioita ctDNA perifeerisessä veressä keuhkosyöpäpotilaiden kerta-pass syvä sekvensointi monistettua

EGFR

fragmentteja . Viimeaikainen kehitys puolijohde sekvensserin (Ion Torrent PGM) [10] on osoittanut puutteita muihin tällä hetkellä saatavana sekvenssereitä (ts pitkä runtime yhden määrityksen ja korkeat käyttökustannukset) ja soveltuu diagnostisiin tarkoituksiin. Käytimme poikkeamien ilmaisuun [11,12] ja määrittää joukon tunnistus kriteerit perustuvat tilastolliseen malliin lukuvirhe nopeus jokaisessa virhe asemassa. Menetelmä kvantitatiivisesti

EGFR

mutaatiot soluttomissa DNA tasolle verrattavissa säteilevä, lupaavia ei-invasiivisia diagnostiikka, jotka täydentävät koepala.

Tulokset

periaate havaitseminen

Deep sekvensointi PCR-monistettu fragmentti, joka sisältää mutaation voidaan suorittaa havaitsemiseksi ja kvantitoimiseksi mutatoituja alleeleja joukossa valtavia määriä normaalien alleelien peräisin isännän kudoksiin. Suurimpana ongelmana liittyvä tässä lähestymistavassa on virheiden aikana käyttöön sekvensointi ja PCR-monistuksen. Keskeinen kysymys on asetus ja tarkan arvioinnin toteamisrajoihin. Kun taajuus emäksen muutos tavoite lokuksessa on suurempi kuin ennalta määrätty lukemaan error rate (RER), voimme arvioida muutos johtua sellaisen mutantin läsnä ollessa sekvenssin. Eli poikkeamia, jotka putoavat merkittävästi ulkopuolelle RER jakelun pidetään mutaatioita. RER määritellään virheprosentti lasketaan lopulliset järjestyksessä, mukaan lukien virheet sekä sekvensointi ja PCR vaiheita. Vuonna poikkeamien ilmaisuun [11,12], kuten hypoteesin testaukseen, vääriä positiivisia ohjataan perustuvat tilastolliseen malliin. Meidän tapauksessamme, tilastollisen mallin RER voidaan rakentaa järjestyksessä dataa kohdealueilla riittävä määrä normaalien yksilöiden kuljettaa mitään mutaatioita.

Jos lukuvirheitä esiintyä todennäköisyysjakauman määrä lukee tarvitaan saavuttamaan tietty havaitsemisraja voidaan arvioida. Kuvassa 1a on esitetty suhde mutaation määritysrajan, lukea syvyyttä, ja RER merkitsevyystasolla p = 2×10

-5 kunkin havaitsemiseen ilman moninaisuus korjausta, olettaen että lukuvirheitä seuraisivatkin Poisson jakauma. Tiedot on esitetty kuviossa 1a toimitetaan taulukossa S1. Jossa on yhä luku- syvyyden ja vähentämällä RER, määritysrajan pienenee. Aiemmassa tutkimuksessa ryhmämme [7], detektioraja harvinaisia ​​Mutanttialleelit käytettäessä säteilevä [4] oli 1 10000 (0,01%). Koska plasma-DNA-määritys näyte sisältää noin 5000 molekyylejä, tämä havaitsemisraja on kohtuullinen. Tämä tavoite voidaan saavuttaa 100000 lukee kun RER on alle 0,01%.

a, suhde luku- virhemäärä, lukea syvyyttä, ja toteamisraja mutaatioiden kun merkitsevyystaso on p = 2×10

-5. Vaaka-akseli, lukea syvyys; pystysuora akseli, detektioraja (%). Ylhäältä alas, jokainen rivi ilmaisee luku- virheprosentti (RER) 1%, 0,2%, 0,05% tai 0,01%. b, Kolmiulotteinen esitys korvaaminen RER. x-akseli, emäskohdissa EGFR eksonien 19-21. Vasemmalta oikealle, nuolilla osoittavat kantojen T790M, L858R, ja L861Q. y-akseli, 48 DNA-näytteet terveillä henkilöillä. Edestä taaksepäin, muunneta A (vihreä), C (keltainen), G (magenta), tai T (sininen) ovat linjassa kunkin näytteen. z-akselin, RER (%). c, Kolmiulotteinen esitys lisäyskohdan /poisto virhe. x-akseli, emäskohdissa EGFR eksonien 19-21. Palkki osoittaa aseman eksonin 19 poisto. y-akseli, 48 DNA-näytteet terveillä henkilöillä. Sininen, plasma-DNA; vaaleansininen, WBC DNA (suuri määrä); tummansininen, WBC DNA (pieni määrä). z-akselin, RER (%). d, jakelu RER. Valkoinen pylväs, korvaaminen virhe; harmaa pylväs, lisäys /poisto virhe. Vaaka-akseli, erilaisia ​​RER (%); pystysuora akseli, esiintyvyys (%).

Lue virhe

EGFR

kohdealueen

EGFR-TKI hoitoa, aktivoiva

EGFR

mutaatio on osoitus hoidon tehokkuudesta [ ,,,0],1,2]. Potilaita annetaan näitä lääkkeitä valittuna perustuvat läsnäoloa aktivoivia mutaatioita. Sen lisäksi, että aktivoimalla

EGFR

mutaatioita, vastustuskykyisen

EGFR

mutaatio tunnetaan T790M tulee noin puolet potilaista altistetaan EGFR-TKI hoitoon [13,14]. Siten kolme aktivoivat mutaatiot, eli deleetio

EGFR

eksonin 19 ja L858R ja L861Q on

EGFR

eksonin 21, samoin kuin T790M resistenttejä mutaatio

EGFR

eksoni 20 valittiin kohde loci.

Selvitimme RERS on 169 emäksen alueen ympärille tavoite loci koostuu suorittamalla syvä sekvensoimalla DNA-näytteet terveillä henkilöillä. Käytimme Ion Torrent PGM [10] sekvensseri tähän työhön. Single-pass sekvensointi suoritettiin, ja määrä lukee vaihteli 44400 ja 373000, keskimäärin 162000. Käytimme kolme DNA-näytteet: 19 plasma-DNA-näytteiden määrä on verrattavissa potilaiden näytteitä, 16 leukosyyttien (valkoisten verisolujen, WBC) DNA-näytteiden määrät, jotka olivat 10 tai 50 kertaa suurempi kuin potilaan näytteestä, ja 13 WBC DNA näytteiden määrät, jotka olivat yksi kymmenesosa koko potilaan näytteestä. Olemme jaettu vaihdosta virheitä neljään kuvioita, jotka vastaavat muuntaminen A, C, G, tai T. Näin ollen, oli 507 erityyppisistä substituutioita (169 emäsasemissa x 3 kuvioita) kohdealueen. Korvaushoidon RER on graafisesti kuvassa 1b ilman muuntaminen G: stä A asemassa 2361 johtuu usein SNP. Vaihdosta RERS eivät ole yhdenmukaisia, eivätkä ne riippumattomia toisistaan, ja korkea RERS liittyy erityisiä pohja kantoja. Lisäksi yksi substitutiomalli on hallitseva kussakin perusasento. Insertio /deleetio RER on graafisesti esitetty kuviossa 1c. Emme eroa deleetion ja insertion virheitä, kuten insertioita usein tunnustettu poistot ja päinvastoin jonka sekvenssirinnastukseen ohjelmisto. Lisäämällä /poisto RER on yleensä korkeampi kuin korvaaminen RER. Suuntaus on samanlainen kuin korvaaminen havaitaan, että korkea lisäys /poisto RERS liittyy erityisiä pohja kantoja. Kuvassa 1 d on esitetty jakauma osavalmistajien. Oli huomattavia eroja korvaaminen ja lisäys /poisto osavalmistajien. Vuonna 410 ulos mahdollisen 506 tyypit korvaaminen (81,0%), RER oli pienempi kuin 0,01%. Sen sijaan ulos 169 tyyppisiä insertioita /poisto, RER oli pienempi kuin 0,01% vain 79 (46,7%). Nämä tulokset sopinut aiemmin raportoitu havaintoja PGM alustan [15]. Tiedot kuvioissa 1 b ja 1 c toimitetaan taulukoissa S2 ja S3, vastaavasti.

Suuren lisäys /poisto lukuvirheitä, käytimme erityistä menetelmää havaitsemaan eksonin 19 deleetiomutaatioiksi. Valmistimme kahdeksan mallia eksonin 19 sekvenssejä edustava deleetioita ja seulottu deleetiosekvenssien yhdistämällä ne mallin sekvenssit. Tämä menetelmä oli varsin tehokas seulomaan lukuvirheistä; no sekvenssit poistetaan lukuvirheitä havaittiin joukosta 48 testatussa.

Statistical malleja lukuvirhe hinnat ja kriteerit poikkeamien ilmaisuun

tutki tilastollisia malleja lukuvirhe. Vuonna Poisson jakauma malli, keskimääräinen ja varianssi määrän ilmaantuvuus odotetaan olevan sama ja määritetään intensiteetti parametri

lambda

. Täällä sen sijaan käyttää RER, lukuvirhe esiintyvyys esiteltiin ilmaantuvuus 100000 lukee, ja sen keskiarvo ja varianssi kussakin perusasento laskettiin. Väliset suhteet keskiarvon ja varianssi on esitetty kuvassa 2a ja kuvio S1 File S1 korvaamisesta ja lisäys /poisto lukuvirheitä, vastaavasti. Molemmissa tapauksissa varianssi tulee suuremmaksi kuin keskimäärin huomattava osa tapauksista. Näissä tapauksissa soveltaminen Poisson-jakauman lisäisi määrä vääriä positiivisia. Tämä ilmiö, jota kutsutaan ”overdispersion”, on yleinen biologisia tutkimuksia, ja tällaisissa tapauksissa kielteinen binomijakauman sovelletaan [16]. Overdispersion johtuu vaihteluista intensiteetin parametrin, ja se on järkevää olettaa, että intensiteetti parametri seuraa gammajakauman. Tässä skenaariossa ilmaantuvuus numero teoriassa seuraa negatiivisen binomijakauman. Kuvassa 2b, kasvu kynnyksen korvaavien Poisson negatiiviseen binomijakauman piirretään varianssia /keskimääräinen suhde lukuvirhe korvaamisesta tyyppejä, joiden varianssi /keskimääräinen suhde vaihteli 1 2. Kun suhde ylitti noin 1,2-1,4, oli kasvanut huomattavasti kynnystä. Niinpä rakensimme tilastollisen mallin kunkin korvaavien seuraavat kriteerit.

a, suhde keskiarvon ja varianssi korvaavien virhe esitetään määrä per 100000 lukee. Vaaka-akseli, keskiarvo; pystysuora akseli, varianssi. Punainen viiva ilmaisee, missä keskimääräinen ja varianssi ovat samat. b, erotus kynnysarvot lasketaan negatiivinen binomijakauman ja Poisson jakauma. Kynnys on vähimmäismäärä emäsmuutokset 100000 lukee täyttävät tilastollisen merkitsevyyden (p-0.01). Vaaka-akseli, varianssi /keskimääräinen suhde korvaaminen lukuvirhe; pystyakselilla, ero kynnysarvot. Tyyppisiä substituutioita, joiden varianssi /keskimääräinen suhde vaihteli 1-2 piirretään. c tarkkuus määrällinen. Kukin tietopiste edustaa keskimäärin kolme määrityksissä. Vaaka-akseli, osa Mutanttialleelit keinotekoisten tuotteet; pystysuora akseli, osa Mutanttialleelit arvioitiin syvä sekvensointi. d, toistettavuus määrällinen. Vaaka-akseli, pohja muutoksen määrä ensimmäisessä oikeudenkäynnissä; pystysuora akseli, pohja muutoksen määrä toisessa tutkimuksessa.

1. Kun keskimääräinen lukuvirhe 100000 lukee oli alle 1, Poisson jakauman λ asetettu 1 levitettiin (169 tyyppiset vaihdot).

2. Kun keskiarvo on suurempi kuin 1 ja varianssi /keskimääräinen suhde lukuvirhe oli vähemmän kuin 1,2, joka on Poisson-jakauma on sovellettu (15 eri substituutioita).

3. Kun keskiarvo on suurempi kuin 1 ja varianssi /keskimääräinen suhde lukuvirhe oli suurempi kuin 1,2, negatiivinen binomijakauman levitettiin (323 tyyppisiä substituutioita).

eksoni 19 poisto ja L858R kuului ensimmäiseen luokkaan, kun taas L861Q ja T790M mutaatio sivustoja kuului toisen ja kolmannen luokkia, vastaavasti. Toteamisrajat eksoni 19 poisto ja L858R, L861Q, ja T790M korvaaminen mutaatiot merkitsevyystasolla p = 2×10

-5 olivat alle 0,01% ja alle 0,01%, 0,01% ja 0,05%, tässä järjestyksessä . Seuraavassa analyysissä käytimme p = 2×10

-5 merkittävyyttä kynnyksen kunkin yksittäisen havaitsemiseen, ottamatta huomioon lukuisia korjaus, odottaa yksi väärä positiivinen 50000 näytettä.

ääriviivat Menetelmän on 1) monistus

EGFR

fragmentteja eksoni alukkeilla plasmasta DNA; 2) syvä sekvensointi

EGFR

fragmenttien kanssa PGM ( 100000 lukee /fragmentti), yhdistämällä PCR-tuotteet; 3) vastaa lähtö sekvenssit

EGFR

mallin sekvenssit; 4) havaitseminen deleetiot ja substituutiot, ja muuntaminen tapahtumien lukumäärä tuohon 100000 lukee; ja 5) arviointi emäsmuutoksista kanssa poikkeamien ilmaisuun kriteerit. Vuonna poikkeamien ilmaisuun, pohja muutokset arvostellaan mutaatioita, kun tapahtumien määrä on 100000 lukee on yhtä suuri tai suurempi kuin raja-arvon (eksoni 19 poistetaan, 7, L858R, 7, L861Q, 12, T790M, 60). Kaavamainen esitys on kuvassa S2 File S1.

Quantitativity ja toistettavuus

Ensimmäinen, selvitimme menetelmän kvantifiointia kyky. Valmistimme testinäytteet kuten erilaisia ​​murto PCR mutatoitujen

EGFR

fragmentteja. Oli erittäin hyvä lineaarisuus (

r

= 0,998) välillä ympätty määrät PCR-tuotteiden ja havaitun mutantti-to-normaalin alleelin suhteet päätellä syvä sekvensointi (kuva 2c). Sitten tutkittiin toistettavuus menetelmän avulla plasmanäytteet keuhkosyöpään potilailla, joiden ensisijainen vaurioita vahvistettiin kuljettaa aktivoivia mutaatioita. Fraktiot, ja mutanttialleelit mitattiin kahdessa tutkimuksessa on esitetty kuvassa 2d. Korkea vastaavuutta (

r

= 0,989) havaittiin, paitsi näytteissä, jotka sisälsivät pieniä määriä Mutanttialleelit, mikä vastaa noin 0,3% osa alleelien läsnä tai vähemmän. Näissä tapauksissa ensimmäinen vaihe PCR-monistus oli todennäköisesti onnistu, koska pieniä määriä mutantti-malleja, arviolta 15: sta tai vähemmän. Siten määritysrajan oli noin 0,3%.

Validation näytteiden kanssa keuhkosyöpäpotilaita

lisäksi arvioitiin myös menetelmää käytetään keuhkosyövän kudosnäytteistä, näytteenotto plasma DNA ja primäärivamma samanaikaisesti osana tulevaisuutta koskeva tutkimus. Tulokset näytteet 22 potilailla havaittiin 86% konkordanssin (95% luottamusväli, 66-95), 78% (44-93) herkkyys, ja 92% (66-98) spesifisyys, asettamalla kudosbiopsia- standardina. Nämä tulokset ovat lupaavia suhteen kehittymistä diagnoosivälineenä täydentää keuhkosyöpä koepala.

analysoitiin yhteensä 155 näytettä: 144 näytettä plasmasta kahdeksan päässä aivo-selkäydinnesteestä, ja yksi virtsasta, pleuraeffuusio, ja keuhkoputkien alveolaarinen huuhtelu. Kuten plasmanäytteet, kaksi tai useampia näytteitä saatiin 32 potilasta eri ajankohtina sairauden kurssien. Kaikki saadut tulokset on esitetty taulukossa S4. Kliiniset tiedot potilaista kuten vaiheessa histologia, käsittely, ja asema vastustuskyvyn EGFR-TKI on myös lueteltu tässä taulukossa. Niistä 33 potilasta, jotka liittyvät ensisijaisen vaurio, joka sisältää eksonin 19 deleetio, tämä mutaatio havaittiin ainakin yksi plasmanäytteistä 24 potilasta (72,7%). 23: potilaat, jonka ensisijainen leesiot osoitti L858R tai L861Q substituutiot, nämä mutaatiot löydettiin vähintään yksi plasmanäytteistä 18 potilasta (78,2%). Kaksinkertainen mutaatio (samanaikainen havaitseminen eksonin 19 poistetaan ja L858R) havaittiin 12 plasmanäytteissä, vaikka kaksinkertainen mutaatiot eivät ole yleisiä biopsianäytteissä. Eroja aktivointi mutaatio tyypit yksilöity koepala ja plasman DNA-näytteet havaittiin viidessä plasmanäytteistä. T790M löytyi 13 ulos 57 plasmanäytteistä (22,8%) potilaista, joilla EGFR-TKI vastus ja 7 ulos 87 plasmanäytteistä (8,0%) ilman EGFR-TKI vastarintaa.

ajallinen muutokset

EGFR

mutaatio tasoja aikana taudinkulku

Huomattava määrä näytteitä kerättiin samasta potilaasta eri ajankohtina vuonna taudinkulku. Ajalliset muutokset

EGFR

mutaatio plasmassa DNA potilailla, joilla on kolme tai useampia näytteitä on kaavamaisesti esitetty kuviossa 3. Johtuen suhteellisen lyhyen näytteenoton ajan, näytteet saatiin vain osa taudin kulkua useimmissa tapauksissa . Me keskityttiin kahteen siirtymiä: siirtyminen johtuu EGFR-TKI hoidon aloittamista ja että hankittuaan EGFR-TKI vastarintaa. Tiedot ennen hoidon aloittamista saatiin kuudessa tapauksessa. Merkittävä väheneminen aktivoinnissa mutaation tasoilla hoito nähtiin kaikissa tapauksissa (p = 1.7×10

-4). Puhdistuma ctDNA käsittelemällä aloittamisesta on yleinen ilmiö.

Jokainen piste edustaa aikapisteessä näytteenotto. Kaaviossa ei ole tarkka esitys aikataulu, ja vain järjestys pisteitä on voimassa tietoja. Luvut edustavat

EGFR

mutaatiot 10000 järjestyksessä lukee: musta, eksoni 19 poisto; sininen, L858R; punainen, T790M. Vain luvut Ylityksestä näkyvät. ”Mutaatio tyyppi” osoittaa, että biopsianäytteissä.

Tiedot saatiin sekä ennen hankkimalla EGFR-TKI vastus seitsemässä tapauksessa. Hankittuaan vastus, aktivointi mutaatio oli kasvanut viidestä potilaasta (218, 226, 259, 61, 66), vähentynyt yhdellä potilaalla (44), ja lisääntynyt viive toisen potilaan (178). Lisäys aktivoinnista mutaatiot voivat korreloida sairauden etenemistä. Huolimatta selkeä korrelaatio T790M ja EGFR-TKI-resistenssitilanteessa edellä validointitutkimuksella dynamiikkaa T790M aikana taudinkulku ei ollut yhtä selvä kuin aktivointi mutaatioiden; T790M usein kuultavana hankkia vastarintaa.

Kolme potilasta on kuvattu tarkemmin. Potilas 226 käsiteltiin gefitinibin ensilinjan kemoterapiaa. Gefitinibin hoito lopetettiin useita kertoja haittavaikutusten vuoksi. Radiologinen vaste (osittainen vaste, PR) havaittiin alkaen kuukausi 1 kk 9, ja taudin etenemistä havaittiin kuukauden 10. Ennen gefitinibin hoitoa, osa mutantti alleeli oli erittäin korkea ( 50%), mutta sen jälkeen vain yksi viikko tämän hoidon, osa mutanttialleelin laski 0,3%, ennen mitään radiologisia muutoksia (Kuva S3a File S1). T790M ilmestyi 10 kuukautta, kun tauti eteni alkoi. Potilaan 243 oli myös vino lasku mutantti alleeli jae aloitettaessa gefitinibin hoidon (Kuva S3b File S1). Tämä potilasta hoidettiin leikkauksella ja adjuvanttihoitoa (CDDP plus VNR) aiemmin, ja sen jälkeen niille gefitinibi. Potilas 41 esitetään etenemisen neoplastisen meningiitin, ja alistettiin yhdistettiin erlotinibiin-pemetreksedihoito. Edellinen hoidot olivat CDDP plus gemicitabine, gefitinibi, ja erlotinibi. Pieni radiologisia vaste havaittiin kuukausista yksi-neljä, ja sairauden eteneminen tapahtui myöhemmin. Oli vinossa lasku mutantti alleeli jae alussa hoidon ja lisääntyisi taudin etenemiseen oli vain vähäistä (kuvio S3C File S1). On huomattava, että vasteen on ctDNA EGFR-TKI hoidon aloittamisesta oli nopeaa kaikissa kolmessa tapauksessa (potilas 229, yhteen viikkoon 243, toinen viikko; 41, kuukausi).

Mutaatio tunnistus koko kohdealueen

tutkitaan mahdollisuuksia yksilöidä korvaaminen mutaatioita koko kohde

EGFR

alue, joka vastaa 503 tyyppisiä vaihtoja lukuun ottamatta L858R, L861Q ja T790M. Koska merkitys asetettiin arvoon p = 2×10

-5 kullekin havaitsemista, vääriä positiivisia odotettiin näkyvän kerran 100 näytettä. Todellisuudessa, jonka mediaani oli kolme substituutioita havaittiin näytettä kohti. Jakelun määrä substituutioita näytettä kohden, on esitetty kuviossa 4a. Perustuen saatujen kokemusten koepalanäytteistä, useimmat näistä substituutioista oli todennäköisesti vääriä positiivisia. Huomattava osa erityyppisten vaihdot esitetään vääriä hälytyksiä (56,2%, kuva 4b), ja tilastolliset mallit olivat käytännössä tämäntyyppisten vaihdot. Toisille parametrin arvio siitä tietoja 48 normaaleista yksilöistä ei ollut riittävän konservatiivinen poissulkemista vääriä positiivisia.

a, jakelu määrä erilaisia ​​vaihtoja arvostellaan mutaatioita näytettä kohti. Vaaka-akseli, useita tyyppisiä vaihdot; pystyakseli, näytteiden lukumäärä. b, jakelu määrä näytteitä vaihtamaan tyyppi arvostellaan mutaatio. Vaaka-akseli, näytteiden määrä kanssa vaihtamaan tyyppi arvostellaan mutaatio; pystyakseli, joukko tyyppisiä substituutioita.

Keskustelu

Rare mutaation havaitsemisen kohde loci syvässä sekvensointi plasma soluttoman DNA on verrattavissa herkkyys säteili. Spesifisyys on myös hyväksyttävissä, koska

EGFR

mutaatio tyyppejä koepala ja plasman näytteet omasivat korkean aloista. Siten harvinainen mutaatio tunnistus syvä sekvensointi on nyt saavuttanut riittävän tason edetä vahvistuksen kautta tulevaisuutta koskeva tutkimus. Menetelmää voidaan soveltaa rajoitettua määrää kohde lokusten tahansa pohja asemassa; käyttämällä paria päähän menetelmää tai sekvensoimalla vastakkaisesta suunnasta lisäisi tarkkuutta korkea virheprosentti kantoja, kasvaa herkkyys ja hyväksyttävälle tasolle.

on kuitenkin vaikeaa laajentaa mutaation havaitseminen suuremman alueen. Väärien positiivisten ei ole hyväksyttävää diagnostisiin sovelluksiin. Parametrien estimointi lisääntynyt määrä normaalia näytteiden ja /tai enemmän konservatiivinen arviointimenetelmiä, kuten Bayes päättely, saattaa vähentää vääriä positiivisia. Käytimme mutaatioton DNA normaalista yksilöiden todettujen lukuvirhe, mutta mutaation havaitseminen suoritettiin plasman DNA keuhkosyöpäpotilaita. Mahdollinen syy riittämätöntä raja-arvot voivat olla erilainen DNA laatua. Äskettäin löytyneen keinotekoista mutaatiot koe-prosesseissa [17] ehdottaa mahdollisuutta vielä tuntemattomien syiden esineitä käyttäen plasmanäytteistä.

menettely on optimoitu tavoitteemme ja sosiaalinen ympäristö, mutta varaa on teknisiä parannuksia. Sen lisäksi, että pariksi-end menetelmä [9], menetelmiä valmistaa virheettömiä käy läpi toistuvan sekvensointi malleja yhdestä molekyylistä [18,19] olisi sovellettavissa parantaa tarkkuutta. Meillä työskentelee pieniä määriä plasmaa DNA PCR-monistamiseen johtuen eettisiä standardeja meidän sairaalassa ja asianomaisten alueellisten sairaaloissa. Kuitenkin eri sosiaalinen ympäristö, käyttäen lisääntynyt määrä plasman DNA voi parantaa toistettavuutta havaitsemista matalan tason mutaatioita.

Sen lisäksi, että käytetään ei-invasiivisia diagnoosi

EGFR

mutaatiot, kuten on esitetty edellä ajallinen analyysit, tämä menetelmä on myös informatiivinen selvittämiseksi dynamiikkaa mutanttialleelit aikana taudin. Erityisesti on huomattava, että vinossa lasku mutanttialleelin osa edeltää radiologisia muutoksia, jotka todennäköisesti käyttökelpoinen ennusteen lääkkeen tehoa.

Koepalat edenneiden ja toistuva koepaloja ovat teknisesti vaativia, ja korvaaminen ei-invasiivinen menetelmä olisi hyödyllistä. Tässä yhteydessä seuranta T790M meidän menetelmällä olisi huomattavia etuja potilaan hoitoon. Esimerkiksi havaitsemiseksi T790M mutaation verinäytteistä olisi hyödyllistä potilasvalintaa hoitoon uusilla EGFR-TKI keuhkojen syöpiä, jotka ovat vastustuskykyisiä gefitinibin ja erlotinibin [20].

Viimeaikaiset kaksi tutkimusta ehdottaa muita mahdollisuuksia ctDNA analyysi. Dawson et ai. seurasi dynamiikkaa ctDNA metastasoituneen rintasyöpäpotilailla käyttäen mutaatiot

TP53

ja /tai

PIK3CA

, ja löysi sen asiasisältöä seurannassa taudin etenemiseen [21]. Käytetään yhteisiä mutaatiot voivat mahdollistaa sen soveltaminen erilaisia ​​kasvaimia. Päinvastoin, meidän tutkimus keskittyy tarkempi, eli mutaation havaitseminen terapeuttista päätöksentekoon, vaikka meidän menetelmää voidaan soveltaa myös niiden tarkoitukseen. Murtaza et ai. suoritetaan exome sekvensointi käyttäen plasmaa DNA syöpäpotilailla [22], Analyysi syövän genomien missään vaiheessa taudin tietenkin saattaa paljastaa geneettisiä muutoksia, joka johtaa sairauden etenemiseen tai lääkeresistenssi. Analyysi ctDNA on syvällinen arvo tieteen ja diagnostisten osa syöpätutkimukseen.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasominaisuudet

Potilaat, joilla on aktivoivia EGFR mutaatioita kasvainkudoksissa rekrytoitiin Osaka Medical Center for Cancer ja Sydän- ja verisuonitaudit. Pleuraneste, aivo-selkäydinnesteestä ja /tai virtsaa kerättiin joillakin potilailla. Kaikki potilaat, aktivoimalla

EGFR

mutaatioita havaittiin biopsianäytteissä käyttäen PNA-LNA PCR puristin menetelmä [23]. Hoitovasteen ja taudin etenemiseen pääosin arvioitiin radiologisia tiedot perustuvat RECIST kriteerien [24].

DNA uutetaan nestemäisiä näytteitä

Plasma valmistettiin sentrifugoimalla 4-5 ml EDTA-käsitellyn veren 800

g

10 min huoneen lämpötilassa. Plasma siirrettiin uuteen putkeen ja uudelleen sentrifugoitiin 15100

g

10 min huoneen lämpötilassa. Sentrifugoinnin jälkeen ylempi plasma siirrettiin uuteen putkeen. Pleuranesteeseen ja virtsanäytteet sentrifugoitiin 800

g

10 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja supernatantit siirrettiin uusiin putkiin. Lingotaan nestemäistä näytteet pakastettiin -80 ° C: ssa, kunnes DNA: n uuttaminen. Selkäydinneste jäädytettiin ilman sentrifugointia. DNA uutettiin 1,5-2,0 ml nestemäistä näytettä (tai 5 ml virtsaa) käyttäen QIAamp kiertävän nukleiinihappo (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA: n konsentraatio määritettiin mittaamalla kopioluvun LINE-1 [25], tai käyttämällä Qubit ssDNA Assay Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

Amplicon kirjaston rakentaminen ja syvä sekvensointi

Yhdistelmät kirjaston rakentamiseen.

monistamiseksi kohdealueita on

EGFR

geeni, PCR paria suunniteltiin Primer3 (https://frodo.wi.mit.edu/). Alukeparia on 5-nt indeksit (syrjiä henkilöä) ja adapteri sekvenssit puolijohde-sekvensointi. Kannat PCR-kohdealueiden ja alukesekvenssit on esitetty taulukossa S5. PCR-monistus suoritettiin 50 ul: ssa reaktioseosta, joka sisältää plasmaa DNA: ta saadaan 300 ui plasmaa (10 ng tai enemmän), 20 pmol kutakin alukkeista ja 1 yksikkö KOD -Plus- DNA-polymeraasia (Toyobo, Osaka, Japani). Analysoida lukuvirhe, käytimme genomista DNA: ta plasmasta tai leukosyyttien terveistä yksilöistä PCR-templaattina. Pyöräily profiili oli seuraava: 2 min 94 ° C: ssa alkudenaturaation, jota seurasi 40 sykliä, joissa 15 sekuntia 94 ° C: ssa denaturoinnin, 30 sekuntia 55 ° C: ssa kuumennuksen ja 50 sekuntia 68 ° C: ssa pidennystä.