Krooninen sairaus

tiivistelmä

Telmisartaani, angiotensiini II -reseptorin tyypin 1 esto, käytetään usein kuin antihypertension huume, ja se on myös tunnettu kuin peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori-gamma (PPARy) ligandia. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli valaista antituumorivaikutukset telmisartaani endometriumin syöpäsoluja. Olemme käsiteltiin kolme kohdun limakalvon syövän solulinjoissa erilaisilla pitoisuuksilla telmisartaanin, ja olemme tutkineet vaikutuksia telmisartaani soluproliferaatioon, apoptoosin, ja niihin liittyviä mittauksia in vitro. Olemme myös antaa telmisartaanin nude-hiiriin kokeellisia kasvaimia määrittää sen in vivo vaikutukset ja myrkyllisyys. Kaikki kolme kohdun limakalvon syöpä solulinjoja olivat herkkiä kasvua estävä vaikutus telmisartaanin. Apoptoosin vahvistettiin konsertti muuttunutta geenien ilmentymistä ja proteiinien, jotka liittyvät apoptoosin. Havaitsimme myös, että DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t) indusoitiin HHUA (ihmisen kohdun limakalvon syöpä) soluja telmisartaani hoitoa. Lisäksi kokeissa nude-hiirissä osoitti, että telmisartaani merkitsevästi esti ihmisen kohdun limakalvon kasvaimen kasvua, ilman myrkyllisiä sivuvaikutuksia. Tuloksemme viittaavat siihen, että telmisartaani saattaa olla uusi hoitovaihtoehto hoitoon kohdun limakalvon syöpiä.

Citation: Koyama N, Nishida Y, Ishii T, Yoshida T, Furukawa Y, Narahara H (2014) Telmisartaani indusoi kasvunestomenetelmää DNA Double-Strand Tauot ja apoptoosi ihmisen kohdun limakalvon syöpä solut. PLoS ONE 9 (3): e93050. doi: 10,1371 /journal.pone.0093050

Editor: Eric Asselin, University of Quebec Trois-Rivieres, Kanada

vastaanotettu: 30 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 28 helmikuu 2014; Julkaistu 25 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Koyama et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Research Fund harkinnan presidentin, Oita University (HN). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpiä ovat yleisimpiä pahanlaatuisia kasvaimia naisen sukuelimet, ja niiden esiintyvyys on lisääntynyt viime vuosina [1], [2]. Kuitenkin etsiä tekijöille tehokkaita hoidettaessa levinnyttä ja toistuva kohdun limakalvon syöpien on ollut pettymys [2], [3]. Innovatiivisia lähestymistapoja tarvitaan siis hoitoon kohdun limakalvon syöpä.

ydin- hormonireseptori peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori-gamma (PPARy) ja sen ligandien indusoida apoptoosia useita erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien kohdun limakalvon syöpä [4] – [6]. Telmisartaani on angiotensiini II -reseptorin tyypin 1 (AT1R) estäjä (ARB), joka on laajalti käytössä verenpainetta alentavana lääkkeenä. Benson et ai. raportoitu rakenteellinen samankaltaisuus telmisartaania ja pioglitatsonin, joka on PPAR-ligandin [7]. Telmisartaani toimii osittaisena agonistina PPARy ligandin, aktivoimalla reseptorin 25% -30%: n enimmäistaso saavutetaan täysagonisteja pioglitatsonin ja resiglitazone, jossa telmisartaani toimii itsenäisesti kautta AT1R vuorovaikutus [7]. Telmisartaani on raportoitu olevan antiproliferatiivinen aktiivisuus eturauhasen syöpä ja munuaissyöpä [8] – [10]. Vaikutus telmisartaani gynecologic syöpäsolut ei ole vielä tutkittu.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli paljastaa, ensimmäistä kertaa, biologiset ja terapeuttiset Telmisartaanin vaikutusta kohdun limakalvon syöpä. Tutkimme, onko tämä yhdiste voi välittää soluproliferaation inhibointi ja apoptoosin induktio kohdun limakalvon syövän solulinjoissa. Me tutkimme, DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t) indusoituvat HHUA (ihmisen kohdun limakalvon syöpä) soluja telmisartaani hoitoa. Testasimme myös kyky telmisartaanin inhiboimaan HHUA soluihin in vivo, käyttäen nude-hiirimallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

HHUA ihmisen kohdun limakalvon tasyöpäsolulinja saatiin riken (Ibaraki, Japani). Ishikawa ihmisen kohdun limakalvon syöpä noomasolulinjasta Dr. Masato Nishida (Tsukuba yliopisto, Ibaraki, Japani) [11] – [13]. HEC-59 ihmisen kohdun limakalvon syövän solulinja, ja normaalin aikuisen ihmisen ihon fibroblastisolulinjaa saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HHUA, Ishikawa, HEC-59-soluja ylläpidettiin yksikerrosviljelminä 37 ° C: ssa, 5% CO

2 /ilma Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM, Gibco, Rockville, MD). Normaali aikuisen ihmisen ihon fibroblastien soluja ylläpidettiin yksikerrosviljelminä minimum essential media (MEM; Invitrogen, Carlsbad, CA) on sama ehto edellä kuvatulla tavalla. Kaikki solut on lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, Omega, Tarzana, CA).

Chemicals

telmisartaani, kandesartaani, losartaani ja valsartaani saatiin LKT Laboratories (St . Paul, MN, USA), ja valmistettu, kuten 10 mg /ml kantaliuokset dimetyylisulfoksidiin (DMSO). GW9662 ja troglitatsoni saatiin Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). GW9662 valmistettiin 5 mg /ml kantaliuosta dimetyyliformamidissa. Troglitatsoni valmistettiin 10 mg /ml kantaliuoksesta DMSO: ssa. Kantaliuokset varastoitiin kuten erinä -20 ° C: ssa.

Arvio Cell Proliferation ja elinkykyyn

Solulisääntyminen ja elinkelpoisuus määritettiin 96-kuoppalevyillä modifioidulla metyylitiatsol tetrazolium (MTT ) määritys käyttäen WST-1 (Roche Diagnostics, Penzberg, Saksa) valmistajan protokollaa. Olemme ympättiin 5 x 10

3-soluja DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisille, tasapohjaisille mikrolevylle (Corning, New York, NY) ja inkuboitiin niitä yön yli. Sitten väliaine poistettiin ja soluja inkuboitiin 48 h 100 ui koe-elatusainetta, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia telmisartaanin, kandesartaani, losartaani ja valsartaani. Sen jälkeen 10 ui WST-1 väriaine lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin edelleen 2 h. Kaikki kokeet suoritettiin, kun läsnä oli 10% FBS: ää. Soluproliferaatiota arvioitiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä. Viittaus aallonpituus oli 620 nm. Tiedot laskettiin suhteena saatuja arvoja telmisartaanikomponentti käsiteltyjä soluja kuin ne, käsittelemättömien kontrollien.

syöpää ehkäisevistä vaikutuksista Telmisartan kautta PPARy-riippuvaisen Pathway

Seuraavaksi tutkimme funktio antituumorivaikutukset telmisartaani kautta PPARy in HHUA kohdun limakalvon syövän soluja in vitro, käyttäen WST-1-määritystä 2 päivän altistumisen sekä telmisartaania 10 tai 50 uM ja PPARy-antagonisti, GW9662, 10 uM. GW9662 käytettiin kuten aiemmin on kuvattu [14], [15]. Ennen käynnistystä stimulaatio, me ympättiin 5 x 10

3 HHUA solujen DMEM 10% FBS: ää kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisille, tasapohjaisille mikrolevylle (Corning, New York, NY) ja inkuboitiin niitä yön yli. HHUA solut esikäsiteltiin GW9662 30 min ennen stimulaatiota telmisartaanin.

Measurement of Apoptosis (Flow-Sytometrisen Analysis kanssa anneksiini V /propidiumjodidia Assay) B

Solut ja kasvatettiin yön yli, kunnes he saavuttivat 80% konfluenssin ja sitten käsiteltiin telmisartaania. 48 tunnin kuluttua, irrotettuja soluja keskipitkällä kerättiin, ja loput tarttuneet solut kerättiin trypsinoimalla. Solut (1 x 10

5), pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan sitovaa puskuria (anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti [FITC] apoptoosin havaitsemiseen Kitin BioVision, Palo Alto, CA), joka sisälsi 5 ui 50 ug /ml propidiumjodidilla (PI) ja 5 ui anneksiini V-FITC, joka sitoutuu fosfatidyyliseriiniin kulkeutua ulkopinnan solukalvon aikaisin apoptoosin sekä aikana myöhään apoptoosin. Kun oli inkuboitu 10 minuuttia huoneen lämpötilassa valolta suojattu alue, näytteet analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). FITC ja PI päästöjen havaittiin FL-1 ja FL-2 kanavaa, vastaavasti. Kutakin näytettä varten tietoja 10000 solua kirjattiin luetteloon tilassa logaritmisella asteikolla. Myöhemmät analyysi suoritettiin CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson).

Mitokondrioiden transmembraaniaktivaattori Mahdolliset

Solut valmistettiin FACS kuten edellä on kuvattu, ja värjättiin käyttäen Mitocapture Apoptosis Detection Kit BioVision fluoresoivalla lipofiilinen kationinen reagenssia, joka arvioi mitokondrioiden kalvon läpäisevyyden mukaan valmistajan suositusten mukaisesti.

kaspaasi-3 ja -7 toiminta

kaspaasi-3 ja -7 ovat tärkeitä jäseniä kysteiini asparagiinihapon-proteaasilla ( kaspaasi) -perheen että pelata avainefektori rooli apoptoosin nisäkässoluissa. Toiminta Näiden caspases mitattiin käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 Pitoisuus hankittiin Promega (Madison, WI), mukaan valmistajan suositusten.

Enzyme immunosorbenttimääritys

Aktivoidut lohkaista poly-ADP riboosi-polymeraasi (PARP) ekspressio laskettiin käyttäen Pierce Kolorimetrinen In-Cell ELISA-kitillä (Thermoscientific, Rockford, IL), mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti.

Western blot -analyysi

Solut pestiin kahdesti PBS: ssä ja hajotettiin käyttämällä M-PER nisäkäsproteiini uuttoreagenssi (Thermoscientific) mukaan valmistajan suositusten. Proteiinikonsentraatiot kvantitoitiin käyttäen Pierce 660 nm proteiinin reagenssilla (Thermoscientific) mukaisesti valmistajan ehdottaman protokollan. Kokosolulysaateista (20 ug) erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 10% -15% geelit, ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Immobilon, Amersham, Arlington Heights, IL). Tämän jälkeen kalvot testattiin peräkkäin vasta-aineiden Bcl-2 (1:1,000; Epitomics, Burlingame, CA), Bcl-xL: n (1:1,000; Cell Signaling Technology), Bax (1:1,000; Cell Signaling Technology), lohkaistaan ​​caspase- 3 (1:1000; Cell Signaling Technology), ja GAPDH (1:10,000; Abcam, Cambridge, UK). Täplät kehitettiin käyttäen parannetun kemiluminesenssi alustan (Länsi Salama ECL Pro) Kit (PerkinElmer, San Jose, CA).

havaitseminen DSB pulssittaisella-PFGE (PFGE) B

aliyhtyvät viljelmiä HHUA soluja käsiteltiin 10 tai 100 uM telmisartaani 24 h tai 48 h. Solut kerättiin sen jälkeen, kun trypsinaatiolla, ja agaroosipalat sisälsi 10

6-soluja valmistettiin CHEF kertakäyttöinen roositulppamuottiin (Bio-Rad, Hercules, CA). Inkuboimme tulpat lyysipuskuria (100 mM EDTA, 1% (w /v) natriumlauryylisulfaatti sarcosyne, 0,2% (w /v) natriumdeoksikolaatti, 1 mg ml

-1 proteinaasi K) 37 ° C: ssa 24 h ja pestään sitten ne 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 100 mM EDTA: ta. Elektroforeesi suoritettiin 23 tunnin ajan 13 ° C: ssa läpi 0,9% agaroosia Tris- boraatti-EDTA-puskuria käyttäen Biometran Rotaphor laitteessa (Biometra, Göttingen, Saksa) käyttäen seuraavia parametreja: intervalli, 30-5 s log; kulma, 120 ° -110 ° lineaarinen; 180-120 V log). DNA värjättiin etidiumbromidilla ja visualisoitiin käyttäen Typhoon FLA 7000 skanneri (GE Healthcare Life Sciences, Tokio, Japani). Elektroforeesin olosuhteet erityisesti tiivistämään alemman molekyylipainon DNA-fragmentit (useita Mbp 500 kbp) yhdeksi kaistan, säilyttäen korkea molekyylipainon genomista DNA: ta hyvin. Alemman molekyylipainon DNA-fragmentit ovat tuloksia DSB on kromosomaalista DNA: ta. Siten määritys mahdollistaa rikki DNA voidaan helposti havaita. Kuitenkin yhteydessä DSB aikana syntyneiden DNA-replikaation pysähtyminen, määrityksen on rajallinen herkkyys ja ei ole kvantitatiivinen. Kun DSB tapahtuu DNA replikaatiohaarukka, rikki DNA on vielä kiinni malliin kromosomiin. Havaitsemiseksi DSB määrityksessä, kaksi suhteellisen lähellä (useita Mbp) toisistaan ​​riippumattomia DSB on tapahtua [16], [17].

immunofluoresenssivärjäyksellä ja γ-H2AX

HHUA soluja käsiteltiin tai ilman telmisartaania kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan, ja sitten blokattiin 0,5% BSA PBS: ssä. Soluja inkuboitiin kanin monoklonaalista anti γ-H2AX-vasta-aine (1:500; Millipore, Billerica, MA) ja 90 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen Alexa488-konjugoitua anti-kani-IgG (1:300; Molecular Probes, Carlsbad, CA) 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. DAPI käytettiin nucleus värjäystä. Solut havaittiin käyttäen BZ-9000 (Keyence, Osaka, Japani).

In vivo

Eläimille Protocol

Protokolla hyväksyttiin valiokunnassa eettisen eläinkokeiden yliopiston Oita (Luvan numero: L029001). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Kaikki eläinkokeet suoritettiin noudattaen National Institutes of Health ohjeita.

Sixteen 6 viikon ikäiseen immuunivajaisiin BALB /c-nu /nu-naaraita hiiriä ostettiin Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japani) ja ylläpidetään alle patogeenivapaissa olosuhteissa säteilytettyjen chow. Eräässä kokeessa, 5 x 10

6 HHUA solua 0,1 ml: ssa Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) molemminpuolisesti ja ihon alle injektoidaan runkojen 16 hiirillä, mikä muodostaa kaksi kasvaimia eläintä kohti. Hoito aloitettiin päivänä injektion jälkeen näiden ihmisen kohtukarsinooma solujen ja lopetettiin 7 viikkoa [18]. Kohortteja (kahdeksan hiirtä per ryhmä) saivat joko laimentimen vain (kontrolliryhmä) tai telmisartaani (100 ug päivässä) vatsaonteloon 5 päivää viikossa. Kasvaimet mitattiin viikottain noniusmittaharppia. Laskimme kasvaintilavuudet käyttäen seuraavaa kaavaa: tilavuus = pituus x leveys x korkeus x 0,5236. Vasen kammio (LV) paine seurattiin käyttäen paineanturi (WS-681G: Nihon Kohden, Tokio) tallentaa huippu positiivinen ja negatiivinen ensimmäinen johdannaiset LV painetta. Aineisto analysoitiin -ohjetta ohjelmistoa (ADInstruments, Colorado Springs, CO). Eläimet lopetettiin natriumpentobarbitaalia anestesian, jonka jälkeen huolellisesti resektio oli suoritettu ja tuumorit punnittiin. Kasvaimet kiinnitettiin ja värjättiin histologista analyysiä.

immunohistokemia

Kasvaimen Näytteet kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin ja upotettiin parafiiniin ennen histologista leikkuu. Immunohistokemiatutkimukset tehtiin formaliinilla kiinnitetyt osat kudosnäytteiden. Kohdat esikäsiteltiin trypsiinin (10 mg per 50 ml Tris-puskuria, pH 8,1) 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin anti-Ki-67 monoklonaalista vasta-ainetta (1:1000 laimennos PBS: ssä, Zymed Laboratories, San Francisco , CA) 30 minuutin ajan. Objektilasit pestiin sitten PBS: ssä ja niitä inkuboitiin peräkkäin 15 min peroksidaasikonjugoidulla sian anti-hiiri-immunoglobuliini G (1:50 laimennos, Dako, Kööpenhamina, Tanska). Värjäys suoritettiin käyttäen Dako Autostaineriin. Lokalisointia reaktiotuotteiden suoritettiin käyttäen diaminobentsideenireaktiota.

Terminal Deoxynucleotidyltransferase-välitteisen uridiinitrifosfaatin End-merkintöjä Analyysi

DNA katkeamisen havaittiin kautta päätelaitteen deoxynucleotidyltransferase-välitteisen uridiinitrifosfaatin pään leimaus ( TUNEL) analyysi käyttäen in situ Cell Death Detection Kit (Roche) sopusoinnussa valmistajan ohjeiden.

tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin itsenäisesti ainakin kolme kertaa kolmena kappaleena parametriyhdistelmää kohti . Kaikki numeeriset tiedot ilmoitetaan keskiarvoina ± SD. Merkitsevyys määritettiin tekemällä

t

-testi kanssa Bonferroni korjaus.

P

arvo 0,05 hyväksyttiin merkittävä.

Tulokset

Telmisartaanin vaikutusta leviämisen ja elinkelpoisuus kohdun limakalvon syöpä solulinjojen

in vitro

tutki antituumorivaikutukset telmisartaanin, kandesartaani, losartaani ja valsartaani kolmeen endometriumsyöpään solulinjoissa in vitro, käyttäen WST-1 määritys, jossa on 2 päivän altistuminen näille arbs. Kolme kohdun limakalvon syöpä solulinjoja (Ishikawa, HEC-59, ja HHUA) osoitti merkittävää herkkyyttä telmisartaanille hoitoa 1-100 uM (Fig. 1 D). Yksikään kolmesta muusta ARBs (kandesartaani, losartaani ja valsartaani) vaikutti elinkelpoisuus kohdun limakalvon syövän solulinjoissa (Fig. 1A-C). Koska huomasimme, että telmisartaani voi inhiboida näistä solulinjoista, tutkimme funktio antituumorivaikutukset telmisartaani kautta PPARy in HHUA kohdun limakalvon syövän soluja in vitro, käyttäen WST-1-määritystä 2 päivän altistumisen sekä telmisartaani 10 tai 50 uM ja PPARy-antagonisti, GW9662, 10 uM. Huomasimme, että lisäys GW9662 esti syöpää ehkäisevistä vaikutuksista Telmisartaanin 10 tai 50 uM (Fig. 1 E).

syöpää ehkäisevistä vaikutuksista Telmisartaanin kautta PPARy-riippuvaisen reitin. (A-D) Ishikawa, HEC-59, ja HHUA kohdun limakalvon syöpä solulinjoja käsiteltiin telmisartaanillla kandesartaani, losartaani tai valsartaani eri pitoisuuksina (1-100 uM) tai kantajaa (kontrolli) 48 tuntia, ja leviämisen (% kontrollista) mitattiin WST-1-määritystä. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kolmen erillisen kokeen kanssa kolmena kappaleena ruokia. *

P

0,05 vs. kontrolli, **

P

0,01 vs. kontrolli. (E) vaikutus GW9662 annetun telmisartaanin esto HHUA solujen lisääntymisen. HHUA soluja inkuboitiin telmisartaanin (10 tai 50 uM) 48 h, mitä seurasi esi-inkubointi GW9662 (10 uM) 30 minuutin ajan. Olemme havainneet, että lisäämällä GW9662 esti syöpää ehkäisevistä vaikutuksista Telmisartaanin 10 tai 50 uM. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Pylväät, välineet; baareja, SDS. *

P

0,05 vs. kontrolli, **

P

0,01 vs. kontrolli.

Apoptotic Muutokset Endometrial Syöpäsolut Hoidettu Telmisartaani

arvioimiseksi kyky telmisartaanin indusoida apoptoosia syöpäsoluissa, ja auttaa erottamaan eri solukuoleman, me double-värjätty telmisartaani-käsitellyt solut anneksiini V: n ja PI ja analysoitiin tulokset virtaussytometriaa käyttämällä. Anneksiini V: n sitoutuminen yhdistettynä PI merkintöjä suoritettiin eroa varhaisen apoptoottisten (anneksiini V + /PI) ja myöhäinen apoptoottiset (anneksiini V + /PI +) solujen [19]. Käsittelyn jälkeen kohdun limakalvon syövän solujen telmisartaanillla 100 uM, havaitsimme samanaikaisesti lisäystä sekä anneksiini V + /PI-jae (varhainen apoptoottinen) ja anneksiini V + /PI + (myöhäinen apoptoottiset) alapopulaatiot (taulukko 1).

mitokondrion transmembraaniaktivaattori Mahdolliset vastauksena telmisartaanihoidon

mitokondrion transmembraanisen potentiaali (MTP) on osoitettu esiintyvän ennen ydin- tiivistyminen ja kaspaasin aktivaatio, ja liittyy sytokromi c release monissa, mutta ei kaikissa apoptoottisia soluja [20]. Hoito kohdun limakalvon syövän solujen telmisartaania johti vähenemiseen MTP (taulukko 1).

telmisartaani Expression Apoptoosin liittyvien proteiinit

tutki Telmisartaanin vaikutusta ilmaisun apoptoosin liittyvien proteiinien kohdun limakalvon syövän solulinjojen Western blot analyysi (Fig. 2). Bcl-2-perheen apoptoosia säätelevä proteiinien toiminnot joko edistää (Bax, Bad, ja Bak) tai inhiboivat (Bcl-2, Bcl-x L, ja Mcl-1) apoptoottisen vastaus erilaisia ​​ärsykkeitä, mukaan lukien kemoterapia ja sädehoito [21]. Telmisartaani 100 uM 48 tunnin ajan vähensi Bcl-2 ja Bcl-x L, jossa lohkaistaan ​​fragmentteja kaspaasi-3 havaittiin (Fig. 2).

HHUA solut käsiteltiin telmisartaanin 10 tai 100 uM, ja solulysaatit talteen 24 ja 48 tuntia. Western-blot-analyysi suoritettiin sarja vasta-aineiden (Bcl-2, Bcl-x L, Bax, pilkottiin kaspaasi-3 ja GAPDH). Ohjaus soluja käsiteltiin pelkällä vehikkelillä.

Telmisartaanin vaikutusta DNA Damage Response ja solukuolema

ilmauksia pilkkoa PARP tutkittiin ELISA käsittelyn jälkeen HHUA solujen telmisartaanihoitoa 48 h. Telmisartaani (100 uM) selvästi nostivat pilkkoa PARP HHUA soluissa (Fig. 3). Valaista aktiivisuuden efektoreina telmisartaanin indusoiman apoptoosin, käytimme kaspaasi-Glo 3/7 määritys, joka mittaa kaspaasi-3 ja -7 toimintaa. Käsittelyn jälkeen HHUA solujen telmisartaanin 100 uM: ssa 48 tuntia, kaspaasi-3 ja -7 toiminta oli voimistunut (Fig. 4). Testasimme telmisartaani aiheuttama DSB muodostumisen HHUA soluissa. HHUA soluja käsiteltiin 10-100 uM telmisartaani 24 tai 48 h, ja DSB havaittiin käyttämällä pulssi-PFGE (PFGE). Jälkeen telmisartaanin hoidon, rikki DNA kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla HHUA soluissa (Fig. 5). Seuraavaksi suoritetaan immunofluoresenssivärjäyksellä ja γ-H2AX havaitsemiseksi n DSB: ihin. Telmisartaani-käsiteltyjen HHUA soluissa oli merkittävästi korkeampi fluoresenssi verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kuten on esitetty kuviossa 6A, B, γ-H2AX on voimistussäädellään HHUA solujen kanssa inkuboinnin jälkeen telmisartaanin on 10-100 uM: 24 tai 48 tuntia.

proteiinin ilmentymistä pilkotun PARP mitattiin ELISA-. HHUA soluja käsiteltiin 100 uM telmisartaani 48 tuntia. Kontrollisoluja käsiteltiin pelkällä vehikkelillä. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Pylväät, välineet; baareja, SDS. **

P

0,01 vs. kontrolli.

toiminta kaspaasi 3 ja kaspaasi-7 arvioitiin kaspaasi-Glo 3/7 määritykset. HHUA soluja käsiteltiin 100 uM telmisartaani 48 tuntia. Kontrollisoluja käsiteltiin pelkällä vehikkelillä. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Pylväät, välineet; baareja, SDS. **

P

0,01 vs. kontrolli.

DSB muodostus analysoitiin PFGE: llä. HHUA solut kerättiin agaroosipaloja, ja niiden DNA-erotettiin koon agaroosigeelillä. Alle elektroforeesiolosuhteissa käytetty, korkean molekyylipainon genomista DNA pysyi hyvin, kun taas alempi molekyylipainon DNA-fragmentit (useita MBP 500 kbp) muuttivat geeli ja tiivistettiin signaalin bändi.

(A) Aika ja annoksesta riippuvuus histoni H2AX fosforylaation telmisartaania. HHUA soluja käsiteltiin 10 tai 100 uM telmisartaania merkitty kertaa, mitä seuraa immunovärjäys käyttämällä anti-γ-H2AX vasta-aine. Heidän tumat paljasti DAPI värjäytymisen. (B) Prosenttia γ-H2AX-positiivisia soluja. HHUA soluja käsiteltiin 10 tai 100 uM telmisartaani 24 h tai 48 h. Kontrollisoluja käsiteltiin pelkällä vehikkelillä. Telmisartaani-käsiteltyjä soluja oli merkittävästi korkeampi fluoresenssi verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Tulokset = tarkoittaa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Pylväät, välineet; baareja, SDS. *

P

0,05 vs. kontrolli, **

P

0,01 vs. kontrolli.

antituumorivaikutus

in vivo

Testasimme kyky telmisartaanin inhiboimaan ihmisen HHUA kohdun limakalvon kasvaimia immuunivajaissa hiirillä aikana 7 viikon hoidon jälkeen. Injektoinnin HHUA soluja (5 x 10

6) johti vahvojen kasvaimia in vivo. Kuten kuviossa 7A, anto telmisartaanin huomattavasti tukahdutti kasvun näiden kasvaimia. Kaikissa hoitoryhmissä oli huomattavasti pienempi kasvaimia verrattuna laimennusainevertailunäytteenä ryhmät (

P

0,01). Mittasimme kasvaintilavuudet eri aikapisteissä koko hoidon, ja lopussa tutkimuksen, kasvaimet leikeltiin varovasti ja punnittiin. Löydökset joilla paino samansuuntainen tilavuuden mittaukset (tuloksia ei ole esitetty). Kasvain painot olivat 77% pienemmät hoitoryhmissä kuin kontrolliryhmässä kohortin (

P

0,01).

(A) HHUA soluja (5 x 10

6) olivat kahdenkeskisesti ihon alle ruiskutetaan rungot nude-hiirten, jotka muodostavat kaksi kasvaimia hiirtä kohti. Hiiret jaettiin satunnaisesti kontrolli- ja koeryhmään. Telmisartaani (100 ug /hiiri) tai laimennusaineen (kontrolli) annettiin vatsakalvonsisäisesti 5 päivää viikossa 7 viikkoa. Sen jälkeen kun 7 viikkoa hoidon jälkeen kasvaimet poistettiin kustakin hiirestä ja punnitaan. Kasvain painot molemmissa ryhmissä olivat merkittävästi erilaiset. Pylväät, välineet; baareja, SDS. **

P

0,01 vs. kontrolli. (B) Vaikutus telmisartaani HHUA kasvaimiin nude-hiirissä. Kohdun karsinooma solut hiiristä hoidettiin telmisartaanillla osoittivat selvästi heikompi värjäyksen Ki-67 kontrolliin verrattuna kohtukarsinooma soluja. (C) kohtukarsinooma solut hiiristä hoidettiin telmisartaanillla kävi apoptoosin (TUNEL-positiivinen). Kaikki määritykset suoritettiin kolme kertaa. Pylväät, välineet; baareja, SDS. **

P

0,01 vs. kontrolli.

Tutkimuksen aikana kaikki hiiret punnittiin ja niiden LV paineet kirjattiin kerran viikossa. Keskimääräinen painon hoitoryhmissä oli 91% -104%: n keskimääräinen paino kontrolliryhmässä (tuloksia ei ole esitetty). Lähtötilanteessa LV painearvot eivät olleet erilaisia ​​ryhmien välillä (telmisartaania ryhmä, 52,8 ± 10,8 mmHg, kontrolliryhmään, 52,6 ± 11,0 mmHg) (keskiarvo ± SD). Viikon kuluttua annon jälkeen keskimääräinen LV paine telmisartaanin ryhmässä oli merkitsevästi alhaisempi kuin kontrolliryhmässä (50,4 ± 7,1 mmHg vs. 68,8 ± 13,1 mmHg;

P

0,01). Lopussa Tutkimuksen LV paine kontrolliryhmässä oli 68,8 ± 6,3 mmHg ja että Telmisartaani ryhmässä oli 58,0 ± 3,9 mmHg (

P

0,01).

yleensä kaikissa kohorteissa, kaikki hiiret näyttivät olevan terveitä. Mitään merkittäviä eroja keskimääräisessä painon välillä havaittiin laimentimen-käsitellyissä hiirissä ja ne, jotka saivat 7 viikkoa hoidon (tuloksia ei ole esitetty). HHUA kasvaimet otettiin näytteet ekspression Ki-67, jonka immunohistokemiallinen analyysi, ja TUNEL-määritys suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut leikkeet. HHUA endometriumsyöpä soluja käsiteltiin telmisartaanin näytteille negatiivinen tai paikallinen heikko värjäystä Ki-67 ja näyttivät olevan apoptoosin (eli ne olivat TUNEL-positiivisia). Ohjaus HHUA kohtukarsinooma solut käsittelemättömiä hiiret osoittivat vahvaa tumavärjäystä Ki-67 ja olivat negatiivisia apoptoosin (Fig. 7B, C).

Keskustelu

Lihavuus, yli estrogeenin, tyypin II diabetes ja kohonnut verenpaine ovat joitakin tärkeitä riskitekijöitä kohtukarsinooma [4], [22] – [24]. PPARy kuuluu perheeseen nukleaarihormonireseptorit jotka sisältävät estrogeeni ja kilpirauhashormonin reseptoreihin [25], [26].

Tämänhetkiset tulokset osoittivat, että joukossa ARB testattu; Ainoastaan ​​telmisartaania kykeni indusoimaan inhibitiota solujen elinkelpoisuuden kohdun limakalvon syövän solulinjat. Inhiboivaa vaikutusta telmisartaania väheni, kun läsnä on PPARy-inhibiittorin, GW9662. Kerrottiin on tärkeää ylikuulumisen välillä PPARy ja estrogeenireseptori [25], [27], [28]. Ota et al. raportoi, että PPARy-immunoreaktiivisuus havaittiin 65% kohdun limakalvon karsinooma kudosta saatiin potilailta, immunohistokemiallisesti. He totesivat myös, että PPARy-ligandia, 15d-PGJ

2, on antiproliferatiivinen aktiivisuus kohdun limakalvon syövän soluissa (Ishikawa, Sawano, RL95-2 solut) [4]. Benson et ai. kertoi, että telmisartaani toimi selektiivinen PPARy osittainen agonisti, aktivoimalla reseptorin 25%: sta 30%: n enimmäistaso saavutetaan täysagonisteja pioglitatsoni ja rosiglitatsoni. Muut ARBs puuttuu telmisartaani mahdollisuudet reseptorivuorovaikutuksessa ja on suhteellisen vähän tai ei lainkaan vaikutusta PPARy toimintaan [7]. Siksi olisi mahdollista mekanismi, joka telmisartaani on syöpää ehkäisevistä vaikutuksista kautta PPAR-riippuvaisen reitin.

On myös osoitettu, että telmisartaani aiheuttaman apoptoosin ja DNA: n fragmentoituminen ihmisen urologinen syöpä [8], [9] , [29]. Täällä olemme huomanneet, että telmisartaanihoidon merkitsevästi lisäsi apoptoottisten solujen kaikissa kohtukarsinooma solulinjoissa tutkittu. Vuonna anneksiini V määrityksen ja MTP arviointi, telmisartaani aiheuttaman apoptoosin 48 tuntia hoitoa 100 uM. Tämä vaikutus liittyi lasku tasot anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl-x L. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus lisääntyi myös vastauksena ärsyke 48 tunnin telmisartaanin hoito 100pM. Meidän koskevat päätelmät kaspaasi-3 pilkkominen ja PARP pilkkominen mukaan tämä apoptosome reitti voi aktivoida jälkeen telmisartaanihoidon.

Useat päällekkäisiä signalointi tapahtumia aloitetaan vastauksena DSB: ihin, suorittamaan apoptoosin [30] , [31]. Käyttämällä pulssi-PFGE ja immunofluoresenssivärjäyksellä ja γ-H2AX, olemme huomanneet, että telmisaratan indusoi DSB. H2AX on jäsen histoni H2A perheen, ja fosforylaatio H2AX seriinin 139, joka on nimeltään ”γ-H2AX,” liittyy DSB: ihin [32] – [35]. Γ-H2AX proteiinia pidetään tunnetuin proteiinin määrityksissä mittaamaan DNA-vaurioita [36]. DSB on kriittisin DNA-vaurioita [37], [38]. Yksi DSB on riittävä tappamaan solun, silloin, kun se ei ole korjattu [37] – [39]. Esillä olevassa tutkimuksessa, DSB tapahtui HHUA soluissa 24 tunnin kuluttua 10-uM telmisartaanin hoitoon. Sen sijaan, Western blottaus osoitti, että kaspaasi 3 pilkkominen ollut selvää 24 h 10 uM telmisartaania hoitoa HHUA soluissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että DSB: t voidaan indusoida ennen apoptoosin telmisartaania hoitoon.

in vivo -tiedot osoittivat, että apoptoosin joihin kasvaimen alueella tapahtunut nude-hiirissä hoidettiin telmisartaanillla, ja tämä antituumoriaktiivisuus ei liittynyt mitään suuria sivuvaikutuksia, nostamalla mahdollisuus, että telmisartaani voi olla hyödyllinen hoito hoitoon kohtukarsinooma. Koska aloitimme telmisartaani hoidon jälkeisenä päivänä pahanlaatuisia soluja injektoidaan hiiriin, emme voi päätellä, että telmisartaani tehoaa tilaa vievä kasvaimia, joita usein havaitaan hoitopaikassa; lisätutkimukset ovat tarpeen selventää tätä asiaa. Olemme kuitenkin havainneet, että telmisartaani osoitti syvällinen antituumorivaikutus in vivo, ja varmistimme, että pieni kasvain taakka voidaan hävittää tämän yhdiste hiirillä. Tämä havainto viittaa siihen, että telmisartaani hoito voi olla erityisen tehokas henkilöille, joilla on minimaalinen jäljellä taudin jälkeen parantava leikkauksen, kemoterapian ja /tai sädehoidon. Vaikka LV paine Telmisartaani ryhmä laski näissä kokeissa että Telmisartaani ryhmää ei muuteta seitsemän viikon ajan ja kaikki hiiret näyttivät olevan terveitä (tuloksia ei ole esitetty).

Mekanismi, joka telmisartaania kykenee sen syövän vastaisen aktiivisuus jää epäselväksi. Vuonna urologiset syöpäsoluja, telmisartaani saattaa välittää voimakas antiproliferatiivisia vaikutuksia kautta PPAR [29]. Eturauhasen syöpäsoluja, telmisartaani vuorovaikutuksessa joidenkin signaalien kulkureiteillä; yksi estää AT1R kuin ARB, ja toinen transkriptiotekijän toimii PPARy ligandin PPARy riippuvainen ja riippumaton vuorovaikutus [10]. Kuten muut ARBs estää signaalitransduktion epidermaalinen kasvutekijä (EGF) tai interleukiini (IL) -6-signaaleja, telmisartaani estää myös muita signaaleja PPARy aktivointi [10], [40].