Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useat kemoterapeuttiset käyttää immunomodulaarisia vaikutuksia. Yksi näistä on nukleosidianalogi gemsitabiini, jota käytetään laajalti potilaille, joilla on keuhkosyöpä, munasarjasyöpä, rintasyöpä, mesoteliooma ja useat muut syöpien, mutta rajoitettu teho. Oletimme, että immuniteettia vaikutuksia tämän lääkkeen osittain hillinnyt estävän T-solujen molekyyli CTLA-4 ja näin voitaisiin vielä täydentää yhdistämällä sen kanssa estävää vasta-ainetta vastaan ​​CTLA-4, joka omasta on viime aikoina osoittanut myönteisiä kliinisiä vaikutuksia potilaille, joilla on metastaattinen melanooma. Tässä osoitamme, käyttäen kahta ei-immunogeeninen hiiren kasvainmalleissa, että gemsitabiinihoidon kemoterapiaa yhdessä CTLA-4-eston tuloksia induktion voimakas kasvaimen vastainen immuunivaste. Ehtyminen kokeet osoittivat, että sekä CD4

+ ja CD8

+ T-soluja tarvitaan optimaalisen terapeuttisen vaikutuksen. Hiiret saivat yhdistelmähoitoa osoitti kasvaimen regressio ja pitkäaikaisen suojaavan immuniteetin. Lisäksi osoitamme, että tehon yhdistelmän moderaattorina ajoitus antamisen kahden aineen. Tuloksemme osoittavat, että immuuni tarkistuspiste saarto solunsalpaajahoitoa voi olla synergistinen vaikutus syövän hoidossa. Nämä tulokset antavat perustan jatkaa yhdistelmähoitoja anti-CTLA-4 ja immuniteettia kemoterapiaa ja vaikuttavat merkittävästi tulevien tutkimusten syöpäpotilailla. Koska molemmat lääkkeet on hyväksytty käytettäväksi potilailla meidän data voidaan välittömästi kääntää kliinisissä tutkimuksissa.

Citation: Lesterhuis WJ, Salmons J, Nowak AK, Rozali EN, Khong A, Dick IM, et al. (2013) Synergistinen vaikutus CTLA-4-esto ja Cancer Chemotherapy että induktio anti-kasvain Immunity. PLoS ONE 8 (4): e61895. doi: 10,1371 /journal.pone.0061895

Editor: Ramon Andrade de Mello, Porton yliopisto, Portugali

vastaanotettu: 20 joulukuu 2012; Hyväksytty: 14 maaliskuu 2013; Julkaistu 23. huhtikuuta 2013

Copyright: © 2013 Lesterhuis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avustuksia National Health ja Medical Research Council of Australia ja Vakuutusvalvontaviraston komission Länsi-Australiassa. WJL tukee translaatiotutkimus apurahan Alankomaiden Cancer Society. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka aiemmin, ortodoksinen kliinisessä käytännössä todennut, että kemoterapiaa ja immunoterapia ei voi yhdistää, koska myelosuppressiivisen luonteen useimpien sytotoksisten lääkkeiden, tämä käsite on kyseenalaistettu viime vuosina suuri elin kokeelliset tiedot (tarkistetaan in [1], [2]). Esimerkiksi, antrasykliinihoitoa ja oksaliplatiinin tulokset immunogeeninen kasvainsolun kuoleman ja platina-pohjainen kemoterapeuttiset downregulate estävää STAT6 /PD-L2-reitin ja herkistää kasvainsolut T-soluvälitteinen sytotoksisuus [3] – [5]. Ryhmämme on osoittanut, että nukleosidianalogi gemsitabiinin voi parantaa kasvaimen antigeeni rajat esittelystä dendriittisolujen ja muut ovat osoittaneet, että tämä hoito johtaa säätelyä kasvaimen MHC-luokan I ilmentymisen ja ehtyminen sekä säätelijä-T-solujen ja myeloidinen johdetut suppressorisolut [6 ] – [10]. Nämä tiedot tarjoavat vahva perusta hyödyntää immuniteettiä vaikutus gemsitabiinin yhdistämällä se muihin immuuniterapeuttista lähestymistapoja.

Immunosuppressiivinen verkot tärkeä rooli kiertäminen kasvaimen vastaisen immuniteetin, ja sellaisenaan voisi rajoittaa immuniteettiä vaikutus kemoterapiaa. Yksi mahdollisesti merkitystä rajoituslinjan reittejä välittää immuunijärjestelmän estävän molekyylin sytotoksisten T-lymfosyyttien Antigen 4 (CTLA-4). Ekspression CTLA-4 on ylössäädelty seuraavat T-soluaktivaation ja reitin on osoitettu olevan tärkeä immunomodulatorisen rooli syövän. Terapeuttinen CTLA-4: n on osoitettu olevan tehokas hoito melanooman [11]. Anti-CTLA-4 monoklonaalinen vasta-aine ipilimumab on nyt rekisteröity FDA kuin ensimmäinen käsittely, joka on osoittanut kokonaiseloonjäämishyödyn Satunnaistetussa vaiheen III tutkimuksessa etäispesäkemelanoomassa yhdistettynä dakarbatsiinia kemoterapiaa [12], [13]. Vaikka jotkut potilaat saavuttivat täydellinen vaste ja muut jatkoi pitkän aikavälin ilman taudin etenemistä, suurin osa potilaista koki sairauden etenemisen.

Lähdimme onko CTLA-4 tarkastuspiste rajoittaa mahdollisia terapeuttisia gemsitabiinin yhdistämällä sen kanssa CTLA-4-salpaaja-aine. Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että CTLA-4-esto ja immuniteettia kemoterapiaa terapeuttisen annoksen on synergistinen vaikutus, mikä induktio voimakas kasvaimen vastainen immuunivaste ja pitkän aikavälin suojaavan immuniteetin. Lisäksi osoitamme, että yleinen tehokkuus yhdistelmä hiirillä riippuu annon ajoitus yksittäisten komponenttien.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiret

BALB /C (H-2

d) ja C57BL /6 (H-2

b) hiiret saatiin Animal Resources Centre (Canning Vale, Australia) ja ylläpidettiin tavanomaisissa olosuhteissa (M-Block Animal Facility, Queen Elizabeth II Medical Centre, The University of Western Australia). Kaikki hiiret käytetään näissä tutkimuksissa olivat 8-12 viikon iässä.

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet tehtiin mukaan The University of Western Australia Animal eettisen komitean hyväksynnät (protokolla RA /3 /100/1016) ja käytännesäännöt National Health ja Medical Research Council of Australia. Länsi Australia Animal eettinen komitea erikseen hyväksynyt tätä tutkimusta.

Solulinjat

MHC-luokan I-positiivisia, luokan II-negatiivinen, erittäin tuumorigeenisemmiksi ja huonosti immunogeeninen BALB /C-johdettu asbestin aiheuttama hiiren mesoteliooma solulinjaa AB1, transfektoitu influenssan HA-geenin (AB1-HA) on kuvattu aiemmin [6], [7]. Sillä Haastealtistus kokeita kuin HA-transfektoidut AB1 soluja käytettiin. Huonosti immunogeeninen ja erittäin tuumorigeenisia Lewisin keuhkosyöpä (LLC) solulinja saatiin CellBank Australia (Westmead NSW, Australia), jossa identiteetti solulinjaa validoitu. Solulinjoja pidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Mulgravessa, Australia), jota oli täydennetty 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-merkaptoetanolia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä (CSL, Melbourne, Australia), 50 ug /ml gentamisiini (David Bull Labs, Kewdale , Australia), ja 10% FCS: ää (Invitrogen). AB1-HA-soluja ylläpidettiin väliaineessa, joka sisälsi neomysiini- analoginen genetisiiniä (Invitrogen), jonka lopullinen konsentraatio oli 400 ug /ml. Kaikki solulinjat säännöllisesti testattu ja pysyivät negatiivisina Mycoplasma spp.

Kasvain Challenge and Experimental pöytäkirjan

ABI-HA kasvainsoluja (1 x 10

6) tai LLC (2,5 x 10

5) 100 ul: ssa PBS: ää istutettiin sc alempaan oikeaan kylkeen saajahiiret. Tavanomaisen kemoterapian alkoi 9 päivää myöhemmin AB1-HA: n ja 6 päivää myöhemmin LLC kun palpoitavissa kasvain on noin 10 mm

2 oli ilmeinen. -Hiiriin ruiskutettiin i.p. gemsitabiinihoito 120 ug /g kehon paino joka kolmas päivä viisi annosta (Q3Dx5), kuuri aiemmin perustettu maksimaalinen siedetty annos BALB /C-hiiriä (kuviot S1, S2 ja S3) [6], [7]. Vaihtoehtoisesti, hiiriä hoidettiin kerta-annoksen sisplatiinia 6 ug /g päivänä 9 AB1-HA tai päivän 6 LLC, jonka löysimme olevan suurin siedetty annos tässä mallissa, joka perustuu titraukseen kokeissa (tietoja ei ole esitetty). Kontrollihiiret saivat 100 ui pelkkää PBS: ää. Anti-CTLA-4: ää annettiin i.p. joka kolmas päivä neljä annosta (Q3Dx4). Aluksi käytimme 100 ug annosta kohti, mutta myöhemmät annosmääritystutkimukset osoittivat, että 75 ug annosta kohden yhtäläiset tuloksia on saatu ja siksi otimme tämä annos seuraavissa kokeissa (kuva S4). Yhdistelmänä kokeita käyttäen AB1-HA sisplatiinin, käytimme yksi kerta-annoksena 200 ug anti-CTLA-4 päivänä 9, joka perustuu tuoreessa raportissa osoitetaan toteutettavuus ja voimakkuutta että aikataulu [14], ja perustuu omaan tiedot osoittavat vastaavuutta 75 ug Q3Dx4 aikataulu (tuloksia ei ole esitetty). Kasvaimen koko mitattiin käyttäen mikro-satulat vähintään kolme kertaa viikossa hoidon aikana ja sen jälkeen, kunnes kasvaimen koko saavutti 100 mm

2, jossa vaiheessa hiiret lopetettiin seuraavien alueen eläinten eettisen ohjeita. Hoidon aikana hiiret painoja tarkkailtiin ja lopetettujen jos merkittävä laihtuminen ( 15%) tai toksisuutta havaittiin.

Joissakin kokeissa hiiriä, jotka olivat osoittaneet täydellistä regressiota kasvainten, altistettiin ei-HA transfektoitujen AB1 mesoteliooma solut vasemmassa alakulmassa kylki (kuva S5). Jos vähintään kaksi kuukautta sen jälkeen, kun hoito on aloitettu uudelleen ei havaittu kasvaimia olivat palpoitavissa, hiiret pidetään immuuni. Kasvaimen tyhjennys imusolmukkeet kerättiin sitten ja värjättiin muisti-T-solujen markkereita (katso alla). Non-kasvain naiivia hiirtä käytettiin verrokkeina.

Vasta-aineet ja kemoterapia

gemsitabiini (Gemzar, Eli Lilly) toimitti apteekissa Sir Charles Gairdner Hospital. Anti-CTLA-4: n (klooni 9H10) monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin ja puhdistettiin on monoklonaalinen vasta-aine Facility, WAIMR (Perth, Australia). CTLA-4 hybridooma oli ystävällinen lahjoitus Prof. JP Allison (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, USA).

Depleetiokokeita seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-NK1.1 (klooni PK136), anti-CD4 (klooni GK1,5) ja anti-CD8 (klooni YTS169.4), kaikki päässä monoklonaalinen vasta-aine Facility, WAIMR (Perth, Australia). Anti-CD4 ja CD8 annettiin 150 ug i.v., yksi päivä ennen gemsitabiini /anti-CTLA4, jota seurasi 100 ug i.p. 3 päivän välein, viimeinen annos päivänä 27. Anti-NK1.1 annettiin 200 mikrog ip päivänä 6, 9 ja 12. väheneminen varmistettiin virtaussytometrillä ääreisverenkierron hännän verenvuotoja (kuva S6).

seuraavia vasta-aineita käytettiin virtaussytometriaa: CD3 FITC, CD4-PECy7, CD4 Pac Blue, CD8 PerCpCy5.5, CD3 PE ja ICOS APC, CD44-PE, CD49b FITC, CD62L-FITC, (kaikki Biolegend), Ki67 AF488 Ki 67 PE ja CD4 APCH7 (kaikki BD Bioscience), CD3 PeCy7 FoxP3-PerCPCy5.5 ja CD8 PECy7, CD8 ef780 (eBioscience).

Solun Värjäys ja virtaussytometria analyysi

Ääreisveren näytteenotto suoritettiin kautta hännän vuotaa päivänä 29. tilavuus 100 ui verta kerättiin hepariini putkeen. Vasta-aine, cocktailit pinta tahrat (CD3, CD4, CD8 ja ICOS) valmistettiin ja 20 ui lisättiin 30 ui verta 1 tunti. Näytteet hajotettiin (BD FACS hajottava liuos) ja läpäiseviksi tehtyjä (eBioscience Fixation /Perm Buffer), vasta-aineen solunsisäisen värjäyksen (Ki-67) valmistettiin ja 20 pl lisättiin 45 min. Näytteet uudelleensuspendoitiin 200 ul vakauttava kiinnitysainetta (BD) ja 50000 lymfosyyttien aidatulla tapahtumaa hankittu FACS Canto II virtaussytometrillä (BD Biosciences) ja tiedot analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa.

Joissakin kokeissa, joissa hiiriä, jotka oli parantunut hoidon ja sen jälkeen vastustanut Haastealtistus kasvainsolujen kontralateraaliselle kylki, kasvaimeen tyhjennys imusolmukkeiden (TDLN) kerättiin (katso edellä) ja analyysi T-muistin solualaryhmiä. Imusolmukkeet molempiin kylkiin otettiin talteen ja yhdistettiin ja värjättiin CD4, CD8, CD44 ja CD62L mukaan samaa protokollaa kuin virtaussytometrialla analyysi perifeerisen veren (katso edellä ja kuvio S5).

analyysi T-soluvasteita in kasvain, TDLN (ipsilateral kainaloiden ja imusolmukkeet solmut) ja perna, hiiret lopetettiin päivänä 15 ja elimet kerättiin. Päivä 15 valittiin ajankohtana, koska noin päivänä 12 kasvukäyrät ryhmien välillä alkoi jakaa, jolloin asianmukaisen arvioinnin T-soluvasteiden. Pernat ja LNS survottiin välillä lasilevyille, suspendoitiin uudelleen punasolujen hajoamista liuosta (eBioscience) ja suodatettiin 40 um: n suodattimen (BD) ja värjättiin asianomaisten vasta-aineita. Kasvaimet hienonnettiin hienoksi ja siirretään ruoansulatusta liuokseen, joka koostui RPMI /2% FCS: ssä 10 mg /ml kollagenaasi ja 1 mg /ml DNAasia I (Sigma-Aldrich), ja inkuboitiin 1 tunnin ajan rullan pankki. Viime 10 minuuttia lisättiin EDTA: ta lopulliseen liuokseen, jossa oli 5 mM. Näytteitä pestiin RPMI /2% FCS ja suodatetaan 40 um suodattimen ja värjättiin asiaan vasta-aineilla.

TILASTOANALYYSI

Tiedot analysoitiin käyttämällä Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc.) . Kasvaimen kasvu analysoitiin käyttämällä PASW tilastojen version 18 MIXED menettely (IBM SPSS, Chicago IL). Vertailut hoitoryhmien välillä kunakin ajankohtana säädettiin useiden vertailujen mukaan Sidak menetelmällä. Tiedot tuumorin eloonjäännin analysoitiin mukaisesti Kaplan Meierin menetelmällä ja eloonjäämisen mittasuhteet verrattiin ryhmien välillä käyttäen log rank testi. Tiedot T-solujen alaryhmiä verrattiin Studentin t-testiä. Eroja pidettiin merkittävinä, kun P-arvo oli 0,05.

Tulokset

Anti-CTLA-4 ja Gemsitabiini Yhdistä terapeuttisesti Tehostemateriaalit Manner

Aiempiin tulokset osoittavat gemsitabiinin immunogeenise- sytotoksinen lääke [7], me arveltu, että terapeuttista tehoa gemsitabiinin voitaisiin edelleen tehostaa yhdistämällä se estävää vasta-ainetta vastaan ​​CTLA-4. AB1-HA-siirrostettiin BALB /C-hiiriä käsiteltiin anti-CTLA-4 yhdessä gemsitabiinin (kuvio S1 ja kuvio 1). Gemsitabiinihoidon pelkällä hyvä hallinta kasvaimen kasvulta, kun lääke annettiin, kuten aiemmin raportoitu, mutta kasvain edennyt hoidon lopettamisen useimmissa hiirien [15]. Hoito anti-CTLA-4 yksinään vähensi kasvaimen kasvunopeus, mutta oli vähemmän tehokas kuin gemsitabiini monoterapiana (kuvio 1A). Kuitenkin, kun anti-CTLA-4 ja gemsitabiinin yhdistettiin, selkeä additiivista vaikutusta hoitojen, joilla on merkittävä viive kasvaimen kasvulta ei havaittu. Eläinten lukumäärän saavutettua täydellinen regressio oli superadditiivinen (-60% yhdistelmässä ryhmässä versus ~13% anti-CTLA-4 ja ~8% gemsitabiinia yksin AB1-HA malli, kuviot. 1A ja B). Olemme myös löytäneet parannetun kasvaimen valvonta LLC mallissa, vaikka vaikutus oli vähäisempää (kuvio S7). Tämä vastaa ihmisen -tutkimukset immuuni tarkastuspiste estäviä vasta-aineita, jotka osoittavat suuria eroja tehokkuudessa eri syöpätyyppejä [16]. Mielenkiintoista, kun käsittelimme hiiriä ei-immunogeeninen kemoterapeuttinen lääke sisplatiinin [17], ei ollut selvä synergistinen vaikutus joko mallissa (kuvio 1 C ja D ja kuvio S7).

(A) Kasvain pinnalle mm

2 (keskiarvo ± SD) ja AB1-HA kasvaimia, joihin injektoitiin päivänä 0, hiiret (n = 87) hoidettiin päivänä 9/12/15/18 75 ug anti-CTLA-4 ja 120 ug /g gemsitabiinia päivänä 9/12/15/18/21 tai PBS (yhdistetyt tiedot 5 erillisen kokeen näkyvät). (B) Kaplan-Meier selviytymisen juoni samassa kokeessa. (C) kasvaimen pinnan mm

2 (keskiarvo ± SD) ja AB1-HA kasvaimia, joihin injektoitiin päivänä 0, hiiret (n = 65) hoidettiin päivänä 9 200 ug anti-CTLA-4 ja 6 ug /g sisplatiini, tai PBS (yhdistettyjen tietojen 3 erillisestä kokeesta on esitetty). (D) Kaplan-Meier selviytymisen juoni samassa kokeessa.

Aikaisemmat tutkimukset syöpäpotilailla ja eläimet ovat ehdottaneet, että ICOS

+ T-soluilla on tärkeä rooli toiminnan anti-CTLA -4, sekä ottaa ennustetekijöiden merkitystä [18], [19]. Analysoimme ICOS ilmaisun ja proliferatiivinen tila kiertävien T-solujen hiirissä ja havaitsivat, että hiiret, jotka saivat yhdistelmähoito osoitti merkittävää kasvua CD4

+ ICOS

+ T-solujen ääreisverenkierrossa, sekä selkeä lisäys CD4

+ proliferatiivista T-solujen määritettynä Ki-67 värjäytymistä (kuva 2A-D, p 0,001).

vertailu esitetään ääreisverenkierron T-soluaktivaation ja lisääntymistä markkereita päivänä 29 istuttamisen jälkeen eri hoitoryhmissä (* p≤0.05; ** p 0,01 *** p 0,001). ICOS

+ /CD4

+ Th-solujen (A); Ki-67

+ /CD4

+ Th-solujen (B); CD8

+ /ICOS

+ CTL: t (C) ja CD8

+ /Ki-67

+ CTL: t (D). (E ja F) virtaussytometrinen analyysi lisääntyvien CD8

+ T-solujen ja Treg kasvaimen, kasvaimeen imusolmukkeiden ja pernan päivänä 15. Esitetään prosenttiosuus Ki-67

+ CD8

+ CD3

+ solujen ja Foxp3

+ CD4

+ CD3

+ solujen (F). Kuusi hiirtä ryhmää kohden testattiin ohjaus ja anti-CTLA-4, 12 hiirtä per ryhmä gemsitabiinia sisältävien järjestelmien yhdistettiin per 2 hiiret, koska pienet kasvaimen koon näissä ryhmissä. Keinot, joilla hakukonemarkkinoijat esitetään (n = 36). (G) Kaplan-Meier selviytymisen käyrä AB1-HA kasvaimia, joihin injektoitiin päivänä 0, hiiret (n = 57) hoidettiin anti-CTLA-4 ja /tai gemsitabiinin tai PBS: llä yhdessä heikentävien vasta-aineita CD4- tai CD8 (yhdistetyt tiedot 2 erillisen kokeen esitetty).

saat paremman käsityksen koostumus kasvaimen infiltroituneen solujen hoidon aikana, laskimme taajuus Foxp3 + CD4 + Tregs, CD49b

+ CD3

– NK-solujen ja ICOS

+ CD4

+ aktivoitu Th-solujen ja Ki-67

+ CD8

+ lisääntyvien CTL kasvain, kasvain-tyhjennys imusolmukkeet (TDLN) ja perna päivänä 15 (kuvio 2E-F, kuva S8). CD8

+ CTL: t eivät eronneet hoitoryhmissä (kuvio S8), mutta niiden proliferatiivinen kapasiteetti, mitattuna Ki-67 tosin nousussa, kun hiiriä hoidettiin anti-CTLA4, sekä kasvaimen ja TDLN. Mielenkiintoista on, että suhteellinen menetys lisääntyvien kasvainta infiltroivien CD8

+ T-solujen gemsitabiinin-käsitellyillä hiirillä oli osittain pelastettiin anti-CTLA-4 (kuvio 2E). Kasvain CD4 + T-solujen tunkeutuminen ei muuttunut merkittävästi joko gemsitabiini tai anti-CTLA-4, vaikka ICOS ilmaisu markkerina aktivaatio väheni kaikilla gemsitabiinin käsitellyissä hiirissä, tai ilman anti-CTLA4 (Kuva S8). Prosenttiosuus kasvaimen infiltroituneen Foxp3

+ CD4

+ T-solut oli merkittävästi vähentynyt kasvaimissa gemsitabiiniryhmässä, anti-CTLA-4 tai yhdistelmähoito (kuvio 2F), joka on löytää yhdenmukaisia ​​aiemmin julkaistu tietoja [10 ]. Mitään selvää eroja havaittiin NK-solujen määrä hoitoryhmien välillä (kuvio S8).

Sen tutkimiseksi, parannetun vaste yhdistelmähoito sisältyy pääasiassa CD4

+ tai CD8

+ T-solujen tai NK solut, suoritimme heikentävien kokeet, joissa käytetään monoklonaalisia vasta-aineita vastaan, CD4, CD8 (AB1-HA-malli) ja NK1.1 (LLC malli, koska BALB /C-hiiriä eivät ilmennä NK1.1). Huomasimme, että terapeuttinen vaikutus gemsitabiinin plus anti-CTLA4 kumosi kokonaan, kun joko CD4

+ tai CD8

+ solut köyhdytetty (kuvio 2G), kun taas ehtyminen NK-solut eivät vaikuta hoidon tehoa ( Kuvio S9). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että anti-CTLA-4 ja kemoterapia synergisesti induktioon voimakas anti-kasvain immuunivasteen, jolla on tärkeä rooli sekä CD4

+ ja CD8

+ T-solujen optimaalisen terapeuttisen vaikutuksen .

Anti-CTLA-4 ja Gemsitabiini Yhdistelmähoito indusoi Pitkäkestoinen Suojaava Anti-kasvain immunologinen muisti

Yksi tärkeä teoreettinen edut immunoterapian yli kemoterapia on, että entinen on potentiaalia indusoi immunologinen muisti ja siten mahdollisuus saavuttaa pysyviä vasteita. Testasimme yhdistelmän hoito anti-CTLA-4 ja gemsitabiini johti kasvaimen vastaisen immunologisen muistin. Olemme reinoculated hiiriä, jotka olivat tuumorit hävisivät seuraavan yhdistelmän hoidon ja havaitsi, että 93% (13 ulos 14 hiiret) näiden hiirten olivat täysin resistenttejä kasvaimen hoidon uudelleen (kuvio 3A). Tärkeintä, uudelleenaltistuksen kokeissa käytettiin AB1-soluja, joita ei ole transfektoitu HA, mikä osoittaa, että indusoitu immuniteetti oli vastaan ​​jaettuja kasvaimen antigeenien AB1 mesoteliooma soluja eikä pelkästään vastaan ​​transfektoitu HA-antigeenin. Virtaussytometrinen analyysi T-solualaryhmien, että tyhjennys imusolmukkeet nämä hiiret osoittivat kohonneet sekä keskus- muistin ja effektori CD4

+ T-soluja, ja vähäisemmässä määrin CD8

+ muisti solujen (kuvio 3B-E , p 0,001). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että yhdistelmähoito johtaa lisäykseen muisti-T-solujen ja suojaavan immuniteetin induktiolle.

(A) Kaplan-Meier selviytymisen juoni hiirten, jotka oli kovetettu joko anti-CTLA- 4 yksinään tai yhdistelmähoidon ja jotka myöhemmin altistettiin uudelleen AB1 mesoteliooma soluja, jotka osoittavat suojaavan immuniteetin 80% ja 92% vastaavasti. T-solujen osajoukko analyysi kasvaimen tyhjennys imusolmukkeet näissä hiirissä (* p 0,05; ** p 0,01 *** p 0,001): CD44

+ /CD62L

+ /CD4

+ T muisti-soluja (B); CD44

+ /CD62L

– /CD4

+ T effektori soluja (C); CD44

+ /CD62L

+ /CD8

+ T keskusmuistia soluja (D); CD44

+ /CD62L

– /CD8

+ T effektori solut (E).

tehokkuus Anti-CTLA-4 /gemsitabiini Riippuu ajoitus

jotta määrittää optimaalisen hoitoaikataulussa ajoituksen sekä anti-CTLA-4 ja gemsitabiinin, käsittelimme AB1-HA kasvainta kantavien hiirten kolme eri järjestelmää: gemsitabiini seurasi anti-CTLA-4, samanaikainen yhdistelmähoito ja anti-CTLA-4 ja sen jälkeen gemsitabiini (kuvio S3; kuvio 4). Yksi eläin anti-CTLA-4 ja sen jälkeen gemsitabiini ryhmä teurastetaan koska painonpudotus yli 15%, toisin ei ollut ilmeistä toksisuutta. Havaitsimme selviä eroja kasvaimen kasvulta näiden ryhmien välillä (kuvio 4). Ei ollut mitään merkittävää lisäainetta arvo yhdistelmähoidon yli joko anti-CTLA-4 tai gemsitabiini yksin, kun kemoterapeuttinen lääke annettiin erikseen anti-CTLA-4. Synergistinen antituumorivaikutus havaittiin ainoastaan ​​silloin, kun molemmat lääkevalmisteet annettiin samanaikaisesti. Yllättäen kun vain ensimmäinen gemsitabiinin annos oli jätetty pois (kuten ”anti-CTLA-4 ensimmäinen” arm vs. samanaikainen arm), kasvaimen vastainen vaikutus laski dramaattisesti (kuvio 4). Nämä tiedot osoittavat, että sopiva aikatauluttaminen lääkeaineita erikseen on kriittinen optimaalisen tehon.

(A) Kasvain alue mm

2 (keskiarvo ± SD) on AB1-HA kasvaimia, jotka injisoitiin päivänä 0, -hiiriä (n = 86) käsiteltiin eri helpottavat anti-CTLA4 ja gemsitabiinin (katso kuva S2), tai PBS: llä (yhdistetyt tiedot 3 erillisestä kokeesta on esitetty). (B) Kaplan-Meier selviytymisen juoni samassa kokeessa.

Keskustelu

Yhdistelmä kemoterapiaa ja immunoterapia on syövän hoitoon pitää realisoitumattomien lupauksen [1]. Äskettäin FDA-hyväksytty anti-CTLA-4-vasta-aine on looginen ja helposti käännettävissä immunoterapeuttisia lähestymistapa yhdistää kemoterapiaa. Oletimme, että voisimme löytää synergistinen vuorovaikutus yhdistelmä anti-CTLA-4-esto ja immuniteettia sytotoksinen lääke. Odotimme, että kemoterapia aiheuttaa kasvaimen kutistumista ja immunogeenisen antigeenin vapautumisen, kun anti-CTLA-4 parantaisi T-solujen aktivaation ja laajentamiseen. Ennen tietojen tukemaan tätä hypoteesia olivat rajalliset. Suuri faasi III tutkimuksessa etäispesäkemelanoomassa verrattaessa anti-CTLA-4 plus DTIC versus DTIC yksin löysi eloonjäämishyötyä yhdistelmähoitoa verrattuna DTIC kemoterapiaa yksinään [13]. Mutta koska ei ollut verrattuna anti-CTLA-4 Pelkästään suhteellinen vaikutus kemoterapiaa havaittu vaikutus ei voida tarkasti arvioida. Vastaavasti vaiheen II tutkimuksessa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, löydetty parannettu ilman taudin etenemistä varten yhdistelmä ipilimumab ja kemoterapia verrattuna pelkän solunsalpaajahoidon; jälleen tässä ipilimumab yksinään ei ollut vertailuryhmässä [20]. Faasin II tutkimuksessa että ei vertailla ipilimumab yksin versus ipilimumab plus DTIC, mutta käyttämällä pienempiä annoksia tutkimuslääkeannoksen, oli suuntaus kohti paremman tautien torjunnan korko yhdistelmähoitoa saaneilla, mutta tämä ei saavuttanut merkitystä [21]. Näiden pohjalta julkaistut ihmisillä tehdyt tutkimukset, mitään lopullista voida tehdä johtopäätöksiä mahdollisesta synergiavaikutuksesta anti-CTLA-4 ja kemoterapiaa. Vaikka edellinen eläinten tutkimuksen löysi parannettu antituumoriteholla, kun anti-CTLA4 lisättiin melfalaanin kemoterapia, tässä kokeessa käytettiin subterapeuttinen annos melfalaanin, joiden tarkoituksena on vinossa T-soluvasteita kohti Th1-fenotyyppiä [22]. Äskettäin Wu ja kollegansa totesi, että anti-CTLA-4 käsittely yhdistettynä sisplatiiniin johti parempaan taudintorjuntamenetelmien hiiren mesoteliooma malli, kun kasvaimia käsiteltiin ennen he olivat käsin kosketeltava, johtuen luultavasti esti syöpäsolu kannan uudelleen [23]. Emme löytäneet julkaistu eläinten kannalta merkityksellisiä tietoja hypoteesia käyttäen terapeuttisia annoksia kemoterapian avoin syöpää.

Kuten gemsitabiinia käytetään laajalti hoidettaessa monia syöpätyyppejä, mukaan lukien mesoteliooma, testasimme yhdistelmä on hyvin perustettiin ei-immunogeenisiä hiirimallissa mesoteliooma. Hoito AB1-HA gemsitabiinihoito johtaa kohtalainen kasvain vähentäminen tai viivästynyt kasvaimen kasvulta tässä mallissa, mikä matkii kliininen tilanne kemoterapeuttisen hoidossa useimpien metastaattisen syövät.

täältä että yhdistelmähoito Gemsitabiinin ja anti -CTLA-4 kohdistuu paljon suurempi antituumorivaikutus kuin jompikumpi aineista yksinään, mikä toimii synergistinen tavalla (kuvio 1). Tämä korreloi selvä lisäys CD4

+ ICOS

+ T-solujen ääreisverenkierrossa, sekä selvästi lisääntynyt lisääntyvissä CD4

+ T-solut määritettynä Ki-67 värjäys, vaikka emme tunnistaa tämän kasvu kasvaimen sekä (kuvio 2). CD4

+ T-solujen tunkeutuminen kasvain tehostettiin yhdistelmähoitoa, ja gemsitabiinin liittyvä lasku lisääntyvissä kasvaimeen infiltroituneen CD8

+ T-solujen osittain pelastettiin CTLA-4-eston. Mikä tärkeintä, emme löytäneet väheneminen kasvaimen kasvua, kun anti-CTLA-4 yhdistettiin sisplatiiniin. Sisplatiini on osoitettu indusoivan ei-immunogeeninen solukuoleman muoto, [17], ja vaikka se ei downregulate estävää molekyyliä PD-L2-[5], kasvain malli käytämme ilmaisee vain hyvin pieniä määriä PD-L2 (data ei esitetty). Siksi pidämme sisplatiinia olla ei-immuniteettiä muoto kemoterapian tässä mallissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmähoito anti-CTLA-4 on tehokkain, kun se yhdistetään immuunivastetta kemoterapiaa.

Koska yksi teoreettinen edut yhdistyvät kemoterapiaa immunoterapia on induktio pitkäkestoinen immunologinen muisti, olemme tutkineet muisti-T-solu-vasteen hiirissä kasvaimia, jotka olivat taantumista käsittelemällä (kuvio 3). Olemme havainneet, että nämä hiiret olivat lisääntyneitä määriä sekä CD4

+ ja CD8

+ effektori ja muisti-T-solujen kasvaimen tyhjennys imusolmukkeet, korreloi suojaavan immuniteetin Haastealtistus kasvainsolujen kanssa. Nämä havainnot mukaisia ​​tutkimuksia hiiren OVA-ilmentävien

Listeria monocytogenes

malli, jossa CD8

+ T-solu muisti parannettiin yhden annoksen anti-CTLA-4 [14]. Mikä tärkeintä, meidän malli, eikä muodostumista CD4

+ eikä CD8

+ muisti-T-solujen haittasivat gemsitabiinia.

Kolmantena tavoitteena oli määrittää optimointisäädölle kemoterapiaa ja anti-CTLA -4 hoito. Koska tiedetään useista eläinkokeissa että ajoitus on ratkaisevan tärkeää käyttää anti-CTLA-4 yhdistettynä rokotukset lähestymistapoja [24], [25], me arveltu, että optimaalinen ajoitus /aikataulutus yhdessä kemoterapian olisi myös kriittinen anti-CTLA-4-tehoa. Huomasimme, että yhdistelmän tehoon todellakin riippui ajoitus: jos gemsitabiini annettiin ennen tai jälkeen anti-CTLA-4, ei ollut mitään lisäainetta arvo ylittää joko hoito yksinään, kun taas samanaikainen käyttö ei johda taudin torjuntaa useimmissa hiirten ( Kuva 4).

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että anti-CTLA-4-hoidon ja solunsalpaajahoito voi olla selkeä synergistinen vaikutus syövän hoidossa. Tuloksemme antaa perusteet kehittää yhdistelmiä sytotoksisten lääkkeiden ja anti-CTLA-4 klinikalla. Kuitenkin perustuvat tietoihin suosittelemme, että eri sytotoksisten syöpälääkkeen yhdisteistä, niiden optimaalinen aikataulu ja immunogeenisuutta on ensin huolellisesti määritettävä prekliinisissä malleissa ja pieniä kliinisissä tutkimuksissa.

tukeminen Information

Kuva S1.

Hoitoaikataulu Gemsitabiinin ja anti-CTLA-4 AB1-HA malli. Balb /c-hiiret inokuloitiin 1 x 10

6 AB1-HA hiiren mesoteliooma solut päivänä 0 ja sen jälkeen injektoitiin ip PBS, 120 ug /g kehon paino gemsitabiini joka kolmas päivä viisi annosta (Q3Dx5) päivinä 9- 12-15-18-21 tai 75 ug anti-CTLA-4 (Q3Dx4) päivinä 9-12-15-18, joko yksinään tai yhdistelmänä, kuten on esitetty.

doi: 10,1371 /journal.pone.0061895. S001

(PDF) B Kuva S2.

Hoitoaikataulu Gemsitabiinin ja anti-CTLA-4 LLC mallissa. C57BL /6-hiiriin istutettiin 2,5 x 10

5 LLC hiiren keuhkosyöpään solut päivänä 0 ja sen jälkeen injektoitiin ip PBS, 120 ug /g kehon paino gemsitabiini joka kolmas päivä viisi annosta (Q3Dx5) päivinä 6-9 -12-15-18 tai 75 ug anti-CTLA-4 (Q3Dx4) päivinä 6-9-12-15, joko yksinään tai yhdistelmänä, kuten on esitetty.

doi: 10,1371 /journal.pone.0061895.s002

(PDF) B Kuva S3.

Hoitoaikataulu yhdistelmähoitoa Gemsitabiinin ja anti-CTLA-4 AB1-HA malli, jossa verrataan eri hoito-ohjelmat. Balb /c-hiiret inokuloitiin 1 x 10

6 AB1-HA hiiren mesoteliooma solut päivänä 0 ja sen jälkeen injisoitiin IP 120 ug /g kehon paino gemsitabiini (Q3Dx5) ja 75 ug anti-CTLA-4 (Q3Dx4) jaettuna yli kolme ryhmää, ”samanaikainen” (anti-CTLA-4: n päivän 9-12-15-18; gemsitabiini päivinä 9-12-15-18-21), ”anti-CTLA-4 ensin” (anti-CTLA- 4 päivinä 9-12-15-18; gemsitabiini päivinä 12-15-18-21-24) ja ”gemsitabiinia ensimmäinen” (gemsitabiinin päivinä 9-12-15-18-21, anti-CTLA-4 päivinä 24-27-30-33).

doi: 10,1371 /journal.pone.0061895.s003

(PDF) B Kuva S4.

annoksen optimointia tutkimus anti-CTLA4 että AB1-HA malli. Kasvaimen pinta mm

2 (keskiarvo ± SD) ja AB1-HA kasvaimia, joihin injektoitiin päivänä 0, hiiret (n = 40) käsiteltiin 75 ug anti-CTLA-4 i.p. päivinä 9-12-15-18 annettuina annoksina ja gemsitabiinihoito 120 ug /g kehon painoa päivää 12-15-18-21-24.

doi: 10,1371 /journal.pone.0061895.s004

(PDF) B Kuva S5.

Gating strategian määrittämiseksi muisti-T-solujen alaryhmiä kasvaimia tyhjennys imusolmukkeet, virtaussytometriaa käyttämällä. Kasvaimen tyhjennys imusolmukkeet kerättiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät osassa.