Krooninen sairaus

tiivistelmä

sisplatiini on yleisimmin hyväksytty lääke hoitoon munasarjasyöpä lähes 40 vuotta. Vaikka suurin osa munasarjasyöpäpotilaalle reagoivat etulinjan platina yhdistelmä kemoterapiaa, monet potilaat kehittävät sisplatiini-vastustuskyky tautia, joka on erittäin nopea ja kuolemaan. Vaikka erilaisia ​​mekanismeja sisplatiinin vastus on oletettu, avain osallistuvien molekyylien kuten vastus ei ole tunnistettu. MiRNA endogeenisesti ilmaistaan ​​pienet ei-koodaavat RNA: t, jotka ovat evoluutiossa konservoituneita ja toimivat posttranskriptionaalisen sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen. Häiriöstä miRNA on yhdistetty syöpään aloittamista etenemiseen ja lääkeresistenssin. Onkogeeninen miRNA-21, joka on yksi parhaiten tutkittu miRNA määrä lisääntyy lähes kaikissa ihmisen syövissä. Kuitenkin sääntely miR-21 sisplatiini resistenttien munasarjasyöpäsoluja ei ole arvioitu. Tässä tutkimuksessa mittasimme miR-21 ilmentyminen reaaliaikaisella PCR ja löysi ylössäätely miR-21 sisplatiinin kestävä verrattuna sisplatiiniin herkkä munasarjasyöpäsoluja. Kromatiinin immunosaostus tutkimukset osoittivat yhdistys c-Jun-transkriptiotekijän, että PRI-mir-21 DNA promoottorialueille. Estää JNK-1, suuret aktivaattori c-Jun: n fosforylaation, vähentää ilmentymistä pre-mir-21 ja lisääntynyt ilmentyminen sen tunnettujen kohdegeenin, PDCD4. Yli-ilmentymisen miR-21 sisplatiinin herkkien solujen vähentynyt PDCD4 tasot ja lisääntynyt solujen lisääntymistä. Lopuksi kohdistaminen miR-21 vähensi solujen kasvua, lisääntymistä ja hyökkäys sisplatiinin resistenttien munasarjasyöpäsoluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että JNK-1 /c-Jun /miR-21 reitti edistää sisplatiinin vastus munasarjasyövän solujen ja osoitti, että miR-21 on mahdollinen kohde voittamiseksi sisplatiinin vastus.

Citation: Echevarría -Vargas IM, Valiyeva F, Vivas-Mejía PE (2014) lisääntymisen merkkejä miR-21 Sisplatiini Kestää Munasarjasyöpä kautta JNK-1 /c-Jun Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97094. doi: 10,1371 /journal.pone.0097094

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 02 tammikuu 2014; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 27, 2014

Copyright: © 2014 Echevarría-Vargas et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat osittain NIH /NCI (1K22CA166226-01A1) ja PeVM, institutionaalisten siemenrahastot yliopistosta Puerto Rico Kattava Cancer Center (PeVM), National Institute of Health, ja Minority Biomedical Research Support (MBRs) RISE Grant Number R25- GM061838 (IEV). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia kiinnostusta ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OvCa) osuus lähes 3% kaikista syövistä länsimaissa [1]. Tyypillinen hoito naisille OvCa on cytoreduction jälkeen kemoterapiaa [2]. Vaikka korkea alkuperäisen vaste sisplatiini- yhdisteitä ensilinjan kemoterapiaa, useimmat munasarjakarsinoomat taudin uusiutumiseen [2], [3]. Oletetut mekanismeja sisplatiinin resistenssin ovat vähentynyt kertymiseen solun sisplatiinin, lisääntynyt solunsisäisiä tasoja tiettyjä rikkiä sisältäviä makromolekyylejä, ja kohonnut DNA korjaukseen [4]. Todisteet viittaavat siihen, että inaktivointi luontainen solukuolemareittejä, aktivoituminen solun eloonjäämisreittejä, ja säätelyhäiriö onkogeenien, kasvaimen synnyssä, ja MikroRNA, edistää sisplatiinin vastus munasarjasyöpäsoluja [3], [5], [6]. Kuitenkin tarkka mekanismi, jolla munasarjasyöpäsoluja tulevat vastustuskykyisiksi sisplatiinihoitoon on tällä hetkellä tuntematon.

MikroRNA (miRNA) ovat luonnossa esiintyviä pieniä (21-22 emäsparia) ei-koodaavat RNA: t, joka tunnistaa pääasiassa 3 ”-UTR alue lähetti-RNA (mRNA) ja estävät proteiinisynteesiä [7]. Viimeaikaiset raportit osoittavat, että häiriöstä miRNA, ja niiden kohdegeenien, edistää syövän aloittamista, etenemistä ja lääkeresistenssin [6], [8], [9]. Näistä syistä, miRNA on ehdotettu diagnostista, prognostista ja tavoitteet syövän hoidossa [10]. Yksi parhaista tutkimusten miRNA on miR-21, joka on yli-ilmentynyt useimmissa syövät ja näyttää onkogeeninen aktiivisuus [11]. HER2 (+) rintasyöpiä yliekspressio miR-21 resistenssin trastutsumabille hoito [12]. Nam et ai., Löytyy miR-21, miR-203, ja miR-205 yliekspressoitiin vakavien munasarjasyövän ja normaalissa munasarjakudoksessa; miR-21 on läsnä 85% näytteistä [13]. Xie et ai. Havaittiin, että A2780 ihmisen munasarjan syöpäsolujen, miR-21 moduloi hypoksia-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α), ja vastus paklitakselin [14]. MiR-21 saa aikaan biologinen rooli suuntaamalla avain säätelevien geenien solujen kasvua ja lisääntymistä. Kuitenkin kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien munasarjasyöpä, tuumorisuppressorigeenin ohjelmoidun solukuoleman 4 (PDCD4) näyttää olevan yksi tärkeimmistä toiminnalliset miR-21 tavoitteet [15], [16], [17]. Keskeinen rooli PDCD4 munasarjasyövän tukee lisäksi havaintojen alhaisempi tämän tuumorisuppressorin korreloi suoraan huonon ennusteen munasarjasyövän potilailla [15]. Viime aikoina, Chan et ai. osoittivat, että miR-21 yli-ilmentyy sisplatiinin herkkä verrattuna sisplatiinin resistentit solut, ja että miR-21 eston aiheuttaman apoptoosin ja lisää PDCD4 tasolla [18].

ylävirran molekyylitason tapahtumia, jotka selittää miR-21 yli-ilmentymisen in munasarjasyöpäsoluja on vielä tutkittava. Raportit osoittavat, että PRI-mir-21 DNA promoottorin alueet sisältävät tunnustusta elementtejä c-Jun ja STAT3 transkriptiotekijöiden [19]. Paksusuolen syöpäsoluja, curcumin vähensi miR-21 kautta AP-1 (transkriptiotekijä kompleksi koostuu c-Jun ja c-Fos, lähinnä) sääntely ja ihmisen promyelocytic solulinjan HL-60, forboli 12-myristaatti 13- asetaatti (PMA) indusoi miR-21 ilmentyminen AP-1 aktivaatio [17], [20]. MiR-21 ylösajon AP-1 havaittiin myös tietyissä solunsalpaajaresistentti puolella populaatiot syövän kantasolujen [21].

Koska tunnustettu asema miR-21 syövässä aloittamista, etenemistä ja lääkeresistenssi, tutkimme sääntely miR-21 sisplatiini resistenttien munasarjasyöpäsoluja. Käytimme reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR), ja havaitsivat, että sisplatiini resistenttejä munasarjasyövän solut ilmentävät korkeampia miR-21 tasoa verrattuna sisplatiinin herkät solut. Sitten analysoimme mahdollinen mekanismi miR-21 säätelyä. Solujen käsittely SP600125, estäjä c-Jun-fosforylaation, vähensi pre-mir-21 ilmentyminen sisplatiinin resistenttien munasarjasyöpäsoluja. Kromatiinin immunosaostus (chip) tutkimukset osoittivat korkeampia c-Jun fosforylaatiota (p-c-Jun) proteiinin tasot sitoutuneena pri-mir-21 DNA promoottorialueen sisplatiinin kestävä verrattuna sisplatiiniin herkkä munasarjasyöpäsoluja. Yli-ilmentymisen miR-21 sisplatiinin herkkien solujen, lisääntynyt solujen lisääntymistä, ja vähensi PDCD4 proteiinin tasot. Opposite, miR-21 oligonukleotidiestoaineen (antagomir), merkittävät estivät solujen kasvua, lisääntymistä ja hyökkäys kyky A2780CP20 soluja. Nämä tiedot osoittavat, että ylössäätely JNK-1 /c-Jun-reitin johtaa poikkeavaan lisääminen miR-21, ja ehdottaa miR-21 mahdollisena kohteena voittamiseksi sisplatiinin vastus munasarjasyöpäsoluja.

materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Sisplatiini ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ja liuotetaan 0,9% NaCl. SP600125 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) liuotetaan 100% DMSO: ssa jopa lopulliseen pitoisuuteen 10 mM. Kun lisätään soluihin, lopullinen DMSO-konsentraatio on elatusaine oli alle 0,1%.

Solut ja viljelyolosuhteet

Ihmisen munasarjan epiteelin syöpäsolujen SKOV3ip1, HEYA8, ja A2780CP20 solut on kuvattu muualla [22], [23], [24], [25], [26]. A2780 ja A2780CIS solut ostettiin European Collection of Cell Cultures (ECACC). Solut kasvatettiin

in vitro

RPMI-1640-alustassa (Thermo Scientific, Logan, UT, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Thermo Scientific) ja 0,1% antibiootti /antimykoottiliuoksella (Thermo Scientific) ja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2/95,% ilmaa. Kaikki tuumorisolulinjat seulottiin käyttämällä mykoplasma poistaminen ainetta, kuten on kuvattu valmistajan (ABD Sertotec, NC, USA).

In vitro

määritykset suoritettiin 70-85% solutiheyteen. A2780CP20-soluja (5 x 10

5 solua /malja), käsiteltiin 10 umol /l SP600125 kahdeksan tuntia. Sisplatiini pitoisuudet estämällä 50% solujen kasvun (IC

50) laskettiin sen jälkeen, kun 72 tunnin lääkeaineen inkubaation (sisplatiini annokset: 100, 10, 1, 0,1, ja 0,01 uM, lopulliset pitoisuudet). Solukasvu mitattiin Alamar sinistä väriainetta, kuten aikaisemmin on kuvattu [27].

Microarray-analyysi geenin ilmentymisen

Kokonais-RNA eristettiin A2780 ja A2780CP20 munasarjasyövän solulinjoissa kanssa GenElute Mammalian Yhteensä RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich). RNA-pitoisuus luettiin nanodrop. RNA laatu varmistettiin on Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Sata nanogrammaa kokonais-RNA: ta käytettiin cDNA: n synteesiin. Täydentävät cDNA syntetisoitiin, merkitty, hajanainen ja hybridisoidaan Affymetrix GeneChip- Gene 1.0 ST Human Array. 16 tunnin inkuboinnin 45 ° C: ssa, taulukot pestiin, värjättiin ja skannataan (Affymetrix Model 3000 skanneri), ja tiedot analysoitiin käyttäen Partek Genomics Suited (Partek, St. Louis, MO). Kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Kaksisuuntainen ANOVA määrittämiseen käytettiin erojen geeniekspression (p 0,05 kertainen muutos 2). 1359 koettimia (4%) sarjaa osoittivat ± 2-kertainen muutos välillä A2780CP20 ja A2780-soluissa. Lisäsuodatusta (± 3-kertainen muutos, ja p 0,003) osoitti 321 antureista (0,96%) muuttaa välillä A2780CP20 ja A2780-soluissa.

RNA: n eristys ja cDNA-synteesi

Yhteensä-RNA (mukaan lukien miRNA ) eristettiin käyttämällä

mir

Vana miRNA eristyspakkausta Ambion (Life Technology, Grand Island, NY). RNA muutettiin cDNA kanssa Enhanced Avian RT ensimmäisen juosteen synteesi pakki Sigma-Aldrich. Lyhyesti, kokonais-RNA (1 ug), 500 uM dNTP: tä ja 3,5 uM oligo (dT)

23 sekoitettiin ja lisättiin vettä 10 ul: n kokonaistilavuudessa. Näytteet sekoitettiin, sentrifugoitiin ja kuumennettiin 70 ° C: ssa 10 min. Tämä seos yhdistettiin 1 ui parannettu avian RT, 2 ui 10 x puskuria, 1 ui RNaasi-inhibiittoria, ja vettä jopa 20 ui lopulliseen tilavuuteen. Näytteitä inkuboitiin 25 ° C: ssa 15 minuuttia jälkeen, 45 ° C: ssa 50 minuuttia. cDNA-synteesi havaita kypsä miRNA suoritettiin All-in-One miRNA qRT-PCR havaitseminen pakki (GeneCopoeia, Rockville, MD). Lyhyesti, cDNA-synteesi sisälsi 1 ug kokonais-RNA: ta, 1 ui poly (A) Polymerase, 1 ui RTase Mix, 5 ui 5X PAP /RT-puskuria ja vettä jopa 25 ui lopulliseen tilavuuteen. Revere transkription reaktioseosta inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 min, ja 85 ° C: ssa 5 min ajan Veriti lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA).

Polymerase Chain Reaction (PCR) ja SYBR- I-pohjainen reaaliaikainen PCR

PCR suoritettiin Verity 96 kuoppaan -lämpösyklilaitteella (Applied Biosystems). Lyhyesti, 12,5 ui JumpStart REDTaq READYMIX 1X (Sigma), 0,5 ui eteenpäin, ja 0,5 ui reverse-alukkeita (0,4 uM lopullinen pitoisuus kussakin), 2 ui cDNA-tuotteen, ja vettä 50 ul: n lopulliseen tilavuuteen. Pyöräily-olosuhteet olivat seuraavat: yksi sykli 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä 95 ° C 15 sekuntia (denaturointi), 60 ° C 30 sekuntia (pariutuminen) ja 72 ° C 30 sekuntia (laajennus). Lopullinen pidennys vaihe suoritettiin 72 ° C: ssa 10 min. PCR-tuotteet erotettiin elektroforeesilla 1% agaroosigeelillä. Kuvat saatiin (sen jälkeen kun geeli etidiumbromidivärjäyksellä) on FluorChem 8900 (Alpha Innotech). SYBR-I-reaaliaikainen PCR arvioida kypsän miR-21 tasot suoritettiin All-in-One miRNA qRT-PCR havaitseminen pakki (GeneCopoeia) on StepOne plus reaaliaikainen PCR-lämpökäsittelyn järjestelmä (Applied Biosystems). PCR-reaktiot seos sisälsi 10 pl 2X All-in-One qPCR Mix, 2 ui All-in-One miRNA qPCR pohjamaali, 2 ui universaali adapteri PCR, 2 ui ensimmäisen juosteen cDNA, ja 4 ui vettä. Spesifisiä alukkeita miR-21 ja U6 (sisäinen standardi) käytettiin (GeneCopoeia). Sykliolosuhteita: yksi sykli 15 min 95 ° C: ssa, ja 40 sykliä 15 sekuntia 94 ° C: ssa, 30 s 60 ° C: ssa ja 30 sekuntia 72 ° C: ssa [28]. Melt-käyrä analyysi suoritetaan aina lopussa PCR-reaktion. Suhteellinen miR-21-ekspressio laskettu ΔΔCt-menetelmällä [29], [30], [31].

Western blot-analyysi

Solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa Fosfaattipuskuroitu suolaliuos ( PBS), otettiin talteen ja säilytettiin -80 ° C: ssa käsittelyyn asti. Sillä soluliman ja ydin- uuttamalla, solut suspendoitiin uudelleen sytoplasman puskuriin (0,5% Nonidet P-40, 10 mM KCI, 10 mM Hepes, pH 7,9, ja 1 x proteaasi-inhibiittori) 15 minuutin ajan jäissä ja sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä 4 ° C: ssa [32]. Supernatantit (sisältävät solulimafraktio) kerättiin. Loput pelletit pestiin kahdesti sytoplasman puskurin jälkeen, lisäämällä ydin-puskuria (400 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,9 ja 1 x proteaasi-inhibiittori). Näytteitä inkuboitiin 15 minuutin ajan jäillä, sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti (joka sisältää ydin- proteiinifraktiot) kerättiin. Täydellistä proteiinien uutto, solut lyysattiin lyysipuskurilla (150 mM NaCl, 1% Triton-X, 0,4 mM NaF, 0,4 mM NAvó

4, 25 mM Tris-HCl, pH 7,6 ja 1 x proteaasi-inhibiittori) 45 min jäillä, sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantit kerättiin. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-Rad Protein Reagenssit (Bio-Rad, Hercules, CA). Proteiini lysaatit (50 ug) erotettiin SDS-PAGE: lla, blotattiin kalvot, ja tutkittiin sopiva laimennos jokaisen primaarisen vasta-aineen. Membraanit huuhdottiin ja inkuboitiin sopivan piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen, huuhdeltiin jälleen, ja sitoutuneet vasta-aineet todettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia (GE Healthcare, Piscataway, NJ) seuraavasti autoradiografialla on FluorChem 8900 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA). Ensisijainen anti-elimet: anti-fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), anti-SAPK /JNK, anti-fosfo-c-Jun (Ser73), anti-c-Jun, anti-fosfo-ERK (Thr202 /Tyr204 ), anti-ERK kinaasi, anti-STAT3, anti-histoni H3 (Cell Signaling, Danvers, MA), anti-PDCD4 (Rockland, Gilbertsville, PA) ja anti-β-aktiini (Sigma-Aldrich). Sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin anti-hiiri ja anti kaniinin IgG piparjuuriperoksidaasi (HRP) -sidoksellisia, kaniinia (Cell Signaling).

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) B

A2780CP20 ja A2780 solut kerättiin ja silloitetun 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut hajotettiin natriumdodekyylisulfaattia (SDS) lyysipuskuria (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8,1 ja proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit). Näytteet sonikoitiin (4 ° C) käyttämällä Branson 250 sonikaattorilla 10 jatkuu pulssit 10 sekunnin (s) kukin. Sonikoitua lysaatit esipuhdistettiin proteiini A tai G magneetti helmiä yön yli 4 ° C: ssa. Lysaatit immunosaostettiin 5 tai 10 ug vasta-ainetta /magneetti helmiä vastaan ​​pc-Jun, Pol-II (Santa Cruz), c-Jun (BD Transduction laboratoriossa, Franklin Lakes, New Jersey, USA) tai IgG: tä (Abcam, Cambridge, MA , USA) yön yli 4 ° C: ssa. Näytteet pestiin viisi kertaa 5 min kukin 4 ° C: ssa pesupuskurilla (RIPA) (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 500 mM LiCl: a, 1% NP-40, 0,7% deoksikolihappo, 1 mM EDTA, ja 1 x proteaasi- ja 1X fosfataasi-inhibiittorit). Näytteet pestiin kerran 1 x TE-puskuria ja eluoitiin SDS-eluutiopuskuria (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8,1, ja 1 x proteaasi ja 1X fosfataasi-inhibiittorit). Eluoinnin jälkeen, näytteet käänteisfaasi silloitettu 65 ° C: ssa 4 tunnin ajan, käsiteltiin RNaasi A: lla (0,2 ug /ml) 37 ° C: ssa 2 tuntia, sekoitetaan CaCl

2 (300 mM CaCl

2 10 mM Tris, pH 8,0) ja proteinaasi K: n (0,2 mg /ml) 37 ° C: ssa yön yli. Immunosaostetut DNA eristettiin käyttämällä QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). DNA kvantifioitiin SYBR-1-pohjainen reaaliaikainen PCR: llä käyttäen StepOne Plus Thermocyclerissä (Applied Biosystems). Lyhyesti, PCR-reaktioseos sisälsi 10 ui SYBR vihreä, 0,5 ui aluketta, 0,5 ui reverse-aluke (0,25 nM lopullinen konsentraatio), 2 ui DNA-näytettä ja 7 ui nukleaasin vapaata vettä. Sykliolosuhteita: yksi sykli 10 min 95 ° C: ssa, ja 40 sykliä 30 s 95 ° C: ssa, 30 s 60 ° C: ssa ja 30 sekuntia 72 ° C: ssa.

Transient ja vakaa transfektiot

Ectopic miR-21 ilmentyminen suoritettiin A2780 soluissa. Lyhyesti, A2780 (2 x 10

4 solua /ml), solut ympättiin kuudella kuoppalevyille. Kunkin hyvin, 1 ug pCMV-MIR21 tai 1 ug tyhjän vektorin (pCMV-EV) (molemmat Origene Technologies, Inc. Rockville, MD) ja 1 ui MegaTran 1,0 transfektioreagenssia (Origen) laimennettiin 98 ul: aan Opti-MEM I (Life Technologies). pCMV vektori sisältää vihreää fluoreseiini proteiini (GFP) kasetti. Seosta inkuboitiin 10 min huoneenlämpötilassa ja lisätään soluihin. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin väliaine korvattiin tuoreella RPMI-1640 (10% FBS, 0,1% antibiootti /antimykoottiliuoksella ja 500 ug /ml G418: aa disulfaatti suolaliuos). 2-3 viikon kuluessa, riippumattomat pesäkkeet poimittiin ja viljeltiin erikseen itsenäistä kloonia. Transfektiotehokkuus tarkkailtiin immunofluoresenssilla seuraavasti: A2780 kloonit ympättiin mikroskoopin yhdessä yössä. Sitten solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, blokattiin 0,3% H

2O

2 metanolissa 10 min ja 10% FBS: ssa 20 minuuttia. Soluja inkuboitiin anti-GFP-vasta-ainetta (laimennus 1:250) tai DAPI (laimennus 1:5000 Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, Texas, USA) yön yli. Seuraavana päivänä levyjä pestiin, ja sekundaarinen vasta-aine anti-kani (laimennus 1:5000) lisättiin. Pääliliuskat asetettiin mikroskoopin ja kiinnitetään Vesipitoispohjaiset kiinnitysväliaine (Abcam). Soluja tarkasteltiin ja valokuvattu Olympus 1X71 käännettyä mikroskooppia (Center Valley, PA). Estävän miR-21, me ohimenevästi transfek- A2780CP20 solut miR-21-oligonukleotidin (Life Technology, Grand Island, NY, USA) ja negatiivinen oligonukleotidiestoaineen kontrollina (Life Technology). MiRNA-inhibiittorit olivat aina sekoitettiin HiPerfect transfektioreagenssin (Qiagen, Valencia, CA, USA), ja Opti-MEM I kasvualustaan ​​(Life Technologies).

Pieni häiriöitä RNA (siRNA) transfektion

vaientaa ihmisen c-Jun (NM_002228) kaksi siRNA kohdistaminen sekvenssit: 5′-CCTTCTATGACGATGCCCT-3 ’, ja 5′-GATGGAAACGACCTTCTAT-3’ käytettiin (Sigma-Aldrich). Ei-hiljentäminen siRNA (NC-siRNA) käytettiin negatiivisena kontrollina (Sigma-Aldrich). Lyhyesti, A2780CP20 (2,25 x 10

5 solua) ympättiin petrimaljoille. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, 200 nM siRNA (lopullinen pitoisuus) sekoitettiin HiPerfect transfektioreagenssin (Qiagen) on 1:02 suhde (siRNA: transfektioreagenssia) Opti-MEM I elatusainetta. Seos inkuboitiin 15 minuuttia huoneen lämpötilassa ja lisättiin soluille. Solut kerättiin 24 tunnin kuluttua ja säilytä -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Solun kasvua ja lisääntymistä

A2780CP20 (2 x 10

4 solu /ml) siirrostettiin kuuteen hyvin levyt. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin transfektio reaktioseoksessa, joka sisälsi miR-21-estäjä (Life Technology) (50 nM lopullinen konsentraatio) ja HiPerfect transfektioreagenssia (Qiagen) on 1:04 suhde, lisättiin soluihin. Kuusi tuntia myöhemmin elatusaine poistettiin ja korvattiin RPMI-1640-väliaineessa (10% FBS). Arvioida solujen elinkykyä, seitsemänkymmentä kaksi tuntia transfektion jälkeen elävät solut kerättiin ja laskettiin, kun läsnä on 0,5% Trypan blue käyttäen Countess automatisoitu solulaskijalla (Invitrogen, Grand Island, NY). Proliferaatiota arvioitiin kanssa pesäkemuodostusta. Lyhyesti, kahdeksan tuntia transfektion jälkeen, 1000-soluja ympättiin 10 cm petrimaljoille. Kymmenen päivää myöhemmin, pesäkkeet värjättiin 0,5% kristallivioletilla metanolissa, ja laskettiin mikroskoopin Nikon Eclipse TS100.

In vitro invaasiomääritys

Solut (2,5 x 10

4 solut /ml) maljattiin petrimaljaan. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin transfektio reaktioseoksessa, joka sisälsi miR-21-estäjä (Life Technology) (50 nM lopullinen konsentraatio) ja HiPerfect transfektioreagenssia (Qiagen) on 1:02 suhde, lisättiin soluihin. Seuraavana päivänä, 600 ui laimennettua Matrigel (seerumittomalla RPMI) on putted ylempään kammioon 6-kuoppaisille Transwell levyille (Corning Incorporated, Lowell, MA). Kammion inkuboitiin 37 ° C: ssa vähintään 4-5 tuntia geeliytymistä. MiR-21-estäjä-transfektoidut solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen seerumittomaan RPMI-1640-väliaine, jonka tiheys on 1,5 x 10

5 solua /ml. Matrigel varovasti pestiin lämmitettiin seerumittomalla-RPMI-1640-väliaineessa, ja 1,0 ml solususpensiota putted päälle matrigeeliä. Alempaan kammioon Transvvell- täytettiin 1,0 ml: lla RPMI-1640-väliaineessa (10% FBS), ja levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa 48- tunnin ajan. Siirtoaltaat poistettiin 6-kuoppalevyille ja värjättiin pöytäkirjan HEMA 3 Stain setti (Fisher Scientific Company, Kalamazoo, MI). Ei-hyökkäsi solut kaavittiin päällä Transvvell- pumpulipuikolla. Lukumäärä tunkeutuneet solujen laskettiin neljällä mikroskooppikenttää (10x) kohti kunnossa. Prosenttiosuus invaasio laskettiin suhteessa määrä hyökkäsi solujen kontrolli miRNA -estäjä hyvin, joka otettiin 100%.

Tilastollinen

Studentin t-testi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism versio 5.04 Windowsille, GraphPad Software, San Diego Kalifornia USA, www.graphpad.com. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja p-arvo 0,05 kaksipuolinen testi katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Expression of miR-21 ja miR-21 liittyvien molekyylien munasarjasyöpäsoluja

alustavassa mikrosiruanalyysi suoritetaan laboratoriossamme tunnistimme 320 geenit ilmentyvät differentiaalisesti (fold muutos 3 ja p-arvo 3 x 10

-4) in A2780CP20 (sisplatiini kestävä)

vs.

A2780 (sisplatiini herkkä) soluja (taulukko S1). Microarray aineisto talletetaan Gene Expression Omnibus (GEO): liittyminen: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE51683. Kun taas miR-21 ja c-Jun oli voimistunut, PDCD4 säädeltiin vähentävästi vuonna A2780CP20 verrattuna A2780-soluja (taulukko S1). RT-PCR-kokeet vahvistivat microarray tiedot (kuvio 1A). MiR-21-geeni sijaitsee intronin 10 TMEM-49-geenin [17]. Lähetti-RNA (mRNA) tasot TMEM-49 ja β-aktiini eivät erilaisia ​​A2780CP20 ja A2780-soluja (kuvio 1A), joka tukevat aiempaan toteamukseen pre-mir-21 ja TMEM-49 on itsenäisesti säädellään [33]. Kuvio 1B esittää, että miR-21 tasot korreloivat herkkyyttä munasarjojen syöpäsolujen sisplatiinihoitoon (IC

50, kuvio 1 B). Western blot-analyysi (kuvio 1 C) osoitti, että koko c-Jun ja p-c-Jun-proteiinin tasot olivat korkeammat A2780CP20 verrattuna A2780 soluissa. Kuitenkin PDCD4 proteiinin tasot osoittivat päinvastaisiin tuloksiin (kuvio 1 C). Muissa solulinjoissa, Signal muuntimet ja Activator of Transcription 3 (STST3) säädellä miR-21 ilme [17]. Kuitenkin STAT3 proteiinin tasot olivat samanlaiset A2780CP20 ja A2780-soluissa (kuvio S1), joka sulkea pois sitä mahdollisuutta, että STAT3 tilin korkeamman miR-21 tasot A2780CP20 verrattuna A2780 soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että c-Jun on vastuussa miR-21 ekspressiotasot sisplatiinin resistenttien munasarjasyöpäsoluja.

(A) Validointi mikrosirujen RT-PCR: llä. (B) MiR-21: n tasot paneelissa munasarjasyövän soluja. MiR-21-tasot ilmaistu suhteessa A2780 solujen miR-21 tasoa. IC50-arvot laskettiin sen jälkeen, kun 72-tunnin solujen käsittely eri sisplatiinin, kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät” osiossa. (C) Arviointi c-Jun: n ja p-c-Jun-proteiinin ilmentymistä A2780 ja A2780CP20 soluja. (D) Proteiinin ilmentymisen analyysi MAPK yhteensä ja ydin- jakeet A2780 ja A2780CP20 soluja. Ilmentymistaso kuvioissa A, C ja D eivät sisplatiinihoitoon. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 verrattuna kontrolliin. Sarakkeet edustavat avulla kolmena rinnakkaisena ± S.E.M.

On hyvin tunnettua, että suuret aktivaattori c-Jun on JNK-1 [34]. Niinpä arvioidaan proteiinin tasot JNK A2780 ja A27870CP20 soluja. Yhteenlaskettu JNK-1 ja ydinvoiman p-JNK-1protein tasot olivat korkeampia A2780CP20 verrattuna A2780 soluissa. Proteiinin tasot p-JNK-2/3 ja yhteensä JNK-2/3, kaksi muuta JNK-1-isoformit, olivat samanlaisia ​​molemmissa solulinjoissa (kuvio 1 D), jotka viittaavat siihen, että JNK-1 /c-Jun cascade säännellä miR-21 A2780CP20 soluissa. Todisteet osoittavat, että ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi, ERK voi aktivoida c-Jun [35], [36]. Vaikka koko ERK proteiinin tasot olivat samanlaiset sekä solujen linjat, p-ERK proteiinin tasot olivat alhaisempia A2780CP20 verrattuna A2780 solujen sulkea pois mahdollisuutta, että aktivoitu ERK tilin korkeamman miR-21 tasot A2780CP20 verrattuna A2780 soluissa.

vaikutus JNK-1 /c-Jun esto in miR-21 ja PDCD4 ilmaisun

edelleen selvittää JNK-1 säätelee c-Jun ja miR-21 ilmentymistä sisplatiini resistentit solut, me käsiteltiin A2780CP20 solut SP600125, tunnettu kemiallisen inhibiittorin c-Jun-fosforylaation JNK-1 [34]. Inkubointi A2780CP20 solujen SP600125 vähensi p-c-Jun-tasojen, kuten odotettua (kuvio 2A). Ei merkittäviä muutoksia proteiinin tasot c-Jun, kokonais- ja p-JNK-1 tai kokonaan ja p-JNK-2/3 havaittiin käsittelyn jälkeen A2780CP20 solujen SP600125 estäjä (kuvio 2A). Reaaliaikainen PCR osoittivat merkittävää vähenemistä (60% ja * p 0,05) pre-mir-21 tasoa käsittelyn jälkeen A2780CP20 solujen SP600125 (kuvio 2B). Samaa inhibiittorin aiheuttama lisääntyminen PDCD4 proteiinin tasot havaittiin Western blot kuvion 2C. Lisäksi esto miR-21, jossa on miR-21 oligonukleotidi estäjä (antagomiR) lisäsi PDCD4 proteiinin tasot (kuvio 2D), joka vahvisti aiemmat tulokset, jotka miR-21 säätelee PDCD4 munasarjasyövän soluihin [37], [18]. Lisäksi ohimenevä transfektion A2780CP20 solut siRNA vastaan ​​c-Jun merkitsevästi (** p 0,01) esti ennalta miR-21 ilmentyminen (kuvio 2E). Western blot-analyysi osoitti, että käsittely sisplatiinin herkkien A2780-soluja SP600125 ei vaikuttanut tasot p-JNK-1, JNK-1, p-JNK-2/3, JNK2: n /3, c-Jun, pre-asennuspalveli- 21 tai PDCD4 (kuva S2). Nämä tulokset viittaavat siihen, että JNK-1 /c-Jun-reitin johtaa miR-21 yli-ilmentyminen sisplatiinin resistenttien munasarjasyöpäsoluja.

A2780CP20-soluja käsiteltiin 10 uM SP600125. (A) Western blot osoittaneet esto p-c-Jun-hoidon jälkeen SP600125 in A2780CP20 soluissa kontrolliin verrattuna (DMSO). (B) SYBR-I-pohjainen reaaliaikainen PCR suoritettiin lasketaan suhteellinen pre-mir-21 ilmentyminen A2780CP20 soluissa hoidon jälkeen SP600125 estäjä. (C) Western blot ja densitometrinen analyysi PDCD4 proteiinin ekspressiotasoja jälkeen hoito A2780CP20 solujen SP600125. (D) PDCD4 proteiinin ekspressiotasot transfektion jälkeen A2780CP20 kanssa miR-21 oligonukleotidiestoaineen. (E) A2780 CP20 soluja transfektoitiin ohimenevästi kaksi c-Jun-kohdennettuja siRNA kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät” -osassa. Western blot-analyysi osoittaa, että sekä c-Jun-siRNA vähensi c-Jun tasolle. SYBR-I-pohjainen reaaliaikainen PCR suoritettiin (katso ”Materiaalit ja menetelmät” osiossa) lasketaan suhteellinen pre-mir-21 ekspressiotasot A2780CP20 soluissa sen jälkeen, kun siRNA-välitteinen c-Jun hiljentäminen. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 verrattuna kontrolliin. Sarakkeet edustavat avulla kolmena rinnakkaisena ± SEM

analyysi c-Jun-sitoutumisen miR-21 DNA-promoottorin alueet

varmasti osoittaa, että c-Jun on vastuussa korkeamman miR -21 tasot A2780CP20 verrattuna A2780 soluissa, arvioimme pri-mir-21 promoottori-DNA-alueita liittyy pC-Jun Chip analyysi. DNA: n määrä immunosaostettiin p-c-Jun-vasta-ainetta molemmissa solulinjoissa monistettiin alukkeiden parin käsitti c-Jun tunnustamista elementtien pri-mir-21-promoottorialue (kuvio S3 ja taulukko S2). Muut alukkeiden pari monistetaan DNA-alue, kaukana c-Jun-tunnistuskohdat käytettiin kontrollina (taulukko S2). Enemmän kuin viisi kertaa DNA: n tasot olivat vetämällä ulos A2780CP20 kuin A2780-soluissa sen jälkeen, kun immunosaostus p-c-Jun-vasta-aineella (kuvio 3A). Mitään merkittäviä eroja DNA määrinä havaittiin immunosaostuksen jälkeen c-Jun, POL II tai IgG (kuvio 3A), jotka osoittivat, että pc-Jun sitoutuu spesifisesti pri-mir-21 promoottorialueille, ja että enemmän pc-Jun-proteiinin tasot ovat korkeampia A2780CP20 kuin A2780-soluissa. Mitään merkittäviä eroja DNA tasot on havaittu, kun PCR suoritettiin ei-promoottorin DNA-alukkeita immunosaostuksen jälkeen PC-Jun-vasta-ainetta (kuvio 3B).

ChIP-määritys suoritettiin, kuten on kuvattu kappaleessa ”Materiaalit ja menetelmät ”-kappaleessa. (A) SYBR-I-pohjainen reaaliaikainen PCR-monistuksen alueesta, joka sisältää c-Jun tunnustamista sekvenssin pri-miR-21 DNA. Fosfo-c-Jun tasolle sitoutuneen pri-miR-21 promoottori oli suurempi A2780CP20 soluissa verrattuna A2780 soluissa. (B) SYBR-I-pohjainen reaaliaikainen PCR-monistamalla DNA-alueen kaukana pre-mir-21-promoottorin suoritettiin kontrollina. * P 0,05 verrattuna kontrolliin. Pylväät edustavat keinot kolmen rinnakkaisen ± SEM

vaikutus miR-21 yli-ilmentyminen herkkyydessä munasarjojen syöpäsolujen sisplatiinihoitoon

Voit testata, onko miR-21 myötävaikuttaa sisplatiinin vastus munasarjasyöpä soluja, me ektooppisesti ilmaistu ennalta mir-21 A2780 soluissa (kuvio S4 ja S5). Kuvio 4A osoittaa, että verrattuna transfektoimattomiin A2780-soluja tai tyhjällä vektorilla (klooni 1 kuvassa S4), stabiili transfektio ennalta mir-21 (klooni 1 kuvassa S4) lisäsi miR-21 kypsän tasolla. PDCD4 proteiini tasot olivat myös merkittävästi vähentynyt (69%, *** p 0,001) pre-mir-21 A2780 klooni (A2780-miR-21) verrattuna tyhjän vektorin klooni (A2780-EV) (kuvio 4B) . Kohdunulkoinen ilmentyminen ennalta mir-21 A2780 soluissa johti merkittävään kasvuun solujen lisääntymistä (15,4%, *** p 0,001) verrattuna A2780-EV-solut (kuvio 4C). Lisäksi sisplatiinihoitoon (1 uM) A2780-miR-21-soluja aiheutti merkittäviä (noin 15%, ** p 0,01) vähentäminen solukasvuneston verrattiin sisplatiiniin hoidossa A2780-EV-solut (kuvio 4D).

(A) A2780 solut transfektoitiin stabiilisti pCMV-miR21 tai tyhjiä pCMV-EV vektoreita. MIR-21 ilmentyminen kvantifioitiin qRT-PCR. ** P 0,01.