Krooninen sairaus

tiivistelmä

IL-2 on ensisijainen kasvutekijä edistää selviytymistä ja proliferaatiota aktivoitua T-solujen että tapahtuu seuraava sitoutuminen Janus-kinaasi (JAK) 1-3 /ja Signal muuntimet ja Activator of Transcription (STAT) 5 signalointireitille. Stat5: n kaksi isoformia: STAT5A ja STAT5B (kutsutaan yleisesti Stat5: n), jotka T-solut, pelata tarpeeton roolit soitintaminen solusyklin ja selviytymisen geenejä. Sinänsä inhibitio Stat5: n erilaisilla mekanismeilla voidaan nopeasti indusoida apoptoosia joissakin lymfoidisissa kasvainsoluissa, mikä viittaa siihen, että se ja sen kohde-geenit ovat terapeuttisia kohteita ohjataan tiettyjen imukudoksen sairauksien. Jos haluat etsiä näiden molekyylien me linjassa IL-2 geenien havaita Affymetrix geeniekspressiota mikrosiruja kanssa Stat5: n cistrome tunnistaa siru-on-chip analyysi IL-2-riippuvaista ihmisen leukemia solulinjassa, Kit225. Valitse päällekkäisiä geenit sitten validoitu käyttäen qRT

2PCR keski- suoritusteho taulukot ihmisen PHA-aktivoitujen PBMC. 19 otaksuttu geenit, yksi keskeinen säätelijä T-solun reseptorin signalointi, PDE4B-, tunnistettiin uutena kohteena, joka oli helposti sääteli proteiinitasolla (3 h) IL-2 stimuloi, aktivoitujen ihmisen PBMC. Yllättäen vain puhdistettujen CD8 + ensisijainen T-solut ekspressoivat PDE4B, mutta ei CD4 + solut. Lisäksi, PDE4B: tä on havaittu olevan erittäin ilmaistaan ​​CD4 + lymfaattisessa syöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että sillä voi olla fysiologinen rooli ainutlaatuinen CD8 + ja lymfaattisen syöpäsoluja ja siten voisi edustaa tavoite farmaseuttinen interventio tiettyjen lymfaattisen sairauksia.

Citation: Nagy ZS, Ross JA, Rodriguez G, Balint BL, Szeles L, Nagy L, et al. (2013) Genome Wide Mapping paljastaa PDE4B- kuin IL-2 aiheuttama Stat5: n kohdegeenin aktivoitujen ihmisen PBMC ja lymfaattisen syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (2): e57326. doi: 10,1371 /journal.pone.0057326

Editor: Ramin Homayouni, University of Memphis, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 syyskuu 2012; Hyväksytty: 21. 2013 Julkaistu: 25 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Nagy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH) lupanumeroon AI053566 RAK ja pilottihankkeen avustus ZSN (NIGMS SCORE myöntää ohjelman S06 GM008012-37), ja mahdollistivat Grant Number 5G12RR008124 National Center for Research Resources, komponentti NIH. ZSN on vastaanottaja János Bolyai Research Felowship Unkarin tiedeakatemian ja tukee NKTH-OTKA-EU 7KP (Marie Curie) Reintegration Grant (OTKA MB08C 84630). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nisäkkäiden Signal muuntimet ja Activator of Transcription (STAT) perhe koostuu 7 jäsentä (1-4, 5a, 5b ja 6). STAT molekyylien käyttää kriittisiä rooleja solujen lisääntymisen, erilaistumisen ja eloonjäämisen (tarkistetaan [1]). Alunperin STAT uskottiin olevan piileviä tekijöitä asuvat sytosoliin ja vain aktivoituu, kun sytokiineja sitoutuvat niiden vastaavan reseptorin aktivoitumisen jälkeen Janus tyrosiini- kinaasien (JAK). Itse Keski-mallin mukaan Jaks fosfory- tyrosiinitähteiden reseptorin palvelevat telakointikohtina SH2 verkkotunnuksen sisältäviä molekyylejä kuten tilastoja. Sen jälkeen telakka kautta fosfotyrosiinin SH2 vuorovaikutukset, STAT itsestään tulee tyrosiinifosforyloituu by Jaks, irtoamaan reseptorin ja dimeerejä kautta vastavuoroisesti fosfotyrosiinin SH2 domain vuorovaikutusta. STAT dimeeri sitten kulkeutua tumaan käynnistämään geenin transkription [2] – [3]. Kuitenkin tiedämme, että TILASTOT voivat dimerisoimaan ja muoto tetrameerien puuttuessa tyrosiinifosforylaation ja olla ydinvoiman lokalisoitu hallita geenisäätelyn monin ainutlaatuisilla tavoilla, jotka ovat vähemmän ymmärretään [4] – [5].

Selvää että STAT 1, 3, 5A ja 5B ovat laajalti käytössä eri sytokiinien ja ovat tärkeitä sääntelyn solujen kasvua, lisääntymistä ja kuoleman, kun taas STAT 2, 4 ja 6 edistää viruksen puolustus ja Th1 vs. Th2 erilaistumista, vastaavasti. Lisäksi STAT3 ja Stat5: n on todettu olevan läheistä sukua ja merkityksellisiä kasvaimien syntyyn (tarkistetaan [1]). Todellakin, konstitutiivisesti tyrosiinifosforyloidulla muotoja Stat5: n helposti havaita erilaisia ​​syöpäsoluja ja -kudoksia erillisten alkuperää seurauksena kromosomaalisten translokaatio, vapautettiin tyrosiinikinaaseja ja viruksen muunnos (katsaus [1]).

fysiologinen rooli STAT5A ja B johtuu suurimmalta osin

in vivo

tutkimuksissa STAT5A ja B tyrmäyseläinten. Näistä tutkimuksista käy ilmi selvästi, että STAT5A on pääasiassa mukana maitorauhasen kehitykseen [6] ja STAT5B joka sääntelee kasvun kautta kasvuhormonin signalointi [7]. T-lymfosyyteissä, mutta niitä on korvaava toiminnot: tutkimukset STAT5A /B kaksinkertainen hiirillä osoittivat, että ne ovat tarpeettomia rooleja välittämisessä solusyklin etenemisen aktivoitujen T-solujen [8], [9]. Lisäksi tutkimukset työllistää STAT5A /B nollahiiriä osoittavat, että nämä molekyylit ovat tärkeitä imujärjestelmäelinten kehityksen puute näissä proteiinit voivat aiheuttaa sekamuotoinen immuunipuutos fenotyyppi [10]. Lisäksi Stat5: n näyttää toimivan kriittinen eloonjäämistekijä T-soluja, koska konstitutiivisesti aktiivinen (ts tyrosiinifosforyloidulla) Stat5: n on usein läsnä lymfoidisissa ja leukemiasolujen syöpäsolujen muun tyyppisiä kasvaimia verrattuna normaaliin, ei-transformoidut solut (katsaus in [1]). Lisäksi esto Stat5: n ilmentyminen ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa sekä imukudoksen ja leukemiasolujen syöpäsolujen vaarantaa vakavasti solujen elinkelpoisuutta ja aiheuttaa apoptoottista solukuolemaa [11]. Todisteet monista ryhmistä viittaa siihen, että STST3 näyttelee samanlainen kasvaimia synnyttävän rooli Stat5: n ja riippuu solutyypistä, yksi voi olla hallitsevampi [12]. Uudet havainnot tämän perheen proteiinien myös, että niiden solujen selviytymistä edistämällä ominaisuuksia, kun YK-fosforyloitiin voi olla geeniregulatiivista asema ja [4]. Nämä tiedot auttavat tarjoavat mielenkiintoisia uusia malleja, jotka viittaavat siihen, että farmakologinen irrottaminen aktivoitua sekä YK-aktivoitua Stat5: n voidaan vaatia häiritä niiden kohdegeenien aiheuttaa syöpää solukuoleman. Siten tunnistaminen solujen eloonjäämistä ja kasvain asiaan Stat5: n kohdegeenien on tärkeä tavoite kehittää uusia syövän hoitokeinojen.

Yksi menetelmä, joka on osoittautunut onnistuneeksi identifioida uusia kohdegeenien on kromatiinin immunosaostuksella, joka voi paljastaa suoraan transkription tekijä- DNA vuorovaikutuksia [13] ja mahdollistaa tunnistamisen tuntemattomien transkriptiotekijän sitoutumiskohtia uusilla kohdegeenien muodostamalla genominlaajuisten kirjasto, joka voi olla (i) sekvensoitiin ja sijaitsee ihmisen genomin, tai (ii) hybridisoitiin mikrosiruja joka edustaa ei-koodaavia alueita genomin. Genominlaajuisten kartoitus sytokiinien aiheuttama Stat5: n kohdegeenien on suoritettu ja julkaistu eri solutyyppejä (T-, pre-B-, ihmisen NK-kaltainen kasvain ja rintasyöpä solut) käyttäen chip kloonin tai -piirin-sekvenssi teknologioita [4] [14] – [18]. Erityisesti kartoittamalla IL-2 indusoituva Stat5: n sitova tapahtumia ja transkription muutosten ensisijainen T-soluissa käyttäen chip Seq, geenien ilmentyminen mikrosiruja, tai RNA-sekvenssi tekniikka on suoritettu ja julkaistu sekä hiiren [5], [16], [19 ], [20] ja ihmisen [16], [19] mallia. Nämä tärkeät tutkimukset keskitytään pääasiassa roolista Stat5: n T auttajasolujen erilaistumista ja fysiologisia immuunivastetta.

Tämä työ pyrittiin tunnistamaan keskeiset solujen eloonjäämistä ja kasvain asiaan Stat5: n kohdegeenien IL-2-riippuvaista ihmisen leukemiasolujen käyttäen geenien ilmentyminen ja promoottori microarray tutkimuksia. Jonka tulokset olivat linjassa ja valitse altaan Ehdokaskohteiden sitten validoitu normaaleissa ihmisen aktivoitu PBMC. (PDE) 4B, säädin syklisen AMP signaloinnin T-solujen osoitettiin olevan IL-2 säädellään pohjustettu ihmisen PBMC: illä ja CD8 + puhdistettiin T-solut. Mielenkiintoista tämä molekyyli oli vahvasti yliekspressoitu lymfaattisessa kasvain, mutta ei esikäsitelty ensisijainen CD4 + T-soluja.

Tulokset ja keskustelu

genomin laajuinen lähestymistapa tunnistaa Stat5: n Erityinen IL-2-välitteisen Genes

Stat5: n on voimakas säätelijä T-solujen eloonjäämisen sen ehtyminen johtaa massiivinen solukuolema aktivoitujen T ja lymfaattisessa tuumorisoluissa [11] – [12]. Tähän mennessä genominlaajuisten tutkimuksia on käytetty tunnistamaan ja paikantamaan IL-2 säädellään Stat5: n sitova tapahtumia ja kohdegeenien normaalin hiiren [5], [16], [19], [20] ja ihmisen T-solujen [16], [19] tarkistetaan [21]. Kuitenkin, esillä olevassa tutkimuksessa pyrittiin selvittämään genominlaajuisten IL-2: n välittämien Stat5: n geenikohteet päässä lymfoidiset kasvainsoluja (kuvio S1). Järjestelmällisesti kartta Stat5: n sitoutumiskohdat genomiseen mittakaavassa, että määrittelemme kuin Stat5: n cistrome [22] ja IL-2: n välittämien geenien ilmentymisen muutoksia käytimme mikrosiruja. Näitä tutkimuksia varten määriteltiin aluksi Stat5: n cistrome käyttäen chip-on-chip IL-2-riippuvaista Kit225 soluja, jotka olivat joko vasemmalle un-stimuloitiin tai stimuloitu IL-2: ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen myöhemmät geeniekspressioanalyysiä havaitsemiseksi IL-2 välittämä mRNA muuttuu 3 tuntia. Tuloksena tietovarannot Sitten analysoitiin tilastollisesti ja kohdistettu ja valitse joukko geenejä, jotka tunsivat Stat5: n sitoutumiskohtien niiden promoottorialueille validoitiin käyttäen keski- suoritusteho qRT

2PCR paneelit.

generointi kirjasto IL-2 säännelty Stat5: n toutumiskohtiin

Ensinnäkin, kolme biologista rinnakkaisnäytettä ChIP suoritettiin käyttäen seosta, jossa oli vasta-aineita, on suunnattu C-terminaalin STAT5A ja STAT5B in Kit225 stimuloitu IL-2: ssa 30 minuutin ajan. Koe validoidaan mittaamalla IL-2 indusoi rikastusta IL2RA edistäjän [23] elementti nimeltään Positiivinen Regulatory alue (PRR) III (kuvio 1A) kautta Stat5: n vasta-aineita verrattuna kontrolliseerumin. Seuraavaksi jää DNA monistettiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät käyttäen satunnaista vahvistusta protokollaa. Sen varmistamiseksi, että kirjastot pysyi rikastetun positiivisen kontrollin PRR III elementti monistuksenjälkeisissä, PRR III mitattiin qPCR (kuvio 1 B) kaikista jäljitellä kokeissa. Seuraavaksi microarray-analyysillä käyttämällä Affymetrix GeneChip Human Promoottori 1.0R paneelit suoritettiin käyttämällä tulo genomista DNA: ta (kontrollina) ja IL-2-stimuloitujen näytteiden kolmen biologisen rinnakkaista kuten edellä on kuvattu. Tuloksena ”.cel tiedostot” Sitten analysoitiin MAT (Model-pohjainen analyysi Laatoitus array, [24]), joka tuotti ”.bed tiedostot” kanssa kromosomi koordinaatit kaikkien ChIP-alueet kuten p-arvot, MAT tulokset (kohteeseen sallia rikastamisen eri alueilla eripituisia voidaan verrata suoraan), FDR (väärä löytö korko) laskelmat ja toista lippua. Toistuvat ja segmentaalisia päällekkäisyyksiä elementtejä poistettiin ja loput 1581 osumia kartoitettiin kanssa turvapaikkajärjestelmän (cis-sääntelyyn Element Huomautukset System) [25] 300 kb selityksin genomialueiden. Kuten kuviossa 2A vain noin 17% kandidaattigeenejä sijaittava lähellä promoottorit, kun taas noin 25% ja 42% sijaitsevat parantajia ja intronit, vastaavasti. Nämä havainnot ovat hyvässä sopusoinnussa muiden tietojen mukaan suurin osa TF sitoutumiskohtien löytyy introni ja geenien välisen alueen [26]. Verrata tuloksemme kanssa aiemmin julkaistu ChIP-Seq aineistoja, STAT5A ja STAT5B sitoutumiskohtien johdetut ihmisen CD4 + T-solut analysoitiin uudelleen (GSE27158, [16] käyttämällä siru-Seq analyysi putkiston Barta et ai, [27 ]) ja tuloksena huiput suoritettiin turvapaikkajärjestelmän analyysiin. Saatu lopputulokset STAT5A ja STAT5B sivustoja jakelu olivat seuraavat: promoottori-sidottu 21% ja 19%, introni 34% ja 35%, tehostaja-sidottu 38% ja 39%, vastaavasti, mikä osoittaa, että genominen Stat5: n sitova kuvio nykyisestä chip-on-chip aineistoja tiiviisti yhteen chip-Seq tuloksia Liao ja kollegansa [16]. Mielenkiintoista vain noin 20% Stat5: n sitoutumiskohtien rajoittuivat promoottorit. Seuraavaksi rikastamista TF sitovia motiiveja analysoitiin myös perustuu turvapaikkajärjestelmän osoitettu kertaluokkamuutos arvo, joka edustaa merkittävästi rikastettu motiivien kanssa 2 kertamuutosta sisällä siru alueiden koko genomin. Kuva 2B ylempi pöytä ja paneeli esittää, että TF motiivit korkein kertaiseksi muutoksia ovat klassisen STAT sitovia motiiveja TTCNNNGAA eri muodoissa. Interferoni Sensitive Response Element (ISRE) oli myös merkitsevästi rikastettu mikä viittaa siihen, että tietyissä soluissa Stat5: n voi myös mahdollisesti sitoutua nämä motiivit: joko suoraan tai apua toiselta TF, joka sitoo ISRE. Kuva 2B alempi pöytä ja paneeli edustavat merkittävimmin rikastettu TF sitoutumiskohtia. Kiinnostavaa nämä ovat TTC STAT puoliksi sivustoja. Ehkä tämäntyyppisissä solujen Stat5: n voi sitoa puoli-sivustoja suoraan tai epäsuorasti, mikä viittaa epänormaali sääntelyä koska tällainen DNA: ta sitovaa ei ole havaittu

in vitro

[28].

(A ) Kit225 IL-2-riippuvainen ihmisen leukemiasoluja tehtiin lepotilassa ja sitten stimuloitiin elatusaineella (-) tai IL-2 (+) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, kiinnitettiin 1% formaldehydiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten chromatin immunosaostettiin vasta-aineita C-pään STAT5A /B seoksen tai kontrolli-lgG. Eluoitu DNA monistettiin alukkeilla, jotka vastaavat ihmisen IL2RA PRR III. Edustavat tiedot kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. Syöttö materiaali edustaa 5% immuunisaostettujen chromatin. Helmet ohjaus edustaa näytteitä, joissa immunosaostus suoritettiin ilman vasta-aineita mutta muuten hoidettiin identtisesti. (B) Soluja käsiteltiin kuten edellä on kuvattu ja sitten microarray kokeissa ChIP-ed DNA satunnaisesti monistettiin ligaation jälkeen linkkereitä, kuten on kuvattu osassa Materiaalit ja menetelmät kolmesta itsenäisestä kokeesta. Monistettu DNA käytettiin sitten templaattina qPCR reaktioiden mittaamiseen rikastusta IL2RA PRR III.

(A) Genome laajuinen jakelun Stat5: n sitoutumiskohtien (prosenttia kokonaismäärästä sivustoja). Siru-on-chip tunnistettu elementtejä, jotka kuuluivat 300 kb koodaavat alueet analysoitiin perustuen niiden etäisyys lähimmästä geeneistä käyttämällä turvapaikkajärjestelmän. Kaaviossa edustaa ”%” jakelu. (B) rikastettu transkriptiotekijän sitova motiivien korkeimmalla kertamuutosta (ylempi paneeli) ja korkein merkitys (alempi kuva). Rikastettu TF sitoutumiskohdat ja niiden matriisit sisällä siru-on-chip tunnistettu, CEAS analysoidaan säätelyelementit esitetään.

tunnistaminen IL-2 geenien in Kit225 Cells käyttäminen geeniekspressioanalyysissä

tunnistamiseksi IL-2: n välittämien geenien Kit225 soluja, josta oli poistettu IL-2: ta, käsiteltiin IL-2 tai valvoa ajoneuvon 3 tuntia ja saatettiin geeniekspression microarray-analyysi kahden biologisen rinnakkaista. Tämän analyysin, 469 geenien muuttunut yli 2-kertainen, 129 alas- ja 340 ylös geenien myös useita IL-2: n välittämien tavoitteita kuten CISH, SOCS1, OSM, PIM-1, BCL6 ja BCL2. Tämä geeni lista analysoitiin Ingenuity Pathway Analysis web-pohjainen ohjelmisto, joka edelleen vahvisti STAT5A ja STAT5B aktivointistatuksen seuraavat IL-2 hoito (kuva S2) ja tunnistettu matkapuhelinverkoissa merkitystä immuunijärjestelmän toimintaa myös Cellular Development Cell Cycle, Hematologinen System Development Toiminto, Sukuelinten Development Toimintaa sekä Cellular Movement, Growth Leviämisen merkittävästi yliedustettuina (kuva S3).

tunnistaminen IL-2 geenien n Stat5: n Cistrome

Tavoitteena oli löytää poolin IL-2 reagoivat geenejä sisältäviä Stat5: n sääntelyn sivustoja. Siksi loimme leikkaavat ja Stat5: n cistrome ja IL-2 reagoivat geenien avulla UCSC Taulukko Browser. Ensinnäkin Affymetrix tunnukset geeniekspression altaan muutettiin genomisen paikkoihin (.bed-tiedostot), jotka on sitten linjassa chip-on-chip tuloksia. Nämä altaat tehtiin näkyviksi genomi- mittakaavassa käyttäen ”.bed tiedostot” ja genomiikkaa Viewer (IGV, kuva 3). Vuodesta leikkaavat altaan koostuu 106 geenien luettelo 57 geenejä, jotka sisälsivät Stat5: n säätelypaikat niiden proksimaalisen promoottorin (30 geenit), välittömästi alavirtaan segmentit geenin (7 geenit), vahvistin (14 geenejä) tai ensimmäistä eksonia (6 geenit) valittiin validointi ihmisen pohjustettu PBMC (kuva 3 ja taulukko S1.) mRNA-tasolla käyttämällä väliaineen läpimeno qRT

2PCR geeniekspression pakat (kuvattu Materiaalit ja menetelmät ja tilastollisesti merkittäviä tuloksia (p-arvo 0,05) on esitetty taulukossa 1). Tunnetut IL-2 kohdegeenien (merkitty tähdellä taulukossa 1) BCL2, BCL6, CDK6 ja IL2RA todettiin IL-2 indusoitavissa geenien Stat5: n sitoutumiskohtia. Muut tunnetut IL-2 kohdegeenien kuten CISH, IFNy ja FOXP3 tunnistettiin myös GEA ja siksi sisällytettiin positiivisena valvonnan paneelit. Vaikka nämä geenit tiedetään säänneltävä Stat5: n, vuonna Kit225 soluissa niiden Stat5: n sitoutumiskohdat eivät tunnistaa siru-on-chip analyysiin, jota varten emme voi sulkea pois solutyyppispesifisellä vaikutus. Selventää näitä havaintoja, IGV käytettiin visualisoimaan genomiseen sijainnit tunnettujen (SOCS2, SOCS3, IL2RA, CISH, BCL2, BCL6 ja CDK6 (kuvio 4A) korosti ovat mainittuja meidän näyttö) ja 18 tuntematon IL-2 /Stat5: n tavoite geenit (kuvio 4B). Näistä esimerkiksi CD69 (jopa 2,3-kertainen), on osoitettu vaikuttavan Th17 erilaistumista, joka on tunnettu Stat5: n riippuva prosessi [29]. CDKN2C, muuten kutsutaan p18 (INK) 4c, on tunnettu estäjä G1 solusyklin aloittamiseen, mikä tässä on alassäädetty noin 2-kertaisesti IL-2. Lymfosyyttien Sytosoliset Protein (LCP) 2 (1,7-kertainen up) on tavoite ZAP70 kinaasia T-lymfosyyteissä ja sen puute tiedetään aiheuttavan poissaolon double-positiivisia CD4 + CD8 + tymosyyttien ja perifeeristen T-solujen [30]. RAFTLIN (lautta-yhdistää proteiinia) oli myös osoitettu vaikuttavan T-soluvälitteinen immuunivaste ja Th17 erilaistumista [31]. STK17B on seriini-kinaasi tunnetaan myös DRAK (DAP-kinaasi-sukuinen apoptoosia indusoiva kinaasi) 2, jonka tiedetään välittävän indusoiman apoptoosin IL-2 ja säädellä T-solureseptorin herkkyys kehittää tymosyyteissä [32] – [33]. (PDE) 4 B on tyypin 4 PDE (up ~ 2-kertainen), joka säätelee TCR signalointi karkaisu negatiivinen vaikutus cAMP [34] ja CD4 + ihmisen T-solujen vähentynyt PDE4B- ilmaisu johtaa vähentyneeseen IL-2-tuotanto anti -CD3 /CD28 kostimulaatiosignaalin [35]. Siru-on-chip tunnistettu Stat5: n sitoutumiskohtaa sisällä PDE4B- esitetään kuviossa 4B, visualisoida IGV. Kiehtovan, IL-2 nosti tasoa PDE4B-, joka sisältää useita introni Stat5: n sitoutumiskohtia, joka perustuu hiiren T-solujen tutkimuksissa [5].

visualisointi saatujen tulosten genominlaajuisten tunnistaminen IL-2 aiheuttama geenien ja Stat5: n sitoutumiskohdat (kuten on kuvattu kuvassa. 1) käyttäen IGV.

(A) Näkyy tunnetaan Stat5: n kohdegeenien lukien SOCS2, SOCS3, CISH ja ne myös tunnistaa siru-on siru (IL2RA, BCL2, BCL6 ja CDK6) ja (B) 18 vastatunnistetun promoottori sijaitsee geenien visualisoida IGV avulla hg19.

Stat5: n sijaitsee mahdollinen IL-2 reagoiva GAS Site sisällä PDE4B- Gene

in vivo

Human PBMC

Varmista, että Stat5: n pystyy sitoutumaan oletetun GAS sivuston sisällä PDE4B- geeni (sijaitsee kromosomissa 1, hg18 kannat 66567898-66573077) in IL-2 indusoitavissa tavalla, suoritimme ChlP kokeissa lepotilassa ihmisen PBMC: eissä jätetään käsittelemättä (-) tai käsiteltiin IL-2: ssa 30 min (+) eristettiin kolme itsenäistä luovuttajilta. Tämän seurauksena totesimme, että Stat5: n sidottu PDE4B, joka on IL-2-riippuvaista ja merkittävästi (p 0,05), jossa on noin 1,7-kertainen verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio 5A). IL2RA PRR III käytettiin positiivisena kontrollina (kuvio 5B). Mielenkiintoista on, että PDE4B geeni sisälsi sekä STAT5A ja STAT5B IL-2 reagoivat sitoutumiskohtia tutkimuksen kohteena, primäärisistä ihmisen T-solujen [16], että päällekkäin kanssa chip-on-chip alueella. Lisäksi lisääntynyt Stat5: n DNA: ta sitova aktiivisuus seuraavan IL-2 hoito korreloi hyvin havaittujen 2-kertainen nousu mRNA tasolla (taulukko 1).

ChIP määritykset suoritettiin Stat5: n vasta-aineita tai kontrolliseerumit (IgG) suoritettiin vuonna lepotilassa (-) tai IL-2 stimuloi (30 min, +) hPBMC: itä eristettiin kolmesta itsenäisestä luovuttajien mitata rikastusta PDE4B- otaksuttu Stat5: n säännelty alue (A) tai IL2RA tehostajana PRR III (B) tunnistetaan hakkuri on-chip. Tulot osuus 1% kromatiinin käytetty siru määrityksissä ja virhepalkit edustavat standardipoikkeamaa. * Edustaa tilastollisesti merkitseviä eroja (p 0,05).

Short Term IL-2-hoito (3 h) indusoi PDE4B Protein Expression in PHA-aktivoitujen ihmisen PBMC: ja CD8 +, mutta ei CD4 + Cells

lisäksi vahvistaa, että PDE4B- säätelee IL-2, tutkimme myös proteiinin tason muutokset infektoitunut (N), PHA-aktivoitu (A), lepotilassa (Q) ja IL-2 stimuloi ihmisen PBMC 3 h (+) kaksi riippumatonta luovuttajien (kuvio 6A). Taso PDE4B proteiinin lisääntyminen noin 2-kertaisesti (kuvio S4, densitometrian analyysi), mikä korreloi -1,7-kertainen DNA: ta sitovaa aktiivisuutta Stat5: n ja 2-kertainen nousu mRNA-tasot (kuvio 5A ja taulukossa 1, vastaavasti) . Ensisijainen ihmisen CD4 + tai CD8 + T-solut testattiin myös (kuvio 6B). YT NK kaltaisia ​​soluja positiivisena kontrollina toimi ja ß-aktiini latauskontrollina. Sekä PHA-aktivointi (72 h) ja lyhyen aikavälin IL-2 indusoi PDE4B- proteiinin ilmentymistä PBMC ja CD8 +, mutta ei CD4 + T-soluja. Näiden tietojen perusteella on mielenkiintoista spekuloida, että PDE4B- voisi olla ensimmäinen ”puolustuslinja” in PBMC ja CD8 + T-solujen vastaan ​​koholla cAMP signalointi, joka tapahtuu T-solujen stimulaatio [36]. On tunnettua, että toisen tyyppinen 4 isoformia, PDE4D ilmenee myös CD4 + T-solujen [35], joka johtaa meidät spekuloida mahdollisena mallina, jossa on jatkuva karkaisu cAMP aiheuttamaa reittejä verrattuna CD8 + soluja. Toinen mahdollisuus voisi olla, että kestää jopa-säätely PDE4B- CD4 + solujen on alas-säädellä cAMP näissä soluissa distaalisessa ajankohtana. Testaus CD4 + vs CD8 + solujen tehtiin yhdeltä luovuttajalta ja uskomme antaa uusia mahdollisuuksia tutkia mahdollista roolia PDE4B- tämäntyyppisissä T solualaryhmiä.

Normaalit ihmisen PBMC kolmesta itsenäisestä luovuttajien (osoittaneet ovat 2 edustavia tuloksia) jäivät un-aktivoitu (N, naiivit) tai aktivoitiin PHA (A, Q, +) sitten tehdään lepotilassa jälkeen 72 tuntia PHA aktivoitumisen CO

2 strippaus kuvatulla Materiaalit ja menetelmät jaksossa (Q ), sitten stimuloitiin IL-2: ssa 3 h (+). Solut kerättiin ja sitten Western blotattiin vasta PDE4B ß-aktiini kuten oikealle. Molekyylipainomarkkerit on esitetty vasemmalla. Alemmassa paneelissa heti PBMC eristäminen CD4 + (kaistat fi) tai CD8 + (kaistat olla) solut negatiivisesti valittiin kuvattu Materiaalit ja menetelmät jaksossa käyttäen magneettisia helmiä, ja sitten aktivoitiin PHA, tehty lepotilassa, stimuloidaan IL-2 ja Western blotattiin varten PDE4B ja ß-aktiini edellä kuvatulla tavalla. YT-solut toimivat positiivisina säätimet PDE4B- ilme. (C) PDE4B- ilmaistaan ​​CD4 + imukudoksen tuumorisolulinjoissa. Kit225, H9, Molt3, MT2, Hut102 CD4 + ja YT NK kaltainen lymfoidisolulinjojen lyysattiin ja yhtä suuret määrät proteiinia Western blotattiin varten PDE4B ja ß-aktiini kuvatulla Kuva 6A. Edustavia tietoja kahdesta itsenäisestä kokeesta on esitetty.

PDE4B- on ilmoitettuna CD4 + Lymfaattinen tuumorisolulinioissa

Koska PDE4B- havaittiin poikkeuksellisen ilmaistu hajanainen suuri B-solulymfooman näytteitä [35] heräsi kysymys, mikä voisi olla asema PDE4B- ilmaisun eri CD4 + ja muut lymfaattisen syöpäsolun linjat. Näin ollen joukko ihmisen CD4 + lymfoidi- tuumorisolulinjoissa ja NK-solulinjaa, YT, tutkittiin Western-blottauksella että osoitti ilmentyy voimakkaasti PDE4B proteiinin läsnä näissä soluissa (kuvio 6C). Stat5: n signalointireitin on merkityksellinen useita näistä solulinjoista: ihmisen MT2 ja Hut102 ja näyttää hyperaktiivinen Stat5: n reitti [37], kun taas YT ja Kit225 solujen apoptoosia, kun Stat5: n on tyhjentynyt [11], [38]. Kiehtovan, PDE4B todettiin yliekspressoitu osa hajanainen suuri B-solulymfooman näytteet, jotka olivat refraktaarisia kemoterapiaa [39]. Olisi siis mielenkiintoista tutkia solun kohtalon jos PDE4B- voitaisiin tehokkaasti loppuun ja onko kuolema voi johtaa.

Yhteenvetona voi todennäköisyydellä olettaa, että yliekspressio PDE4B- saattaa johtua epänormaalista genomista DNA sitoutumisen Stat5: n joka voi myöhemmin osallistua tuumorigeenisen fenotyypin näistä solulinjoista. Testaus Tämän hypoteesin vaatii lisätutkimuksia.

Johtopäätökset

Yhteenvetona käyttäen systemaattista lähestymistapaa, jossa yhdistyivät määritettäessä IL-2 indusoi Stat5: n cistrome ja geenien ilmentymisen analyysi sisällä ihmisen leukemia solumallin ; ja seurantaa geeni ontologian sekä keski- suoritusteho transkriptioekspressiokuvio validointi ensisijaisen ihmisen PBMC olemme tunnistaneet 19 novel Stat5: n kohdegeenien, jotkut toiminnot vielä-to-määritettävä ja joissakin on merkitystä immuunisolujen. Olemme myös validoitu uusi ehdokas kohdegeenin PDE4B- on proteiini tasolla PBMC ja todennut sen yli-ilmaistaan ​​CD4 + lymfaattisessa tuumorilinjoja. Nämä tiedot myös, että kasvainsolut lymfoidista alkuperää saattaa olla vinoutunut genomista Stat5: n sitoutumiskohtiin ja näin ollen kohteen geenejä verrattuna normaaliin imusoluja (ehdottivat vertailua tietojemme kanssa jo olemassa olevien tietojen kirjallisuudessa Liao ja kollegansa [16] ); Siksi, löytää erityisiä tavoitteita hävittää ne saattavat vaatia genominlaajuisten kartoitus suurempien sarjaa primaarituumorin näytteitä samaa alkuperää. Olipa imusoluja joiden yliaktiivinen Stat5: n polku saattaa olla herkkä PDE4B inhibiittorit ja mekanismi ohjaamaan tietyt kasvaimet tehdään tulevaisuuden tutkimuksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoito

ihmisen lymfooman solulinja YT [40], CD4 + ihmisen T-solulinjojen HUT-102 [41] ja MT-2 [42], kateenkorvasta peräisin CD4 + T-lymfosyyttisolulinja Molt-3 [43], CD4 + T-solulinja H9 [44] ja ihmisen CD4 + IL-2-riippuvaista -leukemiasolulinjan Kit225 [45] (ystävällisesti toimitti Dr. J. Johnston, Queens University, UK) viljeltiin kuvatulla [4], [38]. IL-2 saatiin NCI Prekliiniset Repository. Ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) eristettiin, aktivoitiin PHA: lla, ja pidettiin, kuten on kuvattu [46]. CD4 + tai CD8 + T-solut eristettiin negatiivisella valinnalla käyttämällä Dynabeads® Koskematon ™ Human CD4-T-solut (Cat. No. 113.46D) tai ihmisen CD8-T-solut (Cat. No. 113.48D) sarjat, vastaavasti.

Kromatiini Immunosaostaminen

Kromatiini immunosaostukset suoritettiin noin 5 x 10

7 Kit225 soluja kuvatulla [4] anti-STAT5A /B-vasta-aineita (sekoittaminen sc-1081 ja sc-835 (C-terminaali STAT5A ja STAT5B vasta-aineita, vastaavasti)) tai normaali kanin seerumi (IgG kontrolli) 3 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Vahvistaa, että määritykset olivat onnistuneita, PCR-monistus tunnetaan Stat5: n sitoutumiskohtaan sijaitsee 5 ’ihmisen IL2RA geenin sisällä Positiivinen Regulatory alueen III [23] (Forward: 5′-ACG TCT AGA AAG AAA GTG GTC-3′ Reverse : 5’- CTG TCC CTG GAT GAA CCT AGT-3 ’) suoritettiin käyttäen kvantitatiivista reaaliaikaista PCR. [4] Arvot selostukset tuntemattomissa näytteet interpoloimalla Ct (PCR syklejä kynnys) arvot standardikäyrä. Standardikäyrät valmistettiin tunnettuja määriä puhdistettua PCR-monistettu DNA. ChIP qPCR pohjamaali määritykset PDE4B- ChIP validointi tilattiin SABiosciences, Qiagen yhtiö (Cat # GPH900044 (-) 01A), antamalla kromosomaalinen asentoja 250 emäsparin ympäröivä oletetun GAS sivuston (chr1:66569949-66570198, hg18). PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen 2 x SYBR Green Mastermix BioRad ja BioRad iQ5 pösyklilaitteessa kolmena rinnakkaisena. Mielivaltaisina yksikköinä määritelty ”DNA: ta sitovaa, (Db)” saatiin 2∧ (-averageCt) ja keskihajonta SD ≈ ln (2) * Keskihaj (averageCt) * Db.

Random monistaminen Kromatiini immunosaostettiin DNA

Jos haluat luoda kirjastoja siru-ed DNA, satunnainen monistaminen toteutettiin kuten kuvattu https://research.stowers-institute.org/gertonlab/protocols/RandomPCRamplification.pdf jonka DeRisi laboratorioon UC San Francisco. Lyhyesti, ChIP-ed DNA-näytteet monistettiin muokattu versio satunnainen PCR [47]. DNA hehkutettu aluketta A (5′-GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN), ja toisen juosteen DNA-synteesin suoritettiin Sequenase (US Biochemical). Tämä aine käytettiin sitten templaattina 35 sykliä PCR Primer B (5′-GTTTCCCAGTAGGTCTC) käyttäen seuraavaa profiilia: 30 s 94 ° C: ssa, 30 s 40 ° C: ssa, 30 s 50 ° C: ssa, 60 s 72 ° C: ssa ja dNTP-seosta, joka sisältää dUTP. Tuotteet puhdistettiin kanssa QIAGEN PCR puhdistustarvikepakkausta, määrälliset ja ajettiin 1% agaroosigeelillä tarkistaa palakooltaan, testataan sitten rikastusta Positiivinen säätelyalueen III edellä kuvatulla tavalla.

In Silico

Analysis

Chip-on-chip tulokset analysoitiin MAT (Model-pohjainen analyysi Laatoitus array, [24] https://liulab.dfci.harvard.edu/MAT/), jonka Liu Lab laitoksella Biostatistics ja laskennallisen biologian Dana-Farber Cancer Institute, Harvard School of Public Health. Proksimaalisen geenin kartoitus geenisekvenssejä jopa 300 kb suoritettiin käyttäen cis-Regulatory Element Huomautukset (CEAS https://liulab.dfci.harvard.edu/CEAS/). Tulokset visualisoitiin IGV. Muuntaminen genomin koordinaattien ja genomin merkintätiedostoja eri versioita ihmisen perimän kokoonpanot suoritettiin käyttäen UCSC Genome Liftover työkalun https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver.

RNA: n eristäminen ja cDNA Synthesis

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy-kittiä (QIAGEN). cDNA syntetisoitiin BioRad n iScript cDNA Synthesis Kit mukaan valmistajan ohjeiden.

Microarray Analysis

Gene Expression Analysis käyttäen Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 mikrosiruja tehtiin klo Microarray Core Facility, Baylor College of Medicine, Houston, TX. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen GeneSpring GX yliopistossa Debrecen. Affymetrix GeneChip- Human Promoottori 1.0R paneelit kuulustella alueiden lähelle transkription aloituspaikkoja ja sisältävät koettimet noin 59 prosenttia CpG saaria. Nämä taulukot sisältävät 4,6 miljoonaa antureista laatoitettu kautta yli 25.500 ihmisen promoottorialueille keskimäärin resoluutio on 35 bp.