Krooninen sairaus

tiivistelmä

Caveolin-1: n tiedetään edistävän solujen vaeltamiseen ja lisääntynyt caveolin-1: n ilmentyminen liittyy kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeiden. Fibroblasteissa caveolin-1 polarisaatio ja fosforylaation tyrosiini-14 ovat olennaisen tärkeää edistää muuttoliikettä. Kuitenkin rooli caveolin-1 in kulkeutumista metastaattisen solujen edelleen heikosti määritelty. Tässä caveolin-1 osallistuminen metastaattinen migraatiota arvioitiin shRNA kohdentamista endogeenisen caveolin-1 MDA-MB-231 ihmisen rinta- syöpäsolujen ja ektooppinen ilmentyminen B16-F10 hiiren melanoomasoluja. Ehtyminen caveolin-1 in MDA-MB-231-solujen pienentää, kun taas ilmaisun B16-F10-solujen edistää muuttoliikettä, polarisaatio ja fokaalisen adheesion liikevaihdon tapahtumasarjaa, joka osallistuu fosforylaatiota tyrosiinin-14 ja Ras-1 aktivointi. In B16-F10-solut, ilmaus ei-fosforyloitavissa tyrosiini-14 fenyylialaniinin mutantti ei kerrata havaitut vaikutukset villityypin caveolin-1. Vaihtoehtoisesti, hoitoa MDA-MB-231-solujen kanssa, Src-inhibiittori PP2 vähentää caveolin-1 fosforylaatio tyrosiini-14 ja migraatiota. Yllättäen toisin kuin fibroblastit, caveolin-1 polarisaatio ja uudelleen lokalisointi takareunaan ei havaittu siirryttäessä metastaattisen soluissa. Siten ilmaisun ja fosforylaatio, mutta ei polarisaatio caveolin-1 eduksi erittäin mobiili fenotyyppi metastaattisen soluja.

Citation: Urra H, Torres VA, Ortiz RJ, Lobos L, Díaz MI, Díaz N, et al . (2012) Caveolin-1-Enhanced Liikkuvuus ja Focal Adhesion Liikevaihto Vaadi tyrosiini-14, mutta ei arvosanojen taakse metastaattisessa syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (4): e33085. doi: 10,1371 /journal.pone.0033085

Editor: Burton B. Yang, University of Toronto, Kanada

vastaanotettu 7 huhtikuuta, 2011; Hyväksytty: 09 helmikuu 2012; Julkaistu: 10 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Urra et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Fondo de Financiamiento de Centros de Excelencia en Investigación # 15010006 (AQ), kansallinen rahasto tieteellisen ja teknologisen kehityksen (FONDECYT) # 1110149 (L. Leyton), FONDECYT # 1090071 (AQ), Biomedical Neuroscience Institute P09 -015-F päässä Iniciativas Científicas Milenio (L. Leyton ja SH), Fogarty International Research Collaboration Award-National Institutes of Health 5R03TW007810 (L. Leyton), kansallinen komitea Science and Technology (CONICYT) # 79090021 ”lisääminen Young post doc tutkimukset Akatemian ”(VT), FONDECYT aloittaminen # 11100287 (VT) ja CONICYT PhD apurahoja (HU, ND, RO, MID ja L. Lobos). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cell maahanmuutto on välttämätöntä monenlaisia ​​biologisia prosesseja, mukaan lukien alkion kehitys, kudosten korjaamiseen ja elvyttämiseen sekä liittyvät tapahtumat sairauksia, kuten niveltulehdus, ateroskleroosin ja kasvainsolujen etäpesäkkeiden [1]. Aluksi solut reagoivat ulkoiseen vihjeitä (haavoittaen, kemokiinit ja kasvutekijät), jonka uudistamiseen mikrotubulusverkoston järjestäminen keskus (MTOC) ja Golgi kohti etureunaa (solu polarisaatio vaihe) [2]. Sitten solut ulottuvat leveä (

lamellipodioihin

) ja piikki ulkonemia (

filopodia

) on prosessi, joka seuraa fokaalisen adheesion (FA) muodostumista, solun elin supistuminen ja lopulta takaisinveto takapää katkaisemalla FA [3]. Monet näistä tapahtumista järjestävät Rho perheen pieniä GTPaaseja, joka sisältää RhoA, Rac1 ja Cdc42. Signaaleja, jotka aktivoivat Rho GTPaasit johtaa spatiotemporal sääntelyn FA kokoonpano, dynamiikka ja vaihtuvuus [4], [5].

Monet proteiinit kuten PI3K, PTEN [6], Rho-GTPaasit [4], [7] ja caveolin-1 [8], [9], on osoitettu jakaa uudelleen koko solu polarisoitunut siirtoa. Caveolin-1 on erityisen kiinnostavaa, koska tiedetään edistää solujen vaeltamiseen [10], invaasio [11], [12], [13] ja ehdotetaan olevan osallisena kasvainsolun etäpesäkkeitä (tarkistetaan [14], [ ,,,0],15]).

Caveolin-1 on olennainen membraaniproteiini mukana kaveoleja biogeneesissä, kolesteroli homeostaasin, solunsisäistä kuljetusta ja signaalitransduktion muun toimintoja (tarkistetaan [15]). Tarkka rooli caveolin-1 kasvainten synnyssä kuuluu edelleen vilkasta keskustelua ja onko proteiini toimii tuumorisuppressorina tai edistäjänä etäpesäke näyttää olevan solutyypin ja kontekstisidonnaisia ​​[14], [15]. Siten syöpä malleissa kuten eturauhas-, rinta- ja paksusuolen, caveolin-1 ilmentymisen tiedetään säädelty ja proteiinin tasot korreloivat kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden [15]. Yhdenmukainen rooli etäpesäke, caveolin-1 oli raportoitu parantaa solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus [11], [12], [16], [17]. Kuitenkin rooli caveolin-1 aikana solu muuttoa on enimmäkseen tunnettu ei-metastasoituneen soluissa. Esimerkiksi hiiren alkion fibroblasteissa (MEF), caveolin-1-edistänyt soluliikkuvuus mukana solujen polarisaatio ja lisääntynyt nopeus ja pysyvyys solumigraation [18]. Lisäksi, caveolin-1 vähentää Rac1 ja Cdc42, mutta lisää RhoA aktiivisuutta estämällä Src /p190RhoGAP signalointireitin [10], [18]. Kiehtovan, caveolin-1 itse kerääntyy takana vaeltavat fibroblastien, neuronien ja endoteelisolujen 2D mallit [19], [20], [21], vaikka transmigrating endoteelisoluissa ja neuroneissa, caveolin-1 valikoivasti kertyy solun edessä [20], [22]. Caveolin-1-riippuvaisten solujen vaeltamiseen ja kerääntyminen takana MEF-vaatia aminohapposekvenssin 1-60, joka kattaa otaksutun N-terminaalinen caveolin-1 polarisaatio domeeni [21], [23].

Caveolin- 1 stabiloi polttoväli adheesiokinaasi (FAK) at FA pienentämällä shuttling välillä FA ja sytosolin altaat, kuten fluoresenssilla toipuminen Valovalkaistuminen analyysin mobiili fraktion. Koska FAK, ja tarkemmin sanottuna fosfo-Y397-FAK, jonka tiedetään lisäävän FA liikevaihdon caveolin-1 ehdotettiin osallistumaan säätelyssä prosessin [24]. Todellakin, myöhemmät tutkimukset osoittivat, että caveolin-1-riippuvaisia ​​vakauttaminen FAK, solumigraation ja invaasion mukana Src /Rho /ROCK akselin sekä fosforylaation caveolin-1 tyrosiini-14 [11]. Pikemminkin kiehtovan, caveolin-1 oli myös osoitettu lisäävän stabiilisuutta syntyvän FA (tai paikallisissa kontakteissa) ja RhoA aktivointi [18].

Mielenkiintoista on, että Src-välitteisen fosforylaation caveolin-1 tyrosiini-14 näkyy olevan olennainen caveolin-1-ajettu solumigraation. Vuonna metastaattisen rintasyövän soluja (MDA-MB-231), caveolin-1 ilmentyy voimakkaasti ja fosforyloitu tyrosiini-14, verrattuna ei-metastaattinen soluihin [11]. Vaikka aluksi tutkimukset viittasivat otaksuttu rooli caveolin-1 fosforylaatio tyrosiini-14, kiistanalaisia ​​kysymyksiä liittyy vielä tarkka osallistumista fosfo-caveolin-1 in kiinnitysalueisiin kanssa soluväliaineen [25]. Tärkeintä on kuitenkin, rooli caveolin-1 in kulkeutumista metastaattisen solujen vaatii lisätutkimuksia, jotta ymmärtää, miten tämä proteiini voi edistää prosesseja, kuten etäpesäkkeiden.

Tässä tutkimuksessa olemme erityisesti tutkittu roolia caveolin -1 metastaattisessa migraatiota käyttämällä kahta eri mallia: MDA-MB-231 ihmisen rintasyövän solujen ja hiiren melanoomasolulinjalla B16-F10. Molemmissa solulinjoissa, caveolin-1 edistää solumigraatio lisäämällä FA liikevaihdon, polarisaatio, nopeus, pysyvyys ja paikantuu. Nämä toiminnot caveolin-1 ovat kaikki estetty häiritsemällä fosforylaatio tyrosiini-14, kuten on esitetty farmakologinen esto ja mutaatioanalyysiin. Kiehtovan, molemmissa metastaattinen solumalleissa, caveolin-1 lokalisointi soluun taakse ei tarvitse edistää muuttoliikettä.

Tulokset

Caveolin-1 kertyy takareunaan Siirtyminen MEF-3T3 ja DI-TNC1 Cells, mutta ei Metastaattinen MDA-MB-231 ja B16-F10 Cells

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että caveolin-1 kerääntyy takana vaeltavien solujen kuten MEF, HUVEC ja neuronien [19], [ ,,,0],20], [21]. Olemme pyrkineet laajentamaan näiden havaintojen nopeasti siirtyvät metastaattisen soluja, arvioimalla lokalisoinnin caveolin-1 on arpeutumisprosessit määritys seuraa immunofluoresenssianalyysillä. Ihmisen rintasyövän solulinjan MDA-MB-231 ja DI-TNC1, sekä MEF-3T3-solut, kaikki ilmaistuna korkea endogeenisten tasojen caveolin-1 (kuvio 1A). Yllättäen caveolin-1 kertymä ei takana MDA-MB-231-solujen siirron aikana kohti haavoittuneen alueelle (kuvio 1 B). Yhteisymmärryksessä aiempien raporttien kanssa [8], [9], polarisaatio caveolin-1 havaittiin MEF-3T3-fibroblastisoluja, sekä astrocytic DI-TNC1 soluissa (kuvio 1 B). Arvioidaan laajuutta caveolin-1 polarisaatio, fluoresenssivoimakkuudet etu- ja kvantitoitiin sisällä erillisiä vyöhykkeitä käyttämällä

Image J

ohjelmisto ja takana /edessä suhteet laskettiin eri ajankohtina muuttoliikkeen, kuten aiemmin kuvattu [21], [23]. Sekä MEF-3T3 ja DI-TNC1, mutta ei MDA-MB-231-solujen, ajasta riippuvainen kasvaa caveolin-1 polarisaatio havaittiin, jolloin kertyminen takana oli lähes täydellinen, kun 360 minuuttia muuttoliike (kuvio 1 C). Puute caveolin-1 polarisaation MDA-MB-231-solujen ei voitu katsoa johtuvan korkean endogeenisiä ekspressiotasot näissä soluissa, koska seuraava shRNA välittämää säätely alaspäin caveolin-1, jäännös caveolin-1 epäonnistui polarisoituvan näissä soluissa upon muuttoliike (katso alla oleva teksti, kuviot 2A, 2B ja 2C).

(A) Yhteensä proteiiniextraktien DI-TNC1, MEF-3T3 ja MDA-MB-231-solut erotettiin SDS-PAGE (35 ug kokonaisproteiinia kaistaa kohti) ja analysoitiin Western blotting -tekniikalla, jossa vasta-aineet caveolin-1 ja β-aktiini. (B) Yhtenäisiä yksikerroksiset DI-TNC1, MEF-3T3 ja MDA-MB-231-soluja haavoittui pipetillä kärki ja vahvistettu 0 (vasen paneeli) ja 60 minuuttia (oikea paneeli) jälkeen yksikerroksista loukkaantumisen. Solut värjättiin kaniinin polyklonaalista anti-caveolin-1-vasta-aine ja sen jälkeen anti-kani-lgG-vasta-ainetta (vihreä) ja tumat visualisoitiin DAPI (sininen). Ensimmäinen kerros soluja päin haavoittunut alue eroaa loput valkoinen viiva. Mittakaava, 20 um. (C) Caveolin-1 jakautuminen arvioitiin mittaamalla fluoresenssin voimakkuutta neljällä satunnaisesti valittu alueita samankokoisesta edessä ja takana solun

Image J

ohjelmisto, niin kuin kohdassa Materiaalit ja menetelmät . Data edustaa suhdetta fluoresenssin voimakkuutta ”takana /edessä” (keskiarvo ± SEM, n = 3). Tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna aika 0 minuuttia kunkin solutyypin ilmoitetaan (**, P 0,01, *, P 0,05). (D) B16-F10-solut transfektoitiin joko pLacIOP (mock) tai pLacIOP-caveolin-1 (cav1) käsiteltiin tai ei ole 1 mM IPTG: llä 24 tunnin ajan ja kokonaisproteiinin uutteet valmistettiin, erotettiin SDS-PAGE: lla (35 ug kokonaisproteiinia kaistaa kohti) ja analysoitiin Western blotting -tekniikalla. (E) Yhtenäisiä yksikerroksiset pLacIOP-caveolin-1 transfektoitujen B16-F10-solujen puuttuessa tai läsnä 1 mM IPTG haavoittui pipetillä kärki ja kiinteät joko 0 tai 60 minuuttia sen jälkeen haavoittaen. Näytteet värjättiin anti-caveolin-1 polyklonaalista vasta-ainetta (vihreä) ja DAPI (sininen). Reuna haava hahmoteltu kanssa valkoinen viiva. Mittakaava, 20 um. (F) Caveolin-1 lokalisointi analysoitiin eri ajankohtina, kuten on kuvattu julkaisussa C. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.

laajentaa havainnoista MDA-MB-231-soluja , caveolin-1 polarisaatio tutkittiin myös hiiren melanooma B16-F10-solut. Nämä solut ilmentävät alhaisen endogeenisen tasolla, ja näin ollen caveolin-1 otettiin käyttöön transfektoimalla solut placIOP plasmidilla, joka sisältää insertin, joka koodaa täyspitkää proteiinia. Etuna plasmidi on, että se sallii IPTG-indusoituvan ekspression [26]. Kuten on esitetty, transfektio pLacIOP-caveolin-1 (

cav1 ehto

) johti 5-kertainen caveolin-1-tasot verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla pLacIOP (

mock kunnossa

, kuvio 1 D). Ekspressio entisestään 1 mM IPTG: llä toisessa 5-kertainen verrattuna ei-indusoidun solujen (kuvio 1 D). Siten caveolin-1 lokalisointi arvioitiin sekä indusoi (korkea lauseke) ja ei-aiheuttama solujen (matala lauseke), kun muuttoliikettä arpeutumisprosessit määrityksessä. Kuten MDA-MB-231-solujen, caveolin-1 epäonnistui uudelleen paikallistaa siirryttäessä B16-F10-solut (kuvio 1 E) ja kerääntyminen takana ei koskaan havaittu milloin tahansa siirron aikana (kuvio 1 F).

yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että toisin kuin havainnot kuin metastasoituneen soluissa arvioitiin here (MEF-3T3, DI-TNC1) ja kirjallisuudessa [19], [20], [21], caveolin-1 ei suoriteta polarisaatio muuton aikana metastaattisen soluja. Koska seuraukset caveolin-1 käyttäytyminen solujen vaeltamiseen ovat tuntemattomia, osuus caveolin-1 useita siirtolaisuuteen liittyviä ominaisuuksia MDA-MB-231 ja B16-F10-solut arvioitiin seuraavissa kokeissa.

solun polarisaatio on ensimmäinen askel tarvitaan solujen vaeltamiseen ja suuntaava liikkumista. Re-lokalisaatio MTOC ennen ytimien ja takana Golgin on tärkeä määriteltäessä suuntaan muuttoliike [27]. Jotta voidaan tutkia roolia caveolin-1 in MDA-MB-231 solujen polarisaatio, endogeeninen proteiini alas-säädellä shRNA (shRNA-caveolin-1 # 5) (kuvio 2A). Kuten havaitaan kuviosta 1, haima caveolin-1 ei kertynyt takana vaeltavien solujen (kuviot 2B, 2C). Kuitenkin polarisaatio MDA-MB-231-solujen vähentynyt caveolin-1 ekspressio väheni huomattavasti, kuten on esitetty Golgi suunta (kuviot 2B, 2D, kuvio S1A, S1B). Kvantitatiivinen analyysi osoitti, että shRNA välittämää alas-säätely caveolin-1 viivästyneet MDA-MB-231 solujen polarisaatio, koska erot eivät enää olleet merkittäviä jälkeen 360 minuuttia (kuvio 2D). Kuten voidaan ennustaa ja annosriippuvainen caveolin-1 vaikutus, osittainen menetys solujen polarisaatio havaittiin toisen shRNA (shRNA-caveolin-1, sekvenssi nro 3), että kohdennettu caveolin-1, joilla on alhaisempi tehokkuus (kuvio S1A, kuvio S1C) . Siten caveolin-1 näyttää pelata aikaisin, mutta ohimenevää rooli polarisaatio metastaattisen MDA-MB-231-soluja. Samoin B16-F10 solujen polarisaatio kasvoi ajasta riippuva muoti upon kulkeutumista haavoittuneen alueelle ja määrä polarisoitunut solujen oli huomattavasti suurempi caveolin-1 ilmentävien soluihin seuraavat IPTG induktion (kuviot 2E, 2F, kuva S2). Pienempi kasvu solujen polarisaatio havaittiin alhaisen caveolin-1 ilmentävien solujen (ei IPTG induktio) verrattuna mock ohjaus (kuvio 2F). Nämä tulokset osoittavat, että sekä B16-F10 hiiren melanooma ja MDA-MB-231 ihmisen rintasyöpäsoluilla, caveolin-1 edistää solujen polarisaatio tavalla, joka ei vaadi caveolin-1 kerääntyminen solun takana.

(A) kokonaismäärä proteiinia uutteet valmistettiin sekä vanhempien MDA-MB-231 ja jotka on vakaasti transdusoitu ohjaus shRNA kohdistaminen lusiferaasi (sh-ctrl) tai shRNA kohdistaminen caveolin-1 (shRNA-caveolin-1 # 5, sh-cav1 ). Uutteet erotettiin SDS-PAGE: lla (35 ug kokonaisproteiinia kaistaa kohti) ja analysoitiin Western blotting -tekniikalla, jossa vasta-aineet caveolin-1 ja β-aktiini. (B) Yhtenäisiä yksikerroksiset vanhempien, shRNA-ohjaus (sh-ctrl) tai shRNA-caveolin-1 (sh-cav1) käsitellyn MDA-MB-231-soluja haavoittui pipetillä kärki ja vahvistettu 0 (vasen paneeli) ja 60 minuuttia (oikea paneeli) jälkeen yksikerroksista loukkaantumisen. Näytteet värjättiin anti-caveolin-1 (vihreä) ja anti-Golgin-97 (punainen) vasta-aineita, kun taas tumat värjättiin DAPI (sininen). Ensimmäinen kerros soluja päin haavoittunut alue eroaa loput valkoinen viiva. Mittakaava, 20 um. (C) Caveolin-1 lokalisointi analysoitiin, kuten on kuvattu kuviossa 1C, mittaamalla suhde fluoresenssi-intensiteetin ”edessä /takana”. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM, n = 3 (D) Polarisaatio sekä vanhempien (-) ja shRNA käsiteltiin MDA-MB-231-solujen shRNA-lusiferaasi (sh-ctrl) tai shRNA-caveolin-1 (sh-cav1) mitattiin (C), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, analysoimalla ulompi kerros soluja päin haavoittuneen alueen (B). Prosenttiosuus polarisoitunut solujen arvioitiin 0, 60 ja 360 minuutin kuluttua haavoittaen. Tiedot laskettiin keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta (keskiarvo ± SEM). * Vertailu ohjaus shRNA P 0,05. (E) B16-F10-solut transfektoitiin joko pLacIOP (mock) tai pLacIOP-caveolin-1 (cav1) käsiteltiin tai ei ole 1 mM IPTG: llä 24 tunnin ajan, kasvanut monokerrokset ja loukkaantuneiden pipetillä kärjestä, jotta siirron 1 tunnin ajan. Näytteet värjättiin anti-Gigantin-1 polyklonaalista vasta-ainetta (punainen), phalloidin-Alexa488® (vihreä) ja propidiumjodidia (punainen). Ulompi kerros soluja päin haavoittunut alue on rajattu valkoinen viiva. (F) Cell polarisaatio mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät, analysoimalla ulompi kerros soluja päin haavoittuneen alueen. Prosenttiosuus polarisoitunut solujen arvioitiin 0-360 minuutin kuluttua haavoittaen yksikerroksista. Tiedot laskettiin keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta (keskiarvo ± SEM). Tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna pLacIOP-transfektoitujen B16-F10 (mock) soluja merkitty (**, P 0,01 hetkellä 360 min *, P 0,05 ajankohtana 60 min).

Caveolin -1 Edistää Migration metastasoituneen Cells

rooli caveolin-1 solujen siirto on kiistanalainen ja näyttää olevan solu-tilanneriippuvaista, koska se on kuvattu sekä positiivisena [18], [19] ja negatiivinen säätelijä muuttoliike [28], [29], [30]. Näissä tutkimuksissa pääasiassa fibroblastien ja endoteelisolujen karakterisoitiin. Niinpä arvioitiin vaikutus caveolin-1 kulkeutumista metastaattisen MDA-MB-231 ja B16-F10-soluja. Molemmissa tapauksissa caveolin-1 ilmentymisen suosi muuttoliike, kuten havaittu Boyden istuntosalissa määritys (kuviot 3A, 4A) ja kun analyysi Aikakierrosvideo mikroskopia yhdistettynä yksittäisen solun seuranta (kuviot 3B, 4B). Caveolin-1 down-regulation in MDA-MB-231-soluihin shRNA vähentynyt radan pituus ja paikantuu muuttoliikkeen verrattuna vanhempien ja ohjaus soluja (kuvio 3B). Tulokset tukevat ajatusta, että caveolin-1 läsnäolo näissä soluissa suosii pysyvyys solumigraation. Todellakin, caveolin-1 alassäätöä laski solumigraatio liittyviä parametreja, mukaan lukien instant (kuvio 3C) ja keskinopeus (kuva 3D), pysyvyys (saatu suhde net ja koko matkan, kuvio 3E) ja paikantuu muuttoliikkeen (ilmaistuna solujen prosenttiosuus, jotka liikkuvat alueella 60 ° kulmassa lähtökohta) (kuviot 3B, 3F). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin B16-F10-solut, joissa caveolin-1 ilmentymisen kasvoi transmigraatio on Boyden istuntosalissa määritys (kuvio 4A) ja muuttoliikettä arpeutumisprosessit määritys (kuva 4B), sekä välittömän ja keskimääräinen nopeus, sitkeys ja suuntautuneisuutta muuttoliike (kuvio 4C, kuva S3). Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä aikaisempien havaintojen MEF-3T3-soluissa [10], [11], [18] ja ehdottaa, että caveolin-1 moduloi muuttoa metastaattisen MDA-MB-231 ja B16-F10-solut, mutta tekee niin vielä ilman muutoksia solunsisäisessä jakeluun.

(A) Migration MDA-MB-231-solujen käsitelty shRNA kohdistaminen joko lusiferaasia (sh-ctrl) tai caveolin-1 (sh-cav1) arvioitiin Boyden kammion määritys. -Soluja (5 x 10

4) ympättiin fibronektiinillä päällystetyn (2 ug /ml) transwell levyille ja annettiin siirtyä 2 tuntia. Solut, jotka vaelsivat alapinnan puolelle havaittiin kristallivioletilla värjäytymistä (keskiarvo ± SEM, n = 3). ** P 0,01. (B) Vanhempien ja shRNA käsiteltiin MDA-MB-231-soluja kasvatettiin kuten konfluentteja yksisolukerroksia, haavoittunut pipetillä kärki ja muuttoliike tallennettiin Aikakierrosvideo mikroskopia (yhteensä 15 tuntia, 12 minuuttia kehysväliin). Cell kappaleita määritettiin käyttämällä

Image J

ohjelmisto (

”Manual Seuranta”

plug-in). Kappaleet yksittäisten solujen haavoittuneen reunassa näkyvät (ylempi paneeli). Reuna haava on merkitty valkoinen viiva. Yhden solun kappaleet esitetään koordinaattijärjestelmän kullekin solutyypin (alempi kuva). (C) Instant nopeus analysoitiin kunkin solun tyypin (B), ja piirrettiin ajan funktiona (0-15 tuntia). (D) keskimääräinen nopeus arvot saatiin (C), ja piirrettiin kunkin solutyypin. (E) Pysyvyys muuttoliikkeen laskettiin suhde net etäisyyden ja koko matkan maahanmuuton (B). Keskiarvot saatiin vanhempien, sh-ctrl ja sh-cav1 soluissa (keskiarvo ± SEM). (F) suuntatoiminto muuttoliikkeen saatiin analyysistä esitetään (B), alempi paneelit. Kappaleet että sijoittuisi 60 ° kulmassa suhteessa suuntaan solun liikkeen pidettiin suuntautuneita (tummennetut alue). Prosenttiosuus solujen Orientated kappaleet on laskettu ja piirretty (keskiarvo ± SEM, n = 3). * P 0,05.

tyrosiinifosforylaatiolle on Caveolin-1 tarvitaan Migration metastasoituneen Cells

Caveolin-1 läpikäy Src-välitteisen fosforylaation tyrosiini-14, jonka arvellaan on olennaista fibroblastien migraatiota [18]. Osallistuminen fosforylaation caveolin-1 tyrosiini-14 edistää solumigraatiota tukee edelleen havaintoja rintasyövän solulinjoissa, mukaan lukien MDA-MB-231-soluja [11]. Siten arvioimme rooli tyrosiinifosforylaation B16-F10 melanoomasolulinja. Kiinnostavaa, ilmentyminen ei-fosforyloitavissa caveolin-1 (mutantti Y14F) ei edistää B16-F10 solumigraation (kuvio 4A, 4B). Vaikka Y14F mutantti ei ilmenny samassa määrin kuin villityypin proteiini, on epätodennäköistä, että tällainen erilainen ekspressio osuus kyvyttömyys tämän proteiinin edistää solujen vaeltamiseen (kuvio 4A), koska asukkaan B16F10 (caveolin-1) solut (klooni 3) olisivat vertailukelpoisia caveolin-1 niille havaittu caveolin-1 (Y14F) soluja (katso kuva S3), siirtymänopeuksien olivat samanlaisia ​​kuin havaittu alkuperäistä väestöä B16F10 (caveolin-1) solujen (Kuva 4A). Video mikroskopia analyysi osoitti, että kappaleet mock valvonnan ja caveolin-1 (Y14F) solut olivat lyhyempiä kuin ne, jotka on saatu soluista, jotka ilmentävät villityyppistä caveolin-1 (kuvio 4B). Lisäksi muuttoliike oli satunnainen soluissa, joista puuttuu caveolin-1 tai ilmentävät caveolin-1 (Y14F) ja parametrit keskinopeus, pysyvyyden ja paikantuu muuttoliikkeen olivat alhaisempia caveolin-1 (Y14F) soluja verrattuna soluihin, jotka ilmentävät villityyppistä caveolin -1 (kuvio 4C). Nämä tulokset osoittavat, että caveolin-1 edistää solujen maahanmuuttoa B16-F10-solujen lisäämällä solujen polarisaatio, nopeus, pysyvyyden ja paikantuu solujen liikkeen ja että kyky tehdä niin, riippuu läsnäolo ja oletettavasti fosforylaation tyrosiini-14.

(A) B16-F10-solut transfektoitiin pLacIOP (mock), pLacIOP-caveolin-1 (WT) tai pLacIOP-caveolin-1 /Y14F mutantti (Y14F), käsiteltiin 1 mM IPTG: llä 24 tunnin ajan. Sitten solujen vaeltamiseen arvioitiin Boyden kammiossa määritys istuttamalla soluja (5 x 10

4) fibronektiinilla päällystetty (2 ug /ml) transwell levyt ja mahdollistaa muuttoliikkeen 2 tuntia. Solut, jotka vaelsivat alapinnan puolelle havaittiin kristallivioletilla värjäämällä (keskiarvo ± SEM, n = 3). * P 0,05. Pohja paneelit esittävät yhteensä proteiinin uutteita, erotettiin SDS-PAGE: lla (35 ug kokonaisproteiinia kaistaa kohti) ja analysoitiin Western blotting -tekniikalla. Numbers alla paneelit osoittavat suhteellinen caveolin-1 tasot (caveolin-1 /WT = 22,0 ± 1,8, caveolin-1 /Y14F = 16,6 ± 3,8; arvoihin verrattuna mock kunnossa ja saatu keskiarvo kolmesta itsenäisestä mittausta ± SEM). (B) Yhtenäisiä yksikerroksiset B16-F10-solut transfektoitu pLacIOP (mock), pLacIOP-caveolin-1 (WT) tai pLacIOP-caveolin-1 /Y14F (Y14F) haavoittuu pipetillä kärki ja tallennettu Aikakierrosvideo mikroskopia 10 tuntia (12-min kehysväliin). Cell kappaleita määritettiin kuten kuvassa legenda 3B. Kappaleet yksittäisten solujen haavoittuneen reunassa näkyvät (ylempi paneeli). Reuna haava luonnosteltu valkoinen viiva. Yhden solun kappaleet esitetään koordinaattijärjestelmän kullekin solutyypin (alempi kuva). (C) keskimääräinen nopeus (im /min) johdettiin välittömästi nopeudella (kuvio S3), kuten on kuvattu (D). Sitkeys ja paikantuu muuttoliikkeen saatiin kuten kuvissa 3E ja 3F, vastaavasti. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SEM (n = 3). * P 0,05.

Data saatu B16-F10-solut edelleen validoitu farmakologinen esto Src-ryhmän kinaasien, jotka fosforyloivat caveolin-1 tyrosiini-14 [31]. Solujen migraation ja fosforylaation caveolin-1 arvioitiin läsnä ollessa tai poissa ollessa selektiivinen Src-inhibiittori, PP2 (4-amino-5- (4-kloorifenyyli) -7- (dimetyylietyyli) pyratsolo [3,4-d] pyrimidiini ), sekä MDA-MB-231 ja B16-F10-solut. Seerumin stimulaatio lisääntynyt haavan sekä MDA-MB-231 ja B16-F10-solut. Haavan sulkeminen oli moduloidaan caveolin-1 ilmentymisen, kun shRNA välittämä alassäätö MDA-MB-231-solujen vähentynyt (kuvio 5A, Histogrammipylväiden), kun taas kohdunulkoinen ilmentymistä B16-F10-solujen määrä nousi haavansulkemiseen (kuvio 5B, Histogrammipylväiden) . Tärkeää on, hoidon PP2, mutta ei hallita ajoneuvon (dimetyylisulfoksidi, DMSO) esti caveolin-1-edistänyt haavojen sulkemista sekä MDA-MB-231 (kuvio 5A) ja B16-F10-solut (kuvio 5B). Lisäksi sekä sisäsyntyinen ja ektooppisesti ilmaistuna caveolin-1 ei suoriteta fosforylaation läsnä tämän inhibiittorin (kuviot 5A, 5B, Western-blotit). On huomattava, että pieni pY14-caveolin-1 oli havaittavissa mock-transfektoitujen B16-F10-solut, luultavasti siksi endogeenisten tasojen caveolin-1 olivat liian alhaiset. Tärkeää on, ei merkittäviä muutoksia lisääntymistä havaittiin molemmissa solulinjoissa, kun läsnä on inhibiittoria (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset ovat sopusoinnussa ajatuksen, että kyky caveolin-1 tehostaa metastaattisen solujen vaeltamiseen riippuu tyrosiini-14 fosforylaatiota Src-ryhmän kinaasit.

MDA-MB-231-solujen vakaasti transdusoitu shRNA joko kohdistaminen Luciferase ( sh-ctrl) tai caveolin-1 (sh-cav1) esi-inkuboitiin DMSO (D) tai 10pM PP2 30 minuuttia, haavoittui pipetillä kärki, stimuloi (+) tai ei (-) 3% seerumin ja kuvat rekisteröitiin 0 ja 16 tunnin kuluttua haavan tekemisen. Haavoittunut alue mitattiin

Image J

ohjelmisto ja prosenttiosuus haavan piirrettiin (ylempi paneeli). Kokonaisproteiinia uutteet valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella vasta-aineilla caveolin-1, pY14-caveolin-1 ja aktiini. (B) kasvaneita yksisolukerroksia B16-F10-solut transfektoitiin joko pLacIOP tai pLacIOP-caveolin-1 esi-inkuboitiin 1 mM IPTG: llä 24 tunnin ajan. Sitten soluja käsiteltiin DMSO: ssa (D) tai PP2, haavoittuneen pipetillä kärjestä, stimuloitiin 3% seerumia ja analysoitiin 0 ja 7 tuntia haavoittamisen jälkeen, kuten on kuvattu (A). Kokonaisproteiinia uutteet valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella. Arvot (A) ja (B) on keskimäärin 3 erilliselle kokeelle (keskiarvo ± SEM). * P 0,05.

Caveolin-1 Edistää Focal Adhesion liikevaihto Metastaattinen Solut

Caveolin-1 vähentää sukkuloimisen FAK välillä polttovälin tarttuvuus ja sytosolin altaat, mikä viittaa rooli caveolin -1 liikevaihdon FA: [24]. Tärkeintä on, solujen vaeltamiseen on tiukasti säädeltyä tasolla FA liikevaihdon [32], [33]. Niinpä arvioitiin vaikutuksen caveolin-1 FA liikevaihdon metastaattisessa syöpäsolujen transfektiolla GFP-vinkuliini seurasi nopeutus Videomicroscopy analyysi. GFP-vinkuliinin liittyi FA sekä mock ja caveolin-1 ilmentävien B16-F10-soluja (kuva 6A). Vaikka pieni osa koko FA tehtiin liikevaihto B16-F10-solut (5-10% koko FA), merkittävän kasvun kinetiikka FA purkaminen havaittiin caveolin-1 ilmentävien soluihin verrattuna mock ohjaus (kuvio 6A , nuolet, kuvio 6B, top kuvaaja). Tärkeää on, ilmentyminen caveolin-1 kasvoi polttoväli yhteystiedot (FC) käyttöikä (kuvio 6A, nuolenpää, kuvio 6B, pohja kaavio), kanssa aiempien huomautusten [18].

(A) B16-F10 transfektoitu jossa pLacIOP (mock) tai pLacIOP-caveolin-1 (cav1) transfektoitiin pEGFP-vinkuliinin 24 tuntia, ympättiin fibronektiini-päällystetty peitelaseille (2 ug /ml) ja kasvatettiin, kun läsnä on 1 mM IPTG: ssa 24 tunnin ajan (katso Materiaalit ja menetelmät). Sitten solut seerumin puutteessa 4 tuntia, pulssitettiin 10% seerumia ja tallennettu Aikakierrosvideo mikroskopia 60 minuutin (1-min kehysväliin). Zoomataan alueet näkyvät valituissa aikoina mock ja cav1 soluja. Focal kiinnikkeistä (FA, nuolet) ja paikallisissa kontakteissa (FC, nuolenpäitä) määriteltiin koon. Kuvat edustavat 3 itsenäistä koetta. (B) kinetiikka FA ja FC-mitattiin esitetyissä kokeissa A. FA purkaminen ja FC käyttöikä mitattiin vähintään 6 rakenteiden koetta kohti (keskiarvo ± SEM, n = 3). * P 0,05. (C) B16-F10 mock tai cav1-solut ympättiin fibronektiinillä päällystetyn peitelaseille (2 ug /ml), kasvatettiin läsnä oli 1 mM IPTG: ssa 24 tuntia ja käsiteltiin 10 uM nokodatsoli seerumittomassa väliaineessa 4 tunnin ajan. Sitten, nokodatsoli poistettiin wash-out seerumittomalla elatusaineella ja soluja inkuboitiin 0-20 minuuttia 37 ° C: ssa. Sen jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin anti-vinkuliini vasta-ainetta (punainen) ja DAPI (sininen) merkitä FA ja ytimet, vastaavasti. (D) FA kvantitoitiin kokeista on kuvattu (C) käyttämällä

Image J

ohjelmisto. Vähintään 10 kuvaa aikapistettä kohti analysoitiin. Tiedot laskettiin keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta (keskiarvo ± SEM, n = 3). (E) B16-F10 mock (-), cav1 (WT) tai cav1 /Y14F (Y14F) Soluja käsiteltiin 10 uM nokodatsoli, kuten on kuvattu kuviossa 6C. Nokodatsoli pestiin sen jälkeen pois 60 minuuttia ja FA analysoitiin anti-vinkuliini vasta-ainetta (punainen) ja ytimet DAPI (sininen). FA kvantifioitiin kuten (D). Tiedot edustavat kolmesta itsenäisestä kokeesta (keskiarvo ± SEM). * P 0,05. (F) MDA-MB-231-soluja pysyvästi transdusoitu shRNA joko kohdistus Luciferase (sh-ctrl) tai caveolin-1 (sh-cav1) transfektoitiin pEGFP-vinkuliinin 24 tuntia, seerumia 4 tuntia, pulssitettiin 10 % seerumia ja tallennettu Aikakierrosvideo mikroskoopilla, kuten on kuvattu (A). FA purkaminen ja FC käyttöikä mitattiin 5 rakenteita koetta kohti. Tiedot laskettiin keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta (keskiarvo ± SEM, n = 3). (G) Polttoväli adheesion hajoamista mitattiin nokodatsoli poistoa MDA-MB-231-soluja käsiteltiin shRNA kohdistaminen lusiferaasi (sh-ctrl) tai caveolin-1 (sh-cav1), kuten on kuvattu (C) ja (D). Tiedot laskettiin keskiarvo 12 mittauksista (keskiarvo ± SD).