Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suojattu ja tiettyjä nukleiinihappojen ja pahanlaatuisten solujen edelleen erittäin toivottavaa lähestymistapa syövän hoidossa. Tässä esittelemme tietoa fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet, toimintamekanismi, ja pilotti terapeuttinen teho on tenfibgen (TBG) -kuoriasut nanokapselissa tekniikkaa kasvaimeen suunnatun toimituksen yksisäikeisen DNA /RNA kimeerisiä oligomeerit kohdistaminen CK2αα ’to ksenograftikasvaimina hiirillä . Sub-50 nm koko TBG nanokapselissa (S50-TBG) on hieman negatiivisesti varautunut, yhtenäinen hiukkanen 15-20 nm koko, joka antaa suojan nukleiinihappoon lastia. DNA /RNA kimeerisiä oligomeeriä (RNAi-CK2) toiminnot laskevan CK2αα ”ekspressiotasoja kautta sekä siRNA ja antisense mekanismeja. Systeemistä kuljettamista S50-TBG-RNAi-CK2 kohdistuu erityisesti pahanlaatuisia soluja, mukaan lukien kasvainsolut luun, ja pienillä annoksilla vähentää kokoa ja CK2 liittyvien signaalien potilaalle tehdä ensisijainen ja metastaattinen ksenografti eturauhassyövän kasvaimia. Lopuksi S50-TBG nanoencapsulation teknologia yhdessä kimeerisen oligomeerin kohdistaminen CK2αα ”tarjous merkittävä lupaus systeemistä hoitoa eturauhassyövän pahanlaatuisuuden.

Citation: Trembley JH, Unger GM, Korman VL, Abedin MJ, Nacusi LP, Vogel RI, et ai. (2014) Tenfibgen Ligandin Nanoencapsulation Tarjoaa kaksitoimisen Anti-CK2 RNAi Oligomer Key Sivustot eturauhassyövän Targeting Ihmisperäisiä ksenograftikasvaimissa hiirissä. PLoS ONE 9 (10): e109970. doi: 10,1371 /journal.pone.0109970

Editor: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 elokuu 2014; Hyväksytty: 02 syyskuu 2014; Julkaistu: 15 lokakuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: Kirjoittajat vahvistaa, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja asiaan liittyvien tietojen tiedostoja.

Rahoittajat: Merit katsaus tutkimusvaroja (1IO1B001731), jonka antaa veteraaniviraston www.va.gov (KA). Tutkimus avustus CA150182 myönnetty National Cancer Institute, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services www.nih.gov (KA). Tutkimusmäärärahat CA158730 ja DK067436-05 myönsi National Cancer Institute ja National Institute of Diabetes, Digestive Diseases and munuaistautirekisterin, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services www.nih.gov (BTK). Tutkimus antaa HHS-N261-2008-00027 /N42CM-2008-00027C, CA99366, ja CA119556 myönsi National Cancer Institute, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services www.nih.gov (GMU). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Disclaimer: esitetyt näkemykset tässä artikkelissa ovat kirjoittajan omia eivätkä välttämättä edusta asemaa tai politiikan Yhdysvaltain veteraaniviraston tai Yhdysvaltojen hallitus.

Kilpailevat edut: GMU on omistusta ( myös patenttien) in GeneSegues, Inc. nro eturistiriitoja paljastettiin muiden kirjoittajien. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Across spektri pahanlaatuinen sairaus, tehokas hoito kehittynyt ja /tai metastaattinen jäännökset kriittinen tavoite pyrittäessä vähentämään syöpään liittyvää kuolleisuutta. Nukleiinihappo-pohjainen syöpähoidon pitää edelleen merkittävä lupaus geenispesifiseen, tehokas, ja matalan myrkyllisyys sairauden hoitoa, joka on lisäksi potentiaalia voittaa terapeuttisia vastus usein havaittu aggressiivinen tauti. Sekä antisense ja siRNA terapeuttisten ovat tehneet kliinisissä kokeissa hyvin kohtalainen menestys [1] – [4]. Avaintekijöitä systeemistä käyttöä lyhyt lineaarinen nukleiinihappojen kuin terapeuttisen osan sisältävät että ne on suunnattu spesifisesti kasvainsoluihin suojatussa tavalla, tehokkaasti ylittää solukalvojen ja kytkeytyvät solun koneiston. Lukuisat lähestymistavat sisältävät näitä käsitteitä ovat osoittaneet käyttökelpoisuutta hiiren malleissa kuten esimerkiksi PSMA kohdistetut aptameeriin-siRNA kimeerojen Her2 kohdistetut yksiketjuinen hajanainen vasta-aine-protamiini fuusioproteiini välittämä siRNA toimitus, ja transferriini-reseptori-kohdistettuja syklodekstriini-pohjainen polymeeri välittämä siRNA toimitus [1], [5], [6]. Meidän lähestymistapamme tuloksellisesti nukleiinihapon terapeuttiset kasvaimia käytetään sub-50 nm koko nanokapselissa, joka käsittää ligandin tenfibgen (TBG), karboksiterminaalisen fibrinogeenin maailmaa domeenin tenaskiini-C. TBG muodostaa proteiinin ligandin kuori nanokapselissa ja mahdollistaa reseptorin välittämä kohdistusta syöpäsolujen kautta tenaskiini reseptoreita, jotka ovat koholla näissä soluissa [7] – [12]. TBG nanokapselit on erityisesti otettu kasvainsolujen ja tuumorista peräisin mikrosuonten, mutta ei normaaleissa soluissa tai alusten [13] – [15].

CK2 (entinen kaseiinikinaasi II tai CKII) on kaikkialla läsnä oleva proteiini Ser /Thr-kinaasi, jolla on heterotetrameerisia rakenne koostuu kahdesta katalyyttisestä alayksiköstä (42 kDa α ja /tai 38 kDa α ’) ja kaksi säätelyalayksiköt (28 kDa β) in α

2β

2, αα’β

2 tai α

2β

2 kokoonpanoissa. CK2 fosforyloi useita substraatteja eri toiminnoilla, jotka liittyvät solujen kasvua ja lisääntymistä, on konstitutiivisesti aktiivinen, ja on välttämätöntä selviytymisen [16] – [22]. Lisäksi CK2 on havaittu voimistuvan kaikissa syövissä tutkittiin, jossa yksi sen toiminnoista on tukahduttaa apoptoosin [18], [23] – [29]. Olemme aiemmin perustettu tehoa meidän 20-meeri-nukleiinihapposekvenssi on kohdistettu sekä CK2α ja CK2α ”. Olemme käyttäneet tätä merkkijonoa antisenseoligonukleotidi systeemisesti hiirille kuljettaa potilaalle tehdä PCa kasvaimet, kuin siRNA rahtia S50-TBG nanocapsules toimitettu viljeltyihin eturauhassyöpä (PCA) soluja, ja yhtenä kerrattu RNAi-CK2 rahtia S50-TBG nanokapseleina systeemisesti hiirille kuljettaa pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) ksenografteissa [15], [30] – [32]. Täällä laajentaa mekanismia ja hoito hyödyllisyys sekä S50-TBG nanokapselissa ja RNAi-CK2 oligomeerin käyttäen ihmisen eturauhassyövän ksenograftimalleja aloitettu hiirissä terapeuttisesti asiaan liittyville sivuille. Esitämme ominaista dataa S50-TBG nanokapselissa ja sen systeemisen toimituksen proof-of-concept for mahdollisuuden kohdistaa merkittäviä

in vivo

PCa kasvaimen kasvu sivustoja sekä tehoa käyttäen RNAi-välitteinen downregulation CK2 kuin terapeuttinen lähestymistapa.

tulokset

Tenfibgen nanokapselissa suunnittelu ja vakauden

Vastatakseen kaventamaan CK2 ilmaisun erityisesti pahanlaatuisten eturauhasen soluissa, yksijuosteista DNA /RNA kimeerisiä molekyyli (RNAi-CK2) kohdistaminen CK2αα alayksikön selostukset tiivistyi ja kapseloidaan proteiini kuori koostuu TBG. TBG nanokapseleina ovat tyypillisesti 15-20 nm koko ja kirjoita kasvainsolujen kautta Tenaskiini reseptoreihin käyttämällä lipidilautan välittämää caveolar reitin [13], [15]. Ominaisuudet ja morfologia TBG-RNAi-CK2 nanokapseleita sekä rakenteen ja sekvenssin RNAi-CK2 on esitetty taulukossa 1 ja kuviossa 1 a, b. Vakaus analyysi alasti RNAi-CK2 kimeerisen oligomeeriä ja S50-TBG-RNAi-CK2 nanocapsules (Fig. 1 c) osoittaa, että kun proteinaasi K pilkkomalla alasti RNAi-CK2 oligomeeriä (vasen paneeli) tai S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapseleita (oikea paneeli), oligomeerin lasti pysyy ehjänä. Lisäksi hoito nanocapsules DNaasi ennen proteinaasi K ruoansulatusta osoittaa, että nukleiinihappo lasti on täysin suojattu kapselointi menettelyä (Fig. 1 c, oikea paneeli).

(a) Cartoon kuvaus nanokapselissa suunnittelu. (B) Transmission elektronimikroskoopilla S50-TBG-RNAi-CK2 nanocapsules varten

in vivo

tutkimuksissa. Suurennus 230000 x. Mittakaava 100 nm. (C) Vasen paneeli: Naked RNAi-CK2 oligomeeri hajotettiin proteinaasi K: ta 24-96 tuntia. Inp, undigested tulo oligomeeriä. Oikea paneeli: Naked ja S50-TBG kapseloitu RNAi-CK2 oligomeerit pilkottiin DNaasi seurasi proteinaasi K kuten edellä paneeli. Kaistat 1 2, alasti RNAi-CK2; 3 4, alasti RNAi-CK2 kanssa TBG-sokerin nanokapselit sisältyy ruoansulatus; 5-7,

in vitro

käytössä muotoilussa S50-TBG-RNAi-CK2; 8-10,

in vivo

käytössä muotoilussa S50-TBG-RNAi-CK2.

Mahdolliset toimintamekanismeja varten RNAi-CK2 DNA /RNA kimeerisiä oligomeerin

yksijuosteiset DNA /RNA oligomeeri rahti RNAi-CK2 voisi toimia laskevan CK2 ilmaisun antisense- ja /tai siRNA mekanismeihin. Tilanteen korjaamiseksi, ensin tutkitaan, ovatko RNAi-CK2 oligomeeri suunnittelu koostuu 14 standardin fosfodiesteri DNA tähteet 5 ’päähän, 6 2’

O

metyyli RNA tähteen 3 ’päähän, ja päätelaitteen propyyli linkkeriä (merkitty RNAi-CK2-6R kuvassa. 2a) voisi toimia kannustimena RNaasi H1 toimintaan. Vertailun, otimme mukaan sama sekvenssi, joka koostuu kokonaan fosforotioaatti (PS) muunnettu DNA tähteitä (AS-CK2-PS) sekä oligomeeri muotoilu 8 tavanomaisia ​​DNA-tähteet 5’-päässä, 12 2 ’

O

metyyli RNA tähteen 3 ’päähän, ja päätelaitteen propyyli linkkeriä (RNAi-CK2-12R). Tiedot kuviossa 2a osoittavat, että RNAi-CK2 oligomeeri 14 DNA jäämiä (RNAi-CK2-6R) toimii tehokkaana kannustimena RNaasi H1 toimintaan. Koko jäljellä olevan käsikirjoituksen, RNAi-CK2-6R kutsutaan RNAi-CK2 ja on hoitava lääke kiteytyy TBG nanocapsules.

(a) RNaasi H1 alustan testaus eri DNA /RNA koostumuksen muodot RNAi-CK2 oligomeerit. 5′-leimattua (*) RNA-koetin hehkutettu kanssa RNAi-CK2-6R, RNAi-CK2-12R tai AS-CK2-PS täydentäviä oligomeerit, inkuboitiin eri ajanjaksoja RNaasi H1. Kirjaimet vasemmalla puolella geelin ja upotettavat edustaa sekvenssi portaat 5′-leimattua RNA alustaan. Mitoitus tikkaat on merkitty AL (alkalilyysimenetelmällä), C (miinus RNaasi T1), ja T1 (RNaasi T1 pilkkominen). RNaasi H1 ruoansulatusta ajat ovat 0, 30, 60 ja 120 s (kaistat 1-4, vastaavasti). Identiteetti Testin oligomeeri edellä todettiin rataa. Insertti esittää kevyempi altistuminen RNAi-CK2-12R RNaasi H1 reaktiotuotteet. Oligomeerit täydennetty leimatun RNA-koettimella näytetään arrowheads osoittaa suurten katkaisukohdat. Sillä RNAi-CK2-6R ja RNAi-CK2-12R oligomeerin sekvenssit, pienet kirjaimet tarkoittaa 2 ’

O

metyyli RNA jäämät ja isot kirjaimet ovat tavanomaisia ​​fosfodiesteri liitetty DNA jäämiä. AS-CK2-PS on fosforotioaatti liittyy DNA oligomeeri. (B) havaitseminen Ago2 /RISC pilkkominen tuottamiin RNAi-CK2 transfektiolla PC3-LN4 soluissa. 5 ’RNA ligaasilla välittämää RACE suoritettiin varten CK2α ja CK2α ”selostukset kuvatulla tavalla online-menetelmiä. Kaistat 1 5, siControl transfektoituja soluja; 2 6, siCK2 transfektoituja soluja; 3 7, RNAi-CK2 transfektoidut solut; 4 8, ei cDNA vettä vertailua varten M, DNA kokomarkkereita. Ennustettu RACE tuotteet (CK2α, 242 emäsparia, CK2α ”, 236 bp) osoitetaan vasemmalla, ja alukkeilla käytettiin osoitetaan yläpuolella kaistaa. (C) kartoitus RACE katkaisukohta saatiin sekvensoimalla tuotettuja (b). MRNA-sekvenssi on merkitty pienillä, transfektoiduissa oligomeeri on kuvattu alla mRNA, ja katkaisukohdat osoitetaan nuolenpää.

tarkastella osallistumisen siRNA mekanismein, RNA puhdistettu TBG-RNAi -CK2 transfektoitu PC3-LN4 [33] soluja kasvatettiin tenaskiini-C /fibronektiini (TnFn) analysoitiin käyttämällä modifioitua 5 ’RNA-ligaasia-välitteisen RACE tekniikka kartta mahdolliset pilkkomiskohdat johtuvat Ago2 /RISC-pohjainen käsittely DNA: /RNA kimeerinen oligomeeriä. Puhdistettu RNA soluista, jotka on transfektoitu siRNA ja CK2 (sama sekvenssi kohde kuin RNAi-CK2) tai ei-kohdistuksen säätelysekvenssi käytettiin edelleen ohjaa. Kuten on esitetty kuviossa 2b, katkaisutuotteiden CK2α ja α ’transkriptit havaittiin sekä RNAi-CK2 ja siCK2 transfektoituja soluja. Kartoitus pilkkomiskohtien sekvensoimalla RACE tuotteiden vahvisti pilkkominen sijainti molemmat kopiot on ennustettu 10

th nukleotidin päässä 5′-päästä oligomeerin [34] (Fig. 2c). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että RNAi-CK2 voi alas-säädellä CK2α ja CK2α ”transkriptien RNaasi H ja Ago2 mekanismeja.

Effects of TBG-RNAi-CK2 pahanlaatuisiin ja hyvänlaatuisia viljeltyjä soluja

Olemme johdonmukaisesti havaittu, että S50-TBG nanocapsules toimittavat lastin perinuclear edeltävä alue ydinvoiman merkintä, riippumatta syöpäsolun tyyppiä. Ei-nukleiinihappolajin, kuten varjoaineita, lasti on tyypillisesti viedään ytimet sytoplasmaan, missä se kerääntyy sytoplasman soluelimiin ja myöhemmin viedään. Edelleen karakterisoimiseksi kaupan ja rahdin vapautumisen s50-TBG nanokapseleita, pahanlaatuinen PC3-LN4 soluja viljeltiin TnFn päällystetty 3-ulotteinen nanofiber tukirakenteet (TnFn-3D) helpottaa muodostumista lipidilauttojen tarpeen s50-TBG nanokapselissa tutkimuksia [15] . Kuvio 3a esittää kuljetus tumaan, lastin julkaisu, ja vienti FeO-dekstraanin yli 24 tunnin ajan hoidon jälkeen solujen kanssa S50-TBG-FeO-dekstraani nanokapseleina. Samanlaisessa tutkimuksessa vertailu S50-TBG-FeO-dekstraani otto 8 h lisäyksen jälkeen nanocapsules soluihin suoritettiin PC3-LN4 ja eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH-1) solua. Tulokset osoittavat innokas otto TBG-FeO nanocapsules pahanlaatuisia muttei hyvänlaatuinen soluja (Fig. 3b).

(a) sisäänotto yli 24 h S50-TBG nanocapsules jossa FeO-dekstraanin lastia PC3-LN4 solut maljattiin TnFn-3D. Solut värjättiin DAB-avusteisen preussinsininen raudan ja vastavärjättiin Fast Red. Mittakaava 100 pm. (B) pahanlaatuiset soluspesifisestä ottoa S50-TBG nanokapseleina. S50-TBG-FeO-dekstraani sisäänotto määritettiin rauta värjäys 8 h PC3-LN4 ja BPH-1-soluissa kasvatettu TnFn- tai laminiini kuorrutettu nanofiber tukirunkoja, vastaavasti. Mittakaava 100 pm. (C) Solujen lisääntyminen vaikutukset S50-TBG-RNAi-CK2 hoitoa hyvän- ja pahanlaatuisten eturauhasen soluja. PC3-LN4 ja C4-2 kasvatettu TnFn-3D ja BPH-1-soluissa kasvatettu laminiini- 3D 96-kuoppalevyillä käsiteltiin S50-TBG-RNAi-CK2 tai ohjata TBG nanocapsules sisältävä RNAi-RFP-6R kohdistaminen Red Fluoresenssi proteiini kuten on osoitettu.

3H-tymidiiniä lisättiin 48 tunnin kuluttua, ja solut analysoitiin 72 tunnin jälkeinen nanokapselissa lisäksi. Tulokset on ilmaistu suhteessa hoidon S50-TBG-sokeri nanokapseleina. S50-TBG nanokapselissa rahdin ja käytetyt solulinjat ovat osoitetaan palkkien alla. Tarkoittaa ± SE on esitetty (n = 3 kaikille). * P 0,005 suhteessa S50-TBG-sokeri ja -RFP; # P 0,01 suhteessa TBG-sokeri; $ P = 0,006 verrattuna TBG-RFP. (D) S50-TBG-RNAi-CK2 vähensi CK2α ja CK2α ”mRNA vakaan tilan ekspressiotasot PC3-LN4 soluissa. mRNA eristettiin PC3-LN4 soluja kasvatettu TnFn 24 ja 48 tuntia sen jälkeen S50-TBG-RNAi-CK2 tai Sokeri hoitoon kuten analysoitiin käänteistranskriptaasin reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää varten CK2α ja CK2α ”ilmaisun. HPRT transkripti käytettiin normalisoimaan ekspressiotasoja. Tarkoittaa, SE ja p-arvot on esitetty (24 h CK2α n = 5, CK2α ’n = 6; 48 h CK2α n = 2, CK2α’ n = 2).

tutkittiin vaikutukset of S50-TBG-RNAi-CK2 proliferaatioon viljeltyjen eturauhasen solujen käyttämällä erittäin tuumorigeenisen PC3-LN4 ja C4-2 solulinjoja verrattuna BPH-1. Hoito PC3-LN4 ja C4-2 soluja kasvatettiin TnFn-3D kanssa S50-TBG-RNAi-CK2 3 päivän johti merkittävään menetykseen soluproliferaatiota mitattuna [

3H] -tymidiinin, kun taas TBG-RNAi -CK2 hoito BPH-1-soluissa kasvatettu laminiini matriisi ei vähentänyt niiden leviäminen (Fig. 3c). Kvantitatiivisin käänteistranskriptaasi reaaliaikaisia ​​PCR, CK2α ja CK2α ”mRNA-tasot olivat huomattavasti vähentynyt TnFn viljellyissä PC3-LN4 solut 24 ja 48 tuntia käsittelyn jälkeen S50-TBG-RNAi-CK2 (Fig. 3d), ja lasku oli joka vastaa havaittu hoidon jälkeen TBG-siCK2 [31].

bioleviäminen TBG nanocapsules

sen osoittamiseksi, että S50-TBG nanokapseleita sitovat pahanlaatuisia eikä normaalia kudosta solujen, ja että ne eivät kerääntyä ei-, erityisesti retikuloendoteliaalijärjestelmän, jääleikkeiden PC3-LN4 potilaalle tehdä ksenografti kasvaimen sekä ei-kasvain hiiren maksa-, munuais- ja perna alistettiin nanokapselissa sitoutumismäärityksissä. Näissä määrityksissä, kudoksen leikkeitä inkuboitiin s50-TBG-RNAi-CK2 nanokapseleita, joka sisältää Syyrian hamsterin IgG sisältyvät proteiinin kuori. Sen jälkeen Pesuvaiheiden osat käsiteltiin epäsuoran immuunidetektio hamsterin IgG. Data kuviossa 4a ja kuviossa S1 osoittaa sitoutumisen S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapseleita kasvainkudokseen, mutta ei maksan, munuaisten tai pernan. Lisätodiste ligandin indusoiman nanokapselissa kudosspesifisyys on esitetty kuviossa 4b ja Kuva S2 jossa asialo (ASOR) nanocapsules syyrianhamsterin IgG sisältyy kuoren käytettiin suorittamaan nanokapselissa sitoutumismääritykset. ASOR on ligandi asialoglycoportein reseptoria ilmaistu hepatosyyteissä, ja tiedot osoittavat, että ASOR nanokapselissa sitoutuu spesifisesti maksassa eikä kasvainkudoksen.

(a) sitoutuminen S50-TBG-RNAi-CK2 kasvaimen mutta ei maksassa, pernassa ja munuaisissa. Kudosleikkeet alistettiin immunofluoresenssianalyysillä Syyrian hamsterin IgG inkuboinnin jälkeen S50-TBG-RNAi-CK2. Mittakaava 100 pm. (B) sitoutuminen ASOR-DyDOTA maksan mutta ei kasvain, pernassa ja munuaisissa. Kudokset altistettiin immunofluoresenssianalyysillä Syyrian hamsterin IgG inkuboinnin jälkeen ASOR-DyDOTA. Mittakaava 100 pm. (C) analyysi sääriluun läsnäolon kasvaimen ja oton TBG-DyDOTA nanokapselissa 24 tuntia i.p. injektio. Upper paneelit, kasvain, joka sisältää sääriluun: H immunofluoresenssimenetelmällä havaitseminen syyrianhamsterin IgG (vihreä); havaitaan suoraan Dy (punainen); yhdistää vihreä ja punainen. Keskiosat, kasvain, joka sisältää sääriluun: immunofluoresenssi havaitseminen isotyyppikontrollia CK8 (vihreä); immunofluoresenssimenetelmällä havaitseminen CK8 (vihreä); havaitaan suoraan Dy (punainen); yhdistää vihreä ja punainen. Alempi paneeli, mock pistetään sääriluu: immunofluoresenssi havaitseminen isotyyppikontrollia CK8 (vihreä); immunofluoresenssimenetelmällä havaitseminen CK8 (vihreä); havaitaan suoraan Dy (punainen); yhdistää vihreä ja punainen. DNA vastavärinä näkyy sinisenä. Mittaviivat 100 pm. (D) analyysi maksassa, pernassa ja veri tulehdusreaktiota. Immuuni-hiirissä injektoitiin i.v. 10 mg /kg S50-TBG-RNAi-CK2 tai S50-TBG-sokeria tai yhtä tilavuus ajoneuvon ja kudokset kerättiin 24 tunnin kuluttua. Maksa, perna ja kateenkorva massa esitetään suhteessa hiiren kehon paino (vasen akseli). Interferoni-γ mitattiin veren seerumin (oikea akseli).

Tuottaa validointi S50-TBG nanokapselissa ohjautumista pahanlaatuisia soluja hiirissä, aloitimme eturauhassyöpäksenografteista luussa ruiskuttamalla suoraan PC3 LN4 soluja säären. Contralateral sääriluun kuhunkin hiireen mock pistää. Kun kasvaimen kasvu oli selvästi havaittavissa, hiiriin injektoitiin s50-TBG nanokapseleita sisältävät dysprosium-DOTA-dekstraanin lastin (S50-TBG-DyDOTA) ja otettiin talteen 24 tunnin kuluttua käsittelyä varten. Kasvain läsnäolo luun varmistettiin H E tahra. Lokalisointi s50-TBG-DyDOTA nanokapseleita kasvainsoluihin varmistettiin suoraan visualisointi Dy, fluoresoiva lantanidialkuaine, ja epäsuora tunnistus Syyrian hamsterin IgG: tä. Vasta-aineet CK8 käytettiin havaitsemaan epiteelikasvainsolut. Tiedot kuviossa 4c kuvaavat läsnä Dy signaalin, joka edustaa nanokapselissa lastin, kasvainsoluissa, jotka spesifisesti lokalisoituu joko Syyrian hamsterin IgG sisältyvät nanokapselissa kuori (Fig. 4c, ylärivi) tai CK8 edustavat ihmisen eturauhasen syöpäsolut (Fig. 4c, keskusta rivi). Minimal Dy ja CK8 signaalit havaittiin mock-injektoitu ei-kasvain luun samasta hiirissä (Fig. 4c, alempi rivi), jotka voivat johtua solujen migraatiota Ksenograftikudoksista kasvaimen kontralateraaliseen sääriluut.

S50-TBG nanokapselissa toimitettujen nukleiinihapot eivät indusoi aikaista tulehdusreaktiota

Koska interferoni tai varhainen tulehdusreaktio on vakava asia annettavaksi hiukkasen sisältävien suspensioiden nukleiinihappoja, mittasimme pitoisuus interferoni-γ seerumin ja kudos painosuhteet pernan, maksan ja kateenkorvan kohortin ei-kasvain, immunokompetenteista ulkosiittoinen hiirillä. Näitä kudoksia pidetään ensisijaisena tyhjennys sivustoja intravenoosivalmisteet [35]. Tulokset osoittivat ei merkittäviä eroja pernan, maksan tai kateenkorvan painot käsiteltyjen eläinten S50-TBG nanocapsules sisältäviä RNAi-CK2 tai trehaloosi suhteessa ajoneuvon ohjaus (Fig. 4d). Olemme myös löytäneet mitään todisteita interferoni-γ korkeus, joka tyypillisesti havaitaan partikkelivälitteisen varhainen tulehdusreaktioita (Fig. 4d) [36].

Proof-of-concept hoitotehon ja RNAi mekanismi s50 -TBG-RNAi-CK2

in vivo

Pilot akuutin annos-vaste-kokeet suoritettiin käyttäen S50-TBG-RNAi-CK2 hoitoon PC3-LN4 potilaalle tehdä eturauhasen kasvaimia nude-hiirissä. Sen jälkeen, kun 10-14 päivä, ortotooppisesti aloitettiin kasvaimet olivat palpoitavissa, ja hiiret jaettiin hoitoryhmiin. Hiiret saivat kaksi i.p. injektioita joko s50-TBG-RNAi-CK2 (4 hiirtä ryhmää kohti) tai vehikkeliä (5 hiirtä), annetaan välein 24 tuntia. Kolmetoista päivää ensimmäisen hoitokerran, kasvain kudos kerättiin analyysiä varten. Molemmat annostasot 33 ja 330 ng /kg johti yli 50% pienempi syöpäkasvaimen verrattuna vehikkeliin (p = 0,011 ja p = 0,029, vastaavasti, Fig. 5a). Lisäksi hoitoja johti vähentyneeseen tilavuuteen suurimman kerätyn retro-vatsakalvon imusolmuke kasvain hiirtä kohden verrattuna ajoneuvon vähenemisestä sekä keskipituus kaikkien kerättyjen vatsakalvontakainen imusolmuke kasvaimista annostasoilla 33 ja 330 ng /kg (2,0 ± 0,7 ja 1.5 ± 0.3, vastaavasti) verrattuna vehikkelikontrolliin (3,6 ± 0,7). Lopuksi, oli merkittävä ero läsnä ollessa tai puuttuessa etäispesäkkeitä verrattaessa s50-TBG-RNAi-CK2 vehikkelillä käsiteltyihin hiiriin (p = 0,046; Fig. 5b). Ortotooppisten sijainti primaaristen kasvainten vastaista tarkka mittaus alkuperäisestä kasvainten, siten kyvyttömyys määrittää tarkasti alkaen kasvaimen kokoa voi selittää, miksi havaittu primaarikasvaimen vasteena 33 ng /kg, oli suurempi kuin 330 ng /kg.

(a) Ensisijainen kasvain massa ja imusolmukkeesta kasvainten esitetään seuraavat S50-TBG-RNAi-CK2 hoidot 33 ja 330 ng /kg verrattuna ajoneuvoon. Keinot ± SE esittelyyn (TBG-RNAi-CK2 n = 4; Ajoneuvojen n = 5). * P 0,05. (B) osuus hiirten kaukaisiin etäpesäkkeitä seuraava S50-TBG-RNAi-CK2 hoidot 33 ja 330 ng /kg verrattuna ajoneuvoon. Vertailtavaksi Fisherin testiä p = 0,046. (C) immunoblottianalyysi varten CK2α ja CK2α ”vaste primaarikasvaimia. Ylempi paneeli edustavat 10 ug ydin- matriisin lysaatin kanssa normalisoinnin lamiinivektori B1. Alempi paneelit edustavat 20 ug sytosolin lysaatin kanssa normalisoinnin laktaattidehydrogenaasin (LDH). (D) proteiini ja signalointi vasteen ilmentymisanalyysiä edustavissa imusolmuke kasvaimia. Imusolmuke kasvaimen jäädytetyt leikkeet analysoitiin epäsuoralla immunofluoresenssilla co-värjäyksen AKT-1 fosfo-S129 (vihreä) ja NF-KB: n p65 (punainen). DNA vastavärinä näkyy (sininen). Mittakaava 100 um (e) CK2α RISC pilkkoutumistuotteet ovat läsnä S50-TBG-RNAi-CK2 käsitelty kasvaimia. Kokonais-RNA eristettiin kasvainkudoksen ja käytettiin 5′-ligaation välitteisen RACE onko RISC välittämän pilkkoutumisen CK2α transkriptin tapahtunut. Kaistat 1 2, päivä-10 ajoneuvon saaneista kylki kasvaimet; Kaista 3, päivä-5 S50-TBG-RNAi-CK2 käsitelty kylki kasvain; Kaista 4, päivä-6 S50-TBG-RNAi-CK2 käsitelty kylki kasvain; Kaista 5, päivä-10 S50-TBG-RNAi-CK2 käsitelty kylki kasvain; Kaista 6, päivä-10 S50-TBG-siCK2 käsitelty kylki kasvain; Kaista 7, päivä-6 S50-TBG-RNAi-CK2 käsitelty potilaalle tehdä kasvain; Kaista 8, ei cDNA veden valvonta; M, DNA kokomarkkereita. Ennustettu 242 emäsparin RACE tuote on merkitty jäljellä, koko emäsparin DNA standardien näkyy oikealla ja hoitoa annettiin edellä todettiin rataa.

arvioimiseksi CK2 tavoitevaste, kvantitatiivinen real -Time käänteiskopioijaentsyymin tehtiin PCR-analyysi kasvaimen RNA: ta. Tiedot osoittivat CK2α mRNA vakaan tilan tasot alenivat 11 14% ja CK2α ”3 6% suhteessa ajoneuvon hallintalaitteita. Rajallinen väheneminen CK2 mRNA johtuu todennäköisesti aikaan Näytekokoelmatodistuksen, eli 11 päivää toisen hoidon. Kasvainkudoksessa hajotettiin ja fraktioitiin ydin- matriisin ja sytosolin varten immuunianalyyseilla. Edustavia tuloksia kasvainten kustakin ryhmästä on esitetty kuvassa 5c. Tiheys taajuusalueiden CK2α ja CK2α ”proteiinit laskettu kaikista kasvaimia ja ydinalan matriisissa murto keskimääräinen CK2α proteiinin tasot 1,06 ± 0,19 33 ng /kg ja 0,68 ± 0,06 330 ng /kg, ja keskimääräinen CK2α ’proteiinilla tasoilla 0,83 ± 0,17 ja 0,43 ± 0,03 33 ja 330 ng /kg, vastaavasti, havaittiin suhteessa kontrolleihin (Kuva. 5c, ylemmät paneelit). Korkeimmalla annoksella tasolla, sekä CK2α ja CK2α ”proteiinin ekspressiotasoja olivat samalla vähentynyt (CK2α 0,51 ± 0,12; CK2α” 0,39 ± 0,11) että sytosolin osastossa sekä (Fig. 5c, alempi paneeli).

imusolmuketuumoreihin analysoitiin epäsuoralla immuno- varten CK2 liittyvää signalointia vasteen AKT ja NF-KB reittejä. Vähentää huomattavasti fosforylaation CK2-spesifisten AKT-1 S129 [37] päällä hoidon jälkeen joko 33 ng /kg tai 330 ng /kg S50-TBG-RNA-CK2 (Fig. 5d, ylempi paneeli). Samoin dramaattinen menetys NF-KB p65 proteiinin kokonaismäärän havaittiin myös, varsinkin 330 ng /kg TBG-RNAi-CK2 (Fig. 5d, keskiosat).

RNA S50-TBG-RNAi- CK2 käsitellyt tuumorit päivinä 5, 6 ja 10 riippumattoman kokeen analysoitiin käyttäen modifioitua 5′-RACE-tekniikkaa kartta mahdollisia pilkkomiskohtia. RNA: ta s50-TBG-siCK2 kasvaimen samoin kuin kontrollien tuumoreiden sisällytetty komparaattoreina. Päivä 5 ja 6 kasvaimet edustavat 2 hoidot S50-TBG-RNAi-CK2 annetaan päivinä 1 ja 4. päivä 10 kasvaimet edustavat 3 hoitoja joko S50-TBG-RNAi-CK2 tai -siCK2 päivinä 1, 4 ja 7 tiedot osoittavat, että CK2α RISC pilkkoutumistuotteet havaitaan päivinä 6 ja 10 (Fig. 5e). Toisin kuin viljeltyjen solujen CK2α ’katkaisun tuotetta ei havaittu. RACE-tuotteet sekvensoitiin sekä s50-TBG-RNAi-CK2 ja -siCK2 käsitellyt tuumorit, ja katkaisukohta havaittu oli sama kuin kuviossa. 2c. Alennettu CK2α mRNA ilmaus 10: sta 20% päivällä-6 päivää-10 kasvainten todennettiin.

Keskustelu

aiemmin ehdottanut lupauksen ja sopeutumiskyvyn tämän kasvaimeen suunnatun Nukleiinihappopohjaisten terapiassa kohdistaminen CK2 sekä eturauhassyövän ja pään ja kaulan okasolusyöpä [14], [15], [30], [38], [39]. Tässä olemme antaneet tietoja suojelusta oligomeeriä lastin TBG nanoencapsulation, pahanlaatuisten solujen sitoutuminen tai ottoa TBG nanocapsules viljeltyihin soluihin ja osaksi asiaan eturauhassyövän sivustoja hiirillä, mahdollinen ja havaittiin toimintamekanismeja yhden DNA /RNA kimeerisiä RNAi oligomeerin, ja proof-of-concept pilotti hiiri ksenografti- hoidon tiedot.

Pilotissa hoidon tutkimuksessa havaitsimme tehoa käyttäen S50-TBG-RNAi-CK2 käytettäessä

in vivo

PCa malli suhteellisen alhainen annostus 330 ng /kg, joka edustaa vain kaksi hoitoja. Tällä annoksella tasolla, vaikutukset primäärikasvain painon ja etäpesäkekasvainten muodostumista ja tilavuus olivat ilmeisiä ja yhtäpitävä vähentynyt CK2 ilme ja signalointi. Meidän 2-annos saa verrata myönteisesti toinen raportti pieniannoksisen

in vivo

geenien, joissa ei-kohdennettu lipidipohjaisista siRNA toimitus laski kohdeproteiinin ilmentymisen kerta-annoksen jälkeen on 3 ug /kg [40] . Verrattuna muihin kasvaimeen kohdennettua siRNA jakelujärjestelmät, meidän akuutti hoito tutkimus aikaansai vähentyneet kohdeproteiinin ilmentymisen ja kasvainten paino paljon alemmilla annostasoilla [5], [6]. Käytimme ajoneuvon hallintaan tässä nimenomaisessa tutkimuksessa tarjota proof-of-concept että TBG-RNAi-CK2 voisi tuottaa sopivan hoitovasteen vierassiirrekokeissa eturauhassyövän kasvaimia. Myöhemmin teimme erillinen tutkimus on suunniteltu tunnistamaan oligomeeri kapseloitu TBG, joita voitaisiin käyttää kontrollina kapseloitu terapeuttista RNAi. Tutkimus tehtiin käyttäen kylki kasvaimet helpottaa suoraan mittaamiseen kasvaimen tilavuuden. Vertailu RNAi oligomeerien suhteessa ajoneuvon ohjaus johti tunnistamiseen sopivaa ohjaus PCA, ja vertaileva tulokset osoittivat, että sekä RNAi ja ajoneuvon hallintalaitteita saatiin analogisella tuloksia (ts kasvaimen tilavuus muuttuu täysin päällekkäin). Näin ollen tulokset esitetään kuviossa. 5c tarjota proof-of-concept että TBG-RNAi-CK2 pystyy aiheuttamaan kasvainsolun kuoleman

in vivo

joka johtuu CK2 kohde. Lisäksi PC3-LN4 soluja käytetään näissä tutkimuksissa ovat mallina PTEN-null, androgeenireseptorin (AR) ei-ilmentävät, ja androgeenista riippumaton metastasoitunut PCa. Vaikka AR signalointi pidetään tärkeänä PCA solujen selviytymistä, riippumatta kastraatio resistenttien fenotyypin [41], [42], PC3-LN4 ksenograftikasvaimissa käytetään näihin tutkimuksiin palveli todistamaan-of-concept datan.

käyttö yksijuosteinen oligomeerien RNAi aktiivisuus viljellyissä soluissa ja hiirissä on aiemmin dokumentoitu [43], [44]. Lisäksi kävi ilmi, että korvaaminen DNA jäämiä 5 ’päähän oppaan säikeen (eli siemen alue asemissa 2-8) tuottaa RNAi-molekyylin kanssa geenien aktiivisuutta ja vähäinen off-tavoite vaikutukset; ottaa huomioon, että RNA: n tähteet 3 ’päähän oppaan juosteen ovat välttämättömiä [45]. Käytä meidän DNA /RNA kimeerisiä yksijuosteista RNAi-CK2 oligomeerin yhdistyvät tehokkuus tuottaa vain oppaan säikeen kanssa mahdollisista vähentäminen off-tavoite johtuvat vaikutukset puuttuessa matkustaja säikeen. Olemme osoittaneet

in vitro

kokeita, sekä antisense- ja siRNA hiljentäminen mekanismeja indusoitiin RNAi-CK2; edelleen, kun käytön s50-TBG-RNAi-CK2 hoitoon ksenograftikasvaimissa, olemme osoittaneet, että RISC lohkaista CK2α mRNA otettiin talteen 2-3 päivää käsittelyn jälkeen. Emme havainneet CK2α ”hajoamistuotteessa käsitellyissä kasvaimissa, vaikka CK2α” proteiinin tasot laskivat. Tämä viittaa siihen, että RNAi-CK2 oligomeerit, jotka sisältävät 1 epäsuhta ihmisten CK2α ”mRNA ja 2 epäsuhta hiiren stroomasolulinja CK2α” mRNA voidaan ensisijaisesti indusoimalla RNaasi H- sijaan RISC -välitteisen pilkkomisen tämän transkriptin

in vivo

. Tätä käsitystä tukee vähentää huomattavasti runsaudesta CK2α ”hajoamistuotteessa havaittiin joko siRNA-CK2 tai RNAi-CK2 että soluviljelmätutkimukset. Vaihtoehtoisesti RNAi-CK2 voidaan estää käännöksen CK2α tai CK2α ”selostukset proteiiniin.