Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

siili (Hh) reitin on patogeneesiin syövän lukien haiman adenokarsinooma (PDAC). Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että onkogeenisiä toimintaa Hh on PDAC liittyy signaloinnin stroomasoluihin sijaan solun itsenäinen vaikutuksia kasvainsoluihin. Kuitenkin alkuperä ja luonne strooman solutyypin (t), jotka reagoivat Hh signalointi jäi tuntemattomaksi. Koska Hh signalointi on keskeinen asema aikana alkion ja synnytyksen jälkeinen vaskulo-, me arveltu, että Hh ligandi voi toimia kasvaimen verisuonistossa keskitytään erityisesti luuytimen (BM) -johdannainen soluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

Syklopamiini käytettiin estävän Hh-reitin ihmisen PDAC solulinjoissa ja niiden ksenograftit. BM elinsiirrot, co-kulttuuri järjestelmät kasvainsolujen ja BM-johdettu angiogeneesiä soluja (BMPCs) käytettiin arvioimaan rooliin kasvainperäinen Hh säätelemään BM lokero ja osuus BM johdettujen solujen angiogeneesiä PDAC. Syklopamiinin anto vaimennetaan Hh-signaloinnin strooman pikemminkin kuin syöpäsolut kuten näkyy vähentynyt ilmentyminen täyspitkän Gli2 proteiinia ja Gli1 mRNA erityisesti lokeroon. Syklopamiinin inhiboi kasvua PDAC ksenograftien yhdessä regression kasvaimen verisuonistossa ja vähentää ohjautumisen BM-johdettujen solujen kasvain. Host-johdettu Ang-1 ja IGF-1-mRNA-tasot vaimentua syklopamiinilla on tuumoriksenograftien.

In vitro

yhdessä viljelemisen ja matrigeeliä tulppa analyysit osoittivat, että PDAC soluperäisissä Shh indusoi Ang-1 ja IGF-1 tuotantoa BMPCs, jolloin niiden lisätä maastamuuttoa ja kapillaarisen monogeneesin toimintaa.

johtopäätökset /merkitys

tunnistaneet BMPCs vaihtoehtoisina strooman kohteina Hh-ligandin in PDAC viittaa siihen, että kasvaimen verisuonisto on houkutteleva terapeuttinen kohde Hh saarron. Tuloksemme on yhdenmukainen syntymässä käsite, joka BM peräisin olevia soluja myötävaikuttaa merkittävästi epiteeli- kasvaimien syntyyn.

Citation: Nakamura K, Sasajima J, Mizukami Y, Sugiyama Y, Yamazaki M, Fujii R, et al. (2010) Siili Edistää uudissuonittumisen haimasyöpiin säätelemällä Ang-1 ja IGF-1 Expression in Bone-Marrow Derived angiogeneesiä solut. PLoS ONE 5 (1): e8824. doi: 10,1371 /journal.pone.0008824

Editor: Sudha Agarwal, Ohio State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 lokakuu 2009; Hyväksytty: 1. tammikuuta 2010 lähtien Julkaistu: 21. 2010

Copyright: © 2010 Nakamura et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksen YM päässä New Energy ja Industrial Technology Development Organization of Japan (07A05010a). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa ja viidenneksi Japanissa, ja sen yleinen 5 vuoden pysyvyys on vain 5,0-9,7% [1], [ ,,,0],2]. Gemsitabiini-pohjainen kemoterapiaa paikallisesti edennyt tai metastaattinen PDAC on vain vaatimaton aktiivisuus pienellä eloonjäämishyötyä [3]. Tunnistaakseen uusia molekyylitason tavoitteet PDAC voittaa synkkä ennuste on siis tarpeen. Tähän mennessä erilaisia ​​kohdennettuja hoitoja vastaan ​​EGFR [4], Ras /MEK [5] ja VEGF [6] ole parantaneet selviytymistä merkitsevästi kliinisissä tutkimuksissa.

Aberrant aktivointi siili (Hh) reitin on viime aikoina tunnustettu yhdeksi välittäjiä PDAC kehitystä vaan sen katsotaan olevan lupaava kohde terapiassa [7], [8]. Hh on morfogeenipolypeptidi toimisi kunnolla lajimuodostuksessa sikiönkehityksen aikana. Kohonnut ekspressio Hh-sukuiset proteiinit, Sonic Hedgehog (Shh) tai Intian siili (Ihh), heikentää haiman morfogeneesiä lisääntyneeseen mesenkyymissä ja pienenee epiteelin osastossa [9], mikä osoittaa, että tiukka sääntely yleistä tasoa Hh toiminta on olennaista normaalille haiman kehitykseen. Koska Shh ei misexpressed paitsi PDAC mutta myös esiasteleesioita haiman epiteelinsisäisen kasvain (Panin) [8] ja intraduktaalisissa papillaarisen mucinous neoplasia [10], häiriöstä tämä reitti voi olla rooli aikana alkuvaiheessa kasvaimen. Useat Hh-kohdegeenien, kuten BMP [11], FOXM1 [12], ja PMP22 [13], ovat yli-ilmennetään PDAC, ja siellä on cross-talk välillä onkogeenisiä väyliä myös MAPK /ERK, PI3K /Akt [14 ], Wnt [15], TGFli /BMP [16] ja Hh signalointi. Niistä molekyylejä, jotka osallistuvat Hh signalointi, Smoothenedin (SMO) on tunnustettu keskeiseksi välittäjänä signalointi; se on yksi reseptori komponenttien Hh-ligandin ja muuntaa Gli2 osaksi transkriptionaalisen aktivaattorin [17]. Näin ollen, Smo on erityisen lupaava kohde syövän hoidossa [18]. Syklopamiinia, luonnollinen steroidi alkaloidi, on voimakas estävä vaikutus vastaan ​​Smo [18] ja hoito syklopamiinilla kokeellisessa ympäristössä inhiboi monien syöpien [19], [20], [21]. Syklopamiinia johdannaisia ​​erilaisilla rakenteellisia motiiveja on luotu ja lupaavia mahdollinen kliininen käyttö [22].

Erityisesti useat tutkimukset ovat osoittaneet merkittävää kasvua estämällä PDAC

in vivo

Hh-reitin saarto [ ,,,0],7], [23]. Kasvaimenkasvunestoaktiivisuuteen mekanismi on ajateltu olevan välittyy ensisijaisesti estää autokriininen silmukka, joka saattaa olla tarpeen lisääntymistä [7], selviytyminen [8] ja liikkuvuus [21] syöpäsoluja. Kuitenkin Smo poisto haiman epiteelissä ei heikennä tuumorigeneesiä hiirimallissa PDAC [24], ja Hh ligandit eivät indusoi transkriptionaalisen toimittajille, että väylän PDAC linjat. Lisäksi siirtogeeninen ekspressio aktivoitu Smo alleeli haiman epiteelissä ei indusoida Smo reitin kohde- geenien tai indusoida neoplastisen muutoksen [25]. Näin ollen se on arveltu, että Hh signalointi saattaisi olla paracrine rooli kasvaimen microenvironment, vuonna epiteelisyövissä että puuttuu mutaatiot Hh signalointi komponenttien. Todellakin, tutkimuksia meitä ja muut ovat määritelty ratkaisevaa roolia syöpäsolujen johdettu Hh on solutyyppeihin kasvain strooman osastoissa [26], [27], [28]. Vaikka nämä havainnot, tarkat mekanismit, joilla jotkin kasvainsolut ovat herkkiä Hh inhibition ja strooman solutyyppi (t), jotka ovat herkkiä Hh signaloinnin jäi tuntemattomaksi. Siksi sitoutui tutkimuksia valaista näitä mekanismeja.

Methods

Cell Culture, Protein Analysis, ja RNA Analysis

Ihmisen PDAC solulinjat saatiin ATCC, Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani) ja Cell Resource Center for Biochemical Research (Sendai, Japani). BMMNC eristäminen, proliferaatiomäärityksillä, co-kulttuuri, muuttoliike määritykset, immunoblottauksen ja qPCR kuvataan Menetelmät S1. Primer sekvenssit on esitetty yhteenvetona taulukossa S1.

Eläimet, luuydinsiirto (BMT) ja immunohistokemia

Tutkimuksiin syklopamiinilla tehtiin nude-hiirissä ksenograftien kuvatulla [7]. BMT menettelyt annetaan Methods S1. Protokollat ​​eläinkokeiden oli hyväksynyt Asahikawa Medical Collage Institutional Animal Care ja käyttö komitea.

Kudokset prosessoitiin raportoitu aiemmin [26]. Vasta-aineet ja olosuhteet immunohistokemia esitetään Methods S1.

Cellular, Molecular ja TILASTOANALYYSI

yksityiskohtaiset kuvaukset menettelyistä annetaan Methods S1.

Tulokset

in vivo

vaikutukset Syklopamiini on KP-1N ksenoqraftit

jotta valottaa mekanismeja, joilla Hh signalointi voisi tukea syövän etenemisen kasvainsolun epäitsenäisistä tavalla, arvioimme roolia Hh-signaloinnin kasvuun PDAC

in vivo

. Olemme valittu solulinja, KP-1 N, joka osoitti korkean ilmentymisen Shh, mutta oli herkkä kasvun estäminen syklopamiinilla

in vitro

(kuvio S1, S2 ja taulukko S2). Hoito KP-1N ksenografteissa syklopamiinilla vuorokaudessa 7 päivän aiheutti 46 prosentin vähennys kasvaimen painoa verrattuna ajoneuvon ohjaus-käsiteltyjen kasvainten (kuvio 1A). Histopatologisia analyysi paljasti, että syklopamiinilla käsitelty kasvaimia oli runsas alueita kuolion johtaa 59%: n vähennys elinkelpoisia kasvaimen painoa. Mukaisesti Näiden havaintojen värjäystä Ki-67 ja TUNEL osoittivat, että syklopamiinihoidon vähensi lisääntymistä 14% ja nousi solukuoleman 9%

in vivo

(kuvio 1 B); sitä vastoin ei ollut merkittävää vaikutusta syklopamiinin lisäkasvu /solukuoleman kinetiikan

in vitro

(kuva S2).

(A) CD-1 kantavien nude-hiirten KP-1N -ksenografteja käsiteltiin tai ilman syklopamiinilla (50 mg /kg /vrk; sc) päivittäin 7 päivän ajan (10 ksenografteissa kussakin ryhmässä). Tulokset on esitetty keskiarvona ± SEM kasvaimen paino (mg). H-E värjäykset varten ksenografti kohdat näkyvät ja% nekroottinen alue (N) mitattiin. Mittaviivat; 200 um. (B) Ksenograftikudoksista värjättiin anti-Ki-67 (Mittaviivat; 200 um) ja TUNEL määritys (Mittaviivat; 500 um) tehtiin. Kvantifiointi lisääntyvästä /apoptoottisten näkyy prosenttia positiivisia soluja 5 toteuttamiskelpoinen kentille 10 kohdat. (C) RNA uutettiin ksenograftikudoksesta ja mRNA-tasot Ptch1 ja Gli1 kvantitoitiin TaqMan qPCR.

Jotta voitaisiin määrittää, mitkä solut vaikuttivat syklopamiinihoidon, mittasimme ilmentyminen Ptch1 ja Gli1 mRNA, transkription tavoitteet Hh-signaloinnin, sekä ksenosiirrettyjä ihmisen kasvainsoluissa sekä hiiren strooman osastoon. Tätä varten olemme käyttäneet lajikohtaiset koettimia. Havaitsimme, että ihmisen Ptch1 ja Gli1 vierassiirrekokeissa kudoksista vain hieman väheni syklopamiinihoidon (kuvio 1 C). Vertailukelpoinen, pienet vähenemistä ilmentyminen havaittiin

in vitro

(kuva S3). Vertailun vuoksi hiiri Ptch1 ja Gli1 mRNA-tasot osoittivat selvästi voimakkaampi downregulation, mikä osoittaa, että stroomasolut ovat merkittäviä tavoitteita Hh saarron. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että kasvaimen vastainen vaikutus syklopamiinin ksenograftin kasvun välittyy ensisijaisesti downregulation Hh-signaloinnin in kasvaimeen liittyvien strooman.

vaikutukset Syklopamiini on Kasvaimen verisuonistossa

Niistä peruskudoskomponentit vuonna PDAC ksenografteissa, olimme erityisen uteliaita verisuonien, koska olemme osoittaneet, että BM-johdettu angiogeneesiä (esiaste) solut reagoivat Hh ligandiin aikana uudissuonittumisen [26], [29]. Siksi tutkimme vaikutus syklopamiinin kasvaimen verisuonistossa KP-1 N-ksenografteissa. Immunovärjäys varten endoteelisolumarkkeri CD31 paljasti, että mikroverisuonten tiheys oli merkitsevästi pienempi (42,6%), kun hiiriä hoidettiin syklopamiinilla (kuvio 2A). Tuloksena kasvaimen verisuoniston rajattiin ja hajanainen, ja vähentää keskimääräinen alus alueella oli dramaattinen (64,8%). Angiogeneesin inhibitiota syklopamiinilla havaittiin myös Suit-2 ksenografteissa (kuva S4).

(A) KP-1N ksenografteissa käsitelty tai ilman syklopamiinilla värjättiin CD31. Mittaviivat; 500 um. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM MVD ja tarkoittaa aluksen alueella. (B) Double immunofluoresenssivärjäyksellä kanssa α-sileän lihaksen aktiini (SMA), jossa CD31 tai NG2 kanssa CD31. Mittaviivat; 200 um. Määrä CD31

+ mikrosuonten peitetty α-SMA tai NG2 positiivinen perisyyteissä näkyy.

tulokset viittasivat siihen, että saarto Hh-signaloinnin ”horjuttaa” kasvain alukset. Halusimme vahvistaa tätä olettamusta immunohistokemiallisella värjäyksellä α-sileän lihaksen aktiini (SMA), NG2, ja CD31. SMA ja NG2 ilmaistaan ​​perisyyteillä, jotka ovat soluja, jotka läheisesti liittää CD31-positiivisten endoteelisolujen vakauttaa verisuonten [30], [31]. Havaitsimme 50,0% eli 62,1% vähemmän CD31

+ mikrosuonten peitetty SMA

+ tai NG2

+ perisyyteissä syklopamiinilla käsitellyt tuumorit (kuvio 2B). Siten Hh signalointi on tärkeää kypsymisen ja /tai stabilointi kasvaimen verisuonistossa.

kasvainperäinen Hh edistää kussakin BM peräisin olevien solujen osaksi uudisverisuonistoa

Luuytimen (BM) -johdannainen solut arvellaan olevan rooli kasvainten kehittymiseen [32], [33]. Esimerkiksi, eri BM-johdettujen hematopoieettisia soluja on havaittu tiiviisti yhdistää kasvaimen uudissuonittumisen [34], [35], ja itse asiassa pieni määrä BM johdettujen kantasolujen osoitettiin sisällyttää onteloon kasvava verisuonisto jossa ne erilaistuvat endoteelisolujen hiiren keuhkosyöpään malli [36]. Eri tekijöiden kasvain mikroympäristössä voi moduloida rekrytointia ja säilyttämistä BM peräisin olevien solujen kehittämisen aikana kasvaimen verisuoniston [37]. Siksi pyrimme onko Hh signalointi vaikuttaa tähän prosessiin PDAC. Jotta jäljittää BM peräisin olevia soluja, me istutettiin KP-1N ksenografteina kimeerisiä hiiriä GFP-leimatun BM (GFP-luuydinsiirron mallia; katso menetelmät). Syklopamiinin merkittävästi vähentynyt rekrytointi BM peräisin olevien solujen osaksi ksenografteista 60% verrattuna kontrollien tuumoreiden (kuvio 3A).

(AD) GFP-BMT-kimeerisiä hiiriä, joissa KP-1N -ksenografteja käsitelty tai ilman syklopamiinin. Rekrytointi BM-johdettujen solujen kasvain seurataan immunovärjäys anti-GFP (A). Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM numerot GFP

+ solut. Scale Bars; 100 um. KP-1N Ksenograftikudoksista immunovärjättiin Gli2 (B), CD31, VE-kadheriinin tai NG2 (C), yhdessä GFP. Scale Bars; 100 um. Näkyy ovat keskiarvo ± SEM GFP

+ soluja rekrytoidaan CD31

+ kasvain alukset (

yläpaneeli

) ja GFP

+ solujen yhteistyötä paikallistaa CD31, VE-kadheriinin

+, ja NG2 (

alempi paneeli

).

joukossa Gli perheen transkriptiotekijöiden, valvonta hajoamista Gli2 ja jalostamisesta sen repressorin muotoon määritellä Hh signalointi vastaus [38]. Gli2 proteiinia käsitellään ja hajoaa ilman Hh ligandin, kun taas läsnäolo Hh ligandin edistää Smo rikastumisen ensisijainen värekarvojen [39], jolloin tumaansiirtymiseen täysipitkän, kopiointia toimivaltainen Gli2 proteiini [40]. Siksi arvioitiin vaikutusta syklopamiinin Gli2 proteiinin välityksellä immunofluoresenssianalyysillä hyödyntäen vasta-ainetta vastaan ​​täyspitkä muoto Gli2 [41] (kuva S5a). BM-johdetut solut ekspressoivat täyspitkää Gli2 proteiinia ja syklopamiinilla laski sekä absoluuttinen määrä ja suhteellinen osuus Gli2 positiivisen BM peräisin olevia soluja (kuvio 3B), mikä osoittaa, että Hh-signalointi on aktivoitu BM-johdettujen solujen syklopamiinilla herkkä (Smo : sta riippuva) tavalla. Ptch1 proteiini havaittiin myös BM peräisin olevat solut sekä syöpäsolujen ja syklopamiinilla vähensi Ptch1 ilmentymisen strooman osastossa (kuvio S5B). Olemme pystyneet osoittamaan vahvaa Gli1 proteiinin ilmentymistä ksenograftikudoksesta (tuloksia ei ole esitetty).

ohjaus kasvaimia, GFP-positiivisten BM peräisin olevat solut ovat tiiviisti mukana CD31

+ kasvain alukset, mutta ne eivät ole sisällytetty onteloon vasculatures (kuvio 3C). Toisaalta, osajoukko BM peräisin olevien solujen koekspressoi VE-kadheriinin osoittaa, että BM peräisin olevat solut eivät ole vain rekrytoidaan peri-verisuoni-alueella, mutta myös, antavat suoraan kasvaimeen endoteeliin. NG2 proteoglykaani ilmaistaan ​​syntyvän perisyyteissä alkuvaiheessa angiogeneesin, ja osajoukon BM peräisin olevien solujen ksenograftikasvaimissa koekspressoi NG2. Nämä tulokset osoittavat, että BM peräisin olevien solujen edistää kasvaimen verisuoniston paitsi synnyttää tietyntyyppisen soluissa, mutta myös yhdistämällä eri tavoin. Huomattavaa on, että syklopamiinihoidon merkittävästi vähentynyt integrointi GFP

+ BM-johdettu angiogeneesiä soluja (BMPCs) osaksi CD31

+, VE-kadheriinin

+ tai NG2

+ kasvain vasculatures. Olemme vahvisti, että BMPCs olivat herkkiä Hh koska

in vitro

yhteistyössä viljelmiä KP-1N kasvainsolujen johti syklopamiinilla herkkä induktio Gli1 /Ptch1 mRNA: n BMPCs, mutta ei kypsän endoteelisolulinjaa MS -1 (kuvio S6 ja tietoja ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että Hh-reitin on rooli uudissuonittumista moduloimalla sisällyttämällä BM-johdetun pro-angiogeeninen (prekursori) solujen kasvain alukset.

kasvain- Hh Edistää Migration of BM- johdettu angiogeneesiä Cells

in vitro

ja

in vivo

arveltu, että vähentynyt määrä BM peräisin olevien solujen syklopamiinilla käsiteltyjen kasvainten saattaa johtua heikennettyjä liikkeelle solujen BM. Kuitenkin, määrää verenkierrossa BMPCs, mitattuna leimaamalla viljeltiin perifeerisen veren MNC kanssa AcLDL /isolectin B4 [42], ei ollut merkittävästi vähentynyt, kun läsnä on syklopamiinin (kuva S6). Tämä havainto viittaa siihen, että Hh saattaa suoraan säädellä rekrytointi, erilaistumista tai kulkeutumista lähtöaineiden BMPCs sisällä kasvain microenvironment sijaan vaikuttavat liikkeelle esiasteiden luuytimestä.

Koska esto Hh-signaloinnin ei vaikuttanut mobilisointi BMPCs, pyrimme tutkimaan mekanismeja, joilla Hh signalointi voisi parantaa niiden liittäminen kasvaimen verisuonistoon. Tätä varten tutkimme vaikutuksia Hh signaloinnin siirtolaisuudesta lähtöaineiden. Migraatio BMPCs läpi siirtokuoppaan kalvon

in vitro

mitattiin läsnäollessa KP-1N alemmassa hyvin. Viljellyt BMMNCs ilmentävät c-Kit, CD11 ja VE-kadheriinin käytettiin kuin lähtöaineiden BMPCs (kuva S6). Numero BMPCs siirryttäessä alapuolen kalvo kasvoi merkittävästi, kun viljeltiin yhdessä KP-1N verrattuna angiogeneesiä soluja ilman KP-1 N, mikä tarkoittaa, että eritetty tekijät päässä PDAC solut voivat parantaa kulkeutumista esiasteita (kuvio 4A). Sopusoinnussa rooli Hh-Smo-reitin, esivakiointi BMPCs syklopamiinilla vähentänyt dramaattisesti niiden kyky siirtää annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 4A). Suoraan käsitellä rooli Smo-riippuvainen signalointi BM-johdettu angiogeneesiä soluja, käytimme BM-solut infektoidaan shRNA lentiviruksen kohdentaminen Smo (kuvio 4B). Suppressio Smo merkittävästi heikennetty niiden siirtyminen KP-1N syöpäsoluja. Rooli tuumorista peräisin Shh kulkeutumista esiasteiden varmistettiin myös käyttämällä Shh neutraloiva vasta-aine (kuvio 4C).

(A-B) migraatio BM-johdettu pre-angiogeeninen soluja (BMPCs) arvioitiin. BMMNCs viljeltiin EGM2-MV alustassa 4 päivää ja kiinnitetään-solut ympättiin transwell (5 um huokoskoko) päällystetään 0,1% gelatiinia, ja KP-1N-soluja siirrostettiin alemman hyvin. Määrä siirtynyt solujen pohjaan membraanin kvantifioitiin DAPI-värjäys 18 h inkuboinnin jälkeen. BMPCs esikäsiteltiin Syklopamiini (A), shRNA lentivirus ja Smo (B), ja anti-Shh ja /tai anti-VEGF-neutraloivien vasta-aineiden (C), kun ympättiin hyvin. Jos positiivinen kontrolli, ihmisen VEGF (50 ng /ml) lisättiin alempaan hyvin, ja BMPCs viljeltiin yksinään negatiivisena kontrollina.

selventämiseksi vaikutusten Smo reitin modulointi maahanmuutosta on BMPCs

in vivo

teimme matrigeeliä pistoke määrityksiä. Kun väkevää supernatantti KP-1N soluja sekoitettuna matrigeelin istutettiin ihon alle nude-hiiriin, lukumäärä isäntäsolujen kulkeutuvat matrigeelin lisääntyi merkitsevästi, ja solut muodostivat johto kaltainen rakenne, matkien kapillaarinen morfogeneesiin

in vivo

(kuvio 5A). Jotta voidaan erottaa BM-johdetut solut muista stroomasolujen, koe toistettiin käyttämällä muita kimeerisiä hiiriä, jotka tehtiin BMT. Koska havaitsimme merkittävää Tie2 mRNA: n ekspression BM-johdettu angiogeneesiä soluja käytetään

in vitro

määrityksissä (tuloksia ei ole esitetty), Tie2 /LacZ-hiiriä käytettiin luovuttajana BMT [42]. Suuri osa soluista matrigeeliä peräisin BM näkyy positiivinen immuunivärjäykseen β-gal (kuvio 5B). Muuttoa isäntäsolujen matrigeeliä tulppien heikennettiin merkittävästi, kun syklopamiinihoidon lisättiin Matrigel. Samanlainen tulos saatiin myös käyttäen anti-Shh-vasta-ainetta (tuloksia ei ole esitetty).

Matrigel plug-määritys käyttäen Tie2 /LacZ-BMT kimeerisiä nude-hiiriin. Kasvutekijä vähennetään matrigeeliä sekoitettiin väkevän väliaine KP-1N (CM

KP-1N) oli istutetaan kimeerisiä hiiriä. Kokeellisissa ryhmissä, matrigeeliä oli myös sekoittaa syklopamiinilla. (A) Capillary morphogenesis sisällä matrigeelin kvantitoitiin useissa haaran pistettä H-E osissa. (B) matrigeelin oli immunovärjättiin β-gal. Esitetty ovat keskiarvo ± SEM β-gal-positiivisia soluja.

kollektiivisesti, tuloksemme osoittavat, että inhibitio kasvain- Hh-signalointi johtaa tuumorin angiogeneesin ja epävakauden verisuoniston kanssa samanaikaisesti väheneminen rekrytointi of BMPCs kasvaimeen strooman.

asetukseen Pro- ja Anti-angiogeenisten tekijöiden Hh Signaling

tunnistaa molekyyliperustan verisuonten häiritsemiseen Hh saarto, me määrällisesti mRNA ekspressiotasot pro- ja anti-angiogeenisten tekijöiden in PDAC ksenografteissa käyttäen lajispesifisiä pohjamaali /koetin sarjat qPCR. Erityisesti olimme uteliaita tietää VEGF ja SDF-1, joita pidetään pro-angiogeenisten tekijöiden vuoksi niiden osoitti vaikutuksia rekrytointia ja säilyttämistä angiogeneesiä edeltäjä solujen kasvainmuodostuskohdat [34], [ ,,,0],43].

Huomasimme, että ihmisen VEGF ja SDF-1 mRNA: n ilmentymisen pieneni 31% ja 33%, vastaavasti, syklopamiinilla käsitellyt tuumorit (Kuva S7). Nämä tulokset ovat toisin vaatimaton downregulation VEGF ja SDF-1-mRNA syklopamiinilla käsitellyn KP-1N solujen

in vitro

joko normoxic tai hypoksinen olosuhteet (kuva S8). Samoin HIF-1α vakaus ei vaikuttanut hypoksisissa olosuhteissa

in vitro

. Lisäksi estämällä Shh kumoamalla vasta-ei aiheuttanut vähenemistä VEGF mRNA in KP-1N soluissa, mikä viittaa siihen, että autokriinisen Shh signalointi ei välittää angiogeeninen fenotyyppi suoraan KP-1N (Kuva S8). Sen sijaan nämä kollektiivinen tulokset viittaavat siihen, että Hh signalointi törmää strooman ja että strooman johdetut tekijät saattavat osaltaan VEGF: n ilmentymistä ja SDF-1 kasvainsoluissa

in vivo

.

on osoitettu, että syövän liittyvät fibroblastit erittävät SDF-1 rekrytoida luuytimestä peräisin endoteeliprekursorisoluja kasvaimeen strooman, jotta välittää angiogeneesiä [44]. Siksi meidän seuraava määrällisesti ilmentymistä näiden pro- /anti-angiogeenisten tekijöiden hiiren kasvain strooman. Hiiren VEGF ja SDF-1 tasot eivät vaikuttaneet syklopamiinilla

in vivo

(kuvio 6A), mikä osoittaa, että Hh ei osallistu modulaatiota näiden pro-angiogeenisten tekijöiden kasvain strooman.

(A) mRNA ilmauksia hiiren pro /anti-angiogeenisten tekijöiden in ksenografteissa kvantitoitiin qPCR. (B, C) Co-kulttuuri määritys suoritettiin käyttäen trenswell. BM-johdettu angiogeneesiä soluja (BMPCs) infektoitiin lentiviruksesta ilmentävät ohjaus shRNA tai Smo shRNA ja yhdessä viljelemisen KP-1N-solut ympättiin transwell (0,4 um). RNA kerättiin BMPCs 12 h kuluttua varten qPCR (normalisoitu soluja ilman KP-1N). (D) putken muodostumiseen määritys suoritettiin viljelemällä MS-1 Matrigelillä läsnä ollessa tai poissa ollessa GFP-leimatun BMPCs. Capillary morphogenesis havaittiin 8 h inkubaation kanssa tai ilman anti-IGF-1 neutraloiva vasta-aine. Mittakaava, 500 um. Haarautumiskohtien lukumäärä ja sisällyttämällä BMPCs putkeen kvantifioitiin.

vieressä tarkasteltiin ilmentymisen tekijöitä, jotka moduloivat verisuonten vakautta. Kasvaimissa syklopamiinilla hoidetuissa hiirissä, olemme huomanneet selvä vähentäminen hiiren Ang-1, IGF-1, ja PDGF-B-mRNA: n, tuntemat tekijät vakauttaa uudissuonittumisen. Ang-1 näyttelee ratkaisevaa roolia angiogeneesin aikana vakauttamaan neovessels [30], ja sitä vastaavan Tie2 reseptori ilmentyy EC: eissa, angiogeneesiä monosyytit sekä pericyte esiasteita mesenkymaaliset [45]. Vähentäminen Ang-1 kytkettiin 86,3% ylössäätely Ang-2, luonnollinen antagonisti Tie2, joka johtaa dissosiaatiota seinämaalaus solun päällysteen aloittaa angiogeneesin [46] (kuvio S9). Pyrkiessään ymmärtämään sääntelyyn näihin seikkoihin Hh signalointi, vertasimme niiden mRNA tasot BMPCs jotka olivat viljeltiin yhdessä KP-1N soluissa. Ang-1 ja IGF-1, mutta ei PEDF-B-mRNA: n ilmentyminen lisääntyy enemmän kuin 2-kertaisesti syklopamiinilla ottavalla tavalla (kuvio 6B), ja samanaikaisesti downregulation Ang-2-mRNA: n esiasteita havaittiin. Muuttuneen ilmentymisen Ang-1 ja Ang-2 peruttiin syklopamiinilla, ja vaikutus Ang-1 /Ang-2 suhde oli dramaattinen (54,3%: n vähennys, kuvio S9). Tulokset olivat samansuuntaiset, kun kohdistettuja Smo BM-johdettu lähtöaineita lentivirus shRNA, jossa vahvistetaan, että muutos Ang-1-geenin ilmentyminen syklopamiinilla johtui saarto Smo-riippuvaisen reitin (kuvio 6C). Näin ollen, Hh-riippuvainen Ang-1 /Tie2 signalointi näyttää olevan yksi mahdollisista mekanismeista, joilla BMPCs vakauttaa neovessels.

IGF-1 on suunnattu Hh-signaloinnin BM-Derived angiogeneesiä solut

Reduction in IGF-1-RNA havaitsimme syklopamiinilla käsitelty ksenografteissa (kuvio 6A) myös toisteta yhteistyössä luviljelymäärityksistä; eli voimakas induktio IGF-1 in BMPCs KP-1N-johdettu tekijöiden esti merkitsevästi joko syklopamiini tai shRNA vastaan ​​Smo (kuvio 6B, C). Tarkistaa rooli IGF-1 aikana uudissuonittuminen, putken muodostumisen määritys suoritettiin käyttämällä MS-1 (hiiren kypsän EY line) ja GFP-leimatun BM-johdettu angiogeneesiä esiasteita (kuvio 6D). Kapillaari morphogenesis MS-1 indusoitiin BMPCs, ja vaikutus on parantunut, kun ne oli esikäsitelty, kun läsnä on KP-1N-soluja. Huomiota herättävää on, vaikutus hiussuonten muodostumista merkittävästi vähentynyt käsiteltäessä anti-IGF-1-neutraloiva vasta-aine. Täten IGF-1 on tärkeä tavoite Hh-signaloinnin BM peräisin olevia soluja, ja downregulation IGF-1 in tuumoriksenografteja by syklopamiinihoidon voisi edistää häiriöitä angiogeneesin.

Keskustelu

nykyisessä tutkimuksessa olemme tunnistaneet BM-johdettu angiogeneesiä soluja (BMPCs) yhtenä parakriinisen tavoitteet Hh, joka on keskeisessä asemassa edistää kasvaimen angiogeneesiä ja kasvaimen etenemistä. Destabiloitu kasvaimen verisuoniston että havaitsimme kun syklopamiinihoidon ensimmäinen johtaa meidät spekuloida, että voisimme tarkkailla väheneminen strooman Ang-1 ja IGF-1, tekijät tiedetään säätelevän Hh-reitin [47], [48].

Ang-1 kehittää ja vakauttaa primitiivinen verisuoniston alla Hh signalointi keuhkojen aluevaltaus morfogeneesissä [49] ja Shh lisääntynyt mRNA tasot Ang-1 fibroblasteissa, mutta laski Ang-2 [47], [50]. Yhteistyömme kulttuuri koe osoitti Ang-1 mRNA BMPCs oli voimistuvan liukoisen tekijät KP-1N on Smo riippuvaisella tavalla, mikä viittaa rooli esiasteet säiliö Ang-1 kasvaimen mikroympäristössä vakauttamiseksi Tie2 ilmentävien hankittua sekä osajoukkoja angiogeneesiä soluja. Itse asiassa tietty osa BM-johdetut solut ilmentävät myös Tie-2-reseptorin [51], joka tukee vaihtoehtona autokriinistä tai parakriinistä vaikutusta niiden angiogeeninen aktiivisuus ympäröivän strooman kautta Ang-1-ligandi.

solujen eri lähteistä IGF-1: tuumorin strooman ja väheneminen peruskudosta peräisin IGF-1, jotka havaitsimme, voi selittää kasvun inhibition PDAC solujen

in vivo

kun Hh signalointi on estetty [27]. IGF-1 voi myös parantaa aktiivisuutta BM peräisin olevien solujen edistää neovaskularisaatiota kautta PI3K /Akt signalointi [52]. Nykyisessä tutkimuksessa parantamiseksi kapillaarin morfogeneesiin MS-1-soluja, jotka BMPCs stimuloitiin PDAC solujen vaimenevat selvästi anti-IGF-1 (kuvio 5D). Täten IGF-1 näyttää olevan yksi keskeinen tavoitteet Hh signalointia BMPCs ja välittää sen vaikutus uudissuonittumista. Oli merkittävä väheneminen PDGF-B ilmentyminen kasvaimen strooman

in vivo

sekä BMPCs

in vitro

; kuitenkin, meidän yhdessä viljelemisen määritys BMPCs kanssa KP-1N eivät osoittaneet ylössäätely PDGF-B mRNA, mikä viittaa siihen, että syövän johdettu Hh ligandi on todennäköisesti tärkeä rooli induktioon PDGF-B. Kuitenkin downregulation PDGF-B syklopamiinilla voi osittain selittää vähentynyt rekrytointi perisyyteissä osaksi juuri muodostuneen verisuonten verkosto ksenografteissa.

molekyylitason mekanismeja, jotka olemme paljaana täällä osoittavat selvästi, että Hh signalointi lla paracrine rooli syövän etenemiseen. Se raportoi äskettäin, että transkription induktio Gli voidaan ylläpitää riippumaton Smo [24], ja ei-kanoninen sääntelyn Gli-kohdegeenien välittyy osittain läpi TGF-β ja Kras signalointi. Useimmat PDAC solut, mukaan lukien KP-1 N, näihin onkogeeninen Kras, ja se on osoitettu, että TGF-β-Smad reitti aktivoidaan KP-1N-solujen [53]. Nämä reitit saattavat selittää vaatimaton väheneminen Gli1 transkription syklopamiinilla että havaitsimme. On myös mahdollista, että

in vivo

kasvun esto Hh saarto että havaitsimme saattaa välittyä vaikuttamalla itseuudistumisen omaisuutta harvinaisia ​​PDAC aloittamista solujen [54]. Kuitenkin merkittävä muutos leviämisen /kuolema kinetiikka että me havaittu suuren osan syöpäsolujen ksenografteissa käsitelty cyclopaminewas selvästi mukana angiogeneesin inhibitiota.

Syklopamiini heikennetty paitsi rekrytointi BM johdettujen solujen kasvain, mutta myös niiden sisällyttäminen kasvaimen verisuonistoon, joka tukee osallistuminen Hh, että kasvaimeen liittyvän angiogeneesiä. Tuloksemme eivät tue käsitystä, että autokriinisen signalointi Hh syöpäsoluissa edistää kasvaimen angiogeneesi, ja melko viittaavat siihen, että Hh toimii yksinomaan strooman. Shh on osoitettu suoraan ohjaamaan toimintaa BMPCs solujen stimuloimalla niiden leviämiseen, muuttoliike ja indusoimalla angiogeenisten tekijöiden edistää verisuonten remontin [26], [29], [55]. Olemme osoittaneet, että tekijät erittämiä PDAC solut voi parantaa kulkeutumista esiastesolujen ainakin osittain on Smo-riippuvaisella tavalla. Oli lisävaikutus Hh-signaloinnin EY: n kokoonpanoon kautta aktivointi BMPCs yhdessä versoja kypsä hankittua. Olemme aiemmin osoittaneet, että Shh voi lisätä aktiivisuutta lähtöaineiden edistää hiussuonten morphogenesis mukaan HUVEC [26]. Mittaviivat; Mittaviivat;