Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä on edelleen kaikkein vaarallisin gynecologic syöpä ja uusia kohdistettuja molekyylitason hoitoja vastaan ​​kurja sairaus jatkuu haasteellisena . Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet ilmaisulliset kuviot interleukiini-6 (IL-6) ja sen reseptori (IL-6R) ilmentyminen munasarjasyöpä kudoksissa, arvioi vaikutus näitä ilmaisuja kliiniseen tulokseen potilailla, ja totesi, että korkea- taso IL-6R: n ekspressio, mutta ei IL-6 ilmentymistä syöpäsoluissa on riippumaton ennustetekijä. Vuonna

in vitro

analyyseistä munasarjojen solulinjoissa, kun taas kuusi (RMUG-S, RMG-1, OVISE, A2780, SKOV3ip1 ja OVCAR-3) seitsemän yli-ilmentynyt IL-6R verrattuna ensisijaisen normaalin munasarjan pintaepiteelissä vain kaksi (RMG-1, OVISE) seitsemän solulinjojen yli-ilmentyy IL-6, mikä viittaa siihen, että IL-6 /IL-6R-signalointia kohdistaa parakriinisesti tietyntyyppisten munasarjasyövän soluja. Munasarjasyöpä askites kerättiin potilailta, ja huomasimme, että ensisijainen CD11

+ CD14

+ soluja, jotka olivat pääasiassa M2-polarisoitu makrofagit, ovat merkittävä lähde IL-6-tuotannon munasarjasyöpäsolu mikroympäristön. Kun CD11

+ CD14

+ soluja viljeltiin yhdessä syöpäsolujen, sekä hyökkäyksen ja leviämisen syövän soluja voimakkaasti edistetty ja näistä kampanjoista oli lähes täydellisesti inhiboi esikäsittely anti-IL-6R-vasta-ainetta (tosilitsumabi ). Tässä esitetyt viittaavat siihen perustelut anti-IL-6 /IL-6R terapia tukahduttaa vatsakalvon leviämisen munasarjasyövän, ja edustavat näyttöä terapeuttista potentiaalia anti-IL-6R hoidon munasarjasyövän hoitoon.

Citation: Isobe A, Sawada K, Kinose Y, Ohyagi-Hara C, Nakatsuka E, Makino H, et al. (2015) interleukiini 6: Reseptori on itsenäinen ennustetekijä ja potentiaalinen terapeuttinen kohde munasarjasyöpä. PLoS ONE 10 (2): e0118080. doi: 10,1371 /journal.pone.0118080

Academic Editor: Goli samimi, Garvan Institute of Medical Research, AUSTRALIASSA

vastaanotettu: 01 lokakuu 2014; Hyväksytty: 05 tammikuu 2015; Julkaistu: 06 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Isobe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Grant-in-Aid tieteelliseen tutkimukseen opetus-, tiede-, urheilu ja kulttuuri Japanin (21791555 ja 23592447 KS, 22390308 HK ja 23659779 TK). Tätä työtä myös osittain tukee Osakan Medical Research Foundation for Vaikeasti Diseases (KS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy peräisin gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia. Viimeaikaiset vakuuttavia tiedot tukevat osallistumista tulehduksellinen strooman microenvironment aiheuttama yli-sytokiinien tai kemokiinien, edistämisessä munasarjasyövän kasvainten synnyssä, syövän eteneminen ja kestävyys chemotherapies. [1] Tämän vuoksi kohdistuksen Näiden sytokiinien päässä strooman microenvironment voivat tarjota lupaavaa terapeuttinen strategia hallinnan parantamiseksi munasarjasyöpäpotilaalle.

joukossa sytokiinien toistaiseksi raportoitu, interleukiini-6 (IL-6) on yksi keskeinen immunoregulatorisia sytokiinien läsnä munasarjasyöpä microenvironment; se aiheuttaa useita johtavia reittejä kasvaimen leviäminen, angiogeneesi ja chemoresistance. [2] Korkea seerumin ja askitesta tasoja IL-6 on havaittu potilailla, joilla on munasarjasyöpä kuin potilailla, joilla muiden pahanlaatuisten kasvainten ja tasojen on osoitettu korreloivan laajuudessa taudin ja huono kliiniseen tulokseen. [3-5] Vaikka Rath et al. osoittivat äskettäin, että IL6-R ilmentyminen on erittäin ilmaistaan ​​munasarjasyöpää kudoksissa verrattuna normaaleissa kudoksissa tai hyvänlaatuinen sairauksia, [6] kliinistä vaikutusta IL6-R ilmentyminen munasarjasyövän laji ei ole tutkittu. Siksi meillä oli kannusti tutkimaan kliinistä arvot IL-6 ja IL-6R: munasarjasyöpä kudoksissa käyttäen kudossiruina (TMA) rakensimme ja vastaavat kliiniset tiedot.

Näyttää siltä, ​​että antagonisoimalla IL-6 /IL-6R-signalointi voi olla terapeuttista aktiivisuutta potilailla, joilla on munasarjasyöpä inhibition kautta kasvaimen edistävien sytokiinien verkoston. Todellakin, kohdennettuja anti-IL-6-vasta-hoito on käytetty kliinisissä tutkimuksissa ja sen on todettu olevan hyvin siedettyjä potilailla useiden syöpien, kuten munasarjasyöpä. [7] Tosilitsumabi (Chugai Pharmaceutical, Shizuoka, Japani), on humanisoitu anti- ihmisen IL-6R-vasta-aineen ja sitoutuu IL-6-sitoutumiskohta ihmisen IL-6R: ään. On tunnettua estää kompetitiivisesti IL-6 /IL-6R-signaloinnin ja täysin neutraloi IL-6 toimintaa. [8, 9] sarja kliinisiä tutkimuksia on onnistuneesti osoitettu, että suppressio IL-6 /IL-6R-signalointi tosilitsumabi on terapeuttisesti tehokas lievittämään castlemanin tauti ja nivelreuma. [10, 11] Kun otetaan huomioon menestys näiden sairauksien hoidossa, tosilitsumabi voi osoittautua hyödylliseksi hoidettaessa IL-6-liittyviä syöpiä ja olimme motivoituneita valaista terapeuttista potentiaalia tosilitsumabin vastaan ​​munasarjasyöpä.

Vaikka ei vain munasarjasyöpäsoluja mutta kasvaimeen liittyvät makrofagit on raportoitu tuottamaan IL-6, [12, 13], se on edelleen kiistanalaista, onko lisääntynyt IL-6-tasot potilailla, joilla on munasarjasyöpä tuotetaan kasvain itse tai pääasiassa isännän kudoksiin. Valtaosa munasarjasyöpäpotilaalle tällä vaiheissa hetkellä vatsakalvon metastaattinen sairauksiin, johon usein liittyy massiivinen askites. [14] massiivinen askites potilaiden koostuvat paitsi syöpäsolujen lisäksi myös fibroblastit, endoteelisolut ja pääasiallisesti immuunisolujen, jotka kaikki ovat ratkaisevia syövän kasvua, etenemisen ja etäpesäkkeiden. [15] peritoneaalimakrofageille arvellaan olevan keskeinen rooli tässä yhteydessä, mistä on todisteena useissa tutkimuksissa todetaan, että makrofagi ehtyminen vatsakalvon munasarjasyövän mallit tukahduttaa syövän etenemistä ja kertymistä askites. [16, 17] makrofagit että tunkeutumaan kasvaimen kudokset, joita kutsutaan kasvaimeen liittyviä makrofagit (TAM), ovat hyvin tunnettuja avustajat kasvaimen etenemiseen ja jotka liittyvät huonoon ennusteeseen eri syövissä. [18, 19] koska TAM tiedetään vapauttamaan eri proangiogeeninen sytokiinien ja kasvutekijöiden, me arveltu, että makrofagit voisi olla yksi potentiaalinen vastaavan lähteistä rikastettua IL-6 kertyminen munasarjasyövän askites.

tätä taustaa vasten me yritettiin analysoida ilmaisulliset rakenteessa IL 6R sekä käyttämällä munasarjasyöpää TMA ja arvioida niiden vaikutusta lausekkeita kliinisiä tuloksia potilaiden. Munasarjasyöpä askites kerättiin potilailta, joille tehtiin leikkaus, ja huomasimme, että ensisijainen CD11

+ CD14

+ soluja, jotka olivat pääasiassa M2-polarisoitu TAMeja olivat päälähde IL-6-tuotannon munasarjakasvain mikroympäristön ja voimakkaasti edistänyt munasarjasyöpä hyökkäyksen ja lisääntymistä. Tässä esitetyt viittaavat siihen perustelut anti-IL-6 /IL-6R terapia tukahduttaa vatsakalvon leviämisen munasarjasyövän ja saadaan näyttöä terapeuttista potentiaalia anti-IL-6R hoito parantaa tätä kurja sairaus.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Patient näytteet saatiin kirjallinen suostumus mukaisesti eettinen komitea vaatimukset laitosten ja Helsingin julistuksen. Institutional Review Board (IRB) Osakan yliopistosta Graduate School of Medicine hyväksyi tutkimuksen pöytäkirja 15.2.2011 (nro 10064). IRB Gifun University Graduate School of Medicine hyväksyi sen 02.07.2012 (nro 26-50).

Materiaalit

Vasta-aineita IL-6 (R-49L), IL 6R (C-20) ja yhteensä STAT3 (C-20) olivat Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Rekombinantti ihmisen IL-6 saatiin Chemicon (Temecula, CA) ja ihmisen rekombinantti-sIL-6R oli peräisin R 25%, 1, ≥25%) ja intensiteetti värjäys (0, ei mitään, 1, heikko; 2, voimakas). ”High” IL-6 määriteltiin jos koostumus pisteet tiheys ja intensiteetti oli ≥1. ”Low” ilmaisun määriteltiin jos koostumus pisteet tiheyden ja intensiteetin tulokset oli 0. ”High” IL-6R määriteltiin jos koostumus pisteet tiheys ja intensiteetti = 2. ”Low” ilmaisun määriteltiin jos koostumus pisteet tiheyden ja intensiteetin tulokset oli ≤1.

Real Time Reverse Transcription (RT) -PCR analyysi

Yhteensä-RNA eristettiin Trizol reagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, CA). Yksi ug kokonais-RNA: ta käänteis- transkriptoidaan ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japani). Kvantitatiivista mRNA: n ekspression analyysiä, TaqMan RT-PCR suoritettiin StepOnePlus ™ Real-Time PCR järjestelmä seuraten valmistajan ohjeita. TaqMan Probe-Based Gene Expression Kokeet käytettiin IL-6; Hs 00174131_m1 ja IL-6R; Hs 01075667_m1 (Applied Biosystems). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Suhteellinen mRNA-geenin ilmentymisen laskettiin käyttäen 2

–

ΔΔCT

menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [21].

RT-PCR-analyysi

cDNA syntetisoitiin 1 ug RNA käyttämällä ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Osaka, Japani) satunnaisia ​​alukkeita. IL-6R: n ilmaisu, suunniteltiin alukkeet pariutua alueen silmukoinnin pois IL-6R: n, jotta voidaan havaita paitsi membraaniin sitoutunut muoto (IL-6R), vaan myös liukoinen muoto (sIL-6R). Alukkeen sekvenssit ja odotetut PCR-tuotteet olivat seuraavat; sense IL-6R, 5′-TCCACCCCCATGCAGGCACT-3 ’(emäkset 1419-1438) ja anti-sense-IL-6R; 5’-GTGCCACCCAGCCAGCTATC-3 ’(emäkset 1840-1859), koko; IL-6R, 441 bp, sIL-6R, 341 bp. β-aktiini-sense: 5’-CGTGACATTAAGGAGCTGTG-3 ’, β-aktiini-anti-sense: 5′-GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA-3’, koko 376 emäsparia. Sekvenssit cDNA saatettiin GenBank (tulonumero. X12830 IL-6R: n ja sIL-6R: n ja NM_001101 varten β-aktiini). CDNA templates PCR-monistettiin Taq PCR master mix (Qiagen, Valencia, CA), joka sisälsi 1 mM kutakin dATP, dCTP, dGTP ja dTTP, ja 2,5 U Taq DNA-polymeraasia, ja kukin aluke 0,2 uM seuraavissa olosuhteissa : 35 sykliä 94 ° C 45 s, 60 ° C: ssa 45 s ja 72 ° C: ssa 60. Tuotteet elektroforeesi 2% agaroosigeeleillä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä ja ultravioletti valo.

Western blot -analyysi

yhteensä 4 x 10

5-solut maljattiin 6- kuoppalevyille ja hajotettiin 1 × Cell Lysis Buffer (Cell Signaling). Lysaatit (30 ug) erotettiin 5-20% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvot, jonka jälkeen inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden (p-STAT3, 1: 1000 5% naudan seerumin albumiinia (BSA), STAT3, 1 : 1000 5% BSA: ta, p-ERK, 1: 2000 5% BSA: ta, ERK, 1: 2000 5% BSA: ta, p-aktiini, 1: 10000 5% BSA: ta), ja sitten johdetun piparjuuriperoksidaasi konjugoitu IgG. Proteiinit visualisoitiin Western Salama Plus ECL (PerkinElmer Life Science, Waltham, MA).

proliferaatiomääritystä

SKOV3ip1 tai RMG1 solut maljattiin 24-kuoppalevyille (1 x 10

4 solua /kuoppa) 10% FBS /DMEM: ssä 24 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin 0,1% BSA /DMEM: n läsnä ollessa tai ilman IL-6 kanssa tai ilman anti-IL-6R-vasta-ainetta 72 tuntia. Soluproliferaatiota arvioitiin modifioidun MTS-määritys käyttäen Cell Titer 96AQ kit (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yhteistyössä kulttuurin kokeiluja, polykarbonaatti suodattimet 1 um huokosia (solut eivät voi kulkea suodattimen läpi), asetettiin 24-kuoppaisille levyille ja yhtä suuret lukumäärät ensisijainen solut ympättiin nautintoaine. Soluproliferaatiota ilmaistiin suhde elävien solujen lukumäärä.

Matrigel invaasiomääritys

Lyhyesti, polykarbonaatti suodattimet 8 um huokosia päällystettiin 25 ug matrigeeliä (BD Biosciences). SKOV3ip1 tai RMG1 soluja (1 x 10

5 solua /kuoppa) ympättiin yläkammiot 0,1% BSA /DMEM, ja inkuboitiin samassa alustassa, joka sisälsi IL-6, kuten kemoattraktantti alakammiossa 72 h.Thereafter , suodattimet kiinnitettiin ja värjättiin Carazzi hematoksyliinillä ratkaisu. Noninvading solut poistettiin vanupuikolla, ja tunkeutuvat solut alapuolella suodattimen laskettiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia. Viisi kiertoradan mikroskooppikentäs- kustakin suodattimen valittiin satunnaisesti. Yhteistyössä kulttuuri kokeissa yhtä paljon ensisijainen soluja ympättiin alakammiossa kuin kemoattraktantti.

Entsyymi immunosorbenttimääritys (ELISA) B

kvantitatiivinen määritys ihmisen VEGF-A, SKOV3ip1-soluja (1 x 10

5 solua) viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa läsnä ollessa tai ilman IL-6: ssa 72 tuntia. Anti-IL-6R-vasta-ainetta (10 ug /ml) tai vastaava määrä kontrolli-IgG oli samanaikaisesti sovellettu. Sen jälkeen, ilmastoitu elatusaineet kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Ihmisen VEGF-A Platinum ELISA Kit (eBiosecience, sandiego, CA) käytettiin pitoisuuden määrittämiseksi VEGF-A mukaisesti valmistajan protokollan, joiden herkkyys on 7,9 pg /ml. Sillä kvantitatiivinen määritys ihmisen IL-6: n tai ihmisen sIL-6R, 1 x 10

5 SKOV3ip1 parit ja soluja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa 72 h, ja nämä pitoisuudet viljelyväliaineessa määritettiin käyttäen ihmisen IL- 6 ELISA Ready-SET-GO herkkyydellä 2 pg /ml tai ihmisen sIL-6R Instant ELISA (eBioscience) herkkyydellä 10 pg /ml.

eristys primaarisoluja munasarjasyöpä askites

Patient näytteet saatiin kirjallinen suostumus mukaisesti Osakan yliopistollisen sairaalan eettisen komitean vaatimuksia ja Helsingin julistuksen. Askites kerättiin aseptisesti, ja solut eristetään tavanomaisin Ficoll-Paque tiheys-gradientti (Amersham Biosciences, Uppsala, Ruotsi). Sen jälkeen CD11 positiivinen (CD11

+) solujen sekä CD14 positiivinen (CD14

+) solut puhdistettiin positiivinen valinta käyttäen magneettisia soluerotte- (MACS) tekniikka (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa). Lopuksi CD11

– soluja, CD11

+ CD14

– soluja ja CD11

+ CD14

+ solut kerättiin. Soluja viljeltiin 20% FBS RPMI 1640-väliaineessa ja käytettiin kokeissa kohtien 2 3

Fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS)

solun pinnan värjäytyminen, yksisoluiset suspensiot inkuboitiin fykoerytriini- (PE) konjugoidulla anti-CD11b monoklonaalinen vasta-aine (ICRF44) (BD Biosciences), allofykosyaniini (APC) konjugoidulla anti-CD14 monoklonaalinen vasta-aine (M5E2) (BD Biosciences), Alexa Fluor-488 konjugoitu anti-CD68 monoklonaalinen vasta-aine (y1 /82A) (Miltenyi Biotec) ja eFluor-450 konjugoitua anti-CD206-vasta-aineen (19,2) (eBioscience, San Die mennä, CA) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan 1% BSA /PBS: ssä. Värjätyt solut ajettiin FACSCanto II virtaussytometrillä (BD Biosciences). Tiedot analysoitiin käyttämällä FlowJo ohjelma (TreeStar, Ashland, OR).

Tilastollinen

Statcel versio 3 (OMS-Publishing Inc., Saitama, Japani) ja JMP versio 10.0.2 (SAS Institute Japan Ltd., Tokio, Japani) käytettiin tilastollisiin analyyseihin. Erot analysoitiin käyttämällä Mann-Whitneyn U-testiä. Eloonjäämisennusteet laskettiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmää, ja vertailun ryhmien analysoitiin käyttäen log-rank-testi. Monimuuttujalähettimet analyysi suoritettiin käyttäen Coxin suhteellisen vaarat regressiomallin. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä kaksisuuntaisia ​​

P

0,05 tasolla.

Tulokset

korkea IL-6-reseptori on itsenäinen prognostinen markkeri munasarjasyöpä potilaiden

Jotta voitaisiin arvioida terapeuttista potentiaalia IL-6R, loimme TMA dioja 94 japani munasarjasyöpä potilaalle. Potilaiden ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. IL-6R: n ekspressio arvioitiin immunohistokemiallisesti ja kukin näyte sijoitettiin perustuu positiivisten solujen prosenttiosuuden ja intensiteetti värjäystä. Tyypillisesti kirkas kalvo värjäytymistä nähtiin tapauksissa positiivisen IL-6R ilmentymisen (Fig. 1A). 94 potilasta, 32 (34,0%) osoitti ”high” IL-6R ilmaisu, mukaan lukien 14 34 vakavien (41,1%), 3 16 mucinous (18,8%), 1 11 endomet- (9,1%), 10 20 selkeitä solu (50,0%) ja 4 13 muuta (30,8%) munasarjojen karsinoomat. Sitä vastoin 62 (66,0%) tapauksista ilmaisi ”pieni” tai negatiivinen IL-6R ilme. Niistä munasarjasyöpäpotilaalle, jotka olivat ”high” IL-6R ilme osoitti merkittävästi huonompi PFS kuin ne, jotka olivat ”pieni” tai negatiivinen IL-6R lauseke (PFS, 23,8 vs. 32,3 kuukautta,

P

= 0,0029, Fig. 1 B). Samoin, IL-6: n ilmentyminen arvioitiin immunohistokemialla ja kukin näyte sijoitettiin. Sytoplasminen värjäys havaittiin tapauksissa positiivisen IL-6 ilmentymistä (Fig. 1 C). 94 potilasta, 39 (41,4%) osoitti ”high” IL-6 lauseke, mukaan lukien 13 34 vakavien (38,2%), 8 16 mucinous (50,0%), 5 11 endomet- (45,5%), 11 20 selkeitä solu (55,0%) ja 2 13 muuta (15,4%) munasarjojen karsinoomat. Sitä vastoin 55 (58,5%) tapauksista ilmaisi ”pieni” tai negatiivinen IL-6 ilme. Vaikka ennusteen arvioinnissa IL-6 tutkittiin Kaplan-Meier menetelmä ja vertailut suoritettiin käyttäen log-rank testi, IL-6 lauseke ole osoittanut mitään merkittävää korrelaatiota ennusteita potilaiden (Fig. 1 D). Jotta monimuuttuja-analyysi suoritettiin valita malli selviytymisen useita ennustajia. Ikä, FIGO vaiheessa histologinen tyyppi, jäljellä kasvain ajankohtana leikkaus, ”korkea” IL-6 ilmaisun ja ”korkea” IL-6R ilmentyminen kirjattiin tässä mallissa. Lopullinen malli mukana ”high” IL-6R ilmaisun mutta ei IL-6 lauseke on merkittävä itsenäinen ennustaja alennettua PFS munasarjasyöpää sairastavilla potilailla (

P

= 0,017,

HR

; 2,388 ( 1,171-4,895), taulukko 2) yhdessä kliinisessä vaiheessa ja leikkauksia.

(A) immunohistokemiallinen värjäys kudossiruina kanssa pahanlaatuinen munasarja- kudosleikkeiden. Edustavalla neljästä eri munasarjasyöpiä värjättiin käyttäen anti-ihmisen IL-6R-vasta-aineen ja pisteytetään ”Low” tai ”High”. Jälkeisten monimutkaista korionamnioniitin käytettiin positiivisena kontrollina. Nuolet osoittavat kalvomainen värjäytymistä trofoblastit. Negatiivinen kontrolli on nonimmune seerumit. (B) IL-6-reseptorin ilmentyminen korreloi huonon ennusteen potilailla, joilla on munasarjasyöpä. Kaplan-Meier -käyrät progression free survival (

jäljellä

) ja kokonaiseloonjääminen (

oikeus

) munasarjasyöpä potilasta hoidettiin Gifu yliopistollisen sairaalan (n = 94). (C) edustaja alueilla neljän eri munasarjasyövistä värjättiin käyttäen anti-humaani IL-6-vasta-aineen ja pisteytetään ”Low” tai ”korkea”. Jälkeisten monimutkaista korionamnioniitin käytettiin positiivisena kontrollina. Nuolet osoittavat sytoplasminen värjäytyminen villous mesenkyymisolujen. Negatiivinen kontrolli on nonimmune seerumit. (D) IL-6 ilmaisua ei vaikuttanut ennusteen munasarjasyöpäpotilaalle. Kaplan-Meier -käyrät progression free survival (

jäljellä

) ja kokonaiseloonjääminen (

oikeus

) potilaista. Alkuperäinen suurennos, × 200. Asteikkoviiva kussakin paneelissa edustaa 50 um.

IL-6-reseptoriin, mutta ei IL-6 on erittäin ilmaistaan ​​munasarjasyövän solulinjoissa

Koska ”high ”IL-6R: n, mutta ei IL-6 vaikuttaa ennusteet munasarjasyöpäpotilaalle, me määrällisesti ilmaukset IL-6 ja IL-6R: n munasarjasyövän solulinjoissa reaaliaikaisella RT-PCR: llä. Ilmentymisen taso ensisijainen OSE soluja asetettiin 1,0. Vaikka vain kaksi (RMG-1 ja OVISE) seitsemän solulinjat ilmensivät suuria määriä IL-6 verrattuna OSE solut (Fig. 2A), kuusi (RMUG-S, RMG-1, OVISE, A2780, SKOV3ip1 ja OVCAR-3 ) seitsemän solulinjat osoittivat selvästi korkea IL-6R: n (11,0-270,1 kertainen) (Fig. 2B). Samanlaisia ​​suuntauksia varmistettiin Western Blot (Fig. 2C). Membraaniin sitoutunut muoto IL6R ilmentyminen rajoittuu pitkälti hepatosyyttien, immuunijärjestelmän solut ja jotkut kasvainsolut. [6] Näin ollen liukoisen isoformin (sIL-6R) pidetään tärkeä rooli tulehdus- yhteyksissä antamalla kohonnut vasteena IL -6 kaikissa solutyypeissä. Sen määrittämiseksi, onko munasarjasyövän solulinjoissa pääasiassa ekspressoivat täyspitkän (IL-6R) tai differentiaalisesti silmukoituneet isoformi, josta puuttuu transmembraanidomeeni (sIL-6R), olemme suunnitelleet alukkeet, jotka koodaavat liitos vauriot ja suoritettiin RT-PCR: llä (kuvio . 2D). Kaikissa solulinjoissa, paitsi OSE, olemme huomanneet, että sekä IL-6R: n ja sIL-6R: ää ilmennetään. Ekspression sIL-6R vahvistettiin edelleen kvantitatiivinen ELISA: lla. Kaikki munasarjasyövän testatut solulinjat on tuotettu tietty määrä sIL-6R (6,3-94,0 pg /10

5-solut, Fig. 2E). Siten käsittely IL-6 (100 ng /ml) yksinään merkittävästi indusoi fosforylaatiota STAT3, keskeinen alavirran molekyylin IL-6 /IL-6R-signalointireitin samoin kuin ERK: in SKOV3ip1-soluissa (kuvio. 2F), ja lisäksi eksogeenisen sIL-6R: n ei vaadita näiden fosforylaatiot. Esikäsittely anti-IL-6R-vasta-aine inhiboi näiden reaktioiden annoksesta riippuvalla tavalla, mikä osoittaa, että IL-6R on erittäin ilmaistaan ​​tietyntyyppisten munasarjasyöpäsoluja ja että IL-6 /IL-6R-signalointia kohdistaa parakriinisellä tavalla nämä solut, vaikka solut eivät tuota IL-6.

Reaaliaikainen RT-PCR: llä IL-6 (A) ja IL-6R (B). Kokonais-RNA kerättiin seitsemän eri munasarjasyövän solulinjoissa käyttäen TRIzol ja altistettiin reaaliaikaisen RT-PCR: llä. 2

-ΔΔCT menetelmää käytettiin laskemaan suhteellinen runsaus suhteessa GAPDH ilmaisua. Suhteelliset kertainen erot suhteessa ensisijaisen munasarjojen pinnan epiteeli (OSE) esitetään. (C) Western Blot. Solulysaateista seitsemän munasarjasyöpäsoluja erotettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin vastaisella vasta-aineella IL-6 ja IL-6R: ään. p-Actin käytettiin latauskontrollina. (D) RT-PCR: llä. RNA kerättiin ja ilmaisuja täyspitkän IL-6R: n (IL-6R) ja liukoista IL-6R: n (sIL-6R) ilmentyminen munasarjasyövän solulinjoissa tutkittiin. PCR-olosuhteet olivat kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. (E) ELISA-määritystä ja sIL-6R. Seitsemän munasarjasyöpä soluja (1 x 10

5 kutakin) maljattiin 24-kuoppalevyille ja niitä viljeltiin 1 ml seerumia 72 tuntia. Esikäsitelty väliaine kerättiin ja pitoisuus ihmisen sIL-6R mitattiin ELISA: lla. Kokeet toistettiin kolme kertaa. ei määr .; ei havaittu. (F) Western Blot. Eksogeeninen hoito IL-6 aktivoi IL-6 /IL-6R-signalointi munasarjasyövän solulinjoissa. SKOV3ip1-soluja stimuloitiin IL-6 (100 ng /ml) 30 minuutin ajan tai ilman esikäsittelyä käyttäen Ranti-IL-6R-vasta-ainetta (1-100 ug /ml) ei-immuuni-IgG kontrollina. Solulysaatit otettiin talteen ja sama määrä solulysaateista (30 ug) erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin anti-fosforyloitua STAT3 (p-STAT3) vasta-aineella ja anti-fosforyloitu p44 /42 MAPK: n (p-ERK1 /2) vasta-aine. Kalvot riisuttu ja uudelleenhybridi- soitiin kanssa vasta havaitsemiseen koko muotoja proteiinin. Blots edustavat kolmea koetta.

Eksogeeninen hoito IL-6 indusoi, invaasion ja VEGF: n tuotannon munasarjasyöpäsoluja

Koska IL-6 /IL-6R-signalointi on tiedossa toimimaan useita tapoja lisätä syövän etenemiseen, me tutki, eksogeeninen hoidossa IL-6 lisää leviämisen, invaasio ja VEGF liittyvät angiogeneesin munasarjasyöpäsoluja. Tätä tarkoitusta varten SKOV3ip1 soluja, jotka eivät ilmennä havaittavissa proteiinia tasoja IL-6 ja RMG-1-solut, jotka ilmentävät tiettyä tasoa IL-6 käytettiin. Molemmat solulinjat on korkea IL-6R: n ekspressio on vahvistettu kuvion. 2A. Eksogeeninen hoito IL-6 vahvasti aiheuttama soluinvaasiota munasarjasyövän solujen annoksesta riippuvaisella tavalla (IL-6 100 ng /ml; SKOV3ip1, 4,27 ± 0,53 kertaiseksi, RMG-1, 2,99 ± 0,46-kertainen), kun taas induktio oli lähes täysin inhiboi esikäsittely anti-IL-6R-vasta-ainetta (Fig. 3A). Lisäämättä eksogeenistä sIL-6R ei edistää hyökkäyksen munasarjasyövän indusoiman IL-6, mikä viittaa siihen, että IL-6RS (IL-6R: n ja sIL-6R), joka tuotetaan syöpäsolut ovat tarpeeksi aktivoimaan IL-6 /IL -6R signalointia. Eksogeeninen hoito IL-6 myös merkittävästi parannettu leviämisen sekä munasarjasyövän solujen annoksesta riippuvaisella tavalla (IL-6 100 ng /ml; SKOV3ip1, 1,60 ± 0,29-kertaiseksi, RMG-1, 1,64 ± 0,39-kertainen), ja esikäsittely anti -IL-6R-vasta lähes lakkautti nämä parannukset (Fig. 3B). Seuraavaksi tutkimme VEGF tuotantoa SKOV3ip1 soluista. Eksogeeninen hoito IL-6 (100 ng /ml, 72) merkittävästi stimuloi VEGF tuotantoa syöpäsoluista (kontrolli; 239,4 ± 16,3 pg /1x 10

5-solut, IL-6, 322,4 ± 11,8 pg /1×10

5-solut) ja esikäsittelyn syöpäsolujen anti-IL-6R-vasta-aine inhiboi merkittävästi VEGF: n tuotantoa (kuvio. 3C). Yhdessä eksogeeninen käsittely IL-6 indusoitua proliferaatiota, invaasion ja VEGF tuotantoa munasarjasyöpäsoluja, vaikka ne eivät ilmennä IL-6, ja yhtäaikainen käsittely liukoista IL-6R ei tarvittu. Nämä tiedot osoittivat, että tietyntyyppisissä munasarjasyöpäsoluja, IL-6 /IL-6R signalointi voi lisätä syövän etenemisen parakriinisesti.

(A) Matrigel invaasiomääritys tehtiin käyttämällä modifioitua Boyden kammion järjestelmä . 1 x 10

5 SKOV3ip1 (

vasemmalle

) tai RMU-S (

oikeus

) soluja saattaa alkuun kammion seerumivapaassa väliaineessa ja annettiin hyökätä 72 tuntia . Eri pitoisuuksia IL-6 (1-100 ng /ml) tai 60 ng /ml sIL-6R levitettiin pohjaan kammio kemoattraktantti. 10 ug /ml anti-IL-6R-vasta-aineen tai ei-immuuni-lgG oli co-käsitelty. Non-tunkeutuvat solut poistettiin vanupuikolla, ja valtaavat solujen alapuolella suodattimen laskettiin. Suhteellinen määrä tunkeutumaan solujen suhteen kontrolli (ei IL-6-käsittely) on esitetty. (B)

In vitro

soluproleferaatiomäärityksessä. 1 x 10

4 solut SKOV3ip1 (

vasemmalle

) tai RMG1 (

oikea

) solut maljattiin 24-kuoppalevyille 10% FBS /DMEM: ssä 24 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin seerumittomassa väliaineessa läsnä ollessa tai ilman eri konsentraatioiden IL-6 (1-100 ng /ml) kanssa tai ilman anti-IL-6R-vasta-aineen tai ei-immuuni-IgG-ohjaus 72 tuntia. Soluproliferaatiota arvioitiin modifioidun MTS-määritystä. Soluproliferaatiota ilmaistiin suhde elävien solujen lukumäärään. (C) ELISA-määritys VEGF-A. 1 x 10

5 SKOV3ip1 solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja viljeltiin 2 ml seerumia läsnä ollessa tai poissa ollessa 100 ng /ml IL-6: ssa 72 tuntia. Anti-IL-6R-vasta-aineen tai kontrolli-IgG: tä samanaikaisesti käsiteltiin. Esikäsitelty väliaine kerättiin ja pitoisuus ihmisen VEGF-A mitattiin ELISA: lla. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmen rinnakkaisen. N.S. .; ei merkittävää, *; P 0,05, **; P 0.01.

CD11

+ CD14

+ solujen parannettu invaasion ja leviämisen munasarjasyöpäsoluja kautta IL-6-tuotannon

Koska IL-6 /IL-6R signalointi P P