Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

kartta kattavasti metylaatio tilan CpG sivustojen sisällä HPV16 pitkä säätelyalue (LCR) HPV-positiivisten syöpäsolujen ja tutkia tarkemmin vaikutusten metylaatiostatuksen HPV16 LCR solun bioaktiivisuuden ja E6 ja E7 ilme. Lisäksi, analysoida metylaatiostatuksen LCR HPV-positiivisten nielun okasolusyöpä (OPSCC) potilasta.

Menetelmät ja materiaalit

metylaation HPV16 LCR UM-SCC47, CaSki ja SiHa solut ja HPV16-positiive OPSCC näytteitä havaittiin bisulfiitti-sekvensointi PCR ja TA kloonaus. Solujen käsiteltiin 5-atsa-2′-deoksisytidiinin ja E6 ja E7 pudotus, MTS ja trypaanisininen värjäys, anneksiini-V: n ja 7-AAD värjäys, ja prodidium jodidia käytettiin arvioimaan solukasvun ja solujen proliferaatiota ja apoptoosia, ja solusyklin pysähtymiseen, vastaavasti. E6- ja E7-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä ja immunosytokemia, vastaavasti.

Tulokset

hypermetylaation tilan LCR UM-SCC47 (79,8%) ja CaSki-solujen ( 90,0%) ja unmethylation asema LCR SiHa- soluissa (0%) havaittiin. Kun demetylaation, solut eri metylaatiotasoilla vastasi eri kasvun aikana, apoptoosin, ja solusyklin pysähtymisen sekä niihin liittyvät E6- ja E7 ilme. In HPV16-positiivisia OPSCC potilailla metylointi hinnat olivat 9,5% koko LCR alueella, 13,9% 5′-LCR, 6,0% E6 tehostajana, ja 9,5% p97-promoottori, ja hypermetylaatiota p97-promoottorin todettiin osajoukossa tapauksissa (20,0%, 2/10).

päätelmät

tutkimus paljasti kaksi eri metylaatiotasoilla LCR in HPV16-positiivisia syöpäsolujen ja OPSCC potilailla, joka voi edustaa eri karsinogeneesi mekanismit HPV-positiivisten syöpiä soluja. Demetyloimalla meCpGs vuonna HPV16 LCR voisi olla potentiaalinen kohde alaryhmään HPV16-positiivisia potilaita, joilla pään ja kaulan levyepiteelisyöpä.

Citation: Zhang C, Deng Z, Pan X, Uehara T, Suzuki M, Xie M (2015) vaikutukset metylaatiostatuksen CpG sivustot sisällä HPV16 Long Ohjaus Region on HPV16-Positiivinen pään ja kaulan syövän solut. PLoS ONE 10 (10): e0141245. doi: 10,1371 /journal.pone.0141245

Toimittaja: Scott M. Langevin, University of Cincinnati College of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 05 toukokuu 2015; Hyväksytty: 05 lokakuu 2015; Julkaistu: 28 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Natural Science Foundation of China, (81372477 MX); (https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/), Japanin Society for Promotion of Science (KAKENHI 26462610 MS ja KAKENHI 26462611 on ZD); (https://www.jsps.go.jp/english/), Specialized Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen korkeakoulu-, Kiina (20114433110001 MX); (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm), Natural Science Foundation of Guangdong, Kiina (2014A030310411 ja ZD), (https://www.gdstc.gov. cn /eng /mission.html), ja avustusta Science and Technology Development Center, opetusministeriö Kiinan (20134433120021 ja ZD); (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Jatkuva infektio korkean riskin ihmisen papilloomaviruksen (HPV) on perustettu etiologinen tekijä lisäksi liiallinen tupakan ja alkoholin kulutuksen pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [1-4]. Tämä koskee nielusta levyepiteelisyöpä (OPSCC) erityisesti; 50-70% OPSCC potilaista ovat sairastuneet HPV16 [2-7]. E6 ja E7 ovat kaksi tärkeintä virus onkoproteiineja ylläpidosta vastaavan HPV-välitteisen pahanlaatuisiksi niiden vuorovaikutusta useita tärkeitä solun proteiinien, kuten p53 ja pRb [8,9]. E2-proteiini voi edistää useita biologisia prosesseja kuten viruksen transkription ja viruksen DNA: n replikaatiota [10-13], ja aiheuttaa kasvun pysähtymisen ja apoptoosin kautta sen vaikutuksia ilmaus E6 ja E7 ja muita virusproteiineja [14-16]. Kaikki nämä toimet E2 ovat riippuvaisia ​​sen kyky sitoutua viruksen DNA-genomi, erityisesti varhaisen promoottorin p97 tietyissä E2-sitoutumiskohtiin (E2BSs), joka sijaitsee pitkän säätelyalue (LCR) HPV-genomin [15,17] . Tehostaja, joka sijaitsee 5′-pään p97-promoottorin, edistää myös sääntelyn E6 ja E7 ilmentyminen [12].

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että integraatio virusgenomien isännän genomiin on usein liittyviä häiriöitä E2-geenin, joka johtaa hallitsemattomaan ilmentymisen E6 ja E7 onkoproteiineja [15,18,19], Wilson et ai havaittu merkittävää rikastumista mahdollisista integraation sivustojen E2-aluetta, mikä viittaa siihen, että E2 oli myös yleinen sijainti häiriöitä kun integroitumisen isännän genomiin HNSCC [19]. Kuitenkin sarja tutkimukset osoittivat, että monet pahanlaatuinen HPV: hen liittyvän karsinoomien puuttuu integroitu virus- genomin kopioiden tai sisällyttää integroituja virusgenomien mukana episomaalisia virusgenomien. Vaikka jotkut virusgenomeja täysin integroitu, E2-geeni voi olla ehjä ja useita kopioita HPV-genomin säilytetään yhdessä matriisia, jota kutsutaan myös ”concatemers”, kuten HPV16-tartunnan CaSki-solulinja [20]. Näin ollen on pyritty ymmärtämään muita mekanismeja, kuten metylointi tai sekvenssin vaihtelut LCR, jotka säätelevät E6 ja E7 ilmentyminen [7,21,22].

DNA: n metylaatio viittaa siirtoon metyyliryhmä sytosiiniksi tähteet, jotka tavallisesti johtaa geenien joko fyysisesti inhiboimaan transkriptiotekijöiden tai kromatiinin rakenteen remodeling [15,23]. Metylaatiostatuksen HPV16-genomin, joka sisältää 15-dinukleotidi CpG sivustoja LCR, kohdunkaulan syövän solulinjoissa ja kliinisistä näytteistä on analysoitu, mutta roolit HPV-genomin metylaation karsinogeneesis- edelleen epäselviä [24-29]. Lisääntynyt metylaatio HPV genomi on havaittu johdonmukaisesti korkeintaan sivustoja kohdunkaulan syöpä tai korkea-asteen CIN-muutos (CIN) verrattuna alhainen CIN [24,25]. Metylointi HPV-genomin on tullut biomarkkerina syövän etenemiseen kohdunkaulan syövän [15,24,30,31]. Lisäksi jotkut tutkijat raportoivat, että hypometylaatio asema CaSki solujen indusoiman DNA: n metylaatio estäjä vähensi solujen elinkelpoisuuden mutta ei vaikuttanut bioaktiivisuutta HeLa-soluissa, jotka sisältävät täysin metyloimattomia HPV-18 genomin [27], joka inspiroi meitä tutkimaan mahdollisia uusia vaikutuksia HPV metylaatiostatuksen HPV-positiivisten syöpiä.

Toistaiseksi ei kuitenkaan ole tietoa vaikutuksista metylaation vaihtelun ja sen sääntelyn mekanismi HNSCC soluissa. Lisäksi koska metyloitu CpG (meCpG) on mahdollisesti palautuvia, demetyloidaan meCpGs HPV-genomin voi olla arvokas kohde syövän hoidossa. Tämän aukon osaamiseen, käytimme HNSCC soluja ensimmäisen kerran kartoittaa kattavasti metylaatiostatuksen CpG sivustojen sisällä LCR, ja tutkia tarkemmin vaikutukset demetyloimalla HPV16 LCR solun bioaktiivisuuden ja E6 ja E7 ilme. Lisäksi hyvin harvat tutkimukset tutkitaan HNSCC yksilöitä ja niiden tulokset ovat ristiriidassa [19,32,33]; siksi osoitti metylaatiostatuksen LCR HPV-positiiviset OPSCC potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dc) käsittely

HNSCC solulinja UM-SCC47, joka kehitettiin potilaalta on sivuttainen kielen syöpä [34] (lahja professori Thomas E. Carey, University of Michigan), ja kohdunkaulan syövän solulinjoissa CaSki ( ECACC, Salisbury, UK) ja SiHa (ATCC, Tokio, Japani) on tunnettu tässä tutkimuksessa (taulukko 1). Integroitu HPV16-genomin havaittiin UM-SCC47, CaSki, ja SiHa solulinjoja, jotka sisältävät 15, 600, ja 1-2 kopiota HPV16-genomin, vastaavasti [35,36]. Soluja viljeltiin RPMI1640-(UM-SCC47 ja CaSki) tai EMEM (ja SiHa), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 100 IU /ml penisilliiniä /streptomysiiniä. Demetylaatiota reagenssi 5-atsa-dc (Sigma, St. Louis, MO) liuotettiin DMSO: hon 50 mM ja varastoidaan erinä -80 ° C: ssa käyttöön asti. Eksponentiaalisesti kasvavat solut käsiteltiin 5-atsa-dc eri pitoisuuksilla (0,1-5 pM) ja 72-120 h. Sisältävä elatusaine juuri valmistettu 5-atsa-dc korvattiin 24 tunnin välein.

Kliiniset näytteet

Kasvain kudokset kerättiin saaneilla potilailla laitoksella Korva-, Head ja Neck Surgery, University of the Ryukyus joulukuun 2008 ja toukokuun 2011 eettinen komitea University of Ryukyus erikseen hyväksy tätä tutkimusta, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. HPV16 infektio määritettiin PCR-monistus ja sekvensointi kuten raportoitu aiemmin [5,37]. Näytteet 10 edustaja OPSCC potilaalla HPV16 tartunnan tutkittiin tässä tutkimuksessa (taulukko 2).

bisulfiittimodifikaatio PCR-monistus, TA kloonaus ja DNA-sekvensointi

DNA: n eristämiseksi soluista ja kudosnäytteet suoritettiin käyttäen Gentra Purification Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA), kuten on raportoitu aiemmin [5], niin DNA (1-2 ug) oli bisulfiitti-muunnetaan käyttämällä EpiTect

® Plus bisulfiittimodifiointi Kit (QIAGEN, Valencia, CA) valmistajan protokollan.

muunnettua DNA monistettiin 3 amplikoneihin kanssa bisulfiitti-sekvensointi PCR (BSP) pohjamaali määritykset ja kutsutaan BSP-1, BSP-2, ja BSP-3 (S1 Taulukko). UM-SCC47 ja jotkut kudosnäytteistä, jotka olivat negatiivisia PCR-monistus käyttäen alukesarjoja BSP-1 tai BSP-2, otimme alukesarjoja BSP-5 ja BSP-6 sijaan (S1 taulukko). BSP suoritettiin 25 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 0,2 mM kutakin 4 dNTP: tä, 2 mM MgCI

2, 10 pmol kutakin aluketta, 1,25 yksikköä AmpliTaq-DNA-polymeraasia (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), ja 300 ng bisulfiitti-modifioitua DNA: ta. BSP-olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 45 sykliä 95 ° C 1 min, 54 ° C 1 min, ja 72 ° C: ssa 2 minuutin ajan, ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 min. Kuten raportoitu aiemmin [5], PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä Wizard

® SV Gel ja PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI) ja kloonattiin sitten pCR ™ 4-TOPO

® vektori (Invitrogen , Carlsbad, CA) ja sekvensointiin. Kunkin amplikonin, vähintään 6 yksittäistä kloonia sekvensoitiin käyttämällä ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Metylaatiospesifinen PCR

Perättäiset PCR suoritettiin analysoida koko metylaatiostatus LCR ja metylaation vaihtelua jälkeen demetylaation hoidon. Käytetyt alukkeet sisäkkäistä PCR esitetään S1 taulukossa, ja niiden tuotteet kattavat 7 metyloituja /metyloitumattoman (M /U) CpG sivustoja 5′-LCR ja tehostaja-alue. Bisulfiitti-modifioitu DNA monistettiin ensin PCR: llä BSP-6 alukesarjaa. BSP suoritettiin 25 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 0,2 mM kutakin 4 dNTP: tä, 2 mM MgCI

2, 10 pmol kutakin aluketta, 1,25 yksikköä AmpliTaq-DNA-polymeraasia (Applied Biosystems), ja 100 ng bisulfiitti-modifioitu DNA: ta. BSP-olosuhteet olivat 95 ° C 5 min, mitä seurasi 25 sykliä 95 ° C: ssa 60 s, 54 ° C: ssa 60 s, ja 72 ° C: ssa 2 minuutin ajan, ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 min. Sitten tuote ensimmäisen kierroksen PCR tehtiin toisen kierroksen monistus käyttäen metylaatiospesifinen PCR sarjaa (S1 taulukko), niin metyloidut ja metyloitumattomat sekvenssit voidaan monistaa erikseen. PCR suoritettiin 20 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 0,2 mM kutakin 4 dNTP: tä, 2 mM MgCI

2, 10 pmol kutakin aluketta, 1,0 yksikköä AmpliTaq-DNA-polymeraasia (Applied Biosystems), ja 3 ui tuote ensimmäinen kierros BSP. PCR-olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 25 sykliä 95 ° C: ssa 40 s, 58 ° C: ssa 40 s, ja 72 ° C 1 min, ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 min.

knockdovvn E6 ja E7

Äänenvaimennin

® Valitse siRNA kohdistaminen HPV16 E6 ja E7 (5′-GUA UGG AAC AAC AUU AGA A-3 ’), Äänenvaimennin

® siRNA kohdistaminen GAPDH (positiivinen kontrolli), ja salattu siRNA (negatiivinen kontrolli) saatiin Ambion (Life Technologies Japan, Tokio, Japani). SiRNA transfektiota solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (1,0 x 10

5 solua /kuoppa). Yli yön elpyminen, solut transfektoitiin yksitellen 60 nM siRNA käyttäen Lipofectamine RNAiMax

® Reagent (Invitrogen) mukaan valmistajan protokollaa. Solut altistettiin kokonais-RNA uuttamalla 72 h transfektion jälkeen, ja kasvun inhibitio, apoptoosi, ja solusyklin pysähtymisen analysoitiin 96 h transfektion jälkeen.

Detection proliferaation ja apoptoosin, ja solusyklin analyysi

havaitsemiseksi kasvun inhibitio, kun demetylaation hoidon, solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaisille levyille (1500 solua /kuoppa). Yli yön elpyminen, soluja käsiteltiin jatkuvasti tuoreeltaan valmistetun 5-atsa-dc päivästä 1 päivä 7. Solujen lisääntyminen eri ajankohtina mitattiin käyttämällä CellTiter 96

® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (MTS; Promega , Madison, WI) ja absorbanssi (OD 490 nm) mitattiin käyttäen microreader (SH-1000; Wakenyaku, Kioto, Japani). Sen jälkeen Knockdown E6: n ja E7, olemme lähinnä keskittyneet lisäkasvun estäminen 96 tuntia. Siten käytimme trypaanisinieksluusiolla solujen kasvun estäminen jälkeen siRNA. Solut ympättiin kolmena rinnakkaisena osaksi 6-kuoppaisille levyille (1,0 x 10

5 solua /kuoppa). 96 h transfektion jälkeen siRNA: iden, solut irrotettiin ja värjättiin 0,4% trypaanisinisellä liuosta, ja kasvun esto voidaan määrittää laskemalla ja vertailemalla väriaine-yksinomaisen solujen ryhmien välillä, jotka on transfektoitu salattu siRNA tai siRNA kohdistaminen E6 tai E7 . Lisäksi kuolleet solut menetyksen jälkeen E6 ja E7 voitaisiin verrata eri ryhmien välillä.

arvioimiseksi apoptoosin, anneksiini-V ja 7-AAD värjäytymistä (Guava neksiini Reagent; Millipore, Hayward, CA) tutkittiin virtaussytometrillä (Guava EasyCyte Plus Flow Cytometer, Millipore). Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (1,0 x 10

5 solua /kuoppa). Yön yli elpyminen, soluja käsiteltiin 5-atsa-dc tai transfektoitu siRNA kuten edellä on kuvattu. Mukaan valmistajan ohjeita, log anneksiini-V-PE ja 7-AAD on näkyvissä x- ja y-akselit cytogram, vastaavasti. Anneksiini V-positiivisten solujen piirretty oikeassa alakulmassa ja oikeassa yläkulmassa neljännesten arvioitiin jo apoptoottisten solujen ja myöhäinen apoptoottiset /kuolleita soluja, tässä järjestyksessä.

Solusyklianalyysiä suoritettiin käyttäen propidiumjodidivärjäys määrittää DNA sisältöä . Soluja käsiteltiin 5-atsa-dc tai transfektoitu siRNA kuten edellä on kuvattu. Keräämisen jälkeen elatusaine, solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja irrottaa. Irrotettu ja kelluvat solut elatusaineeseen ja PBS kerättiin sentrifugoimalla. Supernatantin hylkäämisen jälkeen ja vahvistamisesta soluja jääkylmällä etanolilla, solut värjättiin guava solusyklin reagenssia ja tiedot hankittiin käyttäen guava EasyCyte Plus -virtaussytometrillä. Modfit LT ™ 4.0 ohjelmisto (Verity Software House, Topsham, ME) käytettiin analysoimaan solusyklin tuloksia.

Quantitative real-time PCR

havaitsemiseksi E6 ja E7 ilmentyminen jälkeen 5-atsa -DC hoitoon tai E6 ja E7 pudotus, kokonais-RNA uutettiin soluista ja muunnettiin cDNA: ta on raportoitu aiemmin [36]. β-Actin hyväksyttiin sisäisenä kontrollina; β-aktiini, E6 ja E7 monistettiin käyttäen ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems) ja TaqMan

® PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Foster City, CA), kuten aiemmin on kuvattu [32,36] . Suhteellinen ilmaisuja E6: n ja E7 laskettiin E6 /β-aktiini ja E7 /β-aktiini.

Immunosytokemia

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, joissa steriloidaan peitinlasit alaosassa kaivon ja käsiteltiin 5-atsa-dc, kuten edellä on kuvattu. Sen jälkeen, kun solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 min ajan huoneenlämpötilassa, peitelasit blokattiin 3% H

2O

2 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten peitinlasit tehtiin inkuboimalla yön yli 4 ° C: ssa primaarisen anti-HPV16-E6-vasta-aineen (C1P5, 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) tai anti-HPV16-E7-vasta-aineella (ED17, 1: 100 ; Santa Cruz Biotechnology). Solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (MTM Laboratories AG, Heidelberg, Saksa) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten leikkeet väri-kehitetty 3-3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia 3 minuuttia ja vastavärjättiin hematoksyliinillä.

Tilastollinen

vertailussa kahden ryhmän suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä tai ei- parametriset testit. Ero taajuuksia kahden ryhmän välillä analysoitiin käyttäen Pearsonin χ

2 testiä tai Fisherin testiä. Liitot välinen metylaatiostatuksen ja virusmäärä, ja E2 /E6 kurssi analysoitiin Spearmanin listalla korrelaatio. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia, ja kaikki analyysit suoritettiin SPSS ohjelmisto v12.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Tulokset

Eri LCR metylaatiovyöhykkeiden HPV16- positiivinen syöpä solulinjoja

yhteensä 15 CpG sivustoja sijaitsevat LCR HPV16-genomin, jossa on runsaasti säätelyelementtejä, tutkittiin tässä tutkimuksessa (kuvio 1A ja S1 kuviossa). Koska tämä oli ensimmäinen tarkastelu LCR UM-SCC47 solujen ostimme LCR sekvenssi PCR: llä käyttäen 3 aluketta sarjaa, eli LCR-1, -2, ja -3, kuten on esitetty S1 taulukossa. Koska 2 nukleotidin (nt) mutaatiot (nt7435 ja nt31) muutetaan läsnäolo CpG sivustoja (kuvio 1B ja 1C, ja S1 kuviossa), vain 13 CpG sivustoja arvioitiin UM-SCC47 soluja (S1 kuvio). Tässä tutkimuksessa, UM-SCC47 ja CaSki-solut osoittivat hypermetylaation sisällä LCR (79,8% ja 90,0%, vastaavasti) (kuvio 2A ja 2B). CpG-sivusto (nt7862) sijaitsee E2BS-2 oli suhteellisen hypometyloidut (37,5% vuonna UM-SCC47 ja 12,5% vuonna CaSki-), kun taas CpG sivustojen sisällä E2BSs muuta kuin nt7862 oli hypermetyloitunut UM-SCC47 (97,9%) ja CaSki (100%) soluja. Sitä vastoin kaikki CpG-sivustojen LCR SiHa- solut olivat metyloitumattomia (0/120) (kuvio 2C). Siten SiHa soluja voitaisiin käyttää negatiivisena kontrollina jatkotutkimuksena demetylaation meCpG sivustoja.

A) rakenne HPV16 LCR ja sijainti CpG sivustoja. Transkriptiotekijän sitoutumiskohdat on myös esitetty. B, C) nukleotidi- mutaatiot nt7435 (G → A) ja nt31 (C → T) UM-SCC47 vahingoittuneiden solujen läsnä ollessa CpG-sivustoja.

Kahdeksan yksittäistä kloonia sekvensoitiin tunnistamaan läsnäolo ja muutos jokaisen metyloitua CpG ennen ja jälkeen demetylaation aiheuttama 0,5pM 5-atsa-dc 96 tuntia A) UM-SCC47, B) CaSki-, ja C) SiHa soluja. Täytetyt ympyrät edustavat metyloitu CpG: t (meCpGs), avoimet ympyrät edustavat metyloimatonta CpG: t, ja tähdet edustavat puuttuessa CpG sivustoja. D) metylointi CpG sivustoja kudoksissa. Jokaiselle CpG, 6 kloonit sekvensoitiin niiden läsnäolon tunnistamiseksi ja taajuus meCpG klooneja. Prosenttiosuudet meCpG kloonien on merkitty vasemmalle pystypalkki. Alareunassa luku, kannat CpG sijainti on merkitty.

5-atsa-DC indusoi CpG hypometylaatio sisällä LCR in UM-SCC47 ja CaSki solujen

vahva demetylaation reagenssia, 5-atsa-dc on osoittanut terapeuttista vaikutusta hematologisia pahanlaatuisia sairauksia ja joitakin kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien HNSCC [38]. Esillä olevassa tutkimuksessa hoito 0,5 uM 5-atsa-DC-96 h osoittivat optimaalisen demetylaatio teho (0,1-5 pM testattu) (S2 kuvassa).

Kun 0,5 uM 5-atsa-DC-hoitoa, hinnat meCpGs sisällä LCR in UM-SCC47 ja CaSki solut olivat merkittävästi laski 19,2% (20/104; P 0,001) ja 29,2% (35/120; P 0,001), tässä järjestyksessä, kun taas mitään muutosta ei havaittu SiHa- soluissa (0%, 0/120) (kuvio 2). Mielenkiintoista on, UM-SCC47 soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-dc, ei vain ollut meCpGs promoottorialueella demetyloitunut huomattavasti enemmän kuin 5′-LCR ja tehostaja-alue, (P = 0,038), mutta myös meCpGs sisällä E2BSs oli huomattavasti suurempi demetylaatio vaihtelu (P = 0,025).

LCR demetylaatio vähenee E6- ja E7 ilmentyminen UM-SCC47 ja CaSki solujen

Kun demetylaatio hoidon 0,5pM 5-atsa-dc 96 tuntia, ilmaus E6- ja E7-mRNA oli merkittävästi vähentynyt UM-SCC47 (P = 0,021 ja P = 0,008, vastaavasti) ja CaSki-solujen (P = 0,017 ja P = 0,023, vastaavasti), mutta ei SiHa-soluissa (kuvio 3A ja 3B ). Lisäksi havaitsimme E6- ja E7-proteiinien UM-SCC47 ja CaSki solujen immunosolukemiallisella. E6 ja E7-proteiinit lokalisoitu sytosoliin ja ytimen UM-SCC47 ja CaSki soluja, ja prosenttiosuus värjättyjen solujen ja värjäytymisen intensiteetti oli laskenut huomattavasti demetylaatio (kuvio 3C ja 3D).

demetylointi CpG sivustoja aiheuttama 0,5 uM 5-atsa-dc 96 tuntia laski E6- ja E7-ilmentymisen, joka havaittiin käänteistranskriptio-PCR A) ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR B); E6 ja E7 oli laskenut selvästi UM-SCC47 ja CaSki soluja, mutta ei ollut ilmeisiä muutoksia SiHa soluissa. Arvot (keskiarvo ± SD) saatiin vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. C) E6 ja D) E7-proteiinia jälkeen demetylaation CpG sivustoja havaittiin immunosolukemiallisella; E6 ja E7 onkoproteiineja jaettiin sytoplasmassa ja tumassa UM-SCC47 ja CaSki solujen voimakkaan värjäytymisen intensiteetti (x 100, bar = 100 um), ja molemmat prosenttiosuudet ja intensiteetti värjätyt solut vähenivät selvästi jälkeen demetylaatio (x 100 , bar = 100 um).

hypometylaatio HPV16 LCR vähentää solujen lisääntymistä, lisää apoptoosin, ja indusoi solukierron pysähtymisen uM-SCC47 ja CaSki solujen

tutkittava demetylaation HPV16 LCR 5-atsa-dc vaikuttaa solujen bioaktiivisuutta, analysoimme jakautumista, apoptoosia ja solusyklin pysähtymisen. Kasvun ja fysikaaliset ominaisuudet kaikkien 3 solulinjoja ei ilmeisesti ole muuttunut 2 päivää sen jälkeen, kun 5-atsa-DC-hoitoa. Kuitenkin 4 päivää käsittelyn jälkeen, kasvu UM-SCC47 ja CaSki-solujen inhiboi lähes täydellisesti (kuvio 4A), joka oli mukaisesti optimaalisen hoidon keston ja myöhemmin menetys E6- ja E7-ilmentymisen. Kasvun inhibitio SiHa-soluja, jotka johtuvat 5-atsa-DC-hoidon havaittiin myös, mikä voi liittyä sytotoksisuutta 5-atsa-dc aiheuttama kertynyt sisällyttäminen solun DNA: han [39]; Kuitenkin vaikutus oli vaatimaton verrattuna CaSki- ja UM-SCC47 soluja (kuvio 4A).

A) jälkeen demetylaation CpG sivustoja, solujen kasvu esti voimakkaasti vuonna UM-SCC47 ja CaSki soluja, mutta ei SiHa-soluissa. B) E6 ja E7 ilmentyminen väheni merkittävästi jälkeen siRNA transfektion. C) solujen kasvu inhiboituu 96 h kuluttua E6- ja E7-pudotus. Kaikki tiedot ovat keskiarvoja ± SEM 3 erilliselle kokeelle A) ja C), ja välineet ± SD 3 erilliselle kokeelle B).

Apoptoottiset solut kvantifioitiin anneksiini-V-PE värjäys ja virtaussytometrialla. Jossa demetylaation meCpGs 5-atsa-DC-hoidon, apoptoottisen hinnat UM-SCC47 ja CaSki-solut huomattavasti (P ​​= 0,026 ja P = 0,001, vastaavasti). Lisäksi 5-atsa-dc lisäsi UM-SCC47 ja CaSki solujen pidätettiin aikana S-vaiheen (P = 0,048 ja P = 0,003) ja G2 /M vaiheessa (P = 0,002 ja P = 0,044, vastaavasti) (kuvio 5). Sen sijaan SiHa soluissa, joka on yksi metyloitumaton HPV-genomin, eikä merkittäviä muutoksia apoptoosin tai solusyklin pysähtymiseen S ja G2 /M vaiheissa havaittiin (kuvio 5).

A) jälkeen demetylaation CpG sivustoja, määrä apoptoottisten solujen lisääntynyt merkittävästi UM-SCC47 ja CaSki soluja, mutta ei SiHa soluissa. B) Kun demetylaation CpG sivustoja, solujen määrä pidätettiin aikana sekä S ja G2 /M vaiheiden kasvoi UM-SCC47 ja CaSki soluja, mutta ei SiHa soluissa. Kaikki tiedot ovat keskiarvoja ± SEM 3 erilliselle kokeelle.

Cell bioaktiivisuus muutosten jälkeen demetylaatio hoidon liittyy menetys E6 ja E7 ilmentyminen

Sen määrittämiseksi, onko bioaktiivisuus muutokset seuraavat 5-atsa-dc hoitoon liittyi menetys E6 ja E7 ilmentyminen aiheuttamia demetylaation, transfektoimme 3 solulinjoissa siRNA kaataa E6 ja E7 (kuvio 4B). 96 h transfektion jälkeen, kasvu UM-SCC47, CaSki, ja SiHa-soluja estyi (P = 0,044, P = 0,006 ja P = 0,022, vastaavasti) (kuvio 4C); Lisäksi, apoptoosin (P = 0,026, P = 0,050 ja P = 0,016, vastaavasti) ja G2 /M-vaiheen pysähtymisen (P = 0,027, P = 0,035 ja P = 0,012, vastaavasti) indusoitui (kuvio 6). Nämä havainnot olivat mukaisia ​​vaikutuksia soluihin jälkeen demetylaatio. Tuloksemme viittaavat siihen, että merkittävät bioaktiivisuuden muutoksia jälkeen 5-atsa-dc hoito saattaa indusoida vähentynyt E6 ja E7 ilmentyminen aiheuttamia meCpG demetylaation. On kuitenkin syytä huomata, että dramaattisen kasvun estäminen transfektion jälkeen ehdotti E6 /E7 siRNA mahdollisesti oli off-tavoite vaikutuksia.

A) määrä apoptoottisten solujen kasvoi 96 h kuluttua E6- ja E7 knockdown UM -SCC47, CaSki-, ja SiHa soluja. Solut pidätettiin G2 /M vaihe B) UM-SCC47 ja C) CaSki soluja, ja molemmissa G2 /M ja S vaihetta D) SiHa soluja. Kaikki tiedot ovat keskiarvoja ± SEM 3 erilliselle kokeelle.

Eri metylaatiovyöhykkeiden HPV-positiivisten OPSCC potilaat

Keräsimme yksilöitä 10 OPSCC potilaiden HPV16 tartunnan analyysi niiden LCR metylaation (taulukko 2). Keskimääräinen metylaatio korko on 10 näytettä oli 9,5% koko LCR alueella, 13,9% 5′-LCR, 6,0% E6 tehostajana, ja 9,5% p97 promoottori (kuvio 2D). Yli 70%: n CpG-sivustoja (111/150) oli täysin metyloitumaton, kun taas 26,0% (39/150) oli heterogeenisesti metyloitiin (≥ 1 meCpG klooni). Kaikki CpG kloonit olivat metyloitumattomia at nt7862, joka on linjassa selkeät hypometylaatio tila UM-SCC47 ja CaSki soluja. Kuitenkin toisessa CpG sivustoja, vähintään 1 meCpG klooni havaittiin.

Vaikka otoskoko oli suhteellisen pieni, suoritimme lähempää tarkastelua ja luokitteli metylaation profiilit hypermetylaation ja hypometylaatio. Kaksi potilasta, joilla nielurisojen syöpä (OPSCC-1 ja OPSCC-10) oli hypermetylaation asema (41,6% ja 40,0%, tässä järjestyksessä) että p97-promoottori. Kuitenkin muista potilaista, vain yksittäisiä meCpG klooneja tai kaikki metyloimattoman CpG-kloonien havaittiin, ja keskimääräinen metylaatio oli 4,1% (24/585). Erillinen metylaatio profiileja OPSCC potilaat olivat hyvin samanlaisia ​​kuin metylointi tyyppien HPV-positiivisia syöpäsolulinjoja. Lisäksi olemme analysoineet välisiä metylaatiostatus ja virusmäärä (E6 kappaletta), ja E2 /E6 rate [36]. Kun jätetään 2 tapauksessa (OPSCC-5 ja OPSCC-7) virheellisten havaintojen in sirontakuvaajaan metylointi taajuus p97-promoottorin korreloi positiivisesti E2 /E6 korko (r = 0,759, P = 0,029). Ei kuitenkaan ole merkittäviä assosioitunut metylointi taajuus p97-promoottorin ja virusmäärä (P = 0,220).

Keskustelu

Aiemmat tutkimukset HPV16 LCR metylaation perustuivat pääosin kohdunkaulan soluissa ja kliinisistä näytteistä. Kun rekombinaatioon solun genomiin, metylaatiotilan HPV16-genomin voidaan muuttaa ja riippuu tyypistä integrointitapahtumassa ja luultavasti virusmäärä [30]. Esillä olevassa tutkimuksessa, HPV16 LCR oli hypermetyloitunut kohdunkaulan CaSki solujen integroituneena peräkkäin HPV16-genomi (tyypin 2 integrantin) ja metyloitumaton SiHa- solujen integraatiota yksittäisten HPV16 genomien (tyypin 1 integrantti-). Nämä löydökset olivat linjassa tuloksia aiempien tutkimusten [7,15,25,32]. Ensin tunnistetaan HNSCC UM-SCC47 solut, jotka sisältävät koskemattoman E2-geenin HPV16-genomin ja hypermetyloitunut LCR kohdunkaulan CaSki-soluja, joissa HPV-genomeja on integroitu solun genomiin yhdessä taulukoiden [20]. Metyloinnin E2BSs in HPV16 LCR korreloi ilmentymisen taso onkogeenisten E6 ja E7, ja demetylaation HPV16 LCR UM-SCC47 solujen tukahdutettu E6- ja E7-ilmentymisen, esti leviämisen, ja lopulta aiheutti solusyklin pysähtymisen G2 /M. Tulosten perusteella näyttää, että metylaation HPV16 LCR myös keskeinen rooli viruksen elinkaaren HNSCC soluissa, jotka sisältävät tyypin 2 integrantin HPV16-genomi. Lisäksi metylaatio voidaan myös tulkita vaihtoehtona puolustusmekanismi vaientaa viruksen replikaation ja transkription [40], jotka voivat edustaa uutta mekanismia, jolla HPV-genomi muunnetaan tuottava taudinaiheuttajan uutta karsinogeeni.

on osoitettu, että täysin metyloitu HPV16-genomin transkriptionaalisesti aktiivinen [41], ja aikaisemmat tutkimukset ehdotti, että raskas metylaatio ei tarvita LCR E2BSs vaikuttaa p97-promoottorin aktiivisuus [27,42]. Tukahduttaminen promoottori voi palauttaa normaaliin toimintaan p53 ja pRb, sekä muita tavoitteita E6 ja E7 [43-45]. Lisäksi uudelleen E2 yhdessä joko E6- tai E7 valvonnassa E2-riippumaton promoottoria on käytetty selventämään edelleen toimintoja E6 ja E7 transformoiduissa soluissa [43,45]. Meidän tiedot osoittivat CpG sivustoja 5′-LCR ja promoottorialueen UM-SCC47 solujen, mukaan lukien kaikki E2BSs, metyloitiin edullisesti, ja 5-atsa-DC-demetylaatio oli tehokkaampi varten meCpGs promoottorialueella ja E2BSs kuin muut CpG sivustoja HPV16 LCR in UM-SCC47 soluissa, mikä viittaa siihen, että nämä ratkaisevan sivustoja ja alue voi olla altis metylaatio karsinogeneesissä ja demetylaatio. Kuitenkin CpG on nt7862, joka sijaitsee linkkerialueella välillä tehostajan ja promoottorin, oli taipumus hypometyloidut sekä UM-SCC47 ja CaSki-soluja, sekä OPSCC yksilöitä, joilla on samankaltaisia ​​tuloksia myös raportoitu aiemmin [24,25, 29,30,33]. Tämä viittaa siihen, että CpG voi olla osallisena viruksen replikaation ja sen unmethylation tila on usein säilytetään ylläpitämään viruksen elinkaaressa. Lisätutkimukset ovat tarpeen selittää ilmiön.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että HPV-positiiviset HNSCCs on parempi vaste sädehoidon ja /tai kemoterapian kuin HPV-negatiivinen HNSCCs [46,47].