Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ets-1 on transkriptiotekijä, joka säätelee monien geenien syövän etenemiseen ja kasvaimen invaasio. Se on huono prognostinen merkkiaine rinta-, keuhko-, peräsuolen ja munasarja karsinoomat. Täällä tunnistimme poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP-1) uutena vuorovaikutus kumppani Ets-1. Osoitamme, että Ets-1 aktivoi, jonka suora vuorovaikutus, katalyyttisen aktiivisuuden PARP-1, ja sitten poly (ADP-ribosyyli) räisiä DNA-riippumattomalla tavalla. Katalyyttinen esto PARP-1 parannettu Ets-1 transkriptionaalisen aktiivisuuden ja aiheutti sen massiivinen kerääntyminen solutumissa. Ets-1-ekspressio korreloi lisääntyneeseen DNA-vaurioita, kun PARP-1 oli inhiboitu, mikä johtaa syöpäsolun kuoleman. Lisäksi PARP-1-estäjien aiheuttamaa vain Ets-1 ilmentävien solujen kerääntyä DNA-vaurioita. Nämä tulokset tarjoavat uutta tietoa Ets-1 sääntely syöpäsoluissa ja sen yhteyttä DNA: n korjaukseen proteiineja. Lisäksi meidän havainnot viittaavat siihen, että PARP-1-inhibiittorit olisivat käyttökelpoisia uuden terapeuttisen strategian, joka kohdistuu erityisesti Ets-1-ilmentäviä kasvaimia vastaan.

Citation: Legrand AJ, Choul-Li S, SPRIET C, Idziorek T, Vicogne D, Drobecq H, et al. (2013) taso Ets-1 Protein säädellään Poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP-1) syöpäsoluissa ehkäisemiseksi DNA Damage. PLoS ONE 8 (2): e55883. doi: 10,1371 /journal.pone.0055883

Editor: Rajesh Mohanraj, UAE University, Arabiemiirikunnat

vastaanotettu: 25 syyskuu 2012; Hyväksytty: 03 tammikuu 2013; Julkaistu: 06 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Legrand et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Centre National de la Recherche scientifique (CNRS) ja avustuksia la Ligue contre le Cancer, Comité du Pas-de-Calais. Ministère de la Recherche et de l’Enseignement Supérieur ja Fondation ARC pour la Recherche sur le syöpä tarjosi PhD apurahan Arnaud J. Legrand. CNRS ja Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais’n tarjosi PhD apurahan (BDI) ja Souhaila Choul-li. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ets-1 on perustajajäsen perheenjäsen transkriptiotekijöiden kutsutaan ETS. Tämä perhe on ominaista hyvin säilynyt DNA: ta sitovan domeenin (DBD)

5, joka tunnistaa tietyn DNA-elementtejä, nimeltään ETS-sitoutumiskohtia (EBS), löytyy promoottorit kohdegeenien. Ets-1 ekspressoituu pääasiassa alkion kudoksissa. Se osallistuu fysiologisiin prosesseihin, kuten proliferaatiota, erilaistumista, muuttoliike, invaasio ja apoptoosin [1] – [6]. Ets-1 ilmentyminen on tiukasti säänneltyä aikuisen kudoksissa, ja sen yli-ilmentyminen liittyy usein invasiivisia sairauksia, kuten nivelreuma, munuaiskerästulehdus ja moniin syöpiin [7] – [9]. Patologinen ilmentyminen Ets-1 on osittain vastuussa leviämisen ja invaasion kyvyt syöpäsoluja. Tämä invasiivisuus johtuu geenejä, joita ohjataan Ets-1 ja jotka koodaavat proteaaseja, kuten matriksimetalloproteaaseja kollagenaasi-1 ja stromelysiini-1, tai urokinaasityyppinen plasminogeeniaktivaattori (uPA). Näin ollen, Ets-1 pidetään tällä hetkellä markkerina huonon ennusteen useita syöpiä [10] – [13].

Lisäksi, huolimatta siitä, että kaikki ETS perheen jäsenet jakavat saman DBD, Ets-1 on oma DNA-sitovia ominaisuuksia, jotka ovat tiukasti kontrolloitua varmistaa erityinen biologinen toiminta. Ets-1 estää omaa DNA: ta sitova läsnäolon takia kahden estävän verkkotunnuksia, jotka reunustavat sen DBD [14]. Ets-1 on vuorovaikutuksessa kumppaneiden torjumaan tämän automaattisen eston ja sitoutuvat promoottorien sen kohdegeenien [15]. Joissakin promoottorit, kuten ne, jotka esiintyvät

MMP3

(stromelysiini-1) ja

TP53

geenejä, kaksi Ets-1-molekyylit sitoutuvat kahteen palindrominen EBS erotettiin 4 bp [16] – [18]. Kaikissa tapauksissa, proteiini-proteiini vuorovaikutusten näyttävät olevan kulmakivi Ets-1 sääntelyä.

Lisäksi Ets-1 on myös tiukasti ohjaa translaation jälkeisiä modifikaatioita, kuten fosforylaation, SUMOylation ja ubikitinaatio [7], [19]. Kuitenkin Ets-1 on samaa signalointireittejä monia transkriptiotekijöiden. Siten haasteena on tunnistaa erityispiirteisiin polkuja, jotka ohjaavat toimintaa Ets-1 käyttää niitä terapeuttista kohdentamiseen.

tunnistaa uusia polkuja, me aikaisemmin puhdistettu vuorovaikutusta kumppaneiden Ets-1 käyttäen streptavidiini avattavan määrityksessä. Tämän strategian, olemme osoittaneet välisen funktionaalisen vuorovaikutuksen Ets-1 ja DNA-korjaukseen monimutkaisia ​​DNA-PK [20].

Täällä tunnistettiin poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP-1) uutena vuorovaikutus kumppani Ets-1. PARP-1 on runsas ja kaikkialla läsnä ydin- proteiini, joka katalysoi poly (ADP-ribosyyli) ation (PARylation) käyttäen NAD + substraattina syntetisoida haarautunut poly (ADP-riboosi) polymeerit kohde proteiineihin. PARP-1 näyttelee erilaisia ​​rooleja monissa molekyyli- ja solutason prosessit, kuten DNA-vaurion havaitsemiseen ja korjaamiseen ja chromatin muutos [21]. Vaikka PARP-1 alunperin luonnehdittu DNA korjaus proteiinia, monet viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet sen rooli transkription säätelyyn. PARP-1 on osallisena transkription säätelyyn tekijät, kuten NF-KB: n, AP-2, p53 ja monet muut [22] – [24]. Lisäksi PARP-1 inhibition on tullut uusi terapeuttinen strategia syövän [25]. Mielenkiintoista, PARP-1 esto näyttää olevan tehokas syöpiä, jotka on usein yli-ilmentynyt ETS proteiineja, mukaan lukien munasarja-, eturauhas- ja rintasyöpiä [25]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet välillä on toiminnallinen yhteys PARP-1 ja ETS perheenjäsenten, kuten Ese-1, Fli1, Erg ja Elk-1 [26] – [28]. Samoin Ets-1 voi olla keskeinen säätelijä

parp1

geeni valvomalla promoottori [29]. Aivan äskettäin, kiinnostus tätä toimiva linkki on voimistanut siinä määrin, että se pidetään nyt upouusi terapeuttinen lähestymistapa syövän. Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että ETS fuusioproteiineja, jotka ovat mukana monissa syövissä, ovat huumeiden herkkyys biomarkkerit PARP-1 estäminen [26], [30], [31]. Korkea ilmaus TMPRSS2: Erg eturauhassyövissä tai EWS-Fli1 Ewing sarkooma aiheuttaa DNA vahingoista, jotka voimistaa PARP-1 esto ja seuraa voimakas inhibitio syövän etenemisessä. Kuitenkin, sikäli kuin tiedämme, ei ole raportoitu mitään toiminnallisia yhteyksiä Ets-1 ilmentymisen ja sen herkkyys PARP-1-estäjät.

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että PARP-1 negatiivisesti ohjaa taso Ets-1 proteiinien syöpäsoluissa kautta PARylation. Under PARylation esto, Ets-1 transkriptionaalisen aktiivisuuden paranee joka korreloi Ets-1 proteiinien kertymistä solutumissa ja lisätä DNA-vaurioita, joka johtaa syöpäsolun kuoleman. Siksi tulokset viittaavat siihen, että esto PARylation voisi olla uusi terapeuttinen strategia rajoittamiseksi syövän etenemisen Ets-1-ilmentäviä kasvaimia.

Tulokset

PARP-1: uusi Ets-1 vuorovaikutus kumppani syöpäsoluissa

Saat uusia Ets-1 kanssa, me suoritti

in vitro

affiniteettipuhdistuksessa strategiaa käyttäen streptavidiini avattavan määrityksessä. Tämä lähestymistapa varmistaa laajamittainen tunnistaminen kumppaneiden käyttämällä biotinyloitua rekombinanttia Ets-1 immobilisoitu streptavidiinihelmillä säilyttää sitovia proteiineja löytyy tumaekstrakteilla [20], [32]. Täällä, käytimme MDA-MB-231-solujen, invasiivisen rintasyövän solulinjaa, tuottamaan tumauutteet; nämä solut ilmentävät endogeenisesti Ets-1 onkoproteiinin, mikä tarjoaa sopivan solun yhteydessä. Erottamisen jälkeen sitoutuneet proteiinit SDS-PAGE, joka on erittäin näkyvä proteiini vyöhyke, jonka molekyylipaino oli 113 kDa havaittiin sen jälkeen, kun kolloidinen värjäytymistä (Fig. 1A, kaista 3, joka on merkitty tähdellä (*)), mutta se puuttuu ohjaus olosuhteissa (Fig. 1A, kaistat 1 ja 2). Tämä proteiini tunnistettiin massaspektrometrillä kuin PARP-1-entsyymin (Fig. 1 B ja S1) ja sen yksinomainen läsnäolo Ets-1-sitoutuneiden proteiinien varmistettiin Western blot (kuvio. 1C, kaista 3). Johtuen liimautuu PARP-1 koloja DNA tumauutteita käsiteltiin DNaasi I: llä ennen inkubointia poistaa kaikki jäljet ​​nukleiinihappoja. Tämä hoito ei häiritse vuorovaikutusta Ets-1 ja PARP-1 (Fig. 1 D, kaista 4). Tämä vahvistettiin massaspektrometrialla (tuloksia ei ole esitetty). Sitten suoritetaan samanaikainen immunosaostus kokeissa käyttäen anti-Ets-1-vasta-aine-agaroosia konjugaatin MDA-MD-231-soluja ja käytettäessä luusarkoomasolulinjassa, MG63, joka ilmaisee myös Ets-1. Erottamisen jälkeen SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus, jossa on anti-PARP-1-vasta-aine, PARP-1 kerasaostuvat Ets-1 sekä MDA-MB-231 ja MG63-solut (Fig. 1 E, kaista 2). Ohjaus kokeilee IgG tavallista kaniseerumia ei rekrytoida PARP-1 (Fig. 1 E, kaista 1). Vastavuoroinen samanaikainen immunosaostus kokeet suoritettiin käyttäen anti-PARP-1-vasta-aine-agaroosia konjugaatin MDA-MD-231 ja MG63-solut. Ets-1 kerasaostuneet sekä MDA-MB-231 ja MG63-solut, ja se oli poissa Verrokkikokeissa (Fig. 1 F). Lisäksi immunofluoresenssilla kokeissa käyttäen anti-Ets-1 ja anti-PARP-1-vasta-aineita osoittivat, että molemmat proteiinit kolokalisoituvat MDA-MB-231-solujen tumat (Fig. S2, kaista 4).

(A) kolloidinen blue-värjätyn geelin ja Ets-1-proteiinien, MDA-MB-231 tumauutteet. Biotinyloitua Ets-1-proteiineja käytetään avattavasta määritys ladattiin yksinään kontrollina tunnistamiseksi biotinyloitu proteiineja (nuolenpäät) ja niiden mahdollisia hajoamistuotteita (kaista 1). Pull-down proteiineja havaitaan tumaekstrakteilla (NE) inkuboitiin kuormittamattomassa helmiä katsottiin olevan epäspesifisiä tuotteet (kaista 2). Kolloidinen blue-värjätty erityinen PARP-1-proteiinin vedetty alas biotinyloidulla Ets-1 on merkitty tähdellä (kaista 3). (B) tunnistaminen PARP-1 MALDI-TOF-massaspektrometrialla. (C) Western blot-analyysi vahvistaa Ets-1 liittyvä proteiini kuin PARP-1. Proteiinit vedetty alas MDA-MB-231 tumauutteita analysoitiin Western blot kanin kohdistuvien vasta-aineiden PARP-1 (H-250). (D) Kolloidinen blue-värjätyn geelin ja Ets-1-proteiinien, MDA-MB-231-tumauutteita joko (kaistat 1 ja 2) tai käsiteltiin DNaasi I: llä 40 min (kaistat 3 ja 4), ja sitten joko inkuboitiin streptavidiinihelmillä ladattu biotinyloitua Ets-1-proteiini (nuolenpäät) (kaistat 2 ja 4) tai kuormittamattomassa helmiä (kaistat 1 ja 3). Asteriskit osoittavat PARP-1-proteiinin havaittu (A). (E) ja (F) Co-immunosaostus suoritetaan käyttämällä kaniinin anti-Ets-1 (C-20) tai kanin anti-PARP-1 (H-250) vasta-aine-agaroosi-konjugaattia (kaista 2) tai kaniinin normaalilla IgG: tä ohjaus (kaista 1) ja tumauutteista MDA-MB-231-soluja tai MG-63-soluja. Tulo (kaista 3) sisältää 3% ydin- uutteita, jotka tehtiin samanaikainen immunosaostus. PARP-1 ja Ets-1 analysoitiin Western blot käyttäen vastaavasti H-250 ja C-4-vasta-aineita.

Ets-1 suoraan vuorovaikutuksessa PARP-1, ja se on sitten PARylated DNA- riippumaton tavalla

Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että ETS DBD vuorovaikutuksessa PARP-1 [30]; kuitenkin, vuorovaikutus Ets-1 DBD rajoitetaan Ets-1 automaattinen esto. Siksi tutkia vuorovaikutusta Ets-1 ja PARP-1, käytimme kahta biotinyloitua ja automaattinen esti isoformeja Ets-1: täyspitkä muoto, yksinkertaisesti nimeltään Ets-1 ja määräävä-negatiivisia isoformi vaihtoehtoisista silmukoinnin , Ets-1 p27. Ets-1 p27 Äskettäin havaittiin ryhmämme ja puuttuu treoniini-38 (Thr38) jäämiä sekä Terävä (PNT) ja transaktivaation (TAD) verkkotunnuksia (Fig. 2A), jotka kaikki vaaditaan transaktivaatiota Ets -1 kohdegeenien. Kuitenkin Ets-1 p27 on edelleen sama DNA-sitovia ominaisuuksia kuin Ets-1 [33]. Inkuboinnin jälkeen biotinyloitua Ets-1 isoformien immobilisoitu streptavidiinilla helmiä rekombinantti PARP-1-entsyymin, PARP-1 spesifisesti ja suoraan vuorovaikutuksessa Ets-1-isoformit (Fig. 2B, kaistat 2 ja 3). Siten automaattinen esto Ets-1 ei häiritse suoraa vuorovaikutusta DBD ja PARP-1. Tutkia, Ets-1 on posttranslationaalisesti modifioitu PARP-1-välitteisen PARylation teimme-out

in vitro

PARylation määritys. Katalysoida PARylation, PARP-1 vaatii yleensä läsnä lovetun DNA, kuten on esitetty valvontaa lisäämällä sonikoitiin kaksijuosteista DNA: ta (Fig. 2C kaistat 1 ja 2). Kun se on aktivoitu, PARP-1 katalysoi sen automaattinen PARylation, joka voidaan visualisoida käyttämällä anti-PAR-vasta-ainetta (Fig. 2C, kaista 2). Kun läsnä on Ets-1, auto-PARylation oli voimakkaampi ja Ets-1 PARylated, jonka molekyylipaino on noin 51 kDa, joka vastaa mono (ADP-ribosyyli) ation ja PARylation eri polymeerin kokoa (Fig. 2C, kaista 4, musta nuoli). Lisäksi ilman DNA: ta, ei ollut ainoastaan ​​PARP-1 on edelleen aktivoituna, mutta Ets-1 oli vieläkin voimakkaammin PARylated (Fig. 2C, kaista 5, musta nuoli). ETS-1 p27 isoformi, tulokset osoittivat, että läsnä oli koloja DNA, Ets-1 p27 ei PARylated (Fig. 2C, kaista 7). Kuitenkin, jossa ei ole DNA: ta, Ets-1 p27 aktivoi PARP-1, ja sitten PARylated, nähdään kaistalla, jonka molekyylipaino on noin 27 kDa: n ja erikokoisia polymeerien molekyylipainot välillä 40 ja 60 kDa: n (Fig. 2C, kaista 8). Näin ollen C-terminaaliseen päähän Ets-1 voi aktivoida automaattisen PARylation PARP-1 DNA-riippumattomalla tavalla suoraan proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen ja voidaan PARylated vastineeksi. Osoittaakseen PARylation ihmisen syöpäsoluissa, me tuotti HeLa solulinja, joka on saatu retrovirusinfektiolla, että stabiilisti ilmentää Ets-1 merkitty streptavidiini-sitoutuvan peptidin (SBP). Puhdistamisen jälkeen Ets-1 streptavidiinihelmillä, analysoimme PARylation Western blot käyttäen anti-PAR vasta-aine. Tulokset osoittivat, että vain murto-osa Ets-1 proteiinia hieman PARylated soluissa (Fig. 2D, kaista 2). PARylation on hyvin lyhytikäinen translaation jälkeisen modifikaation, joka on vaikea visualisoida soluissa, erityisesti johtuen toiminnan poly (ADP-riboosi) glykohydrolaasi (PARG), joka katalysoi hajoamista PAR polymeerien [21].

(A) Kaavamainen esitys täyspitkän Ets-1-proteiinia ja sen dominanttinegatiivivaikutus isoformi Ets-1 p27. Laatikot vastaavat luetut alueet ja katkoviivoja transloimattomat alueet. Treoniini-38 (Thr38), Terävä domain (PNT), transaktivaatiodomeenin (TAD), inhiboiva domeeni (I), käännetty alue, joka vastaa eksonin VII ja DNA: ta sitovan domeenin (DBD) on osoitettu. (B) Streptavidin avattavasta määrityksessä rekombinantti Ets-1 ja PARP-1 proteiineja. Biotinyloitua Ets-1 (5 ug) tai Ets-1 p27 (2,5 ug) proteiinit ladattiin streptavidiinihelmillä ja inkuboitiin sitten puhtaalla yhdistelmä-PARP-1-proteiinia (1 ug) 1 h (kaistat 2 ja 3). Streptavidiinihelmillä yksin inkuboitiin PARP-1 käytettiin kontrollina (kaista 1). PARP-1 analysoitiin Western blot. (C) PARylation määrityksessä Ets-1 ja Ets-1 p27. Ets-1 (1 ug) tai Ets-1 p27 (500 ng) proteiineja inkuboitiin rekombinantti-PARP-1-proteiinin (500 ng) in PARylation reaktiopuskurissa (katso materiaalit ja menetelmät) läsnäollessa (kaistat 4 ja 7) tai puuttuessa (kaistat 5 ja 8) on koloja DNA 20 min. Kontrollina, Ets-1-isoformit inkuboitiin yksin reaktiopuskuria ja koloja DNA (kaistat 3 ja 6), ja automaattinen aktivointi PARP-1 yksin tarkastettiin kanssa tai ilman DNA: ta (kontrolli, kaistat 1 ja 2) (D) PARylation ETS-1 stabiilisti transfektoiduissa HeLa-soluissa, saadaan retrovirusinfektiota. Ets-1 merkitty streptavidiini sitova peptidi (SBP) puhdistettiin stretavidin helmet HeLa-solujen tuman uutteet (kaista 2). HeLa-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti ainoastaan ​​SBP käytettiin kontrollina (kaista 1). In (C) ja (D), PARylation tila määritettiin käyttäen anti-PAR-vasta-aine.

PARP-1 moduloi Ets-1-välitteistä transkriptiota stromelysiini-1: n promoottori

Sen määrittämiseksi, onko vuorovaikutus PARP-1 moduloi transkriptionaalista aktiivisuutta Ets-1, lusiferaasi transaktivaatiomääritysten suoritettiin. Tätä varten käytimme promoottori matriisi-stromelysiini-1, joka on hyvin tutkittu Ets-1 kohdegeenin osallisena syöpäsolujen muuttoliike ja invaasiota [34]. Tämä promoottori, aktivoituu osuuskunta sitoutumista kaksi Ets-1-molekyylien kautta palindromi EBS, fuusioitiin lusiferaasigeeniin (Fig. 3A). 3T3-hiiren solut, joko PARP-1 villityypin (WT) tai knock-out (KO), käytettiin arvioimaan Ets-1 transkriptionaalista aktiivisuutta lainkaan PARP-1-proteiinin. WT soluissa stromelysiini-1 promoottori oli täysin aktivoitiin Ets-1 transfektiota (Fig. 3B, kaista 3). Sen sijaan, PARP-1 KO vähensi kykyä Ets-1 transaktivoimaan promoottori (Fig. 3B, kaista 4). Rescue kokeet suoritettiin käyttämällä ihmisen PARP-1 ekspressiovektorin sallittu Ets-1 osittain takaisin sen transkriptionaalista aktiivisuutta (kuvio. 3B, kaista 5). Täten PARP-1 on välttämätön täynnä transaktivaation stromelysiini-1-promoottorin Ets-1. Sitten tutkittiin seuraukset PARP-1-välitteisen PARylation ETS-1 transkriptionaalista aktiivisuutta. Tätä varten suoritimme samaa lusiferaasin transaktivaatiomääritysten kanssa 3T3-soluissa käyttäen PJ-34, PARP-1 katalyyttinen estäjä. Yllättäen PARylation inhibitio, toisin kuin PARP-1 KO, lisääntynyt Ets-1 transkriptionaalista aktiivisuutta on stromelysiini-1: n promoottori, kuten on esitetty transfektoiduissa WT-solut (Fig. 3C, kaistat 3 ja 4). Ko-solut, PJ-34 ei ollut vaikutusta, ja ei lisätä transaktivaatiota promoottori (Fig. 3C, kaistat 7 ja 8). Siksi lisäykset Ets-1 transkriptionaalisen aktiivisuuden toimivat kautta spesifinen esto PARP-1. Analyysi Western blotilla osoitti, että inhibitio PARylation PJ-34 aiheutti lisääntymisen Ets-1-proteiinin tason WT-solut (Fig. 3C, kaistat 3 ja 4). Sen vahvistamiseksi, että PARylation estäminen aiheuttaa myös kasvua Ets-1 transkriptionaalista aktiivisuutta ihmisen syöpäsoluja, suoritimme lusiferaasin transaktivaatiomääritysten HeLa-soluissa kasvavia annoksia PJ-34. Tulokset osoittivat, että PJ-34 annoksesta riippuvainen kasvua transaktivaation stromelysiini-1: n promoottori korreloi kasvun kanssa Ets-1-proteiinin tasot (Fig. 3d, kaistat 5-8). Tämä lisäys Ets-1-proteiinin tasot havaittiin HeLa-soluissa paitsi PJ-34, mutta myös kaksi muuta hyvin tutkittu PARP-1-estäjät: 5-AIQ ja ABT-888 (veliparib) (Fig. 3E, kaistat 6- 8). Siten tämä lisäys johtuu nimenomaan PARP-1 esto. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Ets-1-proteiinin tasoja säätelee negatiivisesti PARP-1-välitteisen PARylation.

(A) Kaavamainen esitys lusiferaasigeenin valvonnassa ihmisen stromelysiini-1: n promoottori. Palindrominen Ets-sitoutumiskohtia (EBS) on esitetty sidottu kaksi Ets-1-molekyylejä. (B) vaikutus PARP-1 knock out (KO) ETS-1-välitteistä stromelysiini-1 promoottorin aktiivisuutta. pGL3 lusiferaasireportteri- konstruktioita (100 ng) transfektoitiin hiiren 3T3-soluihin villityypin (WT) (kaistat 1 ja 3) tai KO varten PARP-1-geeni (kaistat 2, 4 ja 5) on 50-80% konfluenssiin puuttuessa (kaistat 1 ja 2) tai läsnäollessa (kaistat 3, 4 ja 5) ja Ets-1 ekspressiovektorin (25 ng) ja pelastus kokeissa PARP-1 ekspressiovektorin (100 ng; kaista 5). (C) vaikutus PARP-1 katalyyttinen inhibitio Ets-1-välitteisen stromelysiini-1: n promoottori aktiivisuuden läsnä ollessa tai ilman PARP-1. pGL3 lusiferaasireportterista konstruktioita (100 ng) transfektoitiin hiiren 3T3 soluihin WT (kaistat 1- 4) tai KO varten PARP-1-geenin (kaista 5-8) klo 50-80% konfluenssiin puuttuessa (kaistat 1, 2 , 5 ja 6) tai läsnäollessa (kaistat 3, 4, 7 ja 8) ETS-1 ekspressiovektorin (25 ng) ja puuttuessa (kaistat 1, 3, 5 ja 7) tai läsnäollessa (kaistat 2 , 4, 6 ja 8) PJ-34, katalyyttisen estäjä PARP-1 (10 uM). (D) vaikutus PARP-1 katalyyttinen estoa Ets-1-välitteistä stromelysiini-1 promoottorin aktiivisuuden syöpäsolu malli. pGL3 lusiferaasireportteri- konstruktioita (100 ng), transfektoitiin HeLa-soluihin 50-80% konfluenssiin puuttuessa (kaistat 1-4) tai läsnä ollessa (kaistat 5-8) ja Ets-1-ekspressiovektoriin (100 ng), ja kasvavia annoksia PJ-34 (0-20 uM, kaistat 1-4 ja 5-8). (B), (C) ja (D), lusiferaasin aktiivisuus, mitattuna 48 tuntia transfektion jälkeen ja 20 h inkuboinnin jälkeen PJ-34, on ilmaistu prosentteina: n aktiivisuutta indusoi Ets-1 on PARP-1 WT yhteydessä merkitty 100%. Tulokset ovat keskiarvo kolmesta kokeesta, jotka suoritettiin kolmena kappaleena. (E) Vaikutus PARP-1 katalyyttinen inhibition tasolla Ets-1-proteiinin. HeLa-soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä, kunnes 70% konfluenssiin, transfektoitu pcDNA3: lla (1 ug, vasen paneeli) tai pcDNA3-Ets1 (1 ug, oikea paneeli) vektoreita 24 tuntia ja käsiteltiin PJ-34 (1 uM) ( kaistat 2 ja 6), 5-AIQ (1 uM) (kaistat 3 ja 7) tai ABT-888 (1 uM) (kaistat 4 ja 8), 20 tuntia. Kaikissa kokeissa, solulysaateista (30 ug kokonais-proteiinit) analysoitiin Western blot käyttämällä erilaisia ​​vasta-aineita (katso materiaalit ja menetelmät).

inhibitio PARylation aiheuttaa kertyminen Ets-1 syöpäsoluissa

kinetiikan määrittämiseksi Ets-1 kertymistä, suoritimme nopeutus kuvantaminen kokeita. HeLa-soluja transfektoitiin ohimenevästi vektorina, joka ekspressoi fuusioproteiinia eGFP (tehostettu vihreä fluoresoiva proteiini) -Ets-1. Kontrolloiduissa olosuhteissa, eGFP-Ets-1-proteiinin tasot olivat stabiileja 12 tunnin aika-raukeavat (Fig. 4A, rivi 1). Lisättäessä PJ-34, havaitsimme vahva kasvu EGFP-Ets-1 signaalin, joka vastaa tumiin HeLa-soluissa (kuvio. 4A, rivi 2). Kuitenkin PJ-34 ei ollut vaikutusta eGFP yksinään (Fig. 4A, rivi 4) ja enemmän mielenkiintoisesti, ei ollut vaikutusta eGFP-Ets-1 p27 (Fig. 4A, rivi 3). Koska täyspitkän Ets-1 on ubikitinoituja ja sitten hajottaa proteasomin, kun taas Ets-1 p27 ei ole ubikinaa- sivustoja [19], [33], tutkimme seuraavaksi, onko kinetiikka Ets-1 kertymistä voidaan verrata kuin proteasomaalisten inhibition. Käyttäen MG-132, tunnettu proteasomin inhibiittoria, johti samaan kinetiikka Ets-1 kertymistä kuin havaittu PARylation inhibition (Fig. 4A, rivi 5). Sen sijaan, MG-132 ei ollut vaikutusta Ets-1 p27-proteiinin tasot ja näin välisen yhteyden vahvistaminen PARylation ja proteasomin hajoaminen Ets-1 (Fig. 4A, rivi 6). Tilastollinen analyysi vaihtelua fluoresenssin voimakkuutta näissä nopeutus kokeet osoittivat, että merkittävää vaihtelua Ets-1-proteiinin tasot (noin 50%: n lisäys) havaittiin lisättäessä PJ-34 tai MG-132 oli verrattavissa (kuvio. 4A, pohja paneeli, kaistat 2 ja 5). Sen vahvistamiseksi, että kertyminen Ets-1 välittävät PARP-1 esto voitaisiin myös havaita endogeeninen yhteydessä käsittelimme MDA-MB-231-solujen PJ-34 ja analysoitiin Ets-1-proteiinin tasot immunofluoresenssilla. Ets-1 oli pääasiassa tumassa MDA-MB-231-solujen mutta sen esiintyminen havaittiin myös, että perinuclear solulimassa (Kuva. 4B, kaista 1, valkoiset nuolet) [33]. Anti-Ets-1-vasta-aine, huomasimme vahva kertyminen endogeenisen Ets-1 soluissa ”ytimet ja sytoplasmassa (kuvio. 4B, kaista 2). Sitten tutki tätä mekanismia oli spesifinen Ets-1. Voit tehdä niin, testasimme useita proteiineja tiedetään PARylated kuten p53, c-Jun, ERK-2 ja PARP-1 [21], [23], [27], [35]. Tulokset osoittivat, että lukuun ottamatta Ets-1, mikään näistä proteiineista kertynyt soluja PARylation inhibition PJ-34 (Fig. 4C). Havaitsimme myös, että Ets-1 tehokkaasti kertynyt MDA-MB-231-solujen käsiteltäessä muiden PARP-1-inhibiittorit, 5-AIQ ja ABT-888, kun taas p53-proteiinin tasot pysyivät ennallaan (kuvio. S3). Täten PARP-1-välitteisen PARylation on mukana erityisen asetuksen ETS-1-proteiinin tasot syöpäsoluissa ja oletamme, että tämä mekanismi on sidoksissa sen proteasomaalisten hajoamista.

(A) kinetiikka Ets-1 kertymistä noudatettava nopeutus kuvia. HeLa-soluja kasvatettiin MatTek ruokia ja transfektoitiin pEGFP-C1-Ets-1 (500 ng; rivit 1, 2 ja 5) tai pEGFP-C-1-Ets-1p27 (500 ng; rivit 3 ja 6) tai tyhjä pEGFP-C1 vektorit (500 ng; rivi 4). 24 h transfektion jälkeen, HeLa-soluja käsiteltiin PJ-34 (10 uM; rivit 2-4) tai MG-132 (5 uM, rivit 5 ja 6), ja havaittiin 12 tuntia fluoresenssimikroskoopilla on × 20 suurennus on yksi kuva otettu tunnin välein. Pohjalevy: tilastollinen analyysi vaihtelua fluoresenssin voimakkuutta. Ehdot 1-6 merkitty x-akselilla ovat samat kuin edellä on kuvattu. Mean fluoresenssivoimakkuudet aika-raukeavat kokeilu kuvat laskettiin ImageJ ohjelmistoja ja suhde vaihtelun välille luotiin T = 12 h ja t = 0 kuvaa. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta kokeesta. (B) visualisointi Ets-1-proteiinin tasot MDA-MB-231-soluja käsiteltiin PJ-34 immunofluoresenssilla. MDA-MB-231-soluja käsiteltiin PJ-34 (10 uM) 20 tunnin ajan. Ets-1 havainnollistetaan Red (Alexa Fluor® 594). Solut tutkittiin fluoresenssi- mikroskoopilla x 40 suurennuksella. Mittakaava = 20 um. Valkoinen nuolet osoittavat sytoplasman lokalisaatio Ets-1 käsittelemättömissä soluissa (kaista 1). Pohjalevy: Pinta tontti esityksiä. Pinnan tonttien saatiin analysoimalla immunofluoresenssilla Kuvien ImageJ ohjelmistot; x- ja y-akselit osoittavat pikselin kantoja ja z-akselin, fluoresenssin voimakkuus. (C) vaikutus PARP-1 katalyyttinen inhibition tasolla PARylated proteiineja. MDA-MB-231-soluja käsiteltiin PJ-34 (10 uM) 20 tunnin ajan. Solulysaateista (30 ug kokonais-proteiinit) analysoitiin Western blot käyttämällä erilaisia ​​vasta-aineita (katso materiaalit ja menetelmät) vastaan ​​PARP-1, p53, c-Jun ja ERK-2, joiden tiedetään läpi PARylation.

Ets-1 ilmentymisen johtaa syöpäsolun kuoleman alle PARylation esto

Voit selvittää seuraukset Ets-1 kertymistä syöpäsoluissa, me tutki eksogeenisiä Ets-1 ilmentymisen vaikuttaa selviytymistä HeLa-solujen käsitelty PJ -34. HeLa-solut transfektoitiin vektorilla, joka ekspressoi Ets-1 tai tyhjän vektorin, ja sitten inkuboitiin 20 h PJ-34. Time-lapse kuvantaminen kokeet osoittivat, että PJ-34 ei ollut dramaattinen vaikutus eloonjäämiseen HeLa-solujen transfektoitiin tyhjällä vektorilla (vale) kuin yhtiö ei ole nekroottisen morfologia ja propidiumjodidilla (PI) sisällyttäminen (Fig. 5A, vasen paneeli ja 5B). Kuitenkin Ets-1 ilmentymisen herkistyneet syöpäsolujen PJ-34 myrkyllisyys suuressa määrin (Fig. 5A, oikea paneeli). Time-lapse kuvantaminen kokeita ja tilastollinen analyysi osoitti, että lähes kaikki Ets-1 ilmentävien HeLa solujen sisällytetty PI ja jalostustoiminto kuolion (Fig. 5A, oikea paneeli ja 5B). Samoin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) analyysi osoitti, että Ets-1-ilmentävien HeLa-solujen kanssa olivat alttiimpia kuolion jälkeen PJ-34 hoitoa (Fig. 5C, oikea paneeli). Kuten PJ-34 tiedetään aiheuttavan mitoottista pidätys on PARP-1-riippumattomalla tavalla [36], myös suorittaa nämä kokeet ABT-888 (Fig. S4). Samat tulokset saatiin, mikä osoittaa, että nekroosia Ets-1-ilmentävien HeLa-solujen toiminta tapahtuu spesifinen esto PARP-1 (Fig. S4). MDA-MB-231-soluja, havaitsimme, että 44% soluista tehdään kuolion jälkeen PJ-34 hoitoa (Fig. 5D ja 5E). FACS-analyysi vahvisti tämän pienempi herkkyys PJ-34 myrkyllisyys (Fig. 5F). Rintasyöpä solut ovat vastustuskykyisiä syöpälääkkeet, kuten doksorubisiini tai paklitakselia, koska korkea ilmentymisen MDR1 ja Ets-1 [37]. Siksi testasimme onko PJ-34 voitaisiin käyttää täydennys doksorubisiini hoitoon. Nämä kokeet myös antoi meille mahdollisuuden tutkia, onko [vai ei] ETS-1 kertymistä välittämä PARP-1 esto aiheuttaa suuremman vastustuskyvyn doksorubisiinin MDA-MB-231-soluja. Tulokset osoittavat, että Ets-1 edelleen kertynyt alle PARylation inhibition, kun MDA-MB-231-soluja käsiteltiin 500 nM doksorubisiinia (Fig. S5a). Huomasimme kuitenkin, että MDA-MB-231-solut olivat alttiimpia nekroosi, kun PJ-34 ja doksorubisiinin yhdistettiin kuin silloin, kun soluja käsiteltiin vain yksi näistä kahdesta lääkkeiden (kuviot. S5B ja S5c). Näin ollen, vaikka PJ-34 vaikutukset ovat kohtuulliset MDA-MB-231-soluja, PARP-1-estäjät voidaan tehokkaasti yhdistää muiden syöpälääkkeiden parantaa hoidon tehokkuutta.

(A) Time-lapse kuvantaminen kokeissa HeLa-solujen käsitelty PJ-34. HeLa-soluja kasvatettiin Hi-Q4 ruokia asti 70% konfluenssiin ja transfektoitu tyhjällä pcDNA3 (250 ug, vasen paneeli) tai pcDNA3-Ets1 (250 ug, oikea paneeli) vektorit 24 tunnin ajan ennen kuin hoidetaan PJ-34 (5 uM) tai ne jätetään hoitamatta. Solut värjättiin Hoechst 33242 (sininen) ja PI (punainen) elävien solujen kuvantamisen ja seurattiin 20 tuntia. Asteikko bar = 20 uM. (B) Graafinen esitys osuus nekroottisen HeLa-solujen (%) kolmena ajankohtana (katso materiaalit ja menetelmät). (C) Virtaussytometria solukuolemaa havaitseminen HeLa-solujen käsitelty PJ-34. HeLa-soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä, kunnes 70% konfluenssiin ja transfektoitiin pcDNA3: lla (1 ug, vasen paneeli) tai pcDNA3-Ets1 (1 ug, oikea paneeli) vektoreita 24 tuntia ja jätettiin käsittelemättä (katkoviivat) tai käsitelty PJ -34 (kiinteät viivat) vielä 20 tunnin inkuboinnin. Nekroottinen solukuolema määritettiin sitten virtaussytometrillä sen jälkeen, kun PI-värjäyksen. Numerot alla rekki antavat prosenttiosuudet erityisiä PJ-34 aiheuttama nekroottisen solukuoleman jokaisessa kunnossa. Virtaussytometria profiilit esitetään edustavat kolmea koetta uudestaan. (D) Aikaväli kuvantaminen kokeita MDA-MB-231-solujen käsitelty PJ-34. MDA-MB-231-soluja kasvatettiin Hi-Q4 ruokia asti 80% konfluenssiin ja käsiteltiin PJ-34 (10 uM) tai ne jätetään hoitamatta. Solut värjättiin Hoechst 33242 (sininen) ja PI (punainen) elävien solujen kuvantamisen ja seurattiin 20 tuntia. Asteikko bar = 20 uM. (E) Graafinen esitys osuus nekroottisen MDA-MB-231-solujen (%) kolmena ajankohtana (katso materiaalit ja menetelmät). F) Virtaussytometria solukuoleman havaitseminen MDA-MB-231-soluja käsiteltiin PJ-34. MDA-MB-231-soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä, kunnes 80% konfluenssiin ja hoitamattomana (katkoviivat) tai käsitelty PJ-34 (yhtenäiset viivat) ja 20 h inkuboinnin jälkeen. Nekroottinen solukuolema määritettiin sitten virtaussytometrillä sen jälkeen, kun PI-värjäyksen. Numerot alla rekki edustavat prosenttiosuudet erityisiä PJ-34 aiheuttama nekroottisen solukuoleman jokaisessa kunnossa. Virtaussytometria profiilit esitetään edustavat kolmea koetta uudestaan.

kertyminen Ets-1 välittyvät PARylation esto lisää DNA-vaurioita

Sitten tutkittiin mahdollisuutta, että solujen kuolion välittämän eston PARP-1 samanaikainen Ets-1 kertyminen johtui kasvusta DNA-vaurioita, kuten havaittiin Ets fuusioproteiinien eturauhassyövässä ja Ewingin sarkooma [26], [30]. Voit tehdä niin, arvioimme taso Histonimerkki DNA double-säikeen katkoksia, fosforyloidun H2AX (γH2AX) pesäkkeitä.