Krooninen sairaus

tiivistelmä

On kertynyt näyttöä siitä, että väärin säädellystä JAK signalointi tapahtuu monenlaisia ​​syöpätyyppeihin. Erityisesti mutaatiot JAK2 voi johtaa konstitutiiviseen aktivoitumiseen STAT transkriptiotekijöiden ja johtaa kasvaimia kasvuun. JAK-kinaasien perustetaan Hsp90 asiakkaan proteiineja ja tässä me osoittavat, että uusi pieni molekyyli Hsp90 estäjä ganetespib (ent STA-9090) osoittaa voimakas

in vitro

ja

in vivo

aktiivisuus erilaisia ​​kiinteitä ja hematologiset tuumorisoluja, jotka ovat riippuvaisia ​​JAK2 toiminnan kasvua ja selviytymistä. Huomattavaa on, että ganetespib hoitotulokset hidastetusti ehtyminen JAK2, kuten konstitutiivisesti aktiivisen JAK2

V617F mutantti, jossa on myöhemmin menetys STAT aktiivisuuden ja vähentää STAT-kohdegeenin ilmentymisen. Sitä vastoin hoito yleiseurooppalainen JAK estäjä P6 aiheuttaa vain ohimeneviä vaikutuksia näihin prosesseihin. Eriyttää nämä toimintamuotojen, RNA: n ja proteiinien ilmentyminen tutkimukset osoittavat, että ganetespib lisäksi moduloi solusykliä sääteleviä proteiineja, kun taas P6 ei. Samanaikainen vaikutus ganetespib molemmin solujen kasvuun ja solunjakautumisen signalointi kääntää voimakas tuumorin vastaista tehokkuutta hiirimalleissa ksenograftien ja levittää JAK /STAT-ajettu leukemia. Kaiken kaikkiaan meidän havainnot tukevat Hsp90 esto uutena terapeuttinen lähestymistapa tautien torjuntaa riippuvaisia ​​JAK /STAT signalointi, jossa multimodaalisen toiminnan ganetespib osoittavat etuja JAK-inhibiittoreiden.

Citation: Proia DA, Foley KP, Korbut T, Sang J, Smith D, Bates RC, et al. (2011) Monipuolinen väliintulo Hsp90 Inhibitor Ganetespib (STA-9090) syöpäsoluissa aktivoiduilla JAK /STAT Signaling. PLoS ONE 6 (4): e18552. doi: 10,1371 /journal.pone.0018552

Editor: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians Yliopisto, Saksa

vastaanotettu 26. tammikuuta 2011; Hyväksytty: 04 maaliskuu 2011; Julkaistu: 14 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Proia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: kaikki kirjoittajat ovat tai olivat työntekijöitä Synta Pharmaceuticals, Inc. ja kaikki paitsi RC Bates ja AF Rosenberg pitää joko varastossa tai vaihtoehtoja Synta Pharmaceuticals, Inc. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

JAK2 on ekspressoituvat jäsen Janus liittyvän kinaasin (JAK) perheen ei-reseptorityrosiinikinaasien, joiden tehtävänä on välittää signaloinnin alavirtaan sytokiini- ja kasvutekijäreseptorit [1]. Sopimatonta aktivointi JAK signaloinnin taustalla solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen erilaisissa kiinteiden kasvainten [2], [3], ja hematologiset kasvaimet [4]. Erityisesti aktivoiva pistemutaatio JAK2 (JAK2

V617F) on kuvattu korkean taajuuden kroonisen myeloproliferatiivista häiriöt (MPD) [5], [6], [7], [8], [9], [ ,,,0],10] ja konstitutiivisen JAK2 aktivaation aiheuttamia kromosomitranslokaation on raportoitu eri leukemia [11], [12], [13].

Aktivoidut sytokiini-JAK kompleksit rekrytoida ja fosfory- efektorimolekyyleille lukien signaalimuunta- ja aktivaattoreita Transcription (STAT) proteiinit [14]. STAT-proteiinit välittävät monenlaisia ​​biologisia prosesseja, kuten solun kasvua, erilaistumista, apoptoosia, tulehdus ja immuunivastetta [15]. Kaksi STAT erityisesti, STAT3 ja Stat5: n, edustavat suurinta substraatteja JAK2 jotka ohjaavat myelopoeisis [16], [17] ja se voi osaltaan solutransformaatioon [18], [19]. Heidän jatkuva aktivointi on yhdistetty lisääntyneeseen kasvainsolujen lisääntymistä, eloonjääntiä, etäpesäkkeiden ja kasvaimen edistävät tulehdusta sekä kiinteitä ja hematologiset kasvaimet [20]. Niinpä estämällä tämä signalointi akseli käyttämällä erityisiä pienmolekyylisalpaajilla JAK2 on hiljattain tutkittu piste terapeuttisen väliintulon useita ihmisen kasvaimen merkintöjen [3], [21], [22], [23], [24] .

lämpöshokkiproteiini 90 (Hsp90) on molekyyli- chaperone tarvitaan translaation jälkeisiä vakautta sen proteiinin substraatteja tai ”asiakas proteiinit”. Syöpäsolut sisältävät kohonneet aktiivisen Hsp90 [25], ja koska monet asiakas proteiinit näyttelevät kriittistä kasvaimia synnyttävän rooleja, syöpäsolut ovat erityisen herkkiä Hsp90 esto. Lisäksi ainutlaatuinen ominaisuus kohdistaminen Hsp90 on, että esto johtaa samanaikaisesti saarto useiden onkogeenisten signalointikaskadien voittaminen potentiaali polku irtisanomisia, ja herkistävä syöpäsolujen kemoterapia-aineiden [26], [27], [28], [29]. Näin ollen, Hsp90 on houkutteleva molekyyli tavoite kehittää uusia syövän hoito [28], [30], [31]. Käsiteltävän asian kannalta, JAK-kinaasien vahvistetaan Hsp90 asiakkaille viittaa siihen, että Hsp90 esto voi olla tehokas hoidettaessa JAK-suunnattu kasvainhäiriöt [32], [33].

Voit testata tätä hypoteesia, olemme palkanneet synteettinen pieni molekyyli estäjä ganetespib (STA-9090), resorsinoli sisältävä yhdiste liity geldanamysiini, joka sitoo ATP sitovan domeenin Hsp90. Prekliinisissä tutkimuksissa lääke on osoittanut alhainen nanomolaarinen aktiviteetti

in vitro

vastaan ​​erilaisia ​​ihmisen syöpäsolujen linjat ja voimakas tuumorin vastaista tehokkuutta ihmisen ksenograftimalleja [34], [35]. Ganetespib on tällä hetkellä kliinisissä tutkimuksissa sekä kiinteiden kasvainten ja hematologisten pahanlaatuisten kasvainten. Tässä osoitamme, että ganetespib voimakkaasti indusoi apoptoosia erilaisissa kasvainlinjojen riippuvainen pysyviä JAK /STAT signalointi kasvua ja selviytymistä. Me osoittavat lisäksi, että lääke muuttaa myös monia elementtejä solukierron säätelyssä syöpäsoluissa, toimintaa poissa peräisin JAK-spesifinen estäjä.

In vivo

, ganetespib n koordinoida vaikutus sekä solujen kasvuun ja solunjakautumisen johtaa voimakas antituumorivaikutus in JAK /STAT-ajettu malleja ihmisen leukemia. Siten esto Hsp90 aktiivisuuden edustaa lupaava lähestymistapa tautien torjuntaa riippuvainen perustava JAK /STAT signalointi, jossa ganetespib osoittavat mahdollista terapeuttista etuja JAK-inhibiittoreiden.

Tulokset

Ganetespib estää JAK2- välitteiseen signaalin siirtoon ja lisääntymistä hematologisissa syövissä

alhainen nanomolaariseen teho, ganetespib vähensi solujen elinkelpoisuuden ryhmässä ihmisen hematologisten ja kiinteiden tuumorien solulinjoissa valittu niiden riippuvuus JAK /STAT signalointi ja vaihtelevia syöpätyypin (Fig. 1A). Kussakin testatusta, ganetespib oli tehokkaampi kuin ansamysiinin Hsp90 -estäjä 17-AAG. Huomattavaa on, että ganetespib oli yli 100 kertaa voimakkaampi kuin 17-AAG SET-2 ja HEL92.1.7 leukemiasolujen, solulinjoja kätkeminen olennaisesti aktiivisen JAK2

V617F mutaatioita, jotka toimivat niiden onkogeenisistä kuljettajia.

(A) SET-2, HEL92.1.7, MV4-11, NCI-H1975 ja DU145 soluja käsiteltiin ganetespib tai 17-AAG laajalla annosalueella (+0,0001-1 uM) 72 tuntia ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin Alamar sininen värjäys. (B) Ganetespib osoittaa kestävämpi esto JAK /STAT signalointi verrattuna P6. HEL92.1.7 soluja viljeltiin, kun läsnä oli 250 nM ganetespib tai 1000 nM P6 ja kerättiin välillä 0 ja 48 tuntia. Ekspressiotasot ilmoitettu proteiinien määritettiin western blot. (C) Ganetespib on huomattavasti tehokkaampi kuin 17-AAG. SET-2-soluja annosteltiin konsentraatiot ganetespib tai 17-AAG: ssa 24 tuntia ja analysoitiin JAK /STAT-proteiinin ja kohde- tasot käyttäen vasta-aineita, on ilmoitettu.

käyttäminen HEL92.1.7 solut vertasimme JAK /STAT-estoaktiivisuus ganetespib yhdisteen pyridoni-6 (P6) [36], joka on palautuva, ATP-kilpailukykyinen pannulla estäjä Jaks (Fig. 1 B). Ganetespib ja P6 kukin tukossa JAK2 riippuvainen signalointi, mistä on osoituksena menetys fosfo-STAT3 ja fosfo-Stat5: n ja ERK signalointi. Kuitenkin ganetespib oli ainakin neljä kertaa voimakkaampi ja tukahdutetaan STAT signalointi pidempään kuin P6. Ganetespib hoito yksinään johti kohteena, proteasomi-riippuvainen (tuloksia ei ole esitetty) menetys JAK2 ja fosfo-Akt-proteiinia tasoilla (Fig. 1 B), sekä Hsp90-asiakas proteiineja. Siten ganetespib hoitotulokset hidastetusti eston useiden onkogeenisten tavoitteita näissä solu malleja JAK2-ajettu maligniteetti. Samanlaisia ​​vaikutuksia JAK /STAT signalointi havaittiin SET-2-solut, joissa 50 nM ganetespib pystyi horjuttaa JAK2 riittävästi johtaa menetykseen aktivoitu (

eli

, fosforyloituu) STST3 ja Stat5: n ilmentymisen (Fig. 1 C ). 17-AAG osoitti vastaavia vaikutuksia kuin ganetespib mutta oli 200 kertaa heikompi, linjassa kannattavuuden tietoja edellä kuvatulla tavalla. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ganetespib hallussaan ylivoimainen JAK /STAT estoaktiivisuus sekä P6 ja 17-AAG suhteen voimakkuuden tai vasteen kesto.

Ganetespib kumoaa JAK /STAT signalointi kiinteissä kasvaimissa

sen lisäksi esiintyvyys hematologisia syöpiä, onkogeeninen STAT aktivointi on myös yleistä erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia. Esimerkiksi jatkuvasti aktivoitu STAT3 on löydetty 50% keuhkojen adenokarsinoomien ja on pääasiassa havaittu kasvaimia, joissa on mutaatioita, että epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) [37], [38]. NCI-H1975 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinja ilmentää Hsp90 asiakas EGFR

L858R /T790M, konstitutiivisesti aktivoitua ja erlotinibin kestävä muoto EGFR, ja ganetespib hoito aiheutti annosriippuvaisesti lasku EGFR ilmentyminen näissä soluissa (kuvio. 2A). Lisäksi ganetespib aiheutti myös voimakas hajoamista JAK2 ja menetys fosforyloitu STAT3 annoksesta riippuvalla tavalla. Inaktivointi AKT ja GSK3p, proteiinit tärkeä apoptoosin säätelyyn, havaittiin samanlainen annos reagointia JAK2 /STAT3 signalointi. Äskettäin on osoitettu, että JAK2 voi moduloida muita apoptoottisten säätävät kuten BAD ja BCL-XL edistää solujen eloonjäämistä. [21] Tämän mukaisesti olemme havainneet samanaikaisen vähennettyä fosforyloidun BAD (Fig. 2A), mikä vähentää pro-apoptoottista aktiivisuutta tämän proteiinin. Nämä tiedot viittaavat siihen mahdollinen mekanismi selittää sytotoksista vastetta havaittiin ganetespib hoitoon (Fig. 1A).

(A) Asiakas proteiini downregulation in NSCLC. NCI-H1975-soluja annosteltiin konsentraatiot ganetespib 24 h ja niiden solulysaateista analysoitiin JAK /STAT ja Hsp90 asiakkaan proteiinin tasot käyttäen vasta-aineita, on ilmoitettu. (B) Ganetespib estää IL-6 aiheuttama ja konstitutiivista STST3 aktiivisuutta NSCLC soluissa. HCC827 keuhkosyövän soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla ganetespib tai P6: ssa 24 tuntia, jota seuraa 15 min stimulaation kanssa tai ilman 50 ng /ml ihmisen rekombinantti-IL-6. Tasot JAK2 kokonaismäärä ja fosfo-STAT3, ja PIM2 analysoitiin western blot. GAPDH on sisällytetty latauskontrollina. (C) Asiakas proteiinien hajoaminen eturauhassyöpäsoluissa. DU145 solut annosteltiin arvostellaan pitoisuuksien ganetespib 24 tuntia ja solulysaateista kohteena western blot selvittää JAK /STAT ja kohdentaa proteiinin tasot käyttäen vasta ilmoitettu. (D) Toiminnallinen Hsp90 vaaditaan JAK2, mutta ei JAK1, vakautta DU145 soluissa. DU145-soluja käsiteltiin DMSO (kontrolli, C), 15 nM, 60 nM tai 240 nM ganetespib joko 24 tai 48 tuntia ja lysaatit testattiin Western blot, jossa on esitetty vasta-aineilla.

JAK /STAT signalointi akseli on keskeinen modulaattori sytokiinisignaloinnin ja ehdotetun mekanismin poikkeavan STAT3 aktivaation keuhkosyöpä liittyy säätelyä autokriinisen ja /tai parakriinisellä IL-6 signalointi [2]. Siksi me tutkimme, ganetespib voi estää tätä signalointi NSCLC soluissa. Koska ulkoisen ligandin, HCC827 solut käsiteltiin ganetespib osoitti annoksesta riippuvaista väheneminen JAK2 ilmentymisen, mikä johtaa menetykseen STAT3 aktiivisuuden ja ilmentymisen alavirran STAT kohde PIM2 (Fig. 2B). Biochemical esto JAK2 mukaan P6, joskin korkeammilla pitoisuuksilla, samoin alassäädetty konstitutiivinen STAT3 aktiivisuutta mutta eivät vaikuttaneet yhteensä JAK2-proteiinin tasoja. Vastaavasti sekä yhdisteet estetty JAK /STAT signaloinnin stimulointi, kun reitti on aktivoitu eksogeenisen IL-6 hoitoja (Fig. 2B).

säädeltyyn IL-6 /JAK2 signalointi on myös liitetty eturauhassyövän tuumorigeneesiin [39 ], [40]. DU145 eturauhassyöpäsolulinja ilmentää autokriini IL-6 signalointi silmukka [41] ja äskettäin raportoitu olevan herkkiä vaikutuksille uusi pienimolekyylisiä JAK2 estäjä

in vitro

ja

in vivo

[3], [41]. Ganetespib oli indusoi solukuoleman tämän linjan (Fig. 1A). Biokemiallinen karakterisointi DU145 solujen osoittivat samanlaisia ​​estovaikutusta JAK2 signalointi seuraaviin ganetespib hoidon (Fig. 2C). Menetys JAK2, fosfo-STAT3 ja fosfo-SHP2, joka on JAK2 vuorovaikutuksessa fosfataasi tärkeää JAK2 signaalitransduktion, havaittiin lisäämisen jälkeen ganetespib. Mielenkiintoista, liittyvät JAK1 kinaasia ilmaistu tässä solulinjassa ei suunnattu hajoamista vaan näyttivät kasvavan seuraavien ganetespib altistuksen (Fig. 2D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, että PC-3 eturauhasen syövän solulinja (tietoja ei esitetty). Nämä tiedot osoittavat, että valikoiva hajoaminen JAK2 vuonna DU145 eturauhasen soluissa oli riittävä kumoamaan myöhemmän aktivoinnin STST3 signalointi.

Hsp90 esto downregulates transkriptio JAK /STAT signalointi tavoitteet ja solukierron geenien

HEL92 keskisuoran vaakasuoraa etäisyyttä.1.7 erytroleukemiasolut biokemiallisia esto JAK2 mukaan P6 hoitoon johtivat solujen elinkelpoisuutta, mutta 30 kertaa vähemmän tehoa kuin ganetespib (IC

50-arvot 600 vs. 20 nM) (Fig. 3A). Vertailla solu vaikutusta kunkin estäjän, ensin tunnistettu olosuhteet, joissa JAK2 aktiivisuus aleni yhtäläinen kukin lääke perustuu niiden kineettinen ja teho erot. Kuten on esitetty kuviossa 3B, 4 tunnin P6 (1000 nM), ja 24 tunnin ganetespib (250 nM) hoitoja, valittiin, koska vastaavat vaikutukset STAT3 /5 signalointia. RNA ilmaisun profilointi näinä ajankohtina, paljasti, odotetusti, että monet JAK /STAT kohdegeenien (kuten SOCS ja PIM perheenjäsenet) on vaimentua sekä lääkkeiden (Fig. S1, taulukko S1). Kuitenkin muita geenejä muutettu ganetespib hoitoon, jotka olivat ennallaan, että P6-käsitellyt solut (Fig. 3 C, D). Sen lisäksi johtaa odotettua säätelyä lukuisia lämpöshokkiproteiiniperheen geenejä, ganetespib hoito myös selektiivisesti muuttaa ilmaus suuri joukko geenejä mukana solusyklin liittyvää toimintaa, mukaan lukien DNA: n replikaatio ja korjaus (BRCA1 /2), solusyklin säätelyssä (cdc2 , CDC25), sentrosomimäärän /kara toimintaa (BUB1 /3, CENPE /M, KIF14, FAM33A), kromosomi tiivistyminen (TOP2A, NCAPG), ja replikointi (RFC3 /4, MCM perhe) (Fig. S1). Todellakin, analyysi muuttaa geenien hierarkkinen klusterointi ja rikastamiseen pisteet paljasti, että modulaattorit solunjakautumisen olivat näkyvin prosesseja väheni ganetespib hoito (taulukko 1).

(A) Comparative vaikutukset ganetespib ja P6 on HEL92 keskisuoran vaakasuoraa etäisyyttä.1.7 kasvainsolujen elinkelpoisuuden. HEL92.1.7 soluja käsiteltiin ganetespib tai P6 laajalla annosalueella (0,0001-10 uM) 72 tunnin ajan, ja solujen elinkyky arvioitiin Alamar blue. (B) Ajallinen ja annoksesta riippuvaa vaikutusta JAK /STAT tavoitteensa ganetespib ja P6. HEL92.1.7 soluja käsiteltiin ganetespib tai P6 4 ja 24 tuntia ja solulysaateista kohteena western blot selvittää JAK2 /STAT ja kohdeproteiinin tasot käyttäen mainituilla vasta-aineilla. (C) Affymetrix GeneChip analyysi käsiteltyjen solujen ganetespib ja P6. HEL92.1.7 solut, joita käsiteltiin 250 nM ganetespib 24 h tai 1000 nM P6: ssa 4 tuntia. Geeniekspressiotasot DMSO käsiteltiin (eli ajoneuvon kontrolli) soluissa (X-akseli) piirretään vastaan ​​kuin lääkkeellä käsiteltyjen solujen (Y-akseli). (D) Venn kaavio määrä geenejä differentiaalisesti säätelee ganetespib ja P6.

modulaatio solukierron proteiinin ilmentymistä ganetespib indusoi kasvun pysähtymisen

Jos haluat pidentää näitä havaintoja, tarkastelimme kokeellisesti klo vaikutuksia solukierron. Ganetespib aiheuttama ajallinen G

1 ja G

2 /M pidätys HEL92.1.7 soluissa, jossa menetystä S vaiheen (Fig. 4A). Sen sijaan, P6 indusoi kertyminen G

1 vaihe vain, menettämättä S-vaiheeseen tai G

2 /M pidätykseen. Tutkimme myös epäsuorat vaikutukset ganetespib kriittisillä välittäjiä solusyklin jako proteiinitasolla. Havaitsimme vähensi proteiinin tasot sykliiniriippuvaisten kinaasi 1 (Cdk-1), joka on keskeinen säätelijä G

2 /M tarkastuspiste jälkeen 24 tunnin altistuminen ganetespib, vaikutus, joka jatkui kunnes vähintään 48 tuntia (kuvio. 4B). Sen sijaan, P6 ei ollut vaikutusta CDK1 ilmentymisen. Edelleen taso fosfo-Chk2, toinen kiinteä tarkastuspiste kinaasi, vähennettiin ganetespib hoitoa. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin fosfo-Chk1 (tuloksia ei ole esitetty). Kuten on esitetty kuviossa 4C, epävakautta sykliini kinaasien liittyi myös ajallinen kertyminen Sykliinien A1 ja B1 vastauksena lääkkeen lisäksi. Lisäksi nämä vaikutukset ganetespib molemmin JAK2 /STAT signalointi ja solukierron säätelyssä havaittiin muita syöpätyyppejä, mukaan lukien rinta- (MCF-7), mahasuolistrooman (GIST882), haiman (HPAF) ja eturauhasen (DU145) kasvainsolulinjojen ( kuva 4D). Kaiken kaikkiaan nämä muut vaikutteita solunjakautumisen koneen viittaavat siihen, että ganetespib hallussaan päätti etuja JAK-spesifiset inhibiittorit ohjaamiseksi STAT-ajettu syöpäsairauksia.

(A) HEL92.1.7 soluja käsiteltiin 250 nM ganetespib tai 1000 nM P6 (tai DMSO: ta kontrollina) ja solusyklin jakautuminen määritettiin virtaussytometrialla 3, 5, 9 ja 24 tuntia käsittelyn jälkeen. (B) HEL92.1.7 soluja annosteltiin ganetespib (250 nM) tai P6 (1000 nM) 48 tuntia. Solut kerättiin osoitettuina ajankohtina ja veren kokonaiskolesterolia ja fosfo-CDK1, fosfo-Chk2 ja GAPDH analysoitiin western blot. (C) kinetiikka ganetespib vaikutuksia JAK /STAT ja solukierron proteiinin ilmentymiseen. HEL92.1.7 soluja käsiteltiin 100 nM ganetespib, korjattu tunnin välein yli 11 tunnin ajan myötä, ja jollei western blotilla mainituilla vasta-aineilla. (D) MCF-7, GIST882, HPAF ja DU145-soluja annosteltiin arvostellaan pitoisuudet ganetespib 24 h ja analysoitiin Western blot käyttäen mainituilla vasta-aineilla.

Ganetespib pidentää eloonjääntiä JAK2

V617F-mutantti hiirimallissa ihmisen leukemian

Voit selvittää nämä kaksi toimintaa ganetespib on JAK2 /STAT signalointi ja solusyklin etenemisen havaittu

in vitro

kääntää antituumorivaikutuksen tehosta

in vivo

, perustimme potilaalle tehdä leukemia mallia käyttäen HEL92.1.7 soluja. Tämä johti levitetään taudin sairastuvuuteen tyypillisesti johtuvat takaraajan halvaus aiheuttama selkärangan etäpesäkkeitä (tuloksia ei ole esitetty). Tutkia vaikutus ganetespib eloonjäämiseen, joka alkaa yhden päivän kuluttua kasvainsolujen istutuksen, lääke annosteltiin suonensisäisesti korkeimmillaan ei-vakavasti myrkyllisiä annos (HNSTD) 25 mg /kg 5 x /viikko aikataulu päivään 19. Kuten kuviossa 5A, ganetespib hoito yli kaksinkertaistui keskimääräinen eloonjäämisaika (76,5 päivää

vs.

34 päivää,

P

0,0001). Ganetespib hoito oli hyvin siedetty ilman merkittävää painon menetys havaittu sen jälkeen, kun 3 viikkoa annostelun (Fig. S2). Lisääntynyt selviytyminen hoidetuista eläimistä korreloivat voimakkaasti vähentynyt kasvainsolujen rasitteen niiden luuytimessä ja selkäytimen, määritettynä histologinen analyysi (kuvio. 5B).

(A) Kaplan-Meier analyysi yleisen eloonjäämisen leukemia vahvistetun mallin iv injektio HEL92.1.7 soluja SCID-hiiriin, mikä johti kehittämiseen levittää taudin. Alku vuorokauden kuluttua kasvainsolujen istutuksen, ganetespib oli i.v. annostellaan sen HNSTD (25 mg /kg) viiden kertaa viikossa aikataulu 3 viikon läpi päivän 19 (n = 10 /ryhmä). *

P

0,0001; 2-puolinen log-rank-testi. (B) Ganetespib dramaattisesti estää kasvainsolun taakka selkäytimessä ja viereisen luuytimestä. Immunohistochemistical värjäys (H 200 × alemman paneelit.

Ganetespib osoittaa voimakas

in vivo

tehoa Stat5: n ajettu AML ksenografteissa

MV4-11 akuutti myelooinen leukemia solut ilmentävät konstitutiivisen Stat5: n toimintaa seurauksena sisäisen tandem päällekkäisyyttä (ITD) mutaation FLT3 reseptorityrosiinikinaasin, toinen Hsp90 asiakas proteiini [42], ja sellaisenaan, ovat vaihtoehtoinen malli STAT-ajettu syövän synnyn. Nämä solut ovat erittäin herkkiä ganetespib

in vitro

(Fig. 1A) ja arvioimme niiden annos-vaste ganetespib hoitoja ksenografteissa. Ganetespib annettiin suonensisäisesti ja kasvain SCID-hiirissä joko päivittäin tai viikoittain HNSTD 25 mg /kg tai 150 mg /kg, vastaavasti. Kuten kuviossa 6A, viikoittainen hoitoaikataulussa aiheutti merkittäviä ja annoksesta riippuvaa kasvaimen kasvun estäminen, kun taas päivässä tapahtuvan annostelun (25 mg /kg 5 x /viikko, käytettynä potilaalle tehdä malli yllä) johti merkittävään kasvaimen regressio ( 84%). Molemmissa ritonaviiriryhmissä, kasvaimen kasvu oli tukahdutetaan jopa viikon tai enemmän, kun hoito lopetettiin. Beyond tämän ajan, mistä on osoituksena kerran per viikon hoitojakson kohortti, kasvaimen kasvu voi uudelleen käynnistää.

(A) SCID hiiriin ihon alle istutettiin MV4-11 akuutti myelooinen leukemia soluja. Hiirissä, joissa oli muodostuneita MV4-11 ksenografteja (100-200 mm

3, n = 8 hiirtä /ryhmä) injektoitiin i.v. annos (nuolenpäät), jossa ganetespib joko 25 tai 150 mg /kg kerran viikossa 3 viikon ajan, tai HNSTD 25 mg /kg viisi kertaa viikossa, kuten on ilmoitettu. % T /C-arvot on merkitty oikealle kunkin kasvukäyrä ja virhepalkkien ovat s.e.m. (B) ganetespib estää STAT-5 fosforylaation ja CDK1 ilmentymisen tuumoriksenografteja SCID-hiirissä. SCID-hiirillä, joilla on MV4-11 kasvaimia (n = 4 hiirtä /ryhmä) annettiin vehikkeliä tai ganetespib joko 25 mg /kg tai 150 mg /kg on ilmoitettuina ajankohtina välillä 6 h ja 144 h (6 päivää). Kasvaimet resektoitua ja tasot p-Stat5: n, CDK1, Hsp70 ja GAPDH määritettiin western blot.

Voit selvittää nämä tuumorivasteita korreloi kohde modulaatio

in vivo

, lisäksi hiirillä, joilla on MV4-11 ksenografteja hoidettiin kerta-annoksen ajoneuvon yksin tai ganetespib 25 tai 150 mg /kg. Kasvaimet kerättiin välillä 6 ja 144 tuntia myöhemmin ja farmakodynaamiset analyysi suoritettiin tutkimalla ekspressiotasot fosfo-Stat5: n, CDK1 ja Hsp70 (Fig. 6B). Sopusoinnussa

in vivo

kasvaimen kasvua data, annoksesta riippuvaa vaikutusta keston tavoite esto sisällä kasvaimia havaittiin. Yksi 150 mg /kg annoksella ganetespib tukahdutettu aktivoinnin Stat5: n ja tukahdutti ilmaus CDK1 yli kolme päivää, johdonmukainen sen tehosta kerran per viikon annostelun. 25 mg /kg, voimakas inhibitio Stat5: n aktiivisuuden saavutettiin 6 tunnin oli menetys CDK1 24 tunnin kuluttua ganetespib annon. Huomattavaa on, että Stat5: n aktiivisuus talteen näissä kasvaimissa 24 tuntia, kun taas cdk1 ilme pysyi tukahdutetaan kautta vähintään 48 tuntia, vaikka tällä pienellä annoksella (Fig. 6B). Vaikka suhteellisen nopea elpyminen Stat5: n aktivaation olisi voinut kasvaimen uudelleen kasvua, sitä kestävämpi tukahduttaminen solusyklin sääntelyviranomaisten näyttää pitäneen kasvua kasvainten pidätettiin vasta seuraavana lääkkeen annostelu. Nämä havainnot antavat vahvaa näyttöä siitä, että koordinoida menetys solujen kasvua ja solujen jakautumista signaalit johtamasta ganetespib huomioon, että voimakas antituumorivaikutuksen lääkkeen tässä mallissa.

Keskustelu

Jatkuva JAK /STAT aktivointi on onkogeenisia ja ominaista monien ihmisten maligniteettien ja siten tarjoaa houkuttelevan Puuttumisajankohdan varten molekyylirakennetta suunnattu terapeuttisten. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että ganetespib on syvällinen antituumorivaikutus riviksi JAK /STAT-ajettu syöpien ja mikä tärkeintä, voi kumota poikkeavaan signalointia läpi useita mekanismeja. Ganetespib tehokkaasti kohdistettu alkupään säädin JAK2, kuten konstitutiivisesti aktiivisen JAK2

V617F mutantti, hajoamiselle eri hematologisen ja kiinteän kasvaimen tyyppejä seurasi pitkä menetys STAT3 ja Stat5: n signalointi. Havainnot ei vain korostavat patogeeninen rooli STAT signalointi kasvainten synnyssä, mutta tukea tehokkaan terapeuttisen hyödyn ganetespib erilaisia ​​ihmisen syövissä. Tältä osin jatkuva estyminen JAK2 /STAT signalointi akseli saavuttaa ganetespib oli tehokkaampi kuin mitä havaittiin yleiseurooppalainen JAK estäjä P6, ja ganetespib oli tasaisen tehokkaampi kuin ansamysiinin perustuu Hsp90 -estäjä 17-AAG meidän määrityksissä.

Vaikka JAK2 mutaatio on yleinen tapa edistää kasvaimia synnyttävän STAT toimintaa, häiriöt muiden signalointi verkoissa, kuten välittävät EGFR, IL-6 /IL-6R tai FLT3, voi myös edistää aktivoitu STAT signalointia syöpäsolut [2], [43]. Tuloksemme osoittavat, että Hsp90 estäminen tehokkaasti sotkee ​​kuin hyvin, ganetespib voimakkaasti halventava EGFR ja estämällä sekä IL-6- ja FLT3 aktivaatio STAT proteiinien. Näin ollen, vaikka ganetespib suoraan asettaa sen farmakologisia vaikutuksia Hsp90, loppupään seuraukset selvästi toiminnan huomattavaa joukko asiakkaan proteiinien ja biokemiallisia reittejä. Tällä tavalla, Hsp90 esto ganetespib voidaan pitää usean solmukohdan modality sijaan kohde-spesifinen terapeuttinen lähestymistapa, kuten synnyttämä jonka JAK2 tai muu inhibiittori (kuvio 7).

Ganetespib kohdistaa voimakas antituumorivaikutukset kautta häiriön useiden signalointikaskadien, kuten JAK /STAT signalointi akselin ja solusyklin välittäjiä. (EN) JAK /STAT-reitin on pääasiallinen signalointi mekanismi monenlaisia ​​sytokiinien ja kasvutekijöiden. Hyperactivation tämän reitin kautta ligandi aktivoida reseptorin tyrosiini- kinaasien (EGFR tai FLT3), sytokiinireseptorin aktivaatio JAK2, tai aktivoivat mutaatiot, kuten JAK2

V617F, liittyy usein syövän synnyn. Asetus solusyklin liittyy useita erittäin koordinoituja ja välttämättömiä prosesseja, kuten Checkpoint valvonta ja paljastaminen /korjaus geneettisiä vaurioita, kriittinen oikea etenemisen ja solunjakautumisen. (B) inaktivointi Hsp90 jonka ganetespib tuloksia proteasomi-välitteinen hajoaminen ylävirran signaloinnin komponentteja (merkitty harmaa) kriittisiä STAT, MAPK ja AKT aktivaation, mikä johtaa kasvun estymistä. Lisäksi, samanaikaisesti downregulation keskeisten solusyklin sääntelyn geenien aiheuttama ganetespib (kuten on esitetty taulukossa 1) johtaa solukierron pysähtymisen G

1 ja G

2 /M vaiheiden solusyklin, ja sen jälkeen menetys S-vaiheessa.

lisätukea tämän, kun sekä ganetespib ja P6 muuttavat yhteisiä JAK /STAT tavoitteet, vain ganetespib hoito kohdistuu samanaikaisen vaikutuksia solusyklin sääntelykoneisto. Vuonna leukemiasolulinjan Esitettyjen tietojen altistuminen ganetespib johti G

1 ja G

2 /M pidätys, osittain kautta hajoamista CDK1 ja epätyypillisten kertymistä Sykliinien A1 ja B1. Lisäksi S-vaiheessa kumottiin. Sen lisäksi geenejä, jotka liittyvät DNA: n replikaatiota ja solun syklin useita komponentteja sentrosomimäärän ja karan vaikutti transkriptionaalisella tasolla ganetespib yhteisymmärryksessä aiempien tulosten kanssa, että nämä komponentit syntetisoidaan S-vaiheessa ja että Hsp90 on välttämätöntä sentrosomimäärän kokoonpanoon [44], [45]. Tärkeää on, tämä oli yleinen vastauksen kaikkiin soluihin tutkittiin, koska havaitsimme samanlainen kombinatorisista vaikutukset JAK /STAT esto menetys sykliiniriippuvaisen kinaasiaktiivisuutta AML, rinta-, mahasuolistrooman, haiman ja eturauhasen kasvain tyypit.

Ganetespib osoitti myös voimakas

in vivo

toimintaa. Hiirillä, joilla on todettu MV4-11 (Stat5: n perustuva) ksenografteja, viikoittain anto ganetespib esti merkitsevästi tuumorin kasvua annoksesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi päivittäinen annostukseen ganetespib oli myös erittäin tehokas ja aiheutti merkittäviä kasvaimen taantumiseen aikana lääkkeen annon. Tässä mallissa, kasvaimen kasvu ilmestyy noin viikon kuluttua lääkehoidon lopetettiin (korkean annoksen, 1 x /viikko kohortti). Tärkeää on, meidän farmakodynaamisia analyysi osoitti, että nämä tuumorivasteita korreloi määrä ja kesto Stat5: n ja CDK1 proteiinin tappion aiheuttama vaihtelemalla ritonaviiriryhmissä. Tiukka kytkös Stat5: n säätely alaspäin kanssa tuumorikasvun eston kuusi tuntia lääkkeen joko annoksella osoittaa nopea vastaus tämän signalointireitin huumeiden hallinnon. Tällä 150 mg /kg annoksella, Stat5: n signalointia, mutta ei CDK1 ilmaisua, palautetaan kuuden päivän ajan. Pitkäkestoinen menetys CDK1 ja muut solusykliä proteiineja oletettavasti ylläpitää solusyklin pysähtymiseen ja estää kasvun uusiutumista annosten välillä on viikkokalenterissa, vaikka läsnä on uudelleen liityvät Stat5: n aktiivisuutta. Samoin cdk1 ilmentyminen tukahdutetaan pidempään verrattuna Stat5: n klo 25 mg /kg, ja todennäköisesti selittää vaikutusteho ganetespib on useammin 5 x /viikko hoito. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että ganetespib hallinto joko aikataulussa riitti lakkauttaa sekä selviytymisen ja solujen kasvua signaalit kauan riitä estämään kasvaimen kasvua. Koska ganetespib oletettavasti johtaa menetykseen vielä asiakkaan proteiineja, sen voimakas antituumorivaikutus todennäköisesti heijastaa sen kohdistuvaan nämä ylimääräiset kohdeproteiinien samoin.

järjestelmä, joka tarkemmin jäljittelee patologian leukeemisten taudin teho ganetespib myös arvioitiin levitetään taudin malliin käyttäen HEL92.1.7 soluja. Ganetespib tehokkaasti elonjäämisetua tässä potilaalle tehdä mallissa, enemmän kuin kaksinkertaistui mediaani elinaika hiirten. Pitkittynyt säilyminen oli yhteydessä vähentänyt dramaattisesti tuumorikuorma luuytimessä, mistä on osoituksena merkittävästi vähentynyt tunkeutuminen ihmisen leukemiasolujen ja vähentää selkärangan etäpesäkkeitä. Yhdessä nämä tiedot ovat sopusoinnussa suora vaikutus ganetespib leukemiasolulinjoilla kasvuun

in vivo

ja osoittaa tehokkaan terapeuttisen hyödyn tämän yhdisteen JAK2

V617F-ajettu syöpäsairauksia.

kausaalista suhdetta konstitutiivista JAK2 aktiivisuus ja kasvainten on johtanut kehittämiseen erilaisia ​​tehokas ja selektiivinen JAK2 pienmolekyylisalpaajien [46].