Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aiemmissa työssä, osoitimme, että transkriptiotekijä Trim28 (kolmikantaisen motiivi, joka sisältää 28) näyttelee kasvain-vaimennin rooli varhaisen lavastettu adenokarsinooma keuhkojen koska sen kyky hillitä transkription solukierron säätelevien geenien. Tässä tarkastelemme Trim28 rooli epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka on vahvasti osallisena syövän etäpesäkkeiden. Olemme havainneet, että Trim28 on rooli TGF-β-indusoidun EMT ei-pienisoluinen keuhkosyöpä soluja. Hiljentäminen Trim28 kanssa estävän RNA: iden muuttaa ilmaus lukuisia EMT markkereita, kuten E-kadheriinin ja N-kadheriinin, kun taas yli-ilmentyminen Trim28 on päinvastainen vaikutus. Trim28 ilmentyminen indusoituu seuraavista TGF-β hoitoa sekä proteiini- että mRNA-tasoja. Trim28 puute heikentää TGF-β-aiheuttama EMT ja vähentää solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Lopuksi osoittavat, että ilmentyminen Trim28 vaikuttaa asetylaatio ja metylaation histonien E-kadheriinin ja N-kadheriinin promoottorit. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Trim28 edistää EMT ja voi olla tärkeää kasvaimen metastaasin keuhkosyövässä. Yhdessä meidän aikaisemmista töistä nämä tulokset viittaavat malliin, jossa Trim28 on tuumorisuppressorina aikaisin muutosprosessin keuhkosyöpää, mutta myöhemmissä vaiheissa se toimii onkogeenin.

Citation: Chen L, Muñoz- Antonia T, Cress WD (2014) Trim28 edistää EMT kautta asetukseen E-kadheriinin ja N-kadheriinin in Lung Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (7): e101040. doi: 10,1371 /journal.pone.0101040

Leikkaus: Olivier de Wever, Gentin yliopisto, Belgia

vastaanotettu 11 joulukuuta 2013 mennessä; Hyväksytty: 3 kesäkuu 2014; Julkaistu: 01 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Cancer Institute (CA119997 ja CA163068) ja Moffitt Cancer Center. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on ominaista menetys solu-soluadheesion ja napaisuuden, alas-säätely epiteelin markkereita, ja hankinta mesenkymaalisten markkereita ja fenotyypin [1]. Kertyvät todisteita tutkimukset EMT ovat sekaantuneet monia signalointi polkuja, mukaan lukien TGF-β, Notch, Wnt, EGF ja FGF [2]. Näistä TGF-β indusoi EMT tehokkaasti erilaisissa mallin solulinjojen ja

in vivo

[3]. Kuten monet muutkin biologiset prosessit, EMT on viime kädessä säädellään transkriptionaalisesti useiden transkriptiotekijöiden, kuten Snail1, Snail2, ZEB1 ja ZEB2 [4]. Lisäksi epigeneettiset määritteet on myös osoitettu olevan rooli säätelyssä EMT. Esimerkkejä on histonideasetylaasi- SIRT1 indusoi EMT kautta transkriptiotekijä ZEB1 taas histoni metyylitransferaasiestäjiä SUV39H1 ja G9a tukahduttaa E-kadheriinin ilmentymisen ja aiheuttaa EMT on Snail riippuvaisella tavalla [5], [6], [7].

Trim28 on jäsenenä evolutionally säilyneeseen transkription kofaktoreita, jotka ovat erilaisia ​​toimintoja [8]; mukaan lukien solujen jakautumisen, DNA: n korjaukseen, erilaistuminen ja pluripotenttisuus [9], [10], [11], [12]. Trim28 on erityisesti liitetty aktivointi EMT fibroblasteissa [13] ja kohdunkaulan syövän soluihin [14]. Riippuu yhteydessä Trim28 voi joko aktivoida tai tukahduttaa transkriptio kautta erillisten mekanismien [15], [16], [17], [18]. Trim28-välitteinen geenien on osoitettu olevan osallisena assosiaatio histoni metyylitransferaasi SETDB1, histonideasetylaasi- monimutkainen Nurd ja rekrytointi promoottorialueet kautta sekvenssi-spesifisen transkription tekijöitä [19], [20]. Tämä monimutkainen estää kohdegeenin transkription muuttamalla histonimodifikaation Myynninedistäjille [8]. Kun fosforyloitiin s824, Trim28 on osoitettu liittyvän transkriptiotekijä Oct3 /4 ja aktivoi Oct3 /4 kohdegeenien transkriptio [12]. Toinen mekanismi Trim28-välitteisen transkription aktivointi on kautta rekrytointi tiettyihin vaste-elementit, kuten glukokortikoidin reagoivan elementin (GRE), ja Nur vaste-elementti (Nure), jonka NGFI-B ja C /EBPβ vastaavasti [17], [18]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Trim28 voisi olla rooli syövän kehittymisen ja etäpesäkkeiden [13], [14]. Erityisesti Trim28 ilmentymistä säädellään ylöspäin syövän kudoksissa verrattuna normaaleissa kudoksissa [9], [21], [22], [23]. Kun etsintä rintasyövän etäpesäkkeiden liittyvien proteiinien, Trim28 tunnistettiin yhdeksi 197 proteiineista koholla ilme metastaattisessa kudoksissa [24].

Edellisessä työssä [9], huomasimme, että korkea Trim28 (kolmikantaisen motiivi on 28) proteiinien tasot korreloivat pidempi kokonaiselossaoloaika alussa lavastettu keuhkoadenokarsinooma potilaita, mutta ei lopulla lavastettu potilaille. Tämä havainto viittasi meille, että Trim28 voisi olla dual roolit keuhkosyöpä. Me arveltu, että rooli myöhemmissä vaiheissa saattaa liittyä EMT [14]. Jotta testata tätä hypoteesia, tutkimme vaikutus shRNAi välittämän Trim28 heikentymisen EMT NSCLC solulinjoissa (A549 ja H358). Olemme havainneet, että Trim28 edistää TGF-β-indusoidun EMT, ja että korkeat Trim28 suosii EMT viittaa siihen, että Trim28 saattaa olla säätelijä kasvaimen etäpesäkkeiden, erityisesti myöhemmässä vaiheessa keuhkosyövän kehitystä.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat, plasmidit ja reagenssit

Original keuhkosyövän solulinjat saatiin ATCC: ltä. A549 ja H358-soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia. Trim28-puutteellinen A549-solut (Trim28 shRNA), Trim28 taitava A549 ja vastaavasti johdettu ohjaus solulinjoja on kuvattu aiemmin [9]. H358-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti Trim28 shRNA valittiin 1 ug /ml puromysiiniä. H358-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti Trim28 valittiin 500 ug /ml G418: aa. Yksittäiset kloonit seulottiin Trim28 ilmentymistä. Samoin johdettu ohjaus solulinjoja käyttäen tyhjiä vektoreita. PcDNA-FLAG-HA-TIF1β ja PRL-TK kuvattu aiemmin [9]. pCS2-Myc-Trim28 [25] ja pGL3-E-kadheriinin [26] olivat antelias lahjoja Ryan Potts (UT Southwestern) ja Jia Fang (Moffitt Cancer Center), tässä järjestyksessä. TGF-β ostettiin R 90% konfluentteja. Kolme suora haavat naarmuuntunut kussakin kuopassa käyttämällä steriiliä 200 ui pipetin kärki. Solut huuhdeltiin varovasti PBS: llä ja 2 ml media (ilman FBS: ää tai joka sisälsi 10% FBS: a) lisättiin. Kuvia otettiin 40x suurennos heti naarmuuntumista ja uudelleen 24 ja 48 tuntia. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

Invasion määrityksissä

Invasion määritykset suoritettiin BD BioCoat Matrigel Invasion kammion (354480, BD Bioscences) seuraten valmistajan ohjeita. Erityisesti, A549-solut suspendoitiin uudelleen 5 x 10

4 solua /ml ja pantiin kammioon inserttien (kontrolli insertit tai Matrigel-päällystetty insertit). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 22 tunnin ajan, ja solut, jotka olivat vaeltaneet pestiin, kiinnitettiin metanolilla, värjättiin 0,5% kristallivioletilla ja lasketaan kolmen mikroskooppikentästä. Prosentuaalinen hyökkäys laskettiin jakamalla solujen keskimääräinen lukumäärä tunkeutuvat läpi Matrigel insertin, jonka keskimääräinen solujen lukumäärä kautta ohjaus insertin. Invaasio-indeksi määritettiin vertaamalla prosenttia hyökkäyksen Trim28 Knockdown solujen prosentuaalinen hyökkäyksen kontrollisolujen.

kolmiulotteisen monisoluisten sferoidiviljelmiä

kolmiulotteisen monisoluisten sferoidiviljelmiä luotu samalla tavalla kuin on kuvattu [28]. Lyhyesti, solut suspendoitiin uudelleen elatusaineeseen pitoisuuteen 5 x 10

6 solua /ml, 30 ui solususpensiota käytettiin tekemään pisaran ja 12 pisaroiden ladattiin kansi steriiliä 10-cm kudosta kulttuuri levy. Kansi oli huolellisesti kääntää ja 20 ui elatusainetta lisättiin kuhunkin pisaran ennen kuin ne saatetaan 10 cm: n kudosviljelymaljalle, joka sisälsi 6 ml kasvualustaa ja inkuboidaan yön yli. Seuraavana päivänä 20 ui kasvatusalustaa poistettiin kustakin pisaran ja 20 ui tuoretta väliainetta ilman TGF-β tai jotka sisältävät TGF-β (lopullinen konsentraatio, 5 ng /ml) lisättiin. Soluja inkuboitiin 72 tuntia ja korjataan RNA.

Tilastollinen

Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja esitetään keskiarvona +/- SD. Aineisto analysoitiin kaksisuuntaisella Studentin

t

-testissä varten merkitys.

P

arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä ja edustaa tähdellä lukuina.

Tulokset

Trim28 puute muuttaa ilmaus EMT merkkiaineiden

käsitellään rooli Trim28 A549 ja H358 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat, ohjaus ja Trim28 vajaiden solujen kehitettiin käyttämällä ei-hiljentäminen shRNA kontrollina ja shRNA kohdistaminen Trim28. Ensin käytettiin E kadheriinin vasta-aine ja konfokaalimikroskopialla kuvan E-kadheriinin ilmentymisen kontrolli A549-soluja ja Trim28 puutteesta A549s. Kuva. 1A osoittaa, että valvonta A549 solut ilmentävät suhteellisen alhainen E kadheriinin, kun taas Trim28-vajaiden solujen ilmentävät runsaasti E kadheriinin lokalisoitu solukalvon. Tasot β-tubuliinin ei vaikuttanut Trim28-puutos. Reaaliaikainen PCR: ää käytettiin ekspression tutkimiseksi lisää EMT merkkiaineiden ohjaus ja Trim28 puutteesta A549s ja H358-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, E-kadheriinin mRNA lisääntyi, kun taas N-kadheriinin ja Snail2 määrä väheni Trim28 knockdown soluissa. In H358-solut (Fig. 1 B alhaalla) E-kadheriinin on lisääntynyt, kun taas fibronektiinin, Snail1, Snail2, ja Twist1 vähenevät Trim28 pudotus soluissa. Western blotit vahvisti, että Trim28 Knockdown johti lisääntymiseen E-kadheriinin ilmentymisen ja vähenemiseen N-kadheriiniekspressiota proteiinitasolla (Fig. 1 C). Väheneminen N-kadheriinin proteiini näkyi myös konfokaalimikroskopiaa (katso kuva S1). Vastaavat positiivinen korrelaatioita Trim28 ilmaisun ja N-kadheriinin ilmentymisen ja negatiivisen korrelaation Trim28 ilmaisun ja E-kadheriinin ilmentymisen on myös selvää, kun joukko käsittelemättömien solulinjoista tutkitaan Western blottauksella (katso kuva S2).

, ohjaus ja Trim28 pudotus A549 solut värjättiin (kuten kohdassa ”Kokeelliset menettelytavat”) ja tutkittiin konfokaali immunofluoresenssimikroskoopilla, seuraavasti: E-kadheriinin (vihreä, yläpaneeli), β-tubuliinia ( vihreä, alapaneeli), ja DAPI (sininen). Sulautunut kuvat ovat pohjalle kunkin paneelin.

B

, RNA uutteet ohjaus ja Trim28 pudotus A549 ja H358-solut altistettiin reaaliaikainen PCR-ekspression määrittämiseksi kohdegeenien, kuten on ilmoitettu.

Tähdellä

edustavat merkittävää

p

arvot, *:

p

0,05.

C

, ilmaus EMT markers E-kadheriinin ja N-kadheriinin mitattiin ohjaus ja Trim28 pudotus A549 ja H358-solujen western blottauksella.

Trim28 yliekspressio muuttaa ilmaus EMT markkereita

koska aikaisempi työ on raportoitu, että Trim28 voi toimia transkription kofaktorina [16], [17], kysyimme Trim28 voi säädellä aktiivisuus E-kadheriinipromoottorin käyttäen lusiferaasireportteri- konstrukti vetämänä E-kadheriinipromoottorin. Tyhjä pcDNA vektori tai pCS2-Myc-Trim28 transfektoitiin A549 ja H358-soluja yhdessä E-kadheriinin promoottoriajetun lusiferaasireportteri- ja transfektio ohjaus reportteri (PRL-TK Renilla Luciferase). Kuva. Kuvio 2A esittää, että E-kadheriinin promoottori on merkittävästi tukahduttaa Trim28 yli-ilmentyminen molemmissa solulinjoissa. Se voi käsitellä suurempaa määrää markkereita A549 ja H358-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti Trim28 saatiin yhdessä ohjauslinjat samoin johdettu käyttämällä tyhjän vektorin. Kuten odotettua, Trim28 yliekspressio johti pienentyneeseen E-kadheriinin ilmentymisen tasoja kun taas N-kadheriinin kohoamiseen (Fig. 2B). Samanlaisia ​​tuloksia (Fig. 2C) saatiin mRNA-tasolla käyttämällä reaaliaikaisella PCR: llä. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Trim28 voi edistää EMT keuhkosyövän solulinjat.

, A549 ja H358 transfektoitiin kolmena rinnakkaisena E-kadheriinipromoottorin lusiferaasireportteri-, PRL-TK reportteri, ja ekspressioplasmidit osoitettu kuvassa. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen määrittämiseen lusiferaasin tasoja.

B

, ohjaus (pcDNA3) ja Flag-Trim28 pysyvästi ilmensivät A549 ja H358-soluja analysoitiin E-kadheriinin ja N-kadheriinin tasoa western blottauksella.

C

, RNA uutteet ohjaus ja Trim28 pysyvästi ilmensivät A549 ja H358-solut altistettiin real-time PCR. Ilmentyminen kohdegeenien määritettiin.

Tähdellä

edustavat merkittävää

p

arvot, *:

p

0,05.

Trim28 ilmentyminen indusoituu TGF-β

on tunnettua, että Trim28 ilmaisun ja TGF-β signalointi sekä lisääntynyt erilaisia ​​syöpiä, kuten keuhko- [9], [23], [29]. Sen määrittämiseksi, nämä havainnot on kytketty keuhkosyöpä, käytimme kaksi ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat, jotka käyvät läpi EMT upon TGF-β kohtelun mallit [30], [31]. Kuten voidaan nähdä kuviosta 3A, Trim28 proteiinin tasot kasvavat, kun TGF-β hoidon molemmissa solulinjoissa. Vaikka pohjapinta taso Trim28 oli hyvin alhainen Trim28 pudotus soluissa, sen ilmentyminen kuitenkin indusoi seuraavien TGF-β inkubointia. Reaaliaikainen PCR osoitti samanlainen tulos mRNA-tasojen (kuva 3B).

ja

B

, A549 ja H358 jotka ilmentävät pysyvästi ei-hiljentäminen shRNA ja Trim28 shRNA käsiteltiin TGF-β (2 ng /ml) 3-10 päivää. Kokosolulysaateista ja RNA uutteet alistettiin western blotting käyttäen mainituilla vasta-aineilla (A) ja reaaliaikainen PCR (B).

Tähdellä

edustavat merkittävää

p

arvot, *:

p

0,05.

Trim28 osallistuu TGF-β-aiheuttama EMT

TGF-β käsitellyt solut käyvät läpi EMT jota voidaan luonnehtia morfologiset solu muuttuu kivi-kuin karan kaltainen muoto [32]. Sen määrittämiseksi, onko Trim28 vaaditaan TGF-β-indusoidun EMT, käsittelimme ohjaus ja Trim28 pudotus solujen TGF-β (2 ng /ml), ja havaittiin morfologisia muutoksia ajan mittaan. Kuva. 4A osoittaa, että hankinta mesenkymaalisten morfologia valvonta H358 aiheuttama TGF-β ei havaittu Trim28 pudotus soluissa samoissa olosuhteissa viittaa vahvasti siihen, että Trim28 on osallisena TGF-β aiheuttama EMT. Käyttäen reaaliaikaista PCR selvitimme mRNA tasoa E-kadheriinin ja muut tunnetut mesenkymaalisten merkkiaineiden A549 ohjaus ja Trim KD solujen jälkeen TGF-β hoitoa. Vaikka Trim28 Knockdown soluissa joidenkin mesenkymaaliset geenejä vähäisiä ylössäätö, vankka induktio mesenkymaalisten merkkiaineiden N-kadheriinin, fibronektiini, vimentiinistä, ja Twist1 aiheuttama TGF-β hoito oli merkittävästi heikennetty (kuvio 4B). Western blot tulokset (4C) vahvistavat, että TGF-β pystyy vähentämään E-kadheriinin ja säätää ylös N-kadheriinin ilmentymisen kontrolli-soluissa, mutta se ei tee niin Trim28 pudotus soluissa.

, ohjaus ja Trim28 pudotus soluja käsiteltiin TGF-β tai ne jätetään hoitamatta. Solut valokuvattiin 40-kertaisella suurennuksella.

B

, RNA uutettiin kontrolli ja Trim28 pudotus A549-soluja käsiteltiin TGF-β kuten edellä tai ne jätetään hoitamatta. Reaaliaikainen PCR suoritettiin ja ilmentyminen kohdegeenien määritettiin.

C

, ohjaus ja Trim28 knockdown A549 ja H358-soluja käsiteltiin TGF-β (2 ng /ml), kunnes morfologian muutoksia havaittiin tai ne jätetään hoitamatta. Kokosolulysaateille alistettiin western blottaus käyttämällä vasta-aineita kuten.

ehtyminen Trim28 vähentää solujen maahanmuuton ja invaasiota

rooli Trim28 solujen maahanmuuton ja invaasiota arvioitiin wound- parantava määritys ja matrigeelin-pohjainen transwell invaasiomääritys. Aiemmissa tutkimuksissa havaittiin, että Trim28 vaikuttaa soluproliferaation A549-soluja, mutta ei merkittävästi H358-soluissa (julkaisemattomia tuloksia ja [9]). Tässä käytimme elatusaineita kanssa tai ilman FBS jättää osuus solujen lisääntymistä määritettäessä muuttoa A549-solut. Trim28 pudotus solut osoittivat vähemmän haavansulkemiseen kuin kontrolli soluja (Kuvio 5A ja 5B) kanssa tai ilman seerumia. Lisäksi, Matrigel-pohjainen transwell invaasiomääritys osoittivat, että Trim28 pudotus esti solujen invaasion A549-solut (5C).

, ohjaus ja Trim28 pudotus H358 solut altistettiin haavan -healing määrityksessä. Solut valokuvattiin heti alusta, ja 24 ja 48 tuntia sen jälkeen tyhjästä.

B

, ohjaus ja Trim28 pudotus A549-soluja altistettiin haavojen määritystä läsnä ollessa tai ilman seerumia. Solut valokuvattiin heti alusta ja 24 tuntia myöhemmin.

C

, ohjaus ja Trim28 pudotus solut maljattiin kolmena päällä kuoppiin Matrigel-päällystetty tai päällystämätön kammioita. 18 tunnin kuluttua solut, jotka olivat tunkeutuneet läpi matrigeelin kerroksen kiinnitettiin ja värjättiin. Prosenttiosuus invasiiviset solut esitetään pylväskaaviona.

Tähdellä

edustavat merkittävää

p

arvot, *:

p

0,05.

D

, ohjaus ja Trim28 pudotus A549-soluja viljeltiin kolmiulotteinen malli ja käsiteltiin TGF-β (5 ng /ml) 72 tuntia. RNA uutettiin soluista ja altistettiin real-time PCR. Ilmentyminen kohdegeenien määritettiin.

kolmiulotteisen soluviljelmissä on osoitettu läpikäyvän EMT tehokkaammin kuin yksikerrossoluissa [28]. Sen tutkimiseksi, onko Trim28 Knockdown tukahduttaa EMT on kolmiulotteinen malli, me kylvetään ohjaus ja Trim28 pudotus A549 solujen kannet P100 viljelymaljaan ja salli heidän muodostaa roikkuu pisaroita kuvatulla

Materiaalit ja menetelmät

. 72 tunnin kuluttua, kun läsnä on TGF-β, solut kerättiin ja RNA uutettiin reaaliaikainen PCR-analyysi EMT markkereita. Kuva. 4B paljastaa, että sen jälkeen, TGF-β hoitoon ilmentymisen vimentiinin, Snail1, ja Snail2 valvonta A549-soluja muuttunut enemmän dramaattisesti (6-10 kertainen) 3D-malli (Fig. 5D) kuin monolayers (1,5-2,5-kertainen). Nämä EMT markkereita eivät olleet säädellään ylöspäin Trim28 pudotus soluissa jälkeen TGF-β hoitoa. Yhdessä nämä tulokset tukevat päätelmää, että Trim28 on säätelijä EMT.

Trim28 muuttaa histoni 3 muutostöitä E-kadheriinin ja N-kadheriinin promoottorit

Trim28 on osoitettu säätelemään geeniekspressiota kautta muuttaminen histonien kohdegeenin promoottorit [8]. Tunnetut kumppanit Trim28 kuuluvat SETDB1 [19], histoni 3 lysiini 9-erityisiä metyylitransferaasi ja histonideasetylaaseja kuten HDAC1 [8]. Aiemmissa työssä, huomasimme, että Trim28 Knockdown lisää histonin 3 lysiinin 9 asetylointi tietyistä kohde promoottorit [9]. Tässä tutkimme, Trim28 vaikuttaa histoni 3 muuttaminen E-kadheriinin ja N-kadheriinin promoottorit. ChIP määrityksiä käytettiin ja IgG, asetyyli-H3K9, dimetyyli-H3K9, ja trimetyyli-H3K9 vasta-aineita käytettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, on Trim28 vajaiden solujen, asetylointi lisääntynyt ottaa huomioon, että metylaatio on vähentynyt histonin 3 lysiinin 9 E-kadheriinin promoottorin verrattuna ohjata shRNA soluihin. Vastakkainen vaikutus N-kadheriinin havaittu samoissa soluissa.

, ChIP testit suoritettiin ohjaus ja Trim28 pudotus A549-soluja. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin tutkimaan täyttöaste IgG, asetyloitua histoni 3 K9, dimetyloitujen histoni 3 K9, ja trimetyloidaan histoni 3 K9 E-kadheriinin ja N-kadheriinin promoottorit. B, ChIP testit suoritettiin ohjaus ja Trim28 ilmentyi stabiilisti A549-soluja. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin tutkimaan täyttöaste IgG, asetyloitua histoni 3 K9, dimetyloitujen histoni 3 K9, ja trimetyloidaan histoni 3 K9 E-kadheriinin ja N-kadheriinin promoottorit.

Lisäksi osoittamiseksi onko Trim28 yli-ilmentyminen voi vaikuttaa E-kadheriinin ja N-kadheriinin promoottoreita, käytimme pcDNA3 ohjaus ja Trim28 taitava A549-solut ja suorittaa ChIP määritys. Kuviossa. 6B, toisin kuin havaitut tulokset Trim28 pudotus soluissa, asetylointi histoni H3K9 on vähentynyt ja metylaatio on lisääntynyt Trim28-taitavia soluja. On N-kadheriinipromoottorin, asetylointi histonien 3 H3K9 lisätään ja metylaatio on vähentynyt. Kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että Trim28 muuttaa E-kadheriinin ja N-kadheriiniekspressiota (ainakin osa) histonimodifikaation joka puolestaan ​​säätelevät niiden transkriptio.

Keskustelu

Olemme osoittaneet, että Trim28 voi vaikuttaa translaation jälkeinen modifikaatio histoni 3 E-kadheriinin ja N-kadheriinin promoottorit. Tässä vaiheessa emme ole selvitetty erityisiä mekanismeja. Trim28 saattaa välittää näitä muutoksia suoraan tai välillisesti. Suora mekanismi liittyisi Trim28 ja Trim28 liittyvä histoni määritteet ollessa palvelukseen kadheriinin promoottoreita EMT säätelevä transkriptiotekijöiden. Trim28 on osoitettu sitovan ja säätelevät monia transkriptiotekijöitä tällä tavalla [16], [19], [33]. Kuitenkin olemme suunnitelleet alukkeet suunnattu -2 kb 0,5 kb E-kadheriinin ja N-kadheriinin promoottoreita ja ei havaita Trim28 sitova alue Chip määrityksellä (julkaisemattomia havaintoja). Toinen mahdollisuus on, että Trim28 säätelee ilmentymistä EMT liittyvien transkriptiotekijöiden, jotka säädellä EMT geenejä. Transkription tekijöitä, jotka voivat sijaita suoraan E-kadheriinin promoottorin sisältävät Snail1, Snail2, ZEB1, ZEB2, Twist1 ja FOXC2 [4]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että ilmaus monista transkriptiotekijöiden on muuttunut Trim28 yliekspressio tai puute, joka tarjoaa todisteita tukemaan mahdollisuutta. Lisätutkimukset tutkii tämän mekanismin.

Merkittävin osa työmme kuvattu tässä, että Trim28 vaikuttaa TGF-β-aiheuttama EMT keuhkosyövän kautta transkription säätelyyn useiden epiteelin ja mesenkymaaliset markkereita. Hiiri ehdollinen tyrmäys tutkimukset ovat selvästi osoittaneet, että Trim28 ja siihen liittyvät perheenjäsen voi käyttäytyä kuin tuumorisuppressoreilla [34]; kuitenkin, muut tutkimukset osoittavat, että Trim28 on kohonneita ja onkogeeninen vaikutuksia erilaisia ​​syöpiä [21], [35]. Ehdotamme mallin kuvassa. 7 selittää kaksoisrooli Trim28 keuhkosyövässä kehittämiseen ja etäpesäke. Oletamme, että Trim28, säätelemällä useita vaihtoehtoisia väyliä voi olla sekä kasvain tukahduttamalla ja onkogeenisten toimintaa paljon kuin TGF-β-signalointireitin tiedetään pelata monimutkaisen roolin kasvaimien syntyyn. Toisaalta TGF-β1 säätelee negatiivisesti solusyklin ja toimii tuumorisuppressorina normaaleissa ja pre-malignment kudoksissa. Toisaalta, TGF-β, kasvainsolujen erittämiä, edistää tuumorin invaasiota ja etäpesäkkeiden [36]. Ehdotamme, että Trim28 vaikuttaa merkittävästi TGF-β kykyä hillitä solujen kasvua ja TGF-β1 aiheuttavan EMT. Nämä mahdollisuudet eivät ole toisiaan poissulkevia ja tämä verkko voi olla vielä monimutkaisempi, kun vaiheita ja syöpien pidetään. Kuten kuviossa 7 on esitetty, normaaleissa kudoksissa ja varhaisessa vaiheessa syöpiä, Trim28 on vastuussa solusyklin sääntelyn kautta E2F transkriptiotekijöiden ja HDAC: t; Näin ollen, Trim28 osoittaa antiproliferatiivista toimintaa ja toimii tuumorisuppressorina. Loppuvaiheen tai metastaattisen syöpiä, korkea Trim28 osaltaan EMT kautta transkription säätelyyn epiteelin ja mesenkymaalisten geenit, seurauksena, soluja korkea Trim28 on yleensä enemmän invasiivisia ja metastaattinen luonto. Tämä malli tukee Kirjallisuudessa [13], [24] ja havaintomme [9]. Tuloksemme saattavat valaista kohti ymmärrystä dual roolit TGF-β signalointi kasvaimissa.

Tämä malli selittää tätä työtä ja edellisessä osoittaviin tuumorisuppressorina rooli Trim28 [9].

tukeminen Information

Kuva S1.

Trim28 puute vähentää ilmentymistä N -cadherin.

C

ontrol ja Trim28 knockdown A549 solut värjättiin (kuten kohdassa ”Kokeelliset menettelytavat”) ja tutkittiin konfokaali immunofluoresenssimikroskoopilla, seuraavasti: N-kadheriinin (vihreä, yläpaneeli), β-tubuliinin (vihreä, pohjapaneeli) ja DAPI (sininen). Sulautunut kuvat ovat alareunassa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0101040.s001

(TIF) B Kuva S2.

Trim28 ilmentyminen osoittavat negatiivinen korrelaatio E kadheriiniekspressiota ja positiivinen korrelaatio N-kadheriiniekspressiota sarjassa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä linjat. A, kokosolulysaateille suoritettiin western blotting käyttäen mainituilla vasta-aineilla. B, kaistaintensiteettejä kvantitoitiin ja piirretty log mittakaavassa. Korrelaatiot eivät ole tilastollisesti merkitseviä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0101040.s002

(TIF) B