Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

miR-26a on keskeisessä rooli tuumorigeneesissä, joko tuumorisuppressori tai onkogeenisen miRNA, riippuen eri kasvaintyypeissä. Kuitenkin toiminta miR-26a haimasyövän ei ole selkeästi selvitetty. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää roolit miR-26a haimasyövän ja sen yhteys potilaiden selviytymiseen haimasyöpä.

Methods

ilmentyminen miR-26a tarkasteltiin 15 paria haimatiehyeeseen (PDAC) ja niiden viereisten hyvänlaatuinen haiman kudoksista (ABPT), jonka qRT-PCR. Tulokset vahvistettiin

in situ

-hybridisaatio käyttämällä kahta paneelit 106 PDACs ja niiden ABPT mikrosirujen. Yhdistys miR-26a ilmaisutapoja kokonaiselossaolo määritettiin. Leviämisen ja solusyklin jakautumisen Capan-2, SW-1990 ja Panc-1-solut, jotka on transfektoitu miR-26a jäljittelee tai miR-26a-inhibiittori, arvioitiin käyttäen Cell Counting Kit-8-määritys ja virtaussytometria, vastaavasti. Solu kasvainten muodostumiseen arvioitiin kautta hiiren vierassiirrekokeissa. Sykliini D2, E2, EZH2, ja PCNA tasot analysoitiin Western blot ja immunohistokemia.

Tulokset

miR-26a ilmentyi sytoplasmassa haimatiehyen epiteelisolujen, kun taas sen ilmentyminen oli huomattavasti vaimentua in PDAC kudoksissa verrattiin ABPT. Potilaat, joilla on alhainen miR-26a ilme oli huomattavasti lyhyempi selviytymisen kuin ne, joilla on korkea miR-26a ilme.

in vitro

ja

in vivo

määritykset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-26a johti solusyklin pysähtymiseen, esti solujen lisääntymistä, ja laski kasvaimen kasvua, joka liittyi sykliini E2 downregulation.

Johtopäätökset

miR-26a on tärkeä vaimennin haiman duktaalikarsinooma, ja voi osoittautua uusi ennustetekijä ja terapeuttinen kohde haimasyövän hoitoon.

Citation: Deng J, hän M, Chen L, Chen C, Zheng J, Cai Z (2013) menetys miR-26a-välitteisen transkription jälkeinen asetus sykliini E2 Haimasyöpä Cell Proliferation ja Vähentynyt Patient Survival. PLoS ONE 8 (10): e76450. doi: 10,1371 /journal.pone.0076450

Editor: Vincenzo Coppola, Ohio State University Kattava Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 marraskuu 2012; Hyväksytty: 27 elokuu 2013; Julkaistu: 08 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (Hanke nro 81172077) ja Shanghai Biopankkiverkosto yhteistä ihmisen kasvainkudoksessa rahasto (Hanke nro 12DZ2295102). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä, etenkin haiman kanava (PDAC), on neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Mediaani elinaika alle 6 kuukautta ja keskimääräinen 5 vuoden pysyvyys on alle 5%, kuolleisuus-ilmaantuvuussuhde potilaille haimasyöpä on noin 99%, joilla on erittäin huono ennuste [1], [2] . Siksi molekyylitason mekanismeja kasvain pahanlaatuinen muutosprosessi, johon kuuluu myös MikroRNA (miRNA), on ymmärrettävä, että parannettu diagnosointiin ja hoitoon haimasyövän [3], [4].

miRNA ovat luonnostaan esiintyviä, pieniä, yksijuosteisia, ei-koodaavaa RNA: t, jotka välittävät geenin ilmentymisen transkription jälkeisellä ja translaation tasolla sekä kasvien ja eläinten [5], [6]. Nämä molekyylit kriittisiä rooleja ihmisen syövissä, kuten haimasyöpä [7], [8], sekä syövän käyttäytyminen, mukaan lukien sen leviämisen, invaasio, muuttoliike, apoptoosin, ja lääkeresistenssin. Mirna toiminnallinen verkosto syöpään liittyy useita näkökohtia kasvaimen synnyssä [9]. Tämä verkosto voidaan käyttää arvioimaan diagnoosin ja ennusteen syövän sekä arvioimaan mahdollisia terapeuttisia vaihtoehtoja.

miR-26a on todistettu kasvain vaimennin, joka on merkittävästi vaimentua maksasolukarsinoomassa (HCC) [10]. Vähentynyt miR-26a tasot on yhteydessä huonoon ennusteeseen; nämä tasot ovat ennustaa terapeuttista vastetta potilailla, joilla on HCC interferoni-α. Lisäksi miR-26a yli-ilmentyminen on korreloitu merkittävä kasvaimen taantumiseen, mikä osoittaa, että miR-26a uudelleen syöpäpotilailla voi olla tehokas hoitostrategia [11]. Edellisessä tutkimus osoitti, että kasvaimen tiettyä miR-26a yliekspressio, ohjaa hAFP-TERT dual-promoottori, vähentynyt elinkelpoisuuden kasvainsolujen HCC jonka ekspressiota sääteleviä estrogeenireseptorin (ER) -α, progesteronireseptori (PR) , p53, sykliini D2, ja E2 [12]. Kuitenkin tarkka suhde miR-26a ja haimasyövän pysyy tuntemattomana.

Tässä tutkimuksessa selvitimme miR-26a ekspressiotasot ihmisen PDAC kudoksissa. Selvitimme kliinistä merkitystä miR-26a downregulation ja sen rooleja solukasvun ja solukierron jakelu. Lisäksi käytimme hiirimallissa tutkia mahdollista roolia miR-26a haiman kasvainten synnyssä. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy perustiedot ymmärtää paremmin synnyssä haimasyövän ja sen mahdollisia terapeuttisia strategioita.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä tutkimus suoritettiin noudattaen Helsinki suuntaviivat ihmisen aineopintoja ja hyväksyi Institutional Review board of Second Military Medical University, Shanghai, Kiina. Allekirjoitettu suostumus saatiin kaikilta TET näytteiden keräämiseen ja analysointiin. Kaikki samaa eläintä hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean toisen Military Medical University.

Potilaille ja Kudosnäytteiden

Tiedot potilaista, joilla PDAC haettiin yli 3 vuoden aikana (tammikuu 2008-joulukuu 2010) alkaen patologian osaston arkistoista Changhai sairaala, toinen Military Medical University in Shanghai, Kiina ja Shanghai Biopankkiverkosto yhteistä ihmisen kasvain kudosta. Kaikkia potilaita hoidettiin kirurgisesti, ja yhteensä 106 paria näytteiden PDACs ja niiden ABPT olivat mukana. Lisäksi ylimääräinen 15 paria PDAC ja niiden ABPT kerättiin potilailta kirurgisissa asemointia ja varastoitiin nestemäisessä typessä. Potilaat, kliininen esitys, lavastus, laboratoriotulokset, hoito, objektiivinen vaste, selviytyminen, ja muut tarvittavat tiedot saatiin sairaalan tietojärjestelmästä. Potilaat arvioitiin vakiomenetelmillä, mukaan lukien niiden historiaa, lääkärintarkastus, ja biokemialliset-hematologisten testejä. TNM Välivarastointi System käytettiin määrittämään potilaan taudin tilasta.

morfologinen analyysi ja rakentaminen Tissue Microarray

Kaikki näytteet on saatu leikkausta, kiinteät formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Jaksot 4 um paksuus värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ennen arvioidaan kolmella patologit varten morfologisia ominaisuuksia haimasyövän, mukaan Maailman terveysjärjestö WHO luokittelu ruoansulatuskanavan [13]. Kudossiruina (TMA) rakennettiin aikaisemmin kuvatulla [14]; Kunkin mikrosirun sisälsi kaksi paneelit 106 PDACs ja niiden ABPT jotka järjestettiin 2,0 mm halkaisijaltaan sydämiä.

Käänteiskopiointia Reaction Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) B

Yhteensä , 15 paria jäädytettyjen PDACs ja niiden ABPT yksilöt (makro-leikellään) käytettiin qRT-PCR mukaan Invitrogen protokollan. U6 käytettiin endogeenisen ohjaus normalisoida määrä kokonais-RNA kussakin näytteessä. qRT-PCR suoritettiin kolmena kappaleena, jossa nontemplate valvontaa. Suhteellinen ilmentyminen laskettiin vertailevaa Ct menetelmällä (2

-ΔΔ

Ct

) [12]. Alukesekvenssejä on esitetty taulukossa S1.

miRCURY LNA microRNA Detection

in situ

hybridisaatio ja Survival Analysis

Lukittu nukleiinihappo (LNA) –

in situ

hybridisaatio (ISH) suoritettiin PDAC TMA käyttäen vastaavaa miRCURY LNA ™ antureista vastaan ​​on-miR-26a tai on-miR-21 (positiivinen kontrolli) (Exiqon, Vedbaek, Tanska). Näitä koettimia käytettiin mukaisesti valmistajan protokollan, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Kolorimetrinen havaitseminen suoritettiin inkuboimalla näytteitä 30 min käyttäen substraattia-kromogeeniliuoksen, 0,04% DAB (DAKO, Tanska) ja 0,05% H

2O

2. Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä ennen tutkimista valomikroskoopilla (Leica, Saksa) [16].

LNA-ISH tuloksia semikvantitatiivisesti arvioitiin. Perustuen intensiteetti hybridisaatio, näytteet pisteytettiin ”0” negatiivinen; ”1” heikosti positiivinen; ”2” kohtalaisen positiivisia; ja ”3” vahvasti positiivinen. Niiden positiivisten epiteelisolujen pisteytettiin ”0” ≤10%; ”1” 11% -25%; ”2” 25% -50%; ja ”3” ≥50%. Intensiteetti ja prosenttiosuus pisteet laskettiin yhteen, jolloin saadaan lopullinen ISH pistemäärä, joka oli luokiteltu ”negatiivinen” ( 3) tai ”positiivisia” (≥3) [17].

LNA-ISH tulokset miR-26a tai miR-21 ja kliiniseen hoitoon tietoja 106 potilasta analysoitiin edelleen. Hoito vastaus kemoterapiaa ja sädehoitoa, mukaan lukien potilaan kliinisten oireiden, tietokonetomografia (CT), magneettikuvaus (MRI) havainnot ja CA19-9 tasot, olivat objektiivisesti arvioida. Näin ollen kaikki potilaat tutkimukseen sisältyvät arvioitiin niiden hoitovasteen, joka sai arvosanan ”täydellinen vaste”, ”osittainen vaste”, ”vakaa sairaus”, ”etenevä sairaus”, ”varhainen kuolema tauti tai myrkyllisyyden”, ja niin edelleen.

sykliini D2, sykliini E2 ja PCNA Immunochemistry in haimasyövän kudokset

leikkeitä esikäsiteltiin 65 ° C: ssa 2 h, jonka jälkeen lajitellut deparaffinization. Antigeeni haku suoritettiin ennen inkubointia primaaristen vasta-aineiden sykliini D2 (1:300 laimentamista; Millipore), sykliini E2 (1:300 laimennos, Millipore), ja proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA) (1:300 laimennus; Dako) , yön yli 4 ° C: ssa, jossa on normaali IgG negatiivisena kontrollina. Sen jälkeen laseja inkuboitiin 2 h huoneenlämpötilassa HRP-konjugoidulla sekundäärisellä vasta-aineella (1:100, DAKO). HRP-aktiivisuus havaittiin käyttäen Liquid DAB + Alustan-Kromogeeni System (DAKO). Lopuksi leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä ja valokuvataan. Immuunihistokemialliset Tulokset arvioitiin käyttäen puoli- kvantitatiivista menetelmää, jossa lopullinen tulokset perustuvat intensiteetti ja prosenttiosuus positiivisten epiteelisolujen määräytyy niiden immunokemiassa; nämä tulokset luokiteltiin ”negatiivinen” ( 3) tai ”positiivisia” (≥3) [17]. PCNA tasot pisteytettiin mukaan prosenttiosuuteen epiteelisolujen kuin ”0” ≤5%; ”1” 5% -25%; ”2” 25% -50%; ”3” ≥50%. Näytteet sijoitettiin ryhmiin, joissa on ”alhainen proliferatiivinen indeksi” ( 2) tai ”korkea proliferatiivinen indeksi” (≥2) [13], [17]. Immuunihistokemialliset Tulokset sitten vielä analysoitu seurantatiedot.

Cell Culture

PDAC solulinjat Capan-2, SW-1990 ja Panc-1, reilusti (Grade 1) , kohtalaisen (luokka 2), ja huonosti (luokka 3) eriytetty haimasyöpä, vastaavasti, saatiin Kiinan Center for Type Culture Collection (Wuhan, Kiina). Soluja kasvatettiin Dulbeccon vähintään Essential Medium (täydennetty 10% naudan sikiön seerumia) ja pidettiin 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa inkubaattorissa.

Plasmidit ja solutransfektiolle

PDAC solulinjat Capan-2, SW-1990 ja Panc-1 ympättiin 3 x 10

5 solua per kuoppa 12-kuoppalevyille ja transfektoitiin miR-26a jäljittelee estäjät, tai sykliini E2 siRNA (Dharmacon) lopulliseen konsentraatioon 100 nM käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen), mukaisesti valmistajan protokollan.

miR-26a yli-ilmentymisen vektoriin p-hTERT-miR-26a (pTM) ja sen valvontaan vektori p-hTERT (pT) muodostettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Tuottaa stabiileja solulinjoja, 4 x 10

5 solua kuhunkin kuoppaan 6-kuoppalevyllä transfektoitiin 2 ug plasmideja (pTM tai pT) käyttäen Lipofectamine 2000, mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Positiiviset viljelmät valitaan 800 ug /ml G418: aa ja 2 viikkoa.

Western blot -analyysi

Solut pestiin jääkylmällä PBS: llä, lyysattiin ja suspendoitiin lyysipuskuria (Promega). Saatu kokonaisproteiinista uute erotettiin 12% SDS-PAGE-geeleillä. Immunoblottaus suoritettiin polyvinylideenifluoridilla kalvoja. Ensisijaisen ja toissijaisen vasta-aineita käytettiin kanin anti-humaani-vasta-aineella ja vuohen anti-kani-IgG: tä, vastaavasti (Sigma). Immunodetektio suoritettiin käyttäen HRP-pohjainen kemiluminesenssisubstraatilla [18]. Taulukko S2 luetellaan vasta tässä tutkimuksessa käytetyt.

Cell Proliferation ja Cell Cycle Analyysit

proliferaatiopotentiaali Solujen analysoitiin protokollan mukaisesti, että Cell Counting Kit-8 (CCK-8 ) määritys (Dojindo, Japani). Solut trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa PBS: llä, kerättiin sentrifugoimalla, kiinnitettiin 70% kylmällä etanolilla, inkuboitiin propidiumjodidilla ja analysoitiin fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (Miltenyi, Saksa).

In vivo

tuumorigeneesiä Pitoisuus

SW-1990-solujen kohtuullisesti erilaistunut PDAC transfektoitiin stabiilisti pTM (p-hTERT-miR-26a) tai pT (kontrollivektori). Transfektoidut solut kerättiin, suspendoitiin 200 ul: aan PBS: ää (1 x 10

7-soluissa), ja injektoidaan subku- in 4 viikkoa vanhoja koiraspuolisia BALB /c-nude-hiiriin (

n

= 8). Välttää ennestään erot yksittäisten hiirten, sekä stabiileja solulinjoja (pTM tai pT) on erikseen ruiskutetaan vastapäätä kylkiin saman hiiri; transfektoiduissa soluissa pTM injektoitiin vasempaan kylkeen, kun taas valvonta (transfektoitu vektorilla pT) injektoitiin oikeaan kylkeen. Hiiriä pidettiin tietyllä patogeenittomassa ympäristön 5 viikkoa ja lopetettiin sitten. Kasvaimen tilavuus

V

laskettiin sen pituus

L

ja leveys

W

, seuraavan yhtälön mukaisesti

V

= 0,4

LW

2. Hiiren ksenograftikasvaimissa kiinnitettiin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin vaha immunokemiallisesta analyysi sykliini D2, E2, ja PCNA.

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta ( SD). Yhdistysten miR-26a ilmaisu kliinisen patologisen ominaisuudet analysoitiin käyttämällä Chi-neliö tai Mann-Whitney testejä. Selviytymisen käyrä rakennettiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin käyttäen log-rank-testi. Ryhmät verrattiin käyttäen Studentin

t

-testi. Korrelaatio analyysi suoritettiin käyttäen Pearsonin korrelaatiota analyysiä. Kaikki todennäköisyys arvot analysoitiin käyttäen kaksisuuntaista testiä ja pidetään merkittävinä, kun

P

0,05. Analyysit tehtiin SPSS (versio 17.0) ohjelmisto (SPSS Inc., Chicago, USA).

Tulokset

alassäätely miR-26a Haimasyöpä Kudokset liittyy Survival

kliinis ominaisuudet 106 tapausta PDAC on esitetty taulukossa 1. suurin osa näistä potilaista oli vaiheessa II (70,8%), mikä osoittaa, että havainnot ovat tärkeitä potilaille, jotka ovat edelleen kirurgisesti kokoisen kanssa parhaat mahdollisuudet 5 vuoden pysyvyys. qRT-PCR-analyysi osoitti, että miR-26a ilmentyminen oli merkitsevästi alhaisempi PDAC kudoksissa kuin normaaleissa kudoksissa (

n =

15,

P

0,05; Fig. 1A), mikä oli edelleen vahvistanut LNA-ISH analyysi 106 tapausta PDAC. LNA-ISH osoitti, että miR-26a oli läsnä sytoplasmassa haimatiehyen epiteelisolujen (kuviot. 1C ja 1D). Mukaan intensiteetti ja prosenttiosuus tulokset ISH pisteet kriteerien [17], 44 106 (41,5%) haimasyövän kudoksiin ja 84 106 (79%) viereisten normaaleissa kudoksissa (ISH ≥3;

P

0,001) olivat positiivisia miR-26a. miR-21 ilmentyminen positiivinen kontrolli analysoitiin samalla potilaalla. miR-21 oli positiivinen 99 106 (93,4%) PDAC kudosten ja 25 106 (23,6%) viereisten normaaleissa kudoksissa, joka perustuu ISH pisteytys kriteerit (kuviot. 1E ja 1F, ISH ≥3;

P

0,01). Suhdetta kliinisiä piirteitä kanssa miR-26a ilmentymisen PDAC kudoksissa, määritettynä LNA-ISH, on esitetty taulukossa 2.

(A) Keskimääräinen ilmentymistaso miR-26a ihmisen PDAC yksilöt (

n

= 15) ja normaalin haiman kudoksista (

n

= 15). miRNA runsaus arvioitiin qRT-PCR ja normalisoitu U6-RNA. Arvot esitetään keskiarvona ± S.D. (B) Kokonaiselossaoloaika seuraavat resektio haimasyövän kanssa miR-26a-negatiivinen versus miR-26a-positiivisten ryhmiä. MIR-26a-negatiivisten ryhmässä oli merkittävästi lyhyempi selviytymisen kuin miR-26a-positiivisten ryhmässä (

P

= 0,029). (C, D)

In situ

-hybridisaatio miR-26a haiman vaurioita.

In situ

-hybridisaatio osoitti paljon pienempi miR-26a ilmentymisen PDAC kudoksissa (C) kuin ABPT (D). Insertti osoittaa negatiivisen kontrollin (salattu järjestyksessä koetin). Soluliman värjäytymistä tiehyen epiteelisoluissa on vastoin negatiivisen värjäyksen salattu anturi. (E, F)

In situ

-hybridisaatio miR-21 (positiivinen kontrolli) haiman vaurioita.

In situ

-hybridisaatio osoitti paljon vahvempi miR-21 ilmentyminen PDAC kudoksissa (E) kuin ABPT (F). Insertti osoittaa negatiivisen kontrollin (salattu järjestyksessä koetin). Sytoplasminen värjäys tuumorisoluissa on vastoin negatiivisen värjäyksen sekoitetun koettimen. Alkuperäinen suurennus, 100 ×.

Seuranta saatuja tietoja 73 106 potilasta osoitti, että yhteensä 18 potilasta hoidettiin adjuvanttihoitoa Gemsitabiinin ja oksaliplatiinin, kun taas loput 55 potilasta ei kemoterapiaa tai sädehoitoa. Niistä 73 potilaasta, jotka saivat seurannan, 68 kuoli, 16, joilla on kemoterapialla ja 52 ilman lisähoitoa. Kuitenkin 5 73 seurannassa potilailla selvisi. Mitattu kokonaiselossaoloaika oli syöpää erityisiä; Keskimääräinen elinaika oli 8,7 kuukautta miR-26a-negatiivinen ryhmä ( 3;

n

= 43) ja 12 kuukauden miR-26a-positiivinen ryhmä (≥3;

n

= 30). 1- ja 3-vuoden eloonjäämisluvut olivat 39,5% ja 0%: lla, kun miR-26a-negatiivinen ryhmä, mutta olivat 50% ja 6,3%, vastaavasti, MIR-26a-positiivisia ryhmässä. Yleinen eloonjääminen analyysi paljasti, että miR-26a-negatiivisten ryhmässä oli merkittävästi lyhyempi selviytymisen kuin positiivinen ryhmä (

P

= 0,029, Fig. 1 B). Adjuvanttihoitoa ei ollut yhteydessä selviytymisen sairastavien potilaiden PDAC (

P =

0,417). Yhdistyksen välillä miR-26a ilmaisun ja muut parametrit (kuten ikä, sukupuoli, kasvaimen massa sijainti, kasvaimen koko, kasvain solujen erilaistumista, hermo invaasio, imusolmuke numero, kaukainen etäpesäke) eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (taulukko 2). Monimuuttuja selviytyminen analyysi (Coxin regressiomallin) tavanomaisten kliinisten ennustetekijöiden ja miR-26a väitti miR-26a on itsenäinen ennustetekijä haimasyövän (

P =

0,001; 95% CI, +0,185-0,650; taulukko 3).

sykliini D2, sykliini E2, ja PCNA Immunokemia in Haimasyöpä kudoksia ja niiden Assosiaatio Survival

immunovärjättiin kudosnäytteitä paljasti, että molemmat kasvainsolut ja kanava epiteelin soluja viereisten hyvänlaatuinen haiman kudoksista ei ilmaissut sykliini D2 (kuviot. 2A ja 2D). Kuitenkin sykliini E2 näytetään vahva positiivinen värjäytyminen kasvainsoluissa (90/106) ja kanavan epiteelisolut viereisen hyvänlaatuinen haiman kudoksista (76/106;

P

= 0,024; kuviot. 2B ja 2E). Ei ollut merkittävää eroa yleisessä eloonjäämisaste välillä 73 seurantaan potilailla, jotka olivat positiivisia (

n =

61) tai negatiivinen (

n =

12) sykliini E2 (

P

= 0,676; Kuva. 2G). Tulokset esitetään PCNA-positiivista värjäytymistä kasvaimen solut (93/106) ja kanava-epiteelisolujen viereisen hyvänlaatuinen haiman kudoksista (68/106;

P

0,01). Vahva positiivinen värjäytyminen PCNA vuonna PDAC kudoksissa osoitti korkeampaa soluproliferatiivisen aktiivisuus haimasyövän (kuviot. 2C ja 2F), verrattuna negatiivisesti värjätty viereiseen normaaleissa kudoksissa. Yleinen eloonjääminen analyysi paljasti, että tapaukset, joissa on PCNA korkea proliferatiivinen indeksi (

n

= 51) in PDAC kudoksissa oli merkittävästi lyhyempi selviytymisen kuin asialla on PCNA alhainen proliferatiivinen indeksi (

n

= 22;

P

= 0,007, Fig. 2 H). Potilaat, joilla on korkea PCNA proliferatiivinen indeksi oli myös sykliini E2 positiivinen.

PDAC tuumorikudoksista (PDAC) olivat negatiivisia sykliini D2 (A) ja voimakkaasti positiivinen sykliini E2 (B), joilla on korkea PCNA proliferatiivinen indeksi (C). Viereinen hyvänlaatuinen haiman kudoksista (ABPT) olivat negatiivisia sykliini D2 oli (D), ja positiivinen sykliini E2, kuten havaitaan tiehyen epiteelisoluissa ABPT (E). PCNA oli hyvin alhainen normaaleissa haiman kudoksista (F). Sisäkkeet A, B, ja C esittävät negatiivisia kontrolleja. Insertti D osoittaa, että sykliini D2 on positiivinen kontrolli keuhkojen adenokarsinooma. Alkuperäinen suurennus, 200 ×. Kokonaiselossaoloaika jälkeen resektio haimasyövän kanssa cyclinE2-positiiviset versus cyclinE2-negatiivisia ryhmiä ei ollut merkittävä (

P

= 0,676) (G), kun taas yleinen selviytymisen jälkeen resektio haimasyövän kanssa PCNA korkea proliferatiivinen indeksi versus PCNA alhainen proliferatiivinen indeksi ryhmissä oli huomattavasti lyhyempi elinaika (

P

= 0,007) (H).

korrelaatio analyysi sekä miR-26a ja sykliini E2 ilmaisun (Pearson kerroin,

R

2

= 0,004) ja miR-26a ja PCNA ilmaisun (

R

2

= 0,024), osoittivat merkittävää suhdetta. Hajonta kaavioita Korrelaatioanalyysin esitetty kuvassa S1.

miR-26a Yliekspressio esti kasvu haimasyöpäsoluissa jonka alassäätely sykliini E2 ja EZH2 Expression

tutkia vaikutuksen miR-26a haiman syöpäsolujen kasvua, PDAC solulinjat, joilla on eri laadut Capan-2, SW-1990 ja Panc-1 transfektoitiin väliaikaisesti, jossa on miR-26a matkivat tai inhibiittori. QRT-PCR-analyysi osoitti, että transkriptio miR-26a matkivat ryhmässä oli merkittävästi lisääntynyt (4,44-kertaisesti Capan-2, 3,45-kertaisesti SW-1990 ja 3,59-kertaisesti Pancin-1), kun taas transkription Mir-26a inhibiittoriryhmä laski merkittävästi (0,35-kertaisesti Capan-2, 0,43-kertaisesti SW-1990 ja 0,44-kertaisesti Pancin-1), verrattuna kontrolliin solulinjojen (

P

0,05, kuviot. 3A-3C).

qRT-PCR-analyysi osoitti, että transkriptio miR-26a jäljittelee, inhibiittori, ja kontrolliryhmissä (A, B, C), ja ilmentyminen sykliini E2 sykliini E2 siRNA, ohjaus siRNA, ja kontrolliryhmissä (D, E, F). Leviämisen PDAC solulinjat transfektoitiin väliaikaisesti miR-26a jäljittelee, miR26a estäjän tai sykliini E2 siRNA analysoitiin CCK-8 proliferaatiomäärityksessä (G, H, I). Sääntely sykliini E2 tai EZH2 ilmentymisen miR-26a analysoitiin Western blot (J, K, L), ja Western blot-analyysi vahvisti myös odotettu tehokkuus sykliini E2 siRNA kolmessa PDAC solulinjoissa (M, N, O) .

tutkia vaikutusta sykliini E2 haiman syöpäsolujen kasvua, sykliini E2 siRNA transfektoitiin kunkin kolmen PDAC solulinjat, ja pudotus varmistettiin qRT-PCR-analyysillä, joka osoitti, että ilmaus sykliini E2 siRNA-transfektoiduissa ryhmä pieneni merkitsevästi kontrolliin verrattuna solujen (0,201-kertaisesti Capan-2, 0,274-kertaisesti SW-1990 ja 0,327-kertaisesti Pancin-1) (kuviot. 3d -3F).

roolin määrittämiseksi miR-26a haiman syöpäsolujen kasvua, CCK-8 lisääntymisen määrityksessä tehtiin Capan-2, SW-1990 ja Panc-1-soluja, jotka transfektoitiin ohimenevästi joiden miR-26a matkivat tai estäjä. Tulokset osoittivat, että miR-26a-jäljittelee inhiboi kasvainsolujen kasvua, kun taas miR26a-inhibiittori edistää kasvainsolujen kasvua. Lisäksi sykliini E2 siRNA oli sama asema kuin miR-26a-matkivat estossa kasvainsolujen proliferaatiota (kuviot. 3G-3I).

miR-26a on raportoitu suoraan välittää sykliini E2: n ja sykliini D2 toiminnot HCC [12] ja rintasyövän [19]. Ekspression Polycomb-proteiinin EZH2 nostettiin PDAC, joka siis lisäsi solujen proliferaatiota ja chemoresistance [20]. Kuitenkin meidän tutkimukset osoittivat, että sykliini D2 värjäytyminen oli lähes negatiivinen haimasyövän kudoksissa. Näin ollen suhde miR-26a ja sykliini E2 tai EZH2 analysoitiin käyttäen Western-blotteja. Tulokset paljastivat, että sykliini E2: n ja EZH2 tasot olivat molemmat laski miR-26a matkivat-transfektoituja soluja, mutta ne kasvoivat miR-26a-inhibiittori-transfektoiduissa soluissa (kuviot. 3J-3L) verrattuna kontrollisoluihin. Western blot-analyysi vahvisti odotettu tehokkuus sykliini E2 siRNA kolmen PDAC solulinjoissa (kuviot. 3M-3O).

Seuraavaksi analysoimme solusyklin jakautumisen Capan-2, SW-1990, ja Panc-1-soluja, jotka transfektoitiin miR-26a jäljittelee tai miR-26a-inhibiittori, sekä valvontaa. Solut, jotka on transfektoitu miR-26a matkivat kerääntynyt G

1 vaihe, kun taas S-vaiheessa väestö väheni. Kuitenkin päinvastainen tulos havaittiin soluissa, jotka oli transfektoitu miR-26a-estäjä (Fig. 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että proliferatiivisen esto miR-26a johtui osittain G

1 vaiheen pysähtymisen kolmen haimasyövän solulinjoissa.

Solut joko transfektoitu miR-26a jäljittelee tai inhibiittorit. Kontrollit jätettiin hoitamatta. D, H ja L osoittavat tilastollinen solusyklin jakelu Capan-2, SW-1990 ja Panc-1, vastaavasti.

Kohdunulkoinen Expression of miR-26a Inhibioitu Haimasyöpä kasvu nude-hiirissä

in vivo

kasvainten synnyssä määritys paljasti, että kasvaimen kasvu oli huomattavasti hitaampaa nude-hiirissä ympätty pTM- transfektoidut SW-1990-soluissa, verrattuna nude-hiiriin ympätty pT transfektoitujen SW -1990-solut (Fig. 5A). Tämä tulos vahvistettiin tuumorin tilavuuden mittaukset 5 viikko (Fig. 5B). Sykliini E2 taso oli paljon alhaisempi kasvainkudoksissa yliekspressoivia miR-26a ja PCNA ilmaisun seurasi samaa kaavaa. Sykliini D2 jäi huomaamatta kasvaimissa (kuviot. 5C-5H).

(A) Nude-hiiriä inokuloitiin subkutaanisesti SW-1990-soluja transfektoitiin pTM (pTM: hTERT-miR-26a-plasmidi) tai pT ( pT: hTERT ohjaus plasmidi), niiden kyljissä. Kuva edustaa kasvainten muodostuu 8 hiirillä. (B) kasvukäyrät kasvainten. Käyrä edustaa kasvaimen kasvua, 5 viikkoa ymppäyksen jälkeen. Kasvaimen tilavuus laskettiin, ja kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. (

n

= 8). (C-H) Expression of sykliini D2, sykliini E2 ja PCNA mitattiin immunohistokemia kudoksissa hiiret inokuloitiin PTM- transfektoitu SW-1990-solut tai kontrollisolut. Luku sisäkkeet C, E ja G osoittaa kielteistä ohjauskentän. Solut ruskeita osoittavat positiivista värjäytymistä. Alkuperäinen suurennus, 200 ×.

Keskustelu

kypsän sekvenssin miR-26a havaitaan 3

p

23, joka on hauras kromosomi alueella liittyy eri ihmisen syövissä, [21] – [23]. Noin puolet kaikista ihmisen miRNA sijaitsevat syöpään liittyvän genomialuetta; Näin ollen, ne voivat toimia kasvaimen suppressori tai onkogeenisten miRNA, riippuen niiden tavoitteita [3] – [5]. Siten miR-26a voi toimia onkogeenin glioomissa, mutta toimii tuumorisuppressori maksasyövän [12], [23] – [26]. Kuitenkin tähän mennessä on vain vähän raportteja roolista ja kasvaimen kehittymisen Mir-26a haimasyövän.

Tässä tutkimuksessa, huomasimme, että ilmentyminen miR-26a oli merkittävästi vaimentua vuonna PDAC kudoksissa verrattuna että ABPT. Tutkimaan edelleen molekyylitason mekanismeja solujen kasvua edistäneet miR-26a downregulation haimasyövän kudoksessa, analysoimme rooli miR-26a yli-ilmentyminen tai downexpression haimasyövän solujen lisääntymisen, solusyklin, ja kasvaimen kasvu ,. Tuloksemme osoittivat, että ilmentymistaso miR-26a vaikuttaa leviämisen kolmen PDAC solulinjojen eri-laadut. miR-26a tasot liittyivät G

1 pidätys haiman syöpäsoluja. Lisäksi, miR-26a yliekspressio SW-1990-solujen tukahdutetaan haiman tuumorigeneesiä nude-hiirissä, joka ehdotti, että miR-26a toimii tuumorisuppressori tämä syöpä.

sykliini D2 ja sykliini E2 ovat välttämättömiä säätävät G

1-to-S-vaiheeseen siirtymistä solusyklin aikana. Nämä sykliinit ovat erityisen kiinnostavia haimasyöpä. Kota [11] ja Zhou [27] on raportoitu, että miR-26a suoraan ylössäätelee ilmaus sykliini D2 ja sykliini E2 mRNA: n HCC. Siten molemmat geenit ovat mahdollisia tavoitteita miR-26a haimasyövän. Toisaalta, EZH2 kohoamiseen vuonna PDAC edistää soluproliferaatiota ja chemoresistance [20]. Niinpä määritettiin onko miR-26a voisi säädellä haimasyövän solusyklin kautta kohdegeenien, sykliini D2 ja sykliini E2. Sykliini D2 ei havaittu tuumorisoluissa ja kanavan epiteelisolut ABPT, kun taas sykliini E2 korreloi positiivisesti miR-26a ilmentymistä haimasyöpä. Sykliini E2 väheni miR-26a säätelyyn ylöspäin Capan-2, SW-1990 ja Panc-1-soluissa. Havaitut vaikutukset soluproliferaatioon ja sykliini E2 ilmaisun olivat yhdenmukaisia ​​havaituista EZH2 sisään PDAC soluissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-26a downregulation johti säätelyä sykliini E2 ja EZH2, mutta ei sykliini D2, on PDAC kudoksissa. Siten vaimentua miR-26a osaltaan solujen lisääntymisen ja köyhien eloonjäämisen haimasyöpä. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​tutkimuksia muiden kasvaimia, kuten HCC, rintasyöpä, NPC, ja lymfoomat [12], [27] – [30]. Muuttunut spesifisten miRNA kasvaimissa on tiettävästi liittyy syövän etäpesäkkeiden ja huonon ennusteen [29] – [32]. Heinzelmann ym., [33] havainnut miRNA allekirjoitus, joka erottelee metastaattinen ja nonmetastatic selkeä solu munuaissolukarsinooman. Ryhmä 12 miRNA, kuten let-7 perhe, miR-30c, ja miR-26a, havaittiin vähenevän erittäin aggressiivinen ensisijainen etäpesäkkeitä.