Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eikosapentaeenihappo (EPA) ja dokosaheksaeenihappoa (DHA) ovat suuret n-3 monityydyttymättömiä rasvahappoja (PUFA) kalaöljyn että pienentää riskiä eturauhassyövän. Kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) ovat tärkein leukosyytteihin kasvaimensisäisiä tunkeutumisen, ja lisääntynyt TAMeja korreloi huonon eturauhassyövän ennustetta. Kuitenkin mekanismi n-3 PUFA: eturauhasen syöpäsolu etenemisen aiheuttama TAM ei ole hyvin ymmärretty. Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutuksia EPA ja DHA moduloimalla muuttoliikkeen ja invaasion eturauhassyöpäsolujen aiheuttama TAM-kuin M2-tyypin makrofagit. PC-3 eturauhasen syövän solut esikäsiteltiin EPA, DHA, tai peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori (PPAR) -γ-antagonisti, GW9662, ennen altistumista kunnostetun alustan (CM). CM on johdettu M2-polarisoitunut THP-1 makrofageissa. Vaeltavien ja invasiivisia kyvyt PC-3-solut arvioitiin käyttäen yhteisviljelmä järjestelmä M2-tyypin makrofagien ja PC-3-solut. EPA /DHA hallinto väheni muuttoliike ja hyökkäys PC-3-solut. PPAR-γ DNA-sitoutumisaktiivisuutta ja sytosolin estävä tekijä κBα (IκBα) proteiinin ilmentymisen lisääntyi, kun taas ydinvoiman tekijä (NF) -κB p65 transkriptionaalisen aktiivisuuden ja ydin- NF-KB p65-proteiinin taso laski PC-3-solut inkuboitiin CM vuonna läsnäolo EPA /DHA. Lisäksi EPA /DHA vaimentua mRNA ilmaisuja matriksimetalloproteinaasi-9, syklo-oksigenaasi-2, endoteelikasvutekijä, ja makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä. Esikäsittely GW9662 poisti myönteiset vaikutukset EPA /DHA PC-3-solut. Nämä tulokset osoittavat, että EPA /DHA hallinto vähennetään muuttoliikettä, invaasion ja makrofagi kemotaksista PC-3-solujen aiheuttama TAM-kuin M2-tyyppinen makrofageja, mikä saattaa osittain selittää aktivoituminen PPAR-γ ja laski NF-KB: n p65 transkriptionaalista aktiivisuutta.

Citation: Li CC, Hou YC, Yeh CL, Yeh SL (2014) vaikutukset Eicosapentaenoic ja dokosaheksaeenihappo eturauhasen syöpäsolu Migration and Invasion indusoima kasvaimeen liittyvät makrofagit. PLoS ONE 9 (6): e99630. doi: 10,1371 /journal.pone.0099630

Editor: Rolf Müller, Philipps University, Saksa

vastaanotettu: 27 joulukuu 2013; Hyväksytty: 17 toukokuu 2014; Julkaistu: 12 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Science neuvosto apurahan NSC 100-2320-B-038-009 Taipei, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä diagnosoidaan miehillä kehittyneissä maissa ja on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [1]. Huolimatta parannuksista eri hoitomenetelmät viime vuosina, hoitoa potilaille, joilla on edennyt eturauhassyöpä puuttuu edelleen tehoa. Kiinteä kasvain koostuu neoplastisten solujen ja peruskudoskomponentit, kuten fibroblastit, endoteelisolut ja muuttavien hematopoieettisten solujen. Makrofagit ovat runsain immuunisolujen kasvaimen mikroympäristössä, niin sanottu kasvaimeen liittyvät makrofagit (TAM) [2], [3]. TAM ovat pääasiassa M2-tyyppi makrofagit, koska ne ilmaisevat useita pinnan markkereita, kuten CD36 ja CD163 [4]. Myös TAMeja osoitettiin keskeisessä asemassa ovat selviytymisen, leviämisen ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen, ja korkeampi TAMeja tunkeutuminen on usein korreloi huonon ennusteen monissa kasvaimissa, kuten eturauhassyöpää. Kliininen tutkimus suoritetaan Lissbrant et al. [5] positiivinen korrelaatioita tiheyden TAMeja kanssa eturauhasen kasvainsoluproliferaation ja mikroverisuonitiheys. Lisäksi TAMeja voi helpottaa syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota erittämällä tekijät, kuten kasvutekijöitä, sytokiinejä, kemotaktisten tekijöiden, ja matriisi (MMP) [6] – [9].

peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorit ( PPAR: t) ovat tumareseptorit ja ligandin transkriptiotekijöitä steroidin superperheen. PPAR-perheen koostuu kolmesta eri alatyyppiä: PPAR-α, PPAR-β /δ ja PPAR-γ. He heterodimerisoitua retinoidi-X-reseptori (RXR) ja säädellä kohdegeenin ilmaisuja sitoutumalla peroksisomiprolife- elementteihin (PPREs) sijaitseva promoottori alueella [10]. PPAR-γ on ensisijaisesti ilmaistaan ​​rasvakudoksesta ja on merkittäviä rooleja säätelyssä sokeri- ja rasva-aineenvaihduntaan ja adiposyyttien erilaistumiseen [11]. On raportoitu, että PPAR-γ aktivointi voidaan moduloida tulehdusvasteita ja estää kehittymistä ja etenemistä monenlaisia ​​epiteelin johdettujen ihmisen syöpäsoluja, mukaan lukien eturauhas-, rinta-, ja paksusuolen syövissä [12] – [14]. Lisäksi, induktio PPAR-γ-ilmentyminen korreloi esto tumatekijä (NF) -κB aktiivisuus ja vähentynyt ilmaisuja angiogeenisten proteiinien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä soluja. Ne havainnot viittaavat siihen, että inaktivointi NF-KB voi olla osallisena PPAR-γ-riippuvaisen reitin [15].

Eikosapentaeenihappo (EPA) ja dokosaheksaeenihappoa (DHA) ovat kaksi yleisintä pitkäketjuisia n- 3 monityydyttymättömiä rasvahappoja (PUFA) kalaöljyssä. Epidemiologiset tiedot osoittivat, että kalan kulutus on käänteisesti yhteydessä ilmaantuvuus ja kuolleisuus eturauhassyöpään, erityisesti metastaattinen [16] – [18]. Seerumin EPA ja DHA määrinä potilailla, joilla on eturauhasen syöpä olivat alhaisemmat kuin potilailla, joilla on hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu [19]. Kasvava todistusaineisto on osoittanut, että n-3 PUFA käyttää antituumoriominaisuuksia. Kuitenkin vähän huomiota on kiinnitetty suhdetta n-3 PUFA ja eturauhasen syöpäsolun etenemisen aiheuttama TAMeja. Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että EPA estää ihmisen HT-29 paksusuolen syöpäsolujen kasvua, ja tämä vaikutus oli seurausta PPAR-γ aktivointi [12]. Edelleen, n-3 PUFA: osoitettiin indusoivan apoptoosia aktivoimalla PPAR-γ eturauhassyöpäsoluissa [20]. Koska n-3 PUFA: on osoitettu sitoutuvan tehokkaasti ligandia sitovan domeenin PPAR-γ ja aktivoivat PPAR-vaste-elementti-reportteri määrityksiä eri solulinjoissa [12], [21], me arveltu, että EPA: n ja DHA hallinto tukahduttaa progressiivinen ominaisuuksia eturauhassyövän aktivoimalla PPAR-γ mukana reitin. Siten käytimme PC-3-solut käsiteltiin kunnostetun alustan (CM) M2-tyyppinen makrofagien tai kosketukseton järjestelmä määrittää vaikutukset ja mahdolliset mekanismit EPA ja DHA eturauhassyövän solumigraatioon ja invaasiota aiheuttama TAMeja.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Prostate PC-3 syöpäsolujen ja ihmisen THP-1-monosyyttejä saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Soluja ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% penisilliini-streptomysiiniä (10 ng /ml penisilliiniä ja 10 U /ml streptomysiiniä), ja 2,5 mM glutamiinia 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa.

valmistaminen rasvahapon-naudan seerumin albumiinia (BSA) kompleksit

EPA, DHA, ja BSA ostettiin Sigmalta ( St. Louis, MO, USA). Rasvahappo-BSA-kompleksit valmistettiin 10 mmol /L kantojen kanssa suhteessa rasvahappojen BSA ja 04:01 ja liuotettiin, jonka sonikaattorilla viileässä vesihauteessa 60 min. Rasvahappo-BSA varastot säilytettiin -20 ° C: ssa argonissa, kunnes valmis käytettäväksi [22].

solunelinkykyisyysmääritys

elinkelpoisuus PC-3-solujen määritettiin Alamar blue määritys (Invitrogen). PC-3-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (1000 solua /kuoppa) yön yli, ja sitten sitä käsiteltiin eri annoksilla EPA tai DHA (0~400 uM). BSA ajoneuvoa on käytetty kontrollina (C). 20 tunnin kuluttua hoidon, soluja inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi 10% Alamar sinistä väriainetta 37 ° C: ssa 4 h, ja kolorimetrinen muutos mitattiin mikrolevylukijalla aallonpituudella 570 ja 600 nm.

CM valmisteet ja hoitoja

makrofaagianalyysi eriyttäminen suoritettiin aikaisemmin vahvistettujen menettelyjen [23]. THP-1-solut (5 x 10

6) ympättiin 75-cm

2 kudosviljelypulloissa ja viljelty 320 nM forboli-12-myristaatti-13-asetaattia (PMA; Sigma) 4 tunnin ajan. M2-tyypin makrofagi erilaistumista, THP-1-soluja käsiteltiin 320 nM PMA: lla, 20 ng /ml interleukiini (IL) -4, ja 20 ng /ml IL-13 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) ja toisen 20 h. Tuottaa M1-tyypin makrofagien THP-1-soluja käsiteltiin 320 nM PMA: lla 4 h, ja sitten käsiteltiin 320 nM PMA: lla, 20 ng /ml interferoni (IFN) -γ (PeproTech) ja 100 ng /ml lipopolysakkaridia ( LPS) alkaen

Escherichia coli

serotyyppi 0111: B4 (Sigma) 20 tuntia. Stimulaation jälkeen solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) kahdesti ja viljeltiin tuoretta alustaa 24 tuntia, ja sitten CM kerättiin.

PC-3 eturauhasen syövän soluja ympättiin 5 x 10

5 6-kuoppalevyille 1 päivä ennen käsittelyä. Hoitoon, solut, laitettiin väliaineessa, joka sisältää eri pitoisuuksia EPA, DHA (0, 25, ja 50 uM) tai 10 uM GW9662 24 tuntia, ja sitten soluja käsiteltiin CM, joka sisältää saman pitoisuuden rasvahappojen vielä 24 h. PC-3-solut kerättiin lisäanalyysiä.

Muuttoliike ja invaasio määritykset

vaeltavia ja invasiivisia kyvyt PC-3-solut (2 x 10

4 migraatiokokeessa ja 10

5 solua varten invaasiomääritys) on vastaavasti määritettiin käyttämällä 24-kuoppalevyille Millicell Culture Plate Inserts (8-mikrometriä huokoskoko Millipore, Billerica, MA, USA) 12 tuntia ja Matrigel päällystetty (BD Biosciences, Bedford , MA, USA) lisätään 24 tuntia. Lyhyesti, PC-3-soluja lisättiin ylälokeroissa RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, ja THP-1-solut (10

5) on jaoteltu M2-tyyppi makrofagien alakammioissa. Sen jälkeen, kun PC-3-solut olivat kiinnittyneet, väliaine ylempi ja alempi kammio korvattiin seerumittomalla RPMI 1640, joka sisälsi eri pitoisuuksia EPA, DHA, tai GW9662 (10 uM). Sitten solut ylä- insertin kalvon pinnan poistettiin vanutupoilla inkuboinnin jälkeen. Kiinnityksen jälkeen 4% paraformaldehydillä, vaeltavat ja invasiivisia solut värjättiin 0,5% kristalliviolettia 2% metanolia. Membraanit pestiin kolme kertaa PBS: llä, ja väriaine eluoitiin 30% etikkahappoa. Absorbanssi luettiin 595 nm: ssä mikrolevylukijalla. Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kullekin määritystä.

DNA: ta sitova toiminta PPAR-γ ja NF-KB: n p65

Nuclear otteita solut kerättiin käyttämällä NE-PER Sytoplastiset ja Nuclear Protein Extraction kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA-sitova aktiivisuus PPAR-γ määritettiin käyttäen entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) -pohjaisen Trans-AM Transcription Factor määritys PPAR-γ Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). Oligonukleotidi, joka sisälsi peroksisomiprolife- vaste-elementin (pPre) (5′-AACTAGGTCAAAGGTCA-3 ’) päällystettiin mikrotiitterilevyn liuskojen säädetty. PPAR sisältämä tumaekstrakti erityisesti sitoutuu pPre. Ensisijainen PPAR-γ-vasta-aine tunnistaa arvioitavissa epitoopin PPAR-γ-proteiinin, kun DNA: ta sitova ja sitten sekundäärinen vasta-aine konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (HRP) lisättiin. Absorbanssi luettiin spektrofotometrillä 450 nm: ssä.

kvantifioimiseksi DNA: ta sitova aktiivisuus NF-KB: n p65: n, 5 ug tumauutteen mitattiin käyttämällä ELISA-pohjainen Trans-AM Transcription Factor Assay NF -κB p65 Kit (Active motiivi). Kuoppiin ELISA immobilisoitiin oligonukleotidin kanssa, joka sisälsi NF-KB-p65-konsensus-(5′-GGGACTTTCC-3 ’). Mukaan valmistajan ohjeiden, 10 ug tumauutteen lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja inkuboitiin sitten tietyn primaarisen vasta-aineen, jota käytetään havaitsemaan NF-KB: n, joka tunnistaa epitoopin p65, joka on käytettävissä vain, kun NF-KB aktivoituu ja sitoutuneen sen kohde-DNA. Inkuboinnin jälkeen HRP-konjugoidulla sekundäärisellä vasta-aineella, kolorimetriset reaktio kvantitoitiin käyttäen spektrofotometrisesti 450 nm: ssä.

Proteiinin uuttaminen ja Western blot-analyysi

Solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja raaputettiin lyysipuskuria (50 mM Tris, pH 7,4, 1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 1% Nonidet P-40, 0,5% Na-deoksikolaattia, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, ja 50 mM NaF), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen ( täydellinen, Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) valmistella kokosolulysaateista. Kerätä ydin- ja sytoplasman uutteita, solut kerättiin käyttämällä NE-PER Sytoplastiset ja Nuclear Protein Extraction Kit (Pierce Biotechnology) mukaan valmistajan ohjeiden. Proteiinikonsentraatiot supernatanttia määritettiin Bradfordin Protein Assay Reagent -kittiä (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Proteiinit elektroforeesi 4% -12% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE), ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja märkä-siirtolaitetta. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa TBS-Tween (TBS-T) 1 h ja sitten inkuboitiin tiettyjä primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Membraanit pestiin kolme kertaa TBS-T: n ja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 1 tunti, ja blotit kehitettiin parannettu kemiluminesenssin reagenssit (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA, USA) ja valotettiin röntgenfilmille. Suhteelliset intensiteetit mitattiin määrällisesti proteiinin tasot käyttäen Image-Pro Plus ohjelmisto (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Kaikki blotit määrällisesti ja normalisoidaan sisäisen valvonnan sopeuttaa määrää proteiinien ladattu.

RNA ja reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) analyysi

Yhteensä solujen RNA uutettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen). Pitoisuudet RNA määritettiin ja kvantifioidaan mittaamalla absorbanssi 260 ja 280 nm: ssä spektrofotometrillä. Täydentäviä (c) DNA syntetisoitiin kokonais-RNA käyttämällä cDNA-synteesi kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA). Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin käyttäen ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Foster City, CA, USA) määrittää kunkin mRNA ilmaisu. Alukkeet CD36, CD163, PPAR-γ: n, MMP-9, kudoksen estäjä metalloproteinaasi (TIMP) -1, VEGF, syklo-oksygenaasi (COX) -2, makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (M-CSF), ja β-aktiini on lueteltu taulukossa 1. Reaktiot suoritettiin kokonaistilavuudessa 25 ui, joka sisälsi 1 x Maxima SYBR Green qPCR Master Mix, 400 nM kutakin aluketta ja 100 ng cDNA: ta. Pyöräily olosuhteet olivat seuraavat: 50 ° C 2 min ja 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. mRNA ilmaisuja kvantitoitiin kahtena kappaleena. Tiedot laskettiin yhtälöllä 2

-ΔΔCT ja esitetty kertoimien muutoksen geenin ilmentymisen normalisoidaan P-aktiini.

Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) B

tasot tuumorinekroositekijän (TNF) -α, IL-1β: n ja IL-6, transformoiva kasvutekijä (TGF) -β, monosyyttien kemoattraktantti proteiinin (MCP) -1 ja IL-8 mitattiin käyttäen ELISA-kittejä (eBioscience San Diego, CA, USA). Pinnat mikrotiitterilevyt päällystettiin MCP-1: n tai IL-8 ihmisen monoklonaalinen vasta-aine. Prostaglandiini (PG) E2-konsentraatiot määritettiin kilpailuun sandwich ELISA-kittiä (R 0,05 katsottiin merkittävästi erilainen.

Tulokset

Expression pintamerkkiaineyhdistelmien ja sytokiinien tasot CM PMA-käsiteltyjen THP-1 makrofagien

Sen määrittämiseksi, onko TAM-, kuten M2-tyyppiset makrofagit tuotettiin onnistuneesti, THP-1-solut ko-käsitelty PMA: lla ja TH2 sytokiinien (IL-4 ja IL-13). Tulos osoitti, että verrattuna PMA-käsitelty vain M1-polarisoitunut THP-1 makrofagit, M2-tyyppi makrofagien merkitsevästi korkeampi mRNA ilmauksia M2 makrofagimarkkereiden CD36 ja CD163 (kuvio 1). Koska M2-tyyppi makrofagit tuottavat suhteellisesti vähemmän TNF-α, IL-1β: n ja IL-6 ja korkeampi TGF-β verrattuna M1-tyypin makrofageissa. Tasot näiden sytokiinien CM voidaan käyttää arvioimaan polarisaatio THP-1 makrofagi. Olemme havainneet, että CM päässä PMA ja M2 ryhmillä oli merkittävästi pienempi TNF-α, IL-1β, ja IL-6 tasoa kuin M1 ryhmä. Lisäksi CMM: stä M2 ryhmillä oli merkittävästi korkeampi TGF-β tasolle kuin, että PMA: lla ja M1 ryhmät (kuvio 2).

mRNA: n ekspressio analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Kerrannaisina mRNA muutoksia kvantitoitiin vertailevaa CT menetelmällä. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD,

n

= 6. Keinot eri kirjaimia merkittävästi eroa (

p

0,05).

CM alkaen PMA-käsitelty THP-1 makrofagien ja M2-polarisoitunut THP-1 makrofagien sekä oli merkittävästi alhaisempi tuumorinekroositekijän (TNF) -α (A), interleukiini (IL) -1β (B), ja IL-6 (C) ja korkeamman tason transformoiva kasvutekijä (TGF) -β (D) verrattuna M1-polarisoidun THP-1 makrofageissa. TNF-α, IL-1β, IL-6, ja TGF-β mitattiin ELISA-. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD,

n

= 6. Keinot eri kirjaimia merkittävästi eroa (

p

0,05).

PC-3 eturauhassyöpä solujen elinkykyä

vaikutukset EPA: n ja DHA: PC-3 solujen elinkelpoisuus määritettiin Alamar blue määrityksessä, ja tulokset on esitetty kuviossa 3. elinkelpoisuus PC-3-solut oli merkittävästi vähentynyt Olipa 24-h altistuksen EPA ja DHA pitoisuudesta riippuvalla tavalla yli 150 ja 100 uM, vastaavasti.

PC-3-soluja inkuboitiin EPA (A) ja DHA (B) 24 tunnin ajan, jonka jälkeen Alamar blue määritys suoritetaan neljänä kappaleena. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD,

n

= 6. * Merkittävästi eroaa ohjaus (

p

0,05).

muuttavien ja invasiivisia kykyjä PC-3 syöpäsolujen viljellään M2-tyypin makrofagien

Voit selvittää, EPA ja DHA ovat mukana M2-tyypin makrofagien aiheuttama syöpäsolujen muuttoliike ja invaasio, PC-3-soluja viljellään M2 tyyppinen makrofagit on kontaktiton laitteessa. Muuttavien ja invasiivisia kyvyt olivat yläreguloituja PC-3-solut viljellään M2-tyypin makrofagit. EPA ja DHA sekä vähentänyt merkittävästi muuttavien ja invasiivisia kyvyt PC-3-solut viljellään M2-tyyppinen makrofagit annosriippuvaisia ​​muodista. Noin 80%: n vähennys muuttavien ja invasiivisia soluja kääntyi läsnäollessa GW9662, tukemalla PPAR-γ aktivaation olla mukana estämällä muuttavien ja invasiivisia kyvyt PC-3-solut viljellään M2-tyypin makrofageissa (kuvio 4, 5 ).

PC-3-soluja siirrostettiin yläkammioiden ja viljellään M2-polarisoitu THP-1 makrofagien läsnä ollessa 50 uM EPA, DHA, tai GW9662 (10 uM) 24 tunnin ajan. Tunkeutuneet solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja värjättiin 0,5% kristalliviolettia. Membraanit pestiin ja väriaine eluoitiin violetti uuttoliuosta (50% etanolia, 0,1% etikkahappoa, ja 49,9% DDH

2O). Absorbanssi mitattiin 595 nm: ssä käyttäen mikrotiitterilevyn lukijaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD,

n

= 3. Keinot eri kirjaimia merkittävästi eroa (

p

0,05).

invaasion määritys, PC-3-soluja siirrostettiin yläkammiot päällystetty Matrigelillä ja viljellään M2-polarisoitu THP-1 makrofagien läsnä ollessa 50 uM EPA, DHA, tai GW9662 (10 uM) 24 tunnin ajan. Tunkeutuneet solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi ja värjättiin 0,5% kristalliviolettia. Membraanit pestiin, ja väriaine eluoitiin violetti uuttoliuosta (50% etanolia, 0,1% etikkahappoa, ja 49,9% DDH

2O). Absorbanssi mitattiin 595 nm: ssä käyttäen mikrotiitterilevyn lukijaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD,

n

= 3. Keinot eri kirjaimia merkittävästi eroa (

p

0,05).

EPA ja DHA ilmen- tymisen lisääntymisen DNA-sitoutumisaktiivisuutta, ja proteiini ja mRNA ilmauksia PPAR-γ PC-3-solut inkuboitiin CM M2-tyyppinen makrofagien

EPA ja DHA molemmat ovat ligandeja PPAR-γ. Voit selvittää, EPA ja DHA vähennetään muuttavien ja invasiivisia kyvyt PC-3 solujen aktivoimalla PPAR-γ, olemme analysoineet PPAR-γ DNA-sitoutumisaktiivisuutta, mRNA ja proteiini ilmaisuja PC-3-solut on viljelty CM M2-tyyppinen makrofagien . PPAR-γ DNA-sitoutumisaktiivisuutta tukahdutettiin PC-3-solut inkuboitiin CM M2-tyypin makrofagit. Hoidon EPA ja DHA sekä lisäsi merkittävästi DNA: ta sitova aktiivisuus, ja mRNA: n ja proteiinin ilmaisuja PPAR-γ PC-3-soluja verrattuna PC-3-solujen kanssa CM M2-tyyppi makrofageissa. GW9662 osittain tukossa PPAR-γ aktivaation PC-3-soluja (kuvio 6).

PPAR-γ-sitova aktiivisuus analysoitiin transkriptiotekijä, ELISA: lla (A). PPAR-γ-proteiinin tasot määritettiin Western-blottauksella (B). Equal Proteiinilisäyksen varmistettiin käyttämällä β-aktiini. mRNA: n ilmentymistä PPAR-γ analysoitiin reaaliaikaisen PCR: llä (C). mRNA muutoksia kvantitoitiin vertailevaa CT menetelmällä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD,

n

= 3, ja tarkoittaa erilaisia ​​kirjaimia merkittävästi eroa (

p

0,05).

EPA ja DHA vähentää NF-KB: n aktivaation PC-3-soluja inkuboitiin CM M2-tyyppi makrofagien

PPAR-γ aktivointi voi vähentää DNA: ta sitova aktiivisuus NF-KB: n p65. Kuten kuviossa 7A, NF-KB: n p65: n DNA: ta sitova aktiivisuus on voimistunut puuttuessa EPA /DHA, ja laski antoon EPA /DHA: ta. Hoito EPA ja DHA molemmat laski merkittävästi ydinaseiden NF-KB p65-proteiinin ilmentymistä ja lisääntynyt soluliman IκBα proteiinin ilmentymistä annoksesta riippuvaa käytöstapoja. Anto GW9662 merkittävästi päinvastaiseksi EPA- tai DHA-välitteinen inaktivaatio NF-KB: n PC-3-soluja viljeltiin CM M2-tyypin makrofagit (kuvio 7B, C).

NF-KB: n DNA: ta sitovan aktiivisuus analysoitiin transkriptiotekijä, ELISA: lla (A). Proteiini tasoilla IκBα alayksikkö (B) ja NF-KB: n p65: n (C) määritettiin Western-blottauksella. Equal lastaus proteiinien havainnollistaa tubuliinin bändejä sytosolifraktion. Histoni H1 ilme näkyy sisäisenä valvonnan tumaekstraktien. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD,

n

= 3, ja tarkoittaa erilaisia ​​kirjaimia merkittävästi eroa (

p

0,05).

Angiogenic- liittyvä tekijä ilmaisuja PC-3-solut on viljelty CM M2-tyyppinen makrofagien

TAM saattaa voimistaa angiogeenisten potentiaalia syöpäsolujen. Analysoimme angiogeenisten liittyviä tekijöitä PC-3-solut inkuboitiin CM M2-tyypin makrofagit. TAM induktio mRNA ilmauksia MMP-9, VEGF, COX-2, ja korkeamman PGE2: ta ja IL-8 havaittiin PC-3-soluja viljeltiin CM M2-tyypin makrofagit (kuvio 8). Näiden angiogeenisten liittyvät tekijät vaimentua, kun läsnä on EPA /DHA: ta. Hoito EPA /DHA tehokkaasti voimistunut mRNA ilmentymistä TIMP-1. Asetus angiogeenisten liittyvät tekijät ilmaisuja EPA /DHA PC-3-solut on viljelty CM M2-tyyppinen makrofagien poistettiin yhteiskäsittely kanssa GW9662.

mRNA ilmaisuja analysoitiin reaaliaikaisen PCR. mRNA muutoksia kvantitoitiin vertailevaa CT menetelmällä. Tasot PGE2: ta ja IL-8 analysoitiin ELISA-. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD,

n

= 6, ja tarkoittaa erilaisia ​​kirjaimia merkittävästi eroa (

p

0,05).

Geenien ilmentyminen M-CSF: n ja MCP-1 -tason PC-3-solut on viljelty CM M2-tyyppinen makrofagien

Kasvutekijät ja kemokiinit ovat tärkeitä säätelemiseksi makrofagien värväyksen tuumorikohdat. Tuloksemme osoittivat, että geenin ilmentyminen M-CSF: n ja pitoisuudet MCP-1: n PC-3-soluja viljeltiin CM M2-tyyppi makrofagit voimistunut (kuvio 9). Geenien ilmentyminen M-CSF: n ja tuotanto MCP-1 vähenivät EPA /DHA antoa. Kuitenkin hoito GW9662 pystyi kääntämään EPA /DHA-välitteistä downregulation M-CSF: n ja MCP-1.

MCP-1 tasoa analysoitiin ELISA. M-CSF analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. mRNA muutoksia kvantitoitiin vertailevaa CT menetelmällä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD,

n

= 6, ja tarkoittaa erilaisia ​​kirjaimia merkittävästi eroa (

p

0,05).

Keskustelu

Aiemmat tutkimukset raportoitu, että n-3 PUFA estävät eturauhasen syöpäsolun kasvua aiheuttamalla apoptoosin. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet mahdollisia mekanismeja n-3 PUFA: moduloinnissa PC-3-soluja viljeltiin CM M2-tyyppi makrofageissa. Tutkimuksemme on ensimmäinen ilmoittaa, että verrattuna PC-3-solut on viljelty CM M2-tyyppinen makrofagit, anto EPA /DHA pienentää vaeltavia ja invasiivisia kykyjä tehostamalla PPAR-γ DNA-sitoutumisaktiivisuutta, vähen- tämisessä NF-KB, ja tukahduttaa ilmentymistä NF-KB-kohdistettuja geenejä.

Makrofageilla on useita alatyyppejä ja voidaan polarisoitunutta erillisissä ärsykkeitä. M1-tyypin makrofagien kasvaimen vastaisia ​​ominaisuuksia ja niille on tunnusomaista tuotanto korkea TNF-α, IL-1β, ja IL-6. M2-tyyppinen makrofagit esittävät kasvaimen kasvua edistäviä ominaisuuksia ja ilmaista korkeampi immunosuppressiivinen sytokiineja, kuten TGF-β. Nämä sytokiinit markkereita käytettiin määrittämään M1- ja M2-tyypin makrofagien polarisaatio. Havaitsimme, että PMA-, IL-4- ja IL-13-käsitelty THP-1-solut osoittivat M2-tyypin makrofagi pinnan markkereita CD36 ja CD163 ja M2-tyyppi makrofageissa sytokiinien profiileja (pienempiä pitoisuuksia TNF-α, IL-1β ja IL-6, ja korkeampi pitoisuus TGF-β). Sisällä kasvain microenvironment, TAM ensisijaisesti näytteille M2-tyyppinen makrofagien funktionaalisia profiili, ja tämä edullinen polarisaatio johtuu stimulaatiota TH2 sytokiinien [24], [25]. TH2-sytokiinit, IL-4 ja IL-13, indusoivat M2 polarisaatio TAMeja johtaa kasvaimen edistämiseen ja kehittämiseen [26], [27]. Makrofagien ja erilaistumista M2-tyypin makrofagit säätelevät kasvutekijät, kuten M-CSF: n ja kemokiinit, mukaan lukien MCP-1 [28]. Yliekspressio M-CSF: n ja MCP-1: n useita erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien eturauhassyöpä, lisää makrofagien ja kasvaimen etenemiseen, ja kiihdyttää etäpesäkkeiden [29] – [32]. M-CSF: n sitoutumista pesäkkeitä stimuloiva tekijä-1-reseptori voi stimuloida makrofagien erilaistumista ja ennustaa caner etäpesäke. Hitaammin syövän etenemisen ja eston etäpesäkkeiden havaittiin rintasyöpä geneettinen ablaatio M-CSF [33]. Myös vähennykset kasvun ja makrofagien löytyivät PC-3-solujen jälkeen MCP-1-vasta-aineen neutralointi [30]. Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että EPA /DHA saattaa vähentää kykyä makrofagien rekrytointi PC-3-solut on viljelty CM M2-tyyppinen makrofagien vähen- tämisessä M-CSF: n ja MCP-1.

Aiemmassa tutkimuksessa kävi ilmi, että M2-polarisoitunut THP-1 makrofagien voi aiheuttaa invaasio ja angiogeneesi ihmisen pohjapinta karsinoomasolut [23]. Olemme myös havainneet, että TAM-kuin M2-tyypin makrofagien koholla migraation ja invaasion PC-3 syöpäsolujen. Lisäksi anto EPA /DHA tukahdutti muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia PC-3-solujen aiheuttama TAM-kuin M2-tyypin makrofagit, kun taas -80% tästä vaikutus estyi yhtäaikainen käsittely GW9662, PPAR-γ-specific antagonisti. Todisteet viittaavat siihen, että endogeeninen PPAR-γ ligandia, 15-deoksi-Δ

12,14-prostaglandiini J

2 (15d-PGJ

2) tukahdutti lisääntymistä ja androgeenin opastinjärjestelmillä eturauhassyövän solut [34] , [35]. Myös hoito 15d-PGJ

2 ja synteettisen ligandin, pioglitatsoni, oli raportoitu estävän leviämisen ja invaasion kyky ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa [36]. PPAR-γ ilmentyy ihmisen eturauhasen epiteelissä. Vaikka eturauhasen karsinoomat havaittiin yli-ilmentää PPAR-γ [13], aktivointi PPAR-γ on osoitettu estävän kasvua eturauhassyöpäsolujen ja syövän etenemistä [37].

transkriptionaalista aktiivisuutta NF-KB: n on pääosin moduloidaan fosforylaatio ja tumaansiirtymiseen NF-KB: n p65 [38] – [40]. Epänormaali NF-KB tunnistettiin syöpäsoluissa, mikä edisti invaasion ja muuttoliike lisäämällä ilmentymiä MMP ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) eturauhassyövässä PC-3-solujen [41]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että PPAR-γ kilpailee NF-KB sitomaan co-aktivaattoreita steroidireseptoriperheen koaktivaattoria (SRC) -1 tai cAMP-vaste-elementti sitova (CREB) proteiini, joka estää NF-KB-välitteisen geeniekspression [ ,,,0],42]. Lisäksi PPAR-γ aktivointi voi indusoida IκBα, joka sitoutuu suoraan p65: n, joka sisältää NF-KB-dimeerit sytoplasmassa ja estää tumaansiirtymiseen NF-KB: n [43], [44]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme havainneet, että EPA: n ja DHA lisääntynyt soluliman IκBα ilmentymistä PC-3-soluja viljeltiin CM. Nämä tiedot viittaavat siihen, että EPA: n ja DHA moduloida muuttavien ja invasiivisia ominaisuudet PC-3-solujen indusoiman M2-tyypin makrofagien osittain lisäämällä PPAR-γ DNA: ta sitovan aktiivisuuden ja vähentää NF-KB: n p65: n transkriptionaalisen aktiivisuuden. Äskettäin, n-3 PUFA: raportoitiin aktivoida G-proteiiniin kytketty reseptori (GPR) 120 ja inhiboivat NF-KB: n toimintaa, voivat näin ollen heikentää proinflammatoristen sytokiinien eritystä ja moduloivat rasvakudoksen tulehdus [45]. Emme harkitse estävää vaikutusta NF-kB n-3 PUFA kautta GPR120 koska edullinen vaikutus n-3 PUFA oli lähes poistettiin yhtäaikainen käsittely GW9662. Vaikka vuorovaikutus n-3PUFA ja GPR120 ei voida sulkea pois, Tutkimuksemme voi todistaa ainakin, että aktivointi PPAR-γ on yksi niistä mekanismeista vastaavan vähentämiseksi muuttavien ja invasiivisia kyvyt eturauhassyöpäsolujen aiheuttama TAMeja.

alassäätely NF-KB: n loppupään tavoitteita kuten MMP-9, COX-2, VEGF, ja IL-8: lla tärkeä rooli estämällä syöpäsolujen muuttoliike, invaasiota ja etäpesäkkeiden [46], [47]. MMP-9 on yksi ratkaiseva MMP hajottavat soluväliaineen (ECM) ja edelleen kannustaa muita kasvutekijöitä voidaan helpottaa siirtymistä ja hyökkäys syöpäsolujen [48]. Pääasiallinen luonnollinen estäjä MMP-9 on TIMP-1. C-terminaalinen domeeni TIMP-1 sitoutuu Hemopeksiini-kaltaisen domeenin MMP-9: [49].