Krooninen sairaus

tiivistelmä

etäpesäke ja lääkeresistenssi ovat merkittäviä esteitä hoitoon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Tutkia uusia hoitovaihtoehtoja, olemme menestyksekkäästi kapseloitu MicroRNA-34a (miR-34a), joka on voimakas endogeeninen tuumorisuppressori NSCLC osaksi S6 aptameeriin konjugoituna dendrimeerimolekyyli muodostamaan keuhkosyöpä kohdistettuja geenikuljettimia nanohiukkasten (PAM-Ap /pMiR-34a NP) . PAM-Ap /pMiR-34a NP halkaisija oli 100-200 nm ja zeta-potentiaali on ~ 30 mV soveltavaa N /P-suhteen. Aptameeriä konjugointi paransi sisäänottoa soluihin sekä geenin transfektion tehokkuutta PAM-Ap /pMiR-34a NP viljellyissä NSCLC soluissa. Osoitimme, että PAM-Ap /pMiR-34a NP tehostettu sääntelyä kohdennettujen geenien, BCL-2 ja p53

in vitro

. Lisäksi olemme paljasti PAM-Ap /pMiR-34a NP esti merkittävästi solujen kasvua, muuttoliike, invaasion ja indusoi apoptoosin keuhkosyöpään solujen verrattuna ei-kohdennettuja NP. Menetelmä aikaan uusi hoitostrategia kokeellinen hoito NSCLC.

Citation: Wang H, Zhao X, Guo C, Ren D, Zhao Y, Xiao W, et al. (2015) aptameeriin-Dendrimeeripeptidi Bioconjugates kohdennettuja Toimitus miR-34a ilmaiseminen Plasmidi ja Kasvaintenvastainen Vaikutukset ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 10 (9): e0139136. doi: 10,1371 /journal.pone.0139136

Editor: Valentin Cena, Universidad de Castilla-La Mancha, ESPANJA

vastaanotettu: 05 toukokuu 2015; Hyväksytty: 08 syyskuu 2015; Julkaistu: 25 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Technology Development Plan Project Shandongin maakunnassa (2013WS0273). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvän kuoleman maailmassa [1]. Noin 85% kaikista kliinisistä keuhkosyöpää ovat ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [2, 3]. Huolimatta lukuisista kehitys kirurginen hoito, kemoterapiaa ja molekyylitason kohdennettuja tekijöille NSCLC, etäpesäke ja monilääkeaineresistenssin vielä suuria syitä vikoja hoidossa keuhkosyöpäpotilaita [4, 5]. Näin ollen on erittäin toivottavaa kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja kuin tavanomaista hoitoa, ei-pienisoluisen keuhkosyövän. MikroRNA (miRNA) on osoitettu olevan tärkeä rooli etenemistä ihmisen syöpien ja voivat olla tehokkaita kohteita syövän hoidossa [6]. MiRNA ovat pieniä RNA: t ~ 22 nukleotidiä pitkiä, jotka ovat kriittisiä säätelijöitä geenin ilmentymisen [7]. Kypsä miRNA kohde-mRNA: ta täydentävien alueiden, mikä johtaa mRNA: n hajoamisen ja translaation estyminen [8, 9]. Niistä yli 700 ihmisen miRNA tunnistettu, miR-34a on transkriptionaalinen tavoite kasvaimen p53 [10], ja alassäädetty miR-34a ilmaisu korreloivat suurella todennäköisyydellä uusiutumisen pienisoluista keuhkosyöpää [11]. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-34a estää niiden kasvun ja etäpesäkkeiden NSCLC säätelemällä useita tuumorisuppressorien tai onkogeenien, kuten p53, BCL-2, c-Met, ja CDK4 [12]. Aiemmat kertomukset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-34a voisi estää etenemisen ja etäpesäkkeiden NSCLC, sekä parantaa kemoterapia herkkyyttä.

kehitys miRNA terapeuttisten on tulossa lupaava vaihtoehto strategia tavanomaisen hoidon, kuten kemoterapian ja sädehoidon NSCLC hoitoon. Kuitenkin kliininen soveltaminen miRNA kohtaa monia biologisia haasteita, kuten nopea verestä, huono pysyvyys seerumissa ja riittämätön soluunottoa [13]. Kasvain kohdistaminen nano-kuljetusjärjestelmiä on kehitetty näiden ongelmien voittamiseksi [14, 15]. Gene ladattu nanocomplexes pidetään paremmin sopivaksi syöpähoitoa varten johtuen niiden passiivinen kertyminen kiinteitä kasvaimia niiden parannettu läpäisevyys ja säilyttäminen (EPR) ominaisuuksia nopeasti kasvavilla kasvaimia [16]. Functionalization polymeerien erityisiä solu kohdistamisen ligandit voivat parantaa kasvain kertymiseen yli EPR vaikutus [17], mikä parantaa transfektion tehokkuutta ja biologisesta yhteensopivuudesta kyseisten geenien ladattu nanocomplexes.

polyamidoamiini (PAMAM) ovat kationiset dendriittisillä rakenne. Elektrostaattiset vuorovaikutukset, PAMAM ja negatiivisesti varautuneita pDNA muodossa nanocomplexes joita käytetään yleisesti ei-virusgeenin vektoreita transfektoimaan eksogeenistä DNA: ta tai RNA: ta soluihin [18]. Tärkeää on, että molekyyli painon ja varaustiheys on PAMAM voidaan helposti manipuloida on ylivoimainen turvallisuuden. Tähän mennessä erilaisia ​​mahdollisia biomarkkereita keuhkosyöpä on tunnistettu, kuten EGFR, TP53, CA-125 ja CEA, mutta puuttuminen spesifisyys ja herkkyys oli edelleen ongelma käytännössä kohdistuva lääkkeiden annostelu [19].

Aptameerit ovat lyhyitä, yksijuosteisia oligonukleotideja (DNA tai RNA), joka valitaan SELEX-menetelmä (systemaattinen kehitys ligandien eksponentiaalinen rikastamiseen). Verrattuna vasta, edut Aptameerien ovat erillisiä, kuten kätevä synteesi ja muuttamista, suuri affiniteetti ja spesifisyys kohde molekyylejä, alhainen immunogeenisyys, vähemmän myrkyllisyys, suurempi vakaus ja nopea kudospenetraatio [20, 21]. Näin ollen, aptameerin-konjugoitu nanocomplexes voi toimittaa oligonukleotideja solutyyppispesifisten tavalla parannetun transfektion tehokkuutta ja /tai vähentää sivuvaikutuksia normaaleihin soluihin [22]. Useat solukohtainen aptameerejä on käytetty geenin toimitus, mutta aptameeri-konjugoitua Nanocomplex käytetään hoitoon ei-pienisoluisen keuhkosyövän on rajallinen. Työmme kehitimme PAMAM-PEG-aptameeriin liitäntä (PAM-Ap) käyttäen S6, aptameeristä valittu A549 keuhkosyöpään solujen solu-SELEX [23] ja hyväksytyt funktionalisoimiseksi PAMAM G5.0, sitten sekoittaa PAM- Ap kanssa pMiR-34a rakentaa PAM-Ap /pMiR-34a nanohiukkasten (PAM-Ap /pMiR-34a NP) antaa sekä pDNA keuhkojen syöpäsoluja. Seuraavaksi arvioimme geenitransfektion tehokkuutta ja antituumorivaikutusta PAM-Ap /pMiR-34a NP A549-soluissa. Tuloksemme osoittavat aptameeriin-dendrimeerin bioconjugates järjestelmä on tehokas tapa toimittaa miR-34a ilmentävien plasmidin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

polyamidoamiini (PAMAM, etyleenidiamiini ydin, G5.0) ja 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Maleimidi polyetyleeniglykoli sukkinimidyyliesteri (Mal-PEG-NHS, Mw 2000) ostettiin Bio-matriisi Inc. (Jiaxing, Kiina). Gelred

TM DNA geeli tahra ostettiin Biotium (CA, USA). Naudan sikiön seerumia (FBS), RPMI-1640-viljelyalustaan, Dulbeccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos (DPBS), trypsiini, penisilliini-streptomysiiniä ja YOYO-1 jodidi ostettiin Invitrogen /Life Technologies (Carlsbad, CA). Anneksiini V-FITC ja propidiumjodidilla (PI) -värjäyspakkausta olivat BD Biosciences (San Jose, CA). Cell Counting Kit 8 (CCK-8), RIPA proteiini lyysipuskuria ja BCA-proteiinikokeella kit hankittiin Beyotime (Nanjing, Kiina). A549 sitovia aptameeriin (S6, sekvenssi: GTGGCCAGTCACTCAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG) kanssa sulfhydryyliryhmän 5′-päähän syntetisoitiin RiboBio Co. Ltd (Guangzhou, Kiina). MIR-34a ja parannettua vihreää fluoresoivaa proteiinia (EGFP) koekspressoivat plasmidi (pMiR-34a, sense: 5′-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3 ’, antisense: 5′-AACCAGCUAAGACACUGCCAUU-3′) ja negatiivinen kontrolli plasmidin (pMiR-NC, sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’, antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’) hankittiin SunBio Co.Ltd (Shanghai, Kiina). A549 ihmisen NSCLC solulinja saatiin Institute Biokemian ja solubiologian, SIBS, CAS (Kiina). Soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, penisilliiniä (100 IU /ml) ja streptomysiiniä (100 mg /ml) 37 ° C: ssa inkubaattorissa 5% CO

2.

synteesi ja aptameerin konjugoitu dendrimeeri (PAM-Ap) B

syntetisoimiseksi aptameeri konjugoitu dendrimeerin, 100 mg PAMAM (metanoliliuos) kuivattiin typen alla ja liuotettiin 5 ml: aan PBS: ää (pH 7,2). Sitten 20 mg Mal-PEG-NHS (Mw 2000) lisättiin PAMAM liuokseen ja sekoitettiin 6 h, ja sitten seos dialysoidaan tislattua vettä käyttäen dialyysikalvoa (MWCO 3500 Da) 24 tuntia poistamiseksi reagoimattoman Mal-PEG- NHS, jota seurasi lyofilisointi saada pegyloidun PAMAM (PAM-PEG-Mal). Konjugoimiseksi S6 aptameerin, 25 mg PAM-PEG-Mal liuotettiin 2 ml: aan PBS: ää (pH 7,2). Sitten 50 nM S6 aptameerin sekoitettiin liuoksen kanssa 6 tuntia, sitten tuote dialysoitiin tislattua vettä vastaan ​​käyttäen dialyysikalvoa (MWCO 7500 Da) 12 tuntia ja lyofilisoitiin, jolloin saat PAMAM-PEG-Ap (PAM-Ap).

formulointi ja karakterisointi pDNA ladattu nanohiukkasten

pDNA sitova kyky arviointi, 1 ug pDNA sekoitettiin PAM-Ap N /P-suhde on välillä 0,5-16 PBS: ssä (pH 7,2 ). Kukin näyte vorteksoitiin 20 s, inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, jolloin muodostuu PAM-Ap /pDNA NP. Sitten näytteitä ajettiin elektroforeesissa 1,5% agaroosigeelissä, joka sisälsi Gelred

TM 20 min (100 V), ja siteet pDNA visualisoitiin UV-valon alla. Hiukkaskoon ja zeetapotentiaalimittauk-, PAM-Ap /pDNA NP valmistettiin eri N /P-suhteen tislattuun veteen ja määritetään Zetasizer Nano ZS (Malvern Inc., Westborough, MA). Sillä seerumi stabiilisuustestin, paljain pMiR-34a, PAM /pMiR-34a ja PAM-Ap /pMiR-34a komplekseja (N /P = 40) inkuboitiin 50% FBS 30 ug /ml. Seoksia inkuboitiin 37 ° C: ssa eri aikavälein. Sen jälkeen, 20 ui seoksia käsiteltiin 10 ui hepariinin vesiliuosta (1000 U /ml), jotta ladattu pDNA seuraavat elektroforeesilla 1,0% w /v agaroosigeelillä, joka sisälsi Gelred

TM 15 min. Hajaantumattomat pDNA visualisoitiin UV-valon alla.

Virtaussytometria solun oton määritystä

A549-soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 3 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja viljeltiin 24 tuntia. PAM-Ap /pDNA tai PAM /pDNA NP valmistettiin YOYO-1 merkitty pDNA (1 molekyyli YOYO-1 jodidia 20 emäsparia nukleotidi) on N /P-suhde oli 40. Ennen transfektion jälkeen viljelyalusta poistettiin. Sitten 2 ml seerumitonta RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi PAM-AP /pDNA tai PAM /pDNA NP lisättiin kuhunkin kuoppaan (pDNA 4 ug /kuoppa). 4 tunnin kuluttua inkuboinnin transfektion väliaine poistettiin. Solut pestiin, trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen DPBS ja näytteet otettiin heti määritettiin virtaussytometrialla (BD, San Jose, CA). Kilpailuun tutkimus S6 aptameerin välitteisen oton solun sisään PAM-Ap, A549-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, 30 min ennen PAM-Ap /pDNA NP hoito, 50-kertainen ylimäärä S6 aptameerin lisättiin elatusaineeseen ja inkuboitiin 4 tunnin ajan, ennen kuin analysoitiin solujen kuten edellä.

CLSM (CLSM) tutkimus

A549-soluja ympättiin lasipeitinlevyn 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

4 kuoppaa kohti ja niitä viljeltiin 24 tuntia. YOYO-1 leimattua PAM-Ap /pDNA tai PAM /pDNA NP valmistettiin samalla menetelmällä kuin edellä on kuvattu. Solut transfektoitiin PAM-AP /pDNA tai PAM /pDNA NP, jonka pDNA pitoisuutena 1 ug /kuoppa. 4 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut pestiin ja kiinnitettiin 4% formaldehydiä, värjättiin DAPI. Solunulkoista polymeerit /pDNA nanohiukkasten pestiin DPBS: llä, joka sisältää hepariinia. Kuvat otettiin konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (Olympus, Japani).

Transfektio tehokkuus arviointi

arvioimiseksi transfektion tehokkuus, 1,5 x 10

5 A549-solut ympättiin 12 kuoppaiset levyt ja viljeltiin 24 tuntia. A549-soluja transfektoitiin PAM-AP /pMiR-34a tai PAM /pMiR-34a NP (2 ug pMiR-34a per kolo) N /P-suhde oli 10, 20 ja 40: ssa 4 h. Transfektion jälkeen elatusaine korvattiin ja soluja viljeltiin vielä 48 tunnin ajan. EGFP ilmentävät solut kuvantaa fluoresenssimikroskooppia (Leica, Saksa) ja kvantitoitiin virtaussytometrillä.

RNA: n eristys ja qPCR analyysi

tasot BCL-2 ja p53 mRNA määritettiin kvantitatiivisen Real-Time PCR (qRT-PCR). A549-soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 3 x 10

5 per kuoppa ja viljeltiin 24 tuntia. Transfektio PAM-AP /pMiR-34a tai PAM /pMiR-34a NP suoritettiin kuten edellä on kuvattu. 48 tunnin kuluttua inkubaation viljelyalusta poistettiin ja solut pestiin PBS: llä. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy mini-sarjat (Qiagen, Germantown, MD) valmistajan protokollan. BCL-2 ja p53-mRNA kvantitoitiin käyttäen iScript

TM yksi askel RT-PCR kit, joissa SYBR green (Bio-Rad, CA) käyttäen iQ

TM5 RT-PCR tunnistusjärjestelmä. Suhteellinen geeniekspressiotasot laskettiin seuraavan vertailevan Ct menetelmä endogeenistä ohjaus β-aktiinin ekspressiotason. Aineisto on normalisoitu BCL-2 tai p53-ilmentymisen määrä käsittelemättömien solujen. Sekvenssit geenin-spesifisiä alukkeita qPCR ovat seuraavat: β-aktiini (sense) 5′-GGATCCGACTTCGAGCAAGAGATGGCCAC-3 ’(antisense) 5′-CAATGCCAGGGTACATGGTGGTG-3′; BCL-2 (sense) 5’-TTGGATCAGGGAGTTGGAAG-3 ’(antisense) 5′-TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3′; p53 (sense) 5’-ACCAGGGCAGCTACGGTTTC-3 ’(antisense) 5′-CCTGGGCATCCTTGAGTTCC-3’.

Western blot-analyysi

A549-soluja viljeltiin ja käsiteltiin, kuten edellä kuvatulla tavalla. Yhteensä proteiini uutettiin RIPA lyysipuskuria ja kvantifioitiin BCA proteiinimääritysmenetelmällä kit. 40 mg proteiinia ladattiin ja erotettiin 10%: Ready Gel Tris-HCl Gel (Bio-Rad, CA) ja siirrettiin sitten polyvinylideenifluoridia (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). PVDF-membraani blokattiin kuoritun maidon 5%: ssa 1 tunti, ja tutkittiin primaaristen vasta-aineiden huoneenlämpötilassa 1 tunti. Sen jälkeen kalvo värjättiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen ja vyöhykkeet havaittiin ECL Plus -kittiä (Beyotime, Nanjing, Kiina).

Sytotoksisuusmääritvs

In vitro sytotoksisuutta arvioitiin CCK-8-määrityksessä. A549-soluja ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 6000 solua per kuoppa ja viljeltiin yön yli. Solut transfektoitiin PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a tai PAM-Ap /pMiR-34a NP: ssa 4 tuntia (2 ug /ml pMiR-34a), sitten elatusaine korvattiin ja soluja inkuboitiin edelleen 24 h, 48 h, 72 h tai 96 h. Poistamisen jälkeen media, 100 ui elatusainetta, joka sisälsi 10 ui CCK-8, lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja inkuboitiin vielä 1 tunnin ajan, kunkin kuopan absorbanssi mitattiin käyttämällä mikrolevyjen lukijaa (Thermo Scientific, MUTISKAN MK3) 450 nm: n aallonpituudella . Solujen elinkelpoisuus A549-solut oli ilmaistu suhteessa käsittelemättömiin soluihin.

Cell apoptoosin analyysi

A549-solujen apoptoosia määritettiin virtaussytometrialla raportoitu aiemmin [24]. Lyhyesti, A549-soluja ympättiin 12-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja inkuboitiin yön yli. Solut transfektoitiin PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a tai PAM-AP /pMiR-34a NP: ssa 4 tuntia (2 ug /ml pDNA), sitten transfektion väliaine vaihdettiin ja soluja inkuboitiin edelleen 48 h. Sitten solut pestiin, trypsinoitiin ja kerättiin sentrifugoimalla. Solun apoptoosi arvioitiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI) värjäys mukainen pakkaus valmistajan protokollan.

In vitro

maahanmuutto- ja invaasiomääritys

Siirtyminen ja hyökkäys kyky A549-solut arvioitiin käyttämällä modifioitua 6,5 ​​mm siirtokuoppaan kammio polykarbonaattia kalvoja (8,0 mm: n huokoskoko) (Costar, Cambridge, Mass). A549-soluja (1 x 10

5-solut) transfektoitiin 24 tuntia ja käsiteltiin trypsiinillä ja suspendoitiin 200 ul: aan seerumitonta RPMI 1640-väliaine. Sitten solut ympättiin päällä kammioiden kanssa päällystämättömien tai esipäällystetty 20 mg matrigeelin (maahanmuutto- ja invaasiomääritys, vastaavasti). Viljelyväliaineeseen, joka sisälsi 10% FBS: alakammiossa käytettiin kemoatrak-. 24 tunnin inkubaation, ei siirretyn tai ei-tunkeutuvat solut pyyhitään vanupuikkojen ylhäältä kammiosta. Solujen alapuolella kammion kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, värjättiin sitten 0,5% kristalliviolettiliuoksella 1 h ja laskettiin mikroskoopilla viidellä ennalta aloilla.

Tilastollinen analyysi

Data oli esitetty keskiarvona ± SD. Yksisuuntainen analyysit varianssianalyysillä (ANOVA) suoritettiin. P-arvo 0.05 määriteltiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset ja keskustelu

synteesi ja karakterisointi materiaalien

Bifunktionaalisen Maleiini polyetyleeniglykoli sukkinimidyyliesteri (Mal-PEG-NHS) annettiin kytke aminoryhmä PAMAM ja 5′-tioloiduilla S6 aptameeri. Dialyysi käyttää puhdistamaan tuotteen. Reaktio PAMAM ja Mal-PEG-NHS seurattiin 1H-NMR (300 MHz), jossa on piikit ja PAMAM (2,3, 2,4, 2,7, 3.1ppm) (kuvio 1A), PEG (3,6 ppm), MAL (5,8 , 6,3 ppm) (kuvio 1B). Tunniste

1H-NMR-tulokset vahvistivat muodostumista PAMAM-PEG-MAL. Käytimme integroitu alueet H-NMR-piikit mitata suhde PEG-ketjujen ja PAMAM. Sillä oletuksella 164 metyleeniprotonien kohden PEG ja 2032 per PAMAM tunnistimme että PAMAM-PEG-MAL oli PAMAM /PEG protoni suhde 0,32, mikä osoittaa, että kukin PAMAM oli keskimäärin 3,9 PEG-ketjujen yhteydessä.

karakterisointi PAM-Ap /pDNA nanohiukkasten

juuri valmistettu PAM-Ap konjugaatteja liuotettiin vesipitoisissa olosuhteissa ja sekoitetaan pDNA muodostamiseksi nano-mittakaavan hiukkasia. Keskimääräinen koot PAM-Ap /pDNA NP vaihtelevat 100-200 nm, kun N /P-suhde on suurempi kuin 5 (kuvio 2A). N /P-suhde kasvoi, koko PAM-Ap /pDNA NP laskenut alle 200 nm (kuvio 2A), eikä koon muutosta sen jälkeen. Nämä tulokset osoittivat muodostuminen tiheä nanohiukkasten välillä PAM-Ap ja pDNA. Kuten on esitetty kuviossa 2B ja 2C, koko ja zeta-potentiaali oli hieman muuttaa, kun konjugointi PEG: n ja aptameerin. Koko PAM-Ap /pDNA edelleen lisättävä noin 150 nm, kun zeta potentiaalia laski noin 31mV, mikä osoittaa, että PEG ja aptameeriin ympäröi nanohiukkasten pinnalle. Lisäksi PAM-Ap /pDNA NP oli kapeampi kokojakauma kuin PAM /pDNA NP. PDNA tiivistyminen kyky syntetisoidun PAM-Ap mitattiin agaroosigeelillä jälkeenjääneisyys. Geeli elektroforeesi osoittivat lisääntynyttä N /P-suhde PAM-Ap /pDNA NP (kuvio 2D). Ja N /P-suhde oli 4, täydellinen hidastuminen PAM-Ap /pDNA tunnistettiin.

(A) koko ja zeta-potentiaali ja PAM-Ap NP mitattiin DLS. (B) kokojakauma PAM /pDNA ja PAM-Ap NP: N /P = 40 (C) Zeta potentiaali jakautuminen PAM /pDNA ja PAM-Ap NP: N /P = 40 (D) Gel hidastumista elektroforeesi PAM-Ap /pDNA NP. Band 1: Naked pDNA, nauhat 2-7: PAM-Ap /pDNA NP valmistettiin N /P-suhde oli 0,5, 1, 2, 4, 8 ja 16, vastaavasti. (E) Serum stabiiliuskokeesta pDNA, PAM /pDNA ja PAM-Ap /pDNA komplekseja 50% FBS olosuhteissa 37 ° C: ssa. Data on esitetty asmean ± SD (n = 3).

vakaus pDNA komplekseissa on tärkeää tehokas geenien toimittaminen. Agaroosigeelillä määritys esiteltiin määrittämiseksi pDNA vakautta 50% seerumia matkia

in vivo

olosuhteissa. Suojelu vaikutus komplekseja vastaan ​​DNA hajoaisi seerumissa kuvassa 2E. Alaston pDNA oli täysin hajonnut 50% FBS kuluttua 8 h, kun taas PAM /pDNA ja PAM-Ap /pDNA näytteillä suojaavia vaikutuksia seerumin 48 h (kuvio 2E). Nämä tulokset viittaavat siihen, PAM-Ap voi vain sitoa pDNA, mutta myös suojella sitä hajoamisen seerumissa, jotka voivat edistää mahdollisen soveltamisen geeninkuljetussysteemiä.

Cellular ottoa Nanohiukkasten

suorituskyky ei-virus- geeninkuljetusvektoreja liittyy läheisesti tasot soluunottoa [25]. Vihreä fluoresenssi emittoituu pDNA /YOYO-1 analysoitiin arvioimiseksi ottoa solun sisään PAM-Ap /pDNA NP. A549-soluja inkuboitiin paljain pDNA, PAM /pDNA tai PAM-Ap /pDNA NP, vastaavasti, ja sitten YOYO-1-positiiviset solut kvantifioitiin virtaussytometrialla edustavat astetta soluunottoa [26]. Osuus YOYO-1-positiivisten solujen lisääntynyt N /P-suhteen, joka osoittaa ottoa solun sisään NP: itä altistettiin N /P-suhde on suuressa määrin (kuvio 3A ja 3B). PAM-Ap /pDNA NP oli korkeampi soluunottoa kuin nontargeted PAM /pDNA NP. Kun käsitelty PAM-Ap /pDNA NP N /P-suhteen 40, A549-solut osoittivat huomattavasti korkeampia fluoresenssisignaalien (94,2% YoYo-1-positiivisten solujen) verrattuna PAM /pDNA NP käsiteltyjen solujen (48,5% YoYo-1-positiivisia soluja). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PAM-Ap /pDNA NP sitoutua ensisijaisesti A549-soluja. Edelleen todistaa, että S6 reseptorivälitteinen ottoa PAM-Ap /pDNA NP soluissa, suoritimme kilpailun kokeen esikäsittelemällä A549 soluja ylimäärin S6 Aptameerin ja paljasti merkittävän alempi otto osoittaa vapaa aptameeriin estetty sitoutumiskohdat S6 on cytolemma pinnalla A549-solut, jotka tukahdutti kohdistaminen kyky PAM-Ap /pDNA NP: itä.

käsittelemättömiä soluja käytettiin kontrollina. Data on esitetty keskiarvona ± SD (n = 3). * P 0,05, merkitsevä ero näiden ryhmien välillä.

CLSM Kokeet vieressä suorittaa edelleen vahvistaa solun sisäistämisen reseptorivälitteisen kohdistettu annostelu PAM-Ap /pDNA NP: itä ja jakelu pDNA A549-soluissa koska CLSM track YoYo-1 leimattua pDNA (vihreä fluoresenssi) muotoiltu nanocomplexes. Verrattuna ei-kohdennettu PAM /pDNA NP, A549-soluja käsiteltiin PAM-Ap /pDNA NP näytteillä vahvempi vihreän fluoresenssin signaaleja jälkeen 4h inkuboinnin osoittaa korkeampi soluotto kohdennettujen NP (kuvio 4). Notebaly, fluoresenssi signaali väheni merkittävästi aptameeriä esikäsitelty A549 samanlaisissa olosuhteissa, mikä viittaa siihen, että S6 reseptorin endosytoosin oli merkittävä koulutusjakson PAM-Ap /pDNA NP sisäistämisen. Lisäksi useimmat YoYo-1 signaaleja havaittiin solulimassa, joka merkitsee protonisieni vaikutuksia PAMAM ollut keskeinen rooli tässä prosessissa endosomaaliset /lysosomaalisen escape [27]. Lopuksi todettakoon, että tiedot viittaavat siihen, että PAM-Ap /pDNA NP näyttää sekä hyvät solujen kohdentamiseen ja endosomaaliset /lysosomaalisen paeta ominaisuuksia.

A549-soluja käsiteltiin YoYo-1 leimattu pDNA kompleksoituna PAM ja PAM-Ap (N /P-suhde: 40) kanssa tai ilman S6 aptameeriin esikäsitelty. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Kaikki mittakaavassa palkit ovat 20 pm.

transfektiotehokkuus nanohiukkasten

Kun osoittaa tehokas solun oton PAM-Ap /pDNA NP, seuraavan kerran mitataan transfektiotehokkuus PAM-Ap /pMiR-34a NP A549 solut EGFP toimittaja. Koska pMiR-34a ekspressiovektori sisältää parannettua vihreää fluoresoivaa (EGFP) geeni, jonka ilmentymistä ohjaa sama promoottori, EGFP-ilmentyminen voi suoraan heijastaa tasot pMiR-34a ilmentymistä ja sitä voidaan käyttää arvioimaan transfektion tehokkuutta. Kuten on esitetty kuviossa 5A ja 5B, geenin transfektion tehokkuutta PAM-Ap /pMiR-34a NP oli paljon suurempi kuin PAM /pMiR-34a NP eri N /P-suhteet. Eksogeeninen EGFP geenin ilmentymisen lisääntyi kanssa N /P-suhde molempien nanohiukkasia. Transfektio tehokkuus oli alhainen N /P-suhde oli 10, mutta lisääntyi N /P-suhde oli 20 ja 40. EGFP ilmentyminen PAM-Ap /pMiR-34a NP A549-soluissa selvästi havaittu N /P-suhde oli 40 , mikä osoitti, että nanohiukkaset varmistaa tehokasta geenien ilmentymisen tehokkuutta. Samoin kvantitatiivisia mittauksia EGFP positiivisten solujen vahvistettiin, että 37,9% soluista onnistuneesti transfektoitu PAM-Ap /pMiR-34a NP kun N /P-suhde oli 40, kun taas se oli vain 9,5%, että PAM /pMiR-34a NP: ryhmä. Lisäksi huomattavia eroja prosenttiosuuden transfektoitujen solujen ryhmien välillä kaikissa N /P-suhteet. Nämä tulokset viittaavat siihen, että aptameeriin konjugointi parantaa merkittävästi transfektiotehokkuus PAM-Ap /pDNA NP. Koska toksisuus, myös kasvaa määrää kationisten polymeerien [28, 29], päätimme nanohiukkasten N /P-suhde 40 seuraavissa kokeissa.

Data on esitetty keskiarvona ± SD (n = 3). Kaikki mittakaavassa palkit ovat 200 pm. * P 0,05, merkittävä ero näiden ryhmien välillä.

vaikutus geeni-ilmentymisen

yli-ilmentyminen anti-apoptoottisten geenien syöpäsoluissa pidetään yhtenä mekanismeja syövän etenemiseen. Tehokkaana säädin apoptoosin, BCL-2 on tunnistettu useita erilaisia ​​syöpiä [30]. BCL-2: ta on havaittu olevan usein yli-ilmentynyt keuhkosyövän ja sen anti-apoptoottisen roolin on tiiviisti liittyy sen ekspressiotasot [31, 32]. Yli-ilmentyminen BCL-2 johtaa syöpäsolujen vastustuskyky kemoterapia lääkkeen indusoiman apoptoosin [33]. BCL-2: ta on aiemmin tunnistettu lupaava alavirran kohde miR-34a [34]. Tuumorisuppressorina, p53-inaktivaatio vastauksena joihinkin syöpään liittyvä stressi signaalit on yksi yhteinen geneettinen muutos useimmissa syöpätyyppien [35]. Aktivoitu p53 aikaansaa lukuisia biologisia tuloksia, kuten korjaus vähäisiä vahinkoja, säätely solusyklin, induktio monistus vanhenemista ja apoptoosia. Vuorovaikutus p53 ja miR-34a on selvennetty monenlaisia ​​syöpiä, kuten NSCLC [36]. Arvioida BCL-2-geenin suppressio ja p53-geenin aktivaation aktiivisuus pMiR-34a siirretään A549-solut, käsittelimme A549-solujen PAM-Ap /pMiR-34a, PAM /pMiR-34a tai PAM-Ap /pMiR-NC NP ja mitataan tasot BCL-2 ja p53-mRNA: t. Tulokset qPCR osoittivat, että taso BCL-2-mRNA oli merkittävästi alassäädetty ja p53 mRNA merkittävästi säädellään ylöspäin A549-solut (kuvio 6A). 48 tunnin kuluttua inkubaation, havaitsimme 60,8%: n lasku BCL-2: n mRNA ilmaisu PAM-Ap /pMiR-34a, mutta vain 26,5%: n lasku PAM /pMiR-34a. Samaan aikaan, PAM-Ap /pMiR-34a transfektoitujen A549-solut johti 7,93-kertainen p53-mRNA: n, huomattavasti korkeampi kuin PAM /pMiR-34a (2,1-kertainen). Vastaavasti, ilmaus taso p53 ja BCL-2 proteiinien A549-soluja mitattiin Western-blottauksella (kuvio 6B). Kuten odotettua, proteiinit oli sama suuntaus kuin mRNA: n ekspression taso, koska p53-proteiinin ekspressio oli säätelemätön ja BCL-2-proteiinia oli vähentynyt PAM-Ap /pMiR-34a transfektoitujen A549-solut. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että PAM-Ap /pMiR-34a NP pystyvät vaikuttamaan niihin liittyvien geenien ja proteiinien ilmentyminen A549-solut.

Soluja viljeltiin 48 h kuluttua transfektoitu PAM-Ap /pMiR-NC NP, PAM /pMiR-34a NP: itä ja PAM-Ap /pMiR-34a NP 4 tuntia. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi tehtiin määrällisesti mRNA ilmaisun, ja Western blotting käytettiin määrittämään proteiinin ilmentymisen. Käsittelemättömän soluja käytettiin kontrollina. Data on esitetty keskiarvona ± SD (n = 3). * P 0,05, merkittävä ero verrattuna PAM /pMiR-34a.

syöpäsolujen kasvun estäminen

Seuraavaksi arvioimme

in vitro

kasvua estävän vaikutuksen PAM- Ap /pMiR-34a NP on A549-soluja käyttäen CCK-8 määrityksessä. 24 tunnin kuluttua, 48 h, 72 h tai 96 h transfektion inhibiitionopeudet solun kasvun mitattiin. Todettiin, että PAM-Ap /pMiR-34a NP osoitti voimakkaimman antiproliferatiivinen vaikutus A549-soluja (kuvio 7A). Solujen elinkelpoisuus PAM-Ap /pMiR-34a NP käsiteltyjen A549-solut osoittivat 29,8%, 49,7%, 57,5% ja 62,4% pienempi kuin kontrolliryhmän 24 tunnin jälkeen, 48 tunnin, 72 tunnin ja 96 tunnin kuluttua transfektion, vastaavasti. Kuten itämisaika aika meni, kuilu solujen elävyyden välillä PAM-Ap /pMiR-34a ja muiden ryhmien lisääntynyt, ja tämä saattaa johtua siitä, että hystereesi eksogeenisen geenin ilmaiseman pMiR-34a. On syytä huomata, että PAM-Ap /pMiR-NC NP hieman esti A549 solujen kasvua. Siten aptameerin myös osaltaan kasvunestotestissä vaikutuksen PAM-Ap /pMiR-34a. Nämä kokeelliset tulokset osoittavat, että kasvu geenin transfektion A549-solut vaikuttavat solujen kasvua. Siten PAM-Ap /pMiR-34a NP on potentiaalia olla kohdegeenin jakelujärjestelmä hoidettaessa keuhkosyöpää.

(A) In vitro sytotoksisuutta PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR- 34a ja PAM-Ap /pMiR-34a NP A549-soluissa eri aikapisteessä transfektion jälkeen. (B) Cellular apoptoosin A549 käsittelyn jälkeen PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a ja PAM-Ap /pMiR-34a NP: ssa 48 tuntia. CCK-8-määritystä käytettiin arvioimaan solujen elinkelpoisuuden ja virtaussytometria käytettiin määrittämään solujen apoptoosin anneksiini /PI-värjäyksen. Data on esitetty keskiarvona ± SD (n = 3). * P 0,05, merkittävä ero näiden ryhmien välillä.

Apoptoosi on yleisesti katsotaan olevan yksi merkittävimmistä mekanismeja solukuoleman [37, 38]. Kuten on esitetty kuviossa 7B, apoptoottisten ja nekroottisten solujen kontrolliryhmässä eivät olleet ilmeisiä ( 10%). Hoito PAM /pMiR-34a ja PAM-Ap /pMiR-34a NP huomattavasti prosenttiosuutta aikaisin ja myöhään apoptoottisia soluja. Lisäksi solut, joita käsiteltiin PAM-Ap /pMiR-34a NP osoitti suurimman prosenttiosuuden koko vaurioituneiden solujen, joka oli huomattavasti korkeampi kuin muiden ryhmien (P 0,05). Tulokset osoittivat, että PAM-Ap /pMiR-34a NP olivat tehokkaampia apoptoosin A549 soluja kuin ei-kohdennettu PAM /pMiR-34a.

In vitro

maahanmuutto- ja invaasio

on olemassa erilaisia ​​muutoksia syöpäsoluissa ja mikroympäristön kudosta, ja muutokset aiheuttavat solujen siirtää tai hyökätä terveitä kudoksia, mikä johtaa syövän metastaasia [39]. Siksi maahanmuutto ja

in vitro

invasion määritykset ovat välttämättömiä arvioida taipumus etäpesäkkeiden prosessi. Sen jälkeen kun oli transfektoitu PAM-Ap /pMiR-34a NP, vaeltavien ja invasiivisia kyky A549-solut tutkittiin. Kuten kuviossa 8A ja 8B, huomasimme, että PAM-Ap /pMiR-34a NP estivät merkittävästi muuttoliikkeen ja hyökkäyksen A549-solut. Merkillistä, muuttavien ja invasiivisia määriä PAM-Ap /pMiR-34a käsitellyt solut olivat 17,7% ja 23,8% verrattuna käsittelemättömiin soluihin, tässä järjestyksessä. Oli kuitenkin hyvin vähäinen vaikutus muuttoliikkeen ja invaasion käsiteltyjen solujen PAM-Ap /pMiR-NC verrattiin kontrolliryhmän, joka voitiin päätellä, että miR-34a ilme vaikuttaa pääasiassa solumigraatioon ja invaasiota pikemminkin kuin S6 aptameeriin.

Soluja esikäsiteltiin PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a ja PAM-Ap /pMiR-34a NP. Käsittelemättömän soluja käytettiin kontrollina. (A) edustaja mikroskopia kuvia maahanmuutto- ja kvantitatiivisen analyysin muuttavien soluja. (B) edustaja mikroskopia kuvia hyökkäyksen ja määrällinen analyysi invasiivisia soluja. Data on esitetty keskiarvona ± SD (n = 3). * P 0,05, merkitsevä ero näiden ryhmien välillä.

Johtopäätös

Vaikka myrkyllisyydestä dendrimeerien on yksi niistä tekijöistä, jotka rajoittivat kliinisiä sovelluksia Dendrimeerejä on pidetty ”älykkäitä” kantajina niiden kykyä kuten solunsisäistä geenikuljetin.