Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on erittäin desmoplastic kasvain synkkä ennuste useimmille potilaille. Fibroosia ja tulehdus ovat tunnusmerkkejä kasvain desmoplasia. Olemme aiemmin osoittaneet, että estetään aktivointi haiman tähtisolut (PSC) ja lievittää desmoplasia ovat hyödyllisiä strategioita hoidettaessa PDAC. Metformiini on laajalti käytetty glukoosi alentava lääke. Se on myös usein määrätty diabeettisen haimasyövän potilaiden ja on osoitettu liittyvän parempaan tulokseen. Kuitenkin mekanismit tämän edun jäävät epäselviksi. Metformiini on havaittu aktiivisuuden moduloimiseksi tähtisolut muiden tautien asetuksia. Tässä tutkimuksessa tarkastellaan metformiinin vaikutusten PSC toimintaa, fibroosia ja tulehdusta PDACs.

Menetelmät /Tulokset

ylipainoinen, diabeettisen PDAC potilaiden ja prekliinisen hiiri malleja, hoito metformiinin kevyemmästä kasvaimen soluväliaineen (ECM) komponenttien, erityisesti hyaluronihaposta (HA).

In vitro

, huomasimme, että metformiini vähensi TGF-ß signalointi ja tuotannon HA ja kollageeni-I viljellyissä PSCs. Lisäksi olemme havainneet, että metformiini lievittää tuumorin tulehdusta vähentämällä ekspression tulehduksellisten sytokiinien, mukaan lukien IL-1 sekä tunkeutumisen ja M2 polarisaatio kasvaimeen liittyviä makrofagit (TAM)

in vitro

ja

in vivo

. Nämä vaikutukset makrofageihin

in vitro

näyttävät liittyvän modulaatio AMPK /STAT3-reitin metformiinia. Lopulta löysimme meidän kokeellisissa malleissa että lievittämiseen desmoplasia metformiinin liittyi vähenemiseen ECM remodeling, epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja lopulta systeeminen etäpesäke.

Johtopäätös

Metformiini lievittää fibro tulehdusta microenvironment lihavilla /diabeettisen yksilöiden haimasyöpä kohdentamalla PSCs ja TAM, mikä korreloi alentunut sairauden etenemiseen. Metformiini tulisi testata /tutkia osana hoitoa strategian ylipainoisten diabeetikko PDAC potilailla.

Citation: Incio J, Suboj P, Chin SM, Vardam-Kaur T, Liu H, Hato T, et al. (2015) metformiini alentaa Desmoplasia in Haimasyöpä mukaan uudelleenohjelmointi tähtisolut ja kasvaimeen liittyvät makrofagit. PLoS ONE 10 (12): e0141392. doi: 10,1371 /journal.pone.0141392

Editor: Keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 04 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 06 lokakuu 2015; Julkaistu: 7. joulukuuta 2015

Copyright: © 2015 Incio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Kaikki datatiedostot ovat saatavilla HARVARD DATAVERSE tietokantaan (hakunumero (t) https://dx.doi.org/10.7910/DVN/LLN5FL).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health (http: //nih.gov/; R35-CA197743, CA80124, CA85140, CA96915, CA115767, ja CA126642 että RKJ ja DF), Lustgarten Foundation (https://www.lustgarten.org/; tutkimus apurahan RKJ) ja säätiön tieteen ja teknologian (https://www.fct.pt/, Portugali, POPH /FSE rahoitusohjelmaan, toveruuden ja tutkimus avustuksen JI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: tekijät Tämän käsikirjoituksen lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat kilpailevia intressejä: RKJ sai konsulttipalkkiot päässä Ophthotech, SPARC, ja SynDevRx. RKJ omistaa tasapuolisuus Enlight, Ophthotech, SynDevRx ja XTuit ja palvelee hallituksen XTuit ja hallitusten valtuutetut Tekla Healthcare Investors, Tekla Life Sciences Sijoittajat, ja Tekla Healthcare Opportunities Fund. Ei reagenssit tai rahoitus näiltä yhtiöiltä käytettiin näissä tutkimuksissa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Ennuste potilaille, joilla on haimasyöpä on synkkä, joiden kokonaispituus viiden vuoden korko selviytymisen 7% [1]. Lihavuus ja tyypin 2 diabetes (DM2) on tullut pandemian maailmanlaajuinen [2, 3]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä aineenvaihdunnan häiriöt liittyvät lisääntyneestä, etenemistä ja huono ennuste PDAC [4-9]. Diagnoosin noin puolet PDAC potilaat ovat ylipainoisia tai lihavia, ja jopa 80%: lla potilaista esiintyy diabetesta tai glukoosi-intoleranssi [10-17]. DM2 ja liikalihavuus voi edistää PDAC kautta pro-tuumorigeenisiä insuliinin ja insuliinin kaltaisen kasvutekijä-1 (IGF-1) [18-20], sekä krooninen tulehdus [21, 22]. Näin ollen farmakologinen toimenpiteitä, jotka kohdistuvat diabetes /lihavuus voi myös tuottaa anti-kasvain vaikutuksia. Yksi tällainen aine, parhaillaan intensiivistä tutkimuksen on metformiini, yleisimmin määrätty diabeteksen geneeristen lääke, joka on myös usein annetaan diabeettisen PDAC potilaille [23]. Metformiini on osoitettu parantavan hoitotuloksia prekliinisissä malleissa PDAC [24-30]. Lisäksi se vähentää esiintyvyys haimasyövän diabeetikoilla sekä eloonjäämistä (vähensi kuoleman riskiä 32%) uusien diagnosoitujen tapausten [31-33]. Kuitenkin vaikutusmekanismit metformiinin haimasyövän ei ymmärretä hyvin.

In vitro

tutkimuksissa ovat käsitelleet vaikutusta metformiinin transkriptiotekijöiden, MikroRNA, DNA-vaurioita, syöpä kantasolut ja aineenvaihdunta [34-38]. Lisäksi metformiinin on osoitettu moduloivan toimintaa maksan tähtisolut, vähentää oksidatiivista stressiä syöpään liittyvän fibroblasteja, ja vähentää kasvaimen tulehduksen [34, 35, 39, 40]. Me ja muut ovat osoittaneet, että uudelleenohjelmointi PSCs vähentää soluväliaineen (ECM) komponentteja kuten kollageeni-I ja hyaluronaani (HA), ja hidastaa niiden etenemistä haimasyövän [41-45]. Kuitenkin vaikutus metformiinin PSC aktivointia, tuotanto ECM komponenttien ja kasvain desmoplasia ole koskaan kuvattu.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää toimintamekanismien metformiinin sisällä PDAC fibro tulehdusta kasvain microenvironment.

In vivo

tutkimuksissa haimasyövistä mennessä on pääasiassa suoritettu ksenograftimalleissa normaalipainoisilla /ei-diabeetikoilla hiirillä, joissa metformiini on osoitettu olevan vähemmän tehokkaita [26, 46-48]. Siksi käytimme kaksi immunokompetenteille syngeneeisissä hiiri malleja, jotka läheisesti matkivat lihavuus /DM2, paremmin edustamaan haimasyövän potilaille-enemmistön haimasyövän potilailla esiintyy joko uusia puhkeaminen DM2 tai heikentynyt glukoosinsieto aikaan diagnoosi [10-17] – ja kohderyhmä metformiinin. Lisäksi me täydentää meidän hiiri malleja, joissa

in vitro

tutkimukset sekä analyysi ihmisen näytteitä haimasyövän normaalista paino ja ylipainon /lihavilla potilailla. Huomasimme, että metformiini suoraan ohjelmoi PSCs ja TAM ja lievittää fibroosia ja tulehduksen lihavilla /diabeetikon malleja PDAC. Nämä vaikutukset metformiinin korreloi vähentynyt ECM remontin ja epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), lopulta vaikuttavat etäpesäke. Olemme vahvistaneet, että ECM tasot ihmisen PDAC näytettä ylipainoisilla ja lihavilla potilailla olivat todellakin pienempi potilasryhmässä hoidettiin metformiinilla.

Materiaalit ja menetelmät

Eläinkokeet

Institutional animal Care ja käyttö komitea Massachusetts General Hospital hyväksyi kaikki koe-eläinten käyttöä tässä tutkimuksessa. Kaikki eläin menettelyissä Public Health Service Policy kivutonta hoito Laboratory Animals ohjeita. Villityypin (WT) C57BL /6 ja FVB koirashiirien alun perin saatiin The Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) ja kasvatetaan ja ylläpidetään meidän määritellään-kasvien eläin laitokseen. Hiiriä pidettiin 12 tunnin valo-pimeä-sykli on lämpötilasäädellyt este laitos, jossa

mielinmäärin

pääsy ruokaan ja happamaksi vettä. Tuottaa liikalihavia /diabeettisen hiiren malleissa hiirissä (6-viikon ikäisiä) annettiin 60% rasvaa ruokavalioon (D12492, Research ruokavalion, New Brunswick, NJ) ja 10 viikkoa kuten aikaisemmin on kuvattu [49-51] (aika kasvaimen istutuksen) ja jatkoi ajaksi kasvaimen tutkimuksissa. Kasvaimen kokeissa PAN02 ja AK4.4 syngeenistä PDAC malleja käytettiin C57BL /6 ja FVB immunokompetentteja hiiriä, vastaavasti. PAN02 solut (

Smad4-m174

) [52], saatiin ATCC: ltä. AK4.4 solut (

KrasG12D

ja

p53

+/-

) ystävällisesti tri Nabeel Bardeesy klo MGH. Nämä solut eristettiin hiiristä tuottaa spontaaneja haiman kasvaimet (

Ptf1-Cre /LSL-Kras

G12D

/p53

Lox /+

) [53]. Orthotopic haiman kasvaimet muodostettiin istuttamalla pieni pala (1 mm

3) elinkykyisen tuumorikudoksen (lähteestä kasvaimen erillisessä luovuttaja eläin) haimaan miesten vähärasvaista tai lihavia FVB (AK4.4 malli) tai C57BL /6 (PAN02 malli) hiiri. Molemmat kasvain käytettyjen mallien oli todistaa oikeaksi IDEXX Laboratories. (PAN02: IDEXX Radil Case # 22366-2013. AK4.4: IDEXX Radil Case # 27818-2014).

Haiman kasvaimen kasvua tutkimukset

7 päivää implantaation hiirillä potilaalle tehdä PAN02 tai AK4.4 haimatuumorien satunnaistettiin ohjaus tai metformiinin yhdistelmää saaneessa ryhmässä. Päivänä 21, plasma- ja kasvain kerättiin, ja kasvaimet punnittiin ja käsitelty tarkempaa analysointia.

Metformiini hoito

Standardi metformiiniannos hoitoon ihmisillä on 1000-2500 mg, tavallisesti annetaan kahdesti vuorokaudessa. Esillä olevassa tutkimuksessa, metformiinin annettiin 300 mg /kg juomavedessä. Tämä voidaan kääntää ihmisen ekvivalenttiannos käyttämällä Reagan-Shaw menetelmä [54]. Kaavan mukaan ihmisen ekvivalenttiannos [(mg /kg) = eläimen annos (mg /kg) x eläimen (km) /ihmisen (km). Km 60 kg ihmisen aikuiset yhtä kuin 37 ja 20 g hiiri on yhtä kuin 3], ihmisen vastaa hiiren annoksella 300 mg /kg on 1459 mg Keskikokoisen 60 kg aikuisen ihmisen. Sen vuoksi, että valittu annos esillä olevassa tutkimuksessa on turvallisella terapeuttisella alueella tallennettu ihmisillä. Lisäksi esillä oleva tutkimus määritti terapeuttinen aikana on 2 viikkoa arvioida antituumorivaikutuksen metformiinin. Tämä oli sopusoinnussa terapeuttinen kausien raportoitu aiemmissa tutkimuksissa [55, 56]. Tuore metformiini annettiin juomavedessä 3 päivän välein. Summa lisätään jokaisen eläimen häkin laskettiin keskimääräinen päivittäinen veden saanti että häkki aikana 2 viikkoa ennen hoidon aloittamista, ja säätää kolmen päivän välein perustuu vedenkulutusta ja ruumiin eläinten painon. Likimääräinen plasmassa metformiinin potilailla, joilla on tyypin 2 diabetes ottaen tämä lääke on 0,05 mM, vaikka se voi kerääntyä kudoksiin ja saavuttaa suurempia pitoisuuksia paikallisesti [35]. Sillä

in vitro

kokeissa pitoisuusalueella 0,05-25 mM riippuen solulinjasta käytetään (katso alla lisätietoja).

metformiinin vaikutusten PSCs ja makrofagit

in vitro

Standard MTT määritykset suoritettiin PSCs ja makrofagit hoidettiin metformiini erilaisia ​​0.05-25mM, tutkia mahdollisia vaikutuksia solujen elinkykyä. RAW 264,7 (hiiren leukemiasoluja monosyytti-makrofageja) saatiin ATCC ja käytetään arvioimaan metformiinin vaikutusten makrofagien

in vitro

. Solut ympättiin 10 cm

2 petrimaljoja seerumin /seerumittomassa alustassa ja joita hoidettiin metformiinilla 48 h pitoisuuksina alueella 0,05 0,4 mM (pitoisuudet, jotka eivät oleellisesti vaikuta solujen elinkelpoisuus). Hoidon, solut kerättiin RNA: n ja proteiinin uuttamalla voidakseen suorittaa myöhempää analyysia geeniekspression sytokiinien ja polarisaatio markkereita, ja analysointiin signaloinnin ja aineenvaihdunnan reittejä. Ihmisen PSCs ympättiin 10 cm

2 petrimaljoja mediassa 2,5% seerumia ja joita hoidettiin metformiinilla 48 h pitoisuuksina alueella 0,1 10 mM. Solut kerättiin proteiinin uuttamista varten analyysi aktivaation fibroosin liittyviä reittejä. Lisäksi PSCs ympättiin 8 Kaivokammio slide (20000 solua /kuoppa), joita hoidettiin metformiinilla (1 mM keskittymä, joka ei vaikuta solujen elävyyden) 48 tuntia, ja immunofluoresenssivärjäyksellä suoritettiin seuraavan standardin protokollia. Soluja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja blokattiin 5% tavallista aasi seerumissa 1 tunti. Ne inkuboitiin ensisijaiseen vasta-aineita yli yön 4 ° C: ssa sen jälkeen 2 tuntia sopivan sekundaarisen vasta-aineita huoneenlämpötilassa. PBS: ää kaikissa pesuissa käytettiin, ja värjättiin näytteet asennettu Prolong Gold DAPI. Kuvat otettiin käyttäen -konfokaalimikroskoopilla. Käytetyt vasta-aineet ja kuvanseurantajärjestelmä asetukset on kuvattu alla. Molemmat solutyypit kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (Sigma, St. Louis, MO), jota oli täydennetty 5% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, Sigma), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, kuten 5% CO

2.

Human näytteet

Human näytteitä haimasyövän saatiin MGH kudoksesta tietokannalle (http: //www.massgeneral.org/research/resourcelab.aspx?id=31) alle aktiivinen IRB-protokollaa (Partners Healthcare IRB hyväksynnän numero: 2013P001969). Kirjallinen suostumus luovuttajalta tai lähiomaisen saatiin käyttöön näiden näytteiden tutkimustarkoituksiin. Kasvaimet valitaan ei ole saanut aikaisemmin kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen kirurgista näyte kerättiin aikaan tuumorin resektion. Yhteensä 28 näytettä valittiin satunnaisesti tämän osajoukon näytteitä. Painoindeksi saatiin kunkin näytteen. 7 näytteistä (25%) vastaavat potilaista, jotka lääkkeitä metformiinin kanssa aikaan resektio. Parafiinileikkeet värjättiin kollageeni-I: n ja HA: kuten alla on kuvattu. Kuvat otettiin käyttäen konfokaalimikroskopia ja määrällisesti Matlab. Tiedot analysoitiin anonyymisti.

Gene Expression

Heti poiston, kasvain kudos oli snap-jäädytetään ja säilytetään nestemäisessä typessä. Kokonais-RNA uutettiin ja suhteellisen geeni-ilmentymisen makrofagien M1 /​​M2 markkereita määritettiin käyttäen SYBR-vihreällä perustuva protokollaa. Lisäksi, uutettiin kokonais-RNA, ja suhteellinen geenin ilmentyminen määritettiin käyttäen RT2 Profiler PCR Arrays-järjestelmä (Qiagen) on Stratagene Mx3000P QPCR System käyttäen valmiiksi tehty reittiin keskittynyt paneelit ( ”fibroosi” -Cat. Numero: PAMM011Z; ”Epithelial ja mesenkymaalitransitioon (EMT) ”- Cat. Number: PAMM090Z;” TGF-ß signalointi tavoitteet ”-PAMM235Z;” soluväliaineen Adheesiomolekyylit ”-Cat. numero: PAMM013Z, ja” Common sytokiinien ”-Cat. Number: PAMM021Z ).

Protein Expression

Western blot-analyysi.

Jokainen kasvain näyte homogenisoitiin suoraan hajotuspuskuria proteiiniuutto. 20 ug denaturoitua proteiinia per näyte ladattiin 7%, 10%, ja 12% SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Vasta-aineita käytettiin: fosfo-p38 MAPKT

180 /Y182 ja p38; fosfo-JNK (SAPK /JNK)

Thr183 /Tyr185 ja JNK; fosfo-AKT

Ser473 ja AKT, fosfo-ERK (p44 /42 MAPK)

T202 /Y204 ja ERK; fosfo-NF-KB

Ser536 ja NK-KB; p65

Ser536; fosfo-Smad2

Ser465 /467 ja Smad2; fosfo-IGF-I-reseptorin ß

Tyr1135 ja IGF; Fosfo-IRS-1

Ser612 ja IRS; IR; phpspho-STAT3

Tyr705 ja STAT3; Fosfo-AMPKα

Thr172 ja Ampkα; fosfo-Ampkβ

Ser108 ja AMPK; fosfo-ACC

Ser79 ja ACC; Fosfo-PDGF-reseptorin ß

Tyr751 ja PDGF-reseptorin ß ja etana, e-kadheriinin ja vimentiinista, TGF-ß, ß-kateniinin, kierre, LC3B. Kaikki vasta-aineet on lueteltu edellä saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA), ja laimennettiin 1: 1000, lukuun ottamatta fosfo-JNK (SAPK /JNK)

Thr183 /Tyr185, Phospho-NF-KB: n p65

Ser536 fosfo-Smad2

Ser465 /467, fosfori-IGF-I-reseptorin ß

Tyr1135, halkaistut kaspaasi-3, Phospho-IRS-1

Ser612. Muita vasta-aineita käytettiin: αSMA ja fosfo-insuliini-reseptorin

Y972 (1: 1000 ja 1: 500, Abcam, MA); col-1 (1: 1000); MMP-9 ja MMP-2 (1: 500 ja 1: 200, EMD Millipore-Billerica, MA), AT1 (1: 1000, Lifespan BioSciences Inc, WA), ZEB1 (1: 1000, Novus Biologicals, CO), ja ß-aktiini (1: 5000, Sigma, MO). Kvantifiointi proteiinin ilmentymisen suhteen yhteensä reseptoria tai ß-aktiini saatiin käyttäen Image J ohjelmisto.

Multiplex array.

Kunkin kasvaimen näyte homogenisoitiin suoraan hajotuspuskuria proteiinin uuttamalla. 2 ug /ul näytettä käytettiin. Multipleksisiirtomenetelmä tulehduksellinen useita sytokiinien proteiinijärjestelmäksi käytettiin (V-PLEX Esitulehduksellisten Panel1 hiiren Kit, Cat. Numero: K15048D) ELISA-analyysi.

Immunofluoresenssikoe /immunohistokemia

analyysi Jääleikkeiden hiiren kasvain kudosten kasvaimet irrotettiin ja jäädytettiin optimaalinen leikkaamiseen lämpötila yhdistettä (Tissue-Tek). Poikittainen tuumorisektioiden, 10 pm paksu, immunovärjättiin erityisiä vasta-aineita. Saadakseen mosaiikki kuvia tuumorisektioiden, Olympus FV1000 konfokaali laser-skannaus mikroskooppia käytettiin. 10x ilma tavoite hankittu 1260-um neliö laatat, ja automaattisen vaiheessa skannataan koko poikkileikkaus kasvainkudoksen. Kuvioitua laatat oli ommeltu lopulliseen mosaiikki kuvaa käyttäen Olympus-ohjelmassa. Antigeeniekspressiota kvantifioitiin mittaamalla pinta-ala tahra kiinnostava normalisoitunut alalla DAPI-värjättyä ytimet (eli dimensioton), ja analysoitiin käyttäen mukautetun algoritmia MATLAB (MathWorks). Identtiset asetukset ja kynnykset analyysiä käytettiin kaikille kasvaimia. Vasta-aineet, joita käytetään immunofluoresenssilla olivat seuraavat: Kollageeni-I [LF-68-vasta-ainetta, 1:50 laimennos, toimitti Dr. Larry Fisher (NIDCR)]; Hyaluronaani (biotinyloitu hyaluronaani proteoglykaanin fragmentti, 385911, Calbiochem, laimennos 1: 200); αSMA (C6198-vasta-aine, Sigma, 1: 500 laimennus); ja F4 /80 (MCA497A488 vasta-aine, ABDserotec, 1: 200 laimennos). Cy3-, Cy5 tai FITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita käytettiin havaitsemiseen signaalien konfokaalimikroskopialla. Objektilasit vastavärjättiin DAPI varten tumavärjäystä.

MMP aktiivisuusanalyysiä

Jokainen kasvain näyte homogenisoitiin suoraan hajotuspuskuria proteiiniuutto. Standardi kaupallinen määritys (Abcam ab112146) käytettiin havaitsemaan yleistä aktiivisuutta MMP kasvain näytteissä. Kasvaimen lysaatit inkuboitiin fluoresoivalla substraatilla [fluoresenssiresonanssienergiansiirto (FRET) peptidi] 1, 2 ja 16 tuntia, ja fluoresenssi mitattiin käyttäen fluoresoivaa mikrolevylukijaa.

virtaussytometria

tuumoreita kantavaa hiirtä perfusoitiin kautta sydämensisäisen injektion PBS: ää ja uhrataan. Haiman kasvainten kudokset otettiin talteen, jauhettu, ja pilkottiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan DMEM: llä, joka sisälsi kollagenaasia tyyppiä 1A (1,5 mg /ml), hyaluronidaasia (1,5 mg /ml), ja DNaasia (2 ug /ml). Hajotusseokset suodatettiin 70 um: solun-. Yksisoluiset suspensiot inkuboitiin rotan anti-hiiri-CD16 /CD32-mAb estää ja värjättiin fluorokromilla-konjugoiduilla vasta-aineilla kylmässä puskurissa (1% BSA, 0,1% NaN3 PBS: ssä). 7-amino-aktinomysiini D (7AAD) reagenssi (eBioscience) lisättiin värjätään putkia kohti valmistajan ohjeiden välittömästi ennen käynnissä analyysin. Virtaussytometria tietoja hankitut LSRII virtaussytometrillä (Becton Dickinson) ja analysoitiin FACSDiva ohjelmisto. FSC-A vs. FSC-W ja SSC-A vs. SSC-W levitettiin erottelemaan kaksinkertainen /yhdistettyjä tapahtumia. Seuraavat monoklonaalinen anti-hiiri-vasta-aineita käytettiin: CD45-PE, CD45-PE-Cy7, CD45-FITC, CD11-APC-Cy7, CD11-APC, F4 /80-APC (BD Biosciences) ja F4 /80-FITC ja F4 /80-PE (eBioscience).

Macrophage eristäminen

leikkaamisen jälkeen kasvainkudos paloiksi halkaisija 0,5 mm, kasvaimet hajotettiin kollagenaasin ja hyaluronidaasin yhden tunnin ajan. Dissosioitunut kasvaimia pestiin lajittelu puskurilla (0,5% BSA: ta PBS: ssä) ja viedään solun-, ennen kuin ne blokattiin käyttäen Fcr ja sen jälkeen inkuboitiin F4 /80 biotinyloitu primääristä vasta-ainetta (eBiosciences) 15 minuutin ajan. Anti-biotiinikonjugoitujen magneettiset helmet (Miltenyl Biotech) lisättiin solususpensioon ja inkuboitiin 15 minuuttia, ennen kuin solut altistetaan magneettisen sarakkeet (MACS LS-sarakkeet Miltenyl Biotech) solujen erottamiseen.

Tilastollinen analyysi

väliset tilastolliset erot ryhmien arvioitiin kaksisuuntaista Studentin t-testi. Kaksisuuntainen varianssianalyysi käytettiin verrattaessa ruumiinpainon ajan välillä valvonta- ja metformiini-käsiteltyjen ryhmien. Ilmaantuvuus etäpesäke ja seinän invaasio analysoitiin chi-neliö. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Prism Graphpad ohjelmistoa. Kaikki tulokset katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun P-arvo oli alle 0,05 laskettuna sopivalla tilastollinen testi. Tulokset esitetään keskiarvona ± keskivirhe.

tulokset

Metformiini vähentää desmoplasia hiiren ja ihmisen PDACs

Olemme osoittaneet, että vähentäminen desmoplasia alentavien ECM komponentteja, kuten HA ja kollageeni-I-in PDACs voimistaa anti-kasvain hoitoja [41-43]. Siksi tutkimme suhdetta metformiinin hoitoa ja desmoplasia in PDACs in kemoterapia /sädehoidon naiivi PDAC kirurginen näytteitä. Huomasimme, että ylipainoisilla tai lihavilla potilailla alla metformiinin, tasot HA oli 30% pienempi kuin potilailla, jotka eivät metformiinia (kuvio 1 i ja 1ii). Mielenkiintoista on, eroa HA tasojen havaittiin metformiinin hoidetuilla potilailla normaalipainoisilla. Toisaalta, metformiinin ei vaikuttanut olevan vaikutusta kollageeni-I ilmentymisen joko kehon painon ryhmä (S1 Kuva).

(i) edustaja histologia kuvat osoittavat vaikutuksen metformiinin kasvaimen hyaluronaani tasoilla normaali paino [painoindeksi (BMI) 25)] tai ylipainon /lihavien potilaiden (BMI 25) (n = 22 säädöillä, 7 metformiini). (Ii) immunohistokemiallinen analyysi koko kasvaimen hyaluronaani tasoilla. Metformiini vähentää hyaluronaania-positiivinen alue jae (%) ylipainoisilla /lihavilla potilailla. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe. * P 0,05 vs. kontrolli potilailla, joilla BMI 25.

arvioimiseksi, jos voisimme saada toistaa nämä havainnot prekliinisissä malleissa, käytimme FVB ja C57BL /6-hiirten ruokittu runsaasti rasvaa ruokavalioon . Me, yhdessä muiden kanssa ovat osoittaneet, että runsasrasvainen ruokavalio indusoi lihavuutta ja aineenvaihdunnan häiriöt tyypillisiä DM2, kohonnut glukoosi, insuliini ja IGF-1 [50, 57-60] näissä kannoissa. 10 viikon jälkeen on rasvainen ruokavalio, AK4.4 ja PAN02 kasvaimia ortotooppisesti istutettiin ylipainoisilla FVB ja C57BL /6, vastaavasti. Eläimiä satunnaisesti metformiinin juomavedessä (300 mg /kg) tai ilman hoitoa päivänä 7 päivään 21, jolloin plasman ja kasvaimet kerättiin. Metformiinin kanssa korreloi alentunut ilmentyminen HA 64% (kuvio 2ai ja 2Aii) sekä kollageeni-I 35% (kuvio 2ai ja 2Aiii) in AK4.4. kasvaimia. Lisäksi prosenttiosuus aktivoitua PSCs (määritettynä ilmentymistä alfa-sileän lihaksen antigeeni, αSMA), joka co-express HA ja kollageeni-I laski 58 ja 38%, vastaavasti (kuvio 2Bi-2Biii). Toisessa, vähemmän desmoplastic malli (PAN02), metformiinin väheni ilmaus HA 40% ja kollageeni-I 22%, vaikka se ei ollut tilastollisesti merkitsevä (S2i-S2iii Kuva). Kuitenkin metformiini vähensi tiheys kollageeni-I positiivisia aktivoitu PSCs kasvaimissa 54% tässä mallissa (S2V kuvio). Tiheys HA positiivinen aktivoitu PSCs in PAN02 kasvaimissa pienensi myös 57% (S2iv kuvio), mutta ei saavuttanut merkitystä. Olemme osoittaneet aiemmin, että angiotensiini II -reseptorin 1 (AT1) on kriittinen HA ja kollageeni-I tuotanto PDACs [43]. Todellakin, havaitsimme, että metformiini pystyi vähentämään ilmentymistä AT1 (kuvio 2C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että metformiini alentaa desmoplasia in PDACs ylipainoisilla /lihavia hosts.

Kun 10 viikon rasvainen ruokavalio, AK4.4 kasvaimet ortotooppisesti istutettiin lihavilla FVB hiirillä. Eläimet jaettiin satunnaisesti metformiinin juomavedessä (300 mg /kg) tai ilman hoitoa päivänä 7 päivään 21, jolloin kasvaimet kerättiin. (A-i) edustaja immunohistokemia kuvat osoittavat vaikutuksen metformiinin kasvaimen Hyaluronaani ja kollageeni-I tasoja AK4.4 kasvain (n = 3-4). (A-ii) kvantifiointi Hyaluronaani ilmaisun AK4.4 kasvaimia. Metformiini vähentää hyaluronaania-positiivinen alue jae (%). (A-iii) kvantifiointi kollageeni-I ilmaisun AK4.4 kasvaimia. Metformiini vähentää kollageeni-I-positiivinen alue fraktio (%). (Bi) edustaja immunohistokemia kuvat osoittavat vaikutuksen metformiinin ilmentymiseen (co-localization) hyaluronaanin ja kollageeni-I tasoja aktivoitu (αSMA-positiivinen) haiman tähtisolut (PSCs) in AK4.4 kasvain (n = 3-4) . (B-ii) kvantifiointi Hyaluronaani ilmaisun PSCs. Metformiini vähentää prosenttiosuus aktivoitua PSCs ilmentävien Hyaluronaani. (B-iii) kvantifiointi kollageeni-I ilmaisun PSCs. Metformiini vähentää prosenttiosuus aktivoitu PSCs ilmentävien kollageeni-I. (C-i) edustaja Western blotit angiotensiini II -reseptorin-1 (AT1) ilmentyminen AK4.4 kasvaimia. ß-aktiini käytetään kontrollina proteiinimäärän. (C-ii) densitometrinen analyysi AT1 ilmaisun normalisoida ß-aktiini. Metformiini vähentää ilmaus AT1. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe. * P 0,05 vs. kontrolli.

Metformiini vaikuttaa desmoplasia suoraan vähentämällä TGF-β signalointi ja kollageenin tuotantoa-I /HA PSCs

Kollageeni-I ja HA olennaisesti tuottavat aktivoidut PSCs in PDACs [43, 61]. Sen määrittämiseksi, metformiini hoito voi suoraan vähentää kollageeni-I /HA ilmaisun PSCs, inkuboimme PSCs

in vitro

metformiinin kanssa. Huomasimme, että annoksella (1 mM), joka ei olennaisesti vaikuta elinkelpoisuutta PSCs (S3 kuvassa), metformiinin väheni ilmaus HA ja kollageeni-I (kuvio 3AI-3Aiii). Tämä osoittaa metformiini vaikuttaa PSCs vähentää tuotantoa näiden kriittisten ECM komponentteja. Lisäksi olemme havainneet, että metformiini (0.1-1mM) vähensi ilmentymä AT1, TGF-β ja alavirran signalointia kautta Smad-2, sekä PDGF-β, kaikki avaintoimijat ECM tuotantoon PSCs (kuvio 3B). Lisäksi metformiinin vaikutti myös aktivointi kanoninen signalointireittien, jotka edistävät PSC aktivointi ja fibroosi [62], erityisesti ERK, p38, ja STAT3, vaikka suhteellisen suuremmilla annoksilla (1-10 mM) (kuvio 3B). Tärkeää on, kokonaan kasvaimia, metformiini laskivat aktivointi STST3 molemmissa malleissa, joissa suuntaus lyhennetyllä p38 aktivaation PAN02 (S4i-S4iii kuvassa), mikä viittaa siihen, että metformiini voi kerääntyä pitoisuuksina tarpeeksi korkea vaikuttavan näihin signalointipolkujen

in vivo

. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että metformiini vaikuttaa desmoplasia suoraan vähentämällä AT1 /TGF-β /STAT3 signalointi ja kollageenin tuotantoa-I /HA PSCs.

(A) PSCs inkuboitiin

in vitro

metformiinin (1 mmol) 48 h. (A-i) edustaja immunosolukemialliset kuvat osoittavat vaikutuksen metformiinin kasvaimen Hyaluronaani ja kollageeni-I-tasot ihmisen haiman tähtisolut (PSCs)

in vitro

(n = 2). (A-ii) kvantifiointi Hyaluronaani ilmaisun PSCs. Metformiini vähentää ilmentymistä Hyaluronaani in PSCs. (A-iii) kvantifiointi ilmentymisen kollageeni-I PSCs. Metformiini vähentää ilmentymistä kollageeni-I PSCs. αSMA tarkoittaa aktivoitu PSCs. (B) edustaja Western blotit ilmentämiseen fibroosin liittyviä markkereita ja merkinanto proteiinien PSC käsitellään metformiinia 0, 0,1, 1 ja 10 mM. Metformiini vähentää ilmentymistä fibroosin liittyviä markkereita ja signalointi proteiineja PSCs. Densitometrinen analyysi proteiinin ilmentymisen normalisoida ß-aktiini tai proteiinin kokonaismäärän (jos fosforyloidun proteiinit) on kuvattu numeroita edustaja bändejä. Data A esitetään keskiarvona ± keskivirhe. * P 0,05 vs. kontrolli.

Metformin parantaa myös desmoplasia ehkäisemällä rekrytointi ja M2 polarisaatio makrofagien PDACs

tulehdus, joka esiintyy PDACs on tärkeä osa desmoplasia [63]. Erityisesti kasvaimeen liittyviä makrofagit (TAM) ovat merkittävä lähde sytokiinien, jotka pahentavat desmoplasia in PDACs [64], ja vaikuttaa negatiivisesti sairauden lopputulokseen [65]. Niinpä määritettiin tässä metformiinin vaikutusten TAM tunkeutuminen kasvaimia. Olemme havainneet, että TAM tasot olivat 60% pienemmät metformiinin kanssa kohtelun AK4.4 mallissa (kuvio 4A). He myös taipumus olla pienempi (~ 30%, ei merkitsevä) on PAN02 malli (S5a kuvio). Määrittämään suoran metformiinin vaikutusten makrofagien inkuboimme makrofagit metformiinin

in vitro

48 h kasvavilla pitoisuuksilla. Huomasimme, että metformiini vaikuttaa elinkelpoisuuden makrofagien annoksilla 0,4 mM tai suurempi (S6 kuvio). Metformiini pitoisuutena 0,05 mM (samanlainen kuin mitattu pitoisuus potilaiden plasmassa metformiinia) vähennetään M2 markkereita, kuten Arg-1: n ja IL-10, kun taas metformiini suurempia annoksia kuin 0,2 mM pelkistettyä sekä M1 ja M2 markkereita (kuvio 4B ). Virtauksen-lajiteltu TAMeja päässä PAN02 kasvaimista

in vivo

, me todellakin vahvisti metformiinin vaikutusten ilmentymistä M2 markers Arg-1 (~ 1/2) ja IL-10 (~ 2/3) ilman jotka vaikuttavat merkittävästi ilmaus M1 merkkiaineiden (kuvio 4C). Sitten pyrittiin ymmärtää, miten metformiini vaikuttaa näihin soluihin. Useita kanoninen ja ei-kanoninen signalointireittien voidaan aktivoida PDACs tulehduksen aikana ja edistää ilmentymistä M2 merkkiaineiden TAMeja [66-69]. Yhdenmukainen vaikutuksia TAM, metformiinin vähensi aktivointi STAT3, JNK, AKT: n ja p38 makrofageissa

in vitro

pitoisuuksina pienempi kuin 0,2 mM (kuvio 4D). Kuten edellä mainittiin, kokonaan kasvaimia metformiinin vähentynyt aktivoituminen STST3 molemmissa malleissa, joissa suuntaus alennettua aktivointia p38 in PAN02, linjassa

in vitro

tuloksiin (S4i-S4iii Kuva). On osoitettu, että STAT3 aktiivisuus on vähentynyt metformiinin aktivaation kautta metabolisen energian anturi AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) useita solutyyppejä [70]. Todellakin, huomasimme, että estäviä vaikutuksia metformiinin STST3 signalointi makrofageissa

in vitro

liittyy aktivaatio AMPKα ja loppupään entsyymi asetyyli-CoA Carboxylase (ACC) (jälkimmäinen esiin vain seerumia media) näissä soluissa (kuvio 4D ja S7 kuvassa). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että metformiini alentaa TAM tunkeutuminen sekä ilmentymä M2 markkereita, jotka voivat välittyä ainakin osittain kautta AMPK /STST3 signalointi esto makrofageissa. Lisäksi, tulehdusta kasvaimissa on tunnusomaista ylimäärä inflammatoristen sytokiinien, jotka edistävät desmoplasia, ja metformiini on osoitettu vaikuttavan useita tulehduksen välittäjäaineita [34, 35]. 0,05, ** p * P * P * P * P * P * P 0,05, ** p * P