Krooninen sairaus

tiivistelmä

HER2 yli-ilmennetään 15-20% rintasyövistä. Yli-ilmentävät HER2 tiedetään vähentävän apoptoosin, mutta taustalla olevien mekanismien tämän yhdistyksen jää epäselväksi. Valottaa mekanismeja HER2-välitteisen selviytymisen, tutkimme suhdetta HER2 ja p53 voimistunut modulaattori apoptoosin (PUMA), joka on voimakas apoptoosin indusoija. Tuloksemme osoittivat, että HER2 vuorovaikutuksessa PUMA, joka on itsenäinen suhteessa HER2 aktivointia. Lisäksi havaitsimme, että HER2 vuorovaikutuksessa PUMA sekä mitokondrioiden ja ei-mitokondrioiden osastoja. Me seuraavaksi tutkittava, onko HER2 fosforyloi PUMA. Erityisesti, PUMA tyrosiinifosforylaatio ei ole koskaan raportoitu. Käyttämällä solunsisäisen määritystä, löydettiin PUMA olevan fosforyloitu rintasyöpäsoluissa aktivoidulla HER2. Via solutonta HER2 kinaasimäritykselle, havaitsimme, että PUMA oli suoraan fosforyloitiin HER2. Aktivointi HER2 laski PUMA proteiini puoliintumisaika. Mitkä kolmesta tyrosiinien kuluessa PUMA on kohdistettu HER2, me syntyy kolme PUMA ei-fosforylaatio mutanttien kukin yhdellä Tyr → Phe korvaaminen. Tulokset osoittivat, että kukin PUMA yksittäinen mutantti oli menettänyt jonkin verran, mutta ei kaikkia fosforylaation HER2 osoittaa, että HER2 tavoitteet kaikilla kolmella tyrosiineilla. Niinpä loimme lisäksi PUMA mutantti kaikkien kolmen tyrosiineilla mutatoitunut (TM-PUMA), jota ei voida fosforyloida HER2. Tärkeää on, että TM-PUMA havaittiin on pidempi puoliintumisaika kuin PUMA. Käänteinen yhdistys välillä havaittiin HER2 ja PUMA 93 invasiivisen rintasyövän karsinoomanäytteistä. Olemme lisäksi havainneet, että TM-PUMA kasvun estyminen rintasyövän solujen enemmän kuin PUMA. Myös TM-PUMA oli vahvempi taipumus apoptoosin kuin PUMA. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että ensimmäistä kertaa, että puma voi olla tyrosiinifosforyloidulla ja että HER2-välitteisen fosforylaation horjuttaa PUMA proteiinia. HER2-PUMA vuorovaikutus edustaa uutta mekanismia, jonka puma säännellään ja uusi molekyyli perustan HER2-välitteistä kasvua ja selviytymistä syöpäsoluja.

Citation: Carpenter RL, Han W, Paw I, Lo HW ( 2013) HER2 fosforyloi ja horjuttaa proapoptoottisiin PUMA, Johtavat antagonisoivat apoptoosi syöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (11): e78836. doi: 10,1371 /journal.pone.0078836

Editor: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 elokuu 2013; Hyväksytty: 24 syyskuu 2013; Julkaistu 13 marraskuuta 2013

Copyright: © 2013 Carpenter et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health apurahan K01-CA118423, ja W81XWH-11-1-0600 Yhdysvalloista puolustusministeriön, Pediatric aivosyövän Foundation, Beez säätiön ja Intramural Division of Surgical Sciences Dani P. Bolognesi, Ph.D. Award ja Clarence Gardner, Ph.D. Award (H-WL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rintasyöpä alkavan pudota, mutta se on edelleen merkittävä kansanterveydellinen uhka. Tämänhetkisten arvioiden mukaan tulee olemaan 300000 uutta tapausta ja 40000 kuolemantapausta rintasyöpään vuonna 2013 [1]. On arvioitu, että siellä on enemmän uusia rintasyövistä naisilla kuin mikään muu syöpätyyppi vuonna 2013 [1]. HER2 yli-ilmennetään 15-20% ihmisen rintasyövistä ja tämä yli-ilmentyminen liittyy huono hoitotuloksia lukien pieneni eloonjäämiseen, lisääntynyt kasvaimen uusiutuminen, ja aggressiivisempi sairaus [2] – [4]. HER2 aktivointi tapahtuu hetero- muiden erbB-perheen reseptorien, kuten hereguliini sitoutumaan HER3- että sitten heterodimerisoitua HER2 aktivoida alavirtaan HER2 reittejä [5].

HER2 tiedetään vähentävän apoptoosin. Proapoptoottisten ja anti-apoptoottisten Bcl-2-proteiinien ohjaavat luontainen apoptoottisen reitin klo mitokondrioita. Positiiviset korrelaatiot on todettu välillä HER2 ilmaisun ja anti-apoptoottiset proteiinit, kuten Bcl-x L, Mcl-1, ja Bcl-2 [6] – [8]. Lisäksi, pakko ilmentyminen HER2 aiheuttaman lisääntyneen proteiinin tasot anti-apoptoottiset proteiinit, kuten Bcl-2 ja Bcl-x L, kun taas inhibitiota HER2 vähentää Mcl-1 ja lisääntynyt Bax ilmaisun [6], [7], [9]. HER2 voivat myös aktivoida PI3K-AKT ja ERK1 /2 signalointi, joka voi säädellä apoptoosin ohjaamalla geeniekspressiota, kuten säätelyä surviviinin, ja translaation jälkeiset sääntelyä, kuten fosforylaation ja inaktivoitumisen proapoptoottisten Bad [10], [11 ]. HER2 apoptoosin säätelyyn on pääasiassa havaittu välittyvän alavirran signalointia kun taas suora sääntely Bcl-2 proteiinien HER2 ei ole arvioitu.

PUMA

geeni tunnistettiin ensimmäisen kerran vuonna 2001 [ ,,,0],12], [13] myös ruudun transkription tavoitteita p53.

BBC3

geeni tunnistettiin pian sen jälkeen, kun hiivan kahden hybridin seulonta ja cDNA tämän geenin täsmäsi että PUMA [14]. Tämä myöhemmin löytö

BBC3

geeni myös, että PUMA ilmaisua voidaan indusoida apoptoottinen ärsykkeiden riippumaton p53 [14]. PUMA sisältää kaksi toiminnallista domeenin C-päähän, BH3: een domeeni ja mitokondrioiden lokalisaatiosignaaliin (MLS) [15], [16]. Toiminnallinen aktiivisuus PUMA aloitetaan proteiinin kohdistamista ulomman mitokondrion kalvon jossa PUMA vuorovaikutuksessa anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäseniä estämällä niiden tukahduttaminen Bax ja Bak [12], [17]. Inhibitio anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäsenten johtaa aktivoitumiseen pro-apoptoottisten proteiinien Bax /Bak liipaisu mitokondrion ulomman kalvon läpäiseväksi (MOMP) ja vapautumista sytokromi C [12], [16], [17]. Sytoplasmisen sytokromi C lopulta muodostaa apoptosome aktivoitumiseen johtavat efek- caspases 3/9 ja apoptoosin. Menetys PUMA toiminta on liittynyt useita syöpätyyppejä. Poistamalla osa kromosomin 19, jossa

PUMA

geeni sijaitsee, on raportoitu useita syöpätyyppejä [13], [18], [19]. Lisäksi,

PUMA

on p53-geenin, ja p53 on mutaatioita yli 40% syövistä [20]. Niinpä heikentynyt PUMA induktio on havaittu p53-mutaatio tai deleetio [13], [21]. Lisäksi, syöpäsolut PUMA poistetaan on korkea kestävyys p53-indusoituva hoitomuotoja, kuten DNA: ta vaurioittavien aineiden, UV-ja gamma-säteilytyksen mm [19]. Kuitenkin useat tutkimukset ovat raportoineet, että PUMA ilmaisua voidaan indusoida p53-riippumattomien mekanismien [19], [22] – [25].

suora yhteys HER2 ja PUMA ei ole tutkittu. Tunneta onko PUMA läpikäy tyrosiinifosforylaatio. Tässä tutkimuksessa olemme löytäneet uuden toteamisesta PUMA voidaan fosforyloitiin tyrosiiniryhmää suoraan HER2. Lisäksi PUMA fosforylaation HER2 johtaa PUMA epävakautta ja solujen eloonjäämistä. Osoitamme myös, että puma-mutantti, joka ei voi fosforyloida tyrosiini tähteitä (TM-PUMA) on parannettu kyky indusoida apoptoosia. Yhdessä Tutkimuksemme paljastivat uusi HER2 → PUMA signalointi-akselin, joka edustaa uutta mekanismia, jolla PUMA proteiinia ja PUMA-välitteisen solukuoleman säädellään. Meidän havainnot myös todisteita siitä PUMA alas asetuksessa uutena molekyylitason perustan HER2-välitteistä kasvua ja selviytymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja Cell Culture

MDA-MB -453, MCF-7, BT-474, ja SK-BR3 ihmisen rintasyövän solulinjat saatiin American Type Culture Collection, ATCC (Manassas, VA). MDA-MB-453-soluja ylläpidettiin Leibovitz L-15 väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 0% hiilidioksidia. MCF-7-soluja ylläpidettiin MEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 1 mM natriumpyruvaattia, 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja ja 10 ug /ml naudan insuliinia. BT-474-soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. SK-BR3-soluja ylläpidettiin McCoyn 5a väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. MCF-7 /HER2-soluja ylläpidettiin MEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 1 mM natriumpyruvaattia, 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja, 10 ug /ml naudan insuliinia ja 350 ug /ml G418: aa.

kemikaalit ja reagenssit

Kaikki kemikaalit hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO), ellei toisin mainita. Sykloheksimidi hankittiin Amresco (Solon, OH), MG132 hankittiin Calbiochem (San Diego, CA), anisomysiini ostettiin Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY), ja Lapatinibin ostettiin LC Laboratories (Woburn, MA). Tubuliinia, β-aktiini, ja IgG-vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Sigma. HA-vasta ostettiin Roche (Indianapolis, IN), PARP-1-vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), COX IV vasta-aine hankittiin Abcam (Cambridge, MA), ja 4G10-vasta hankittiin Millipore ( Billerica, MA). PUMA, HER2, ja fosfori-HER2 (Y1248) vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technologies (Danvers, MA).

Plasmidit

PHA-PUMA plasmidi toimitti ystävällisesti Dr. Bert Vogelstein kautta Addgene plasmidin 16588 [13]. Sukupolven yhden mutantin Pumas (Y58F-PUMA, Y152F-PUMA, ja Y172F-PUMA) sekä kolmoismutantti (Y58F /Y152F /Y172F-PUMA) tehtiin käyttäen QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara , CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käytetyt alukkeet mutageneesiä varten olivat seuraavat: Y58F-Forward 5′-TGCCCGCTGCCTTTCTCTGCGCCCCCA-3 ’, Y58F-Reverse 5′-TGGGGGCGCAGA GAAAGGCAGCGGGCA-3′, Y152F-Forward 5’-CTCAACGCACAGTTTGAGCGGCGGAGA-3 ’, Y152F-Reverse 5’-TCTCCGCCGCTCAAACTGTGCGTTGAG- 3 ’, Y172F-Forward 5′-TCACCTGGAGGGTCCTGTTCAATCTCATCAT-3′, ja Y172F-Reverse 5’-ATGATGAGATTGAACAGGACCCTCCAGGGTGA-3 ’. Mutaatio varmistettiin sekvensoimalla.

immunosaostus /Western-blottaus (IP /WB) B

Solut lyysattiin RIPA-puskurilla (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP- 40, 0,1% SDS, 1% natriumdeoksikolaatti), johon oli lisätty proteaasi /fosfataasi-inhibiittorit sen jälkeen sonikoimalla ja kokoelma supernatanttia. Koko solu-uutteet esipuhdistettiin 1 ug kaniinin IgG: n ja 20 ui proteiini-A-agaroosia 1 h 4 ° C: ssa. Selvitetty lysaatit inkuboitiin sitten 1 ug HER2 tai PUMA vasta-aine tai kontrolli kanin IgG: tä 4 ° C: ssa yön yli samalla sekoittaen. Proteiini A-agaroosi-Sitten lisättiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 60 minuuttia samalla sekoittaen. Proteiini A-agaroosi-pelletit kerättiin talteen ja pestiin useita kertoja RIPA-puskurissa 4 ° C: ssa. Pestiin pelletit keitettiin ja saatettiin SDS-PAGE ja immunoblottaus, kuten aiemmin on kuvattu [26]. Määrittäminen PUMA tyrosiinifosforylaation määritettiin immunosaostuksella PUMA seurasi immunoblottauksella käyttäen anti-fosfo-tyrosiini 4G10 Platinum vasta-aine (Millipore).

Soluvapaitakin HER2 Kinaasimääritykset

Rekombinantti ihmisen PUMA proteiinia ( Origene, Rockville, MD), defosforyloitiin rekombinantti ihmisen PTP1 B-proteiinia 30 ° C, minkä jälkeen PTP1 B inaktivointi 65 ° C: ssa. Defosforyloitiin PUMA inkuboitiin sitten rekombinantti ihmisen HER2-proteiinia (Promega, Madison, WI) ja ATP: tä 30 ° C: ssa. Sitten näyte keitettiin ja saatettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottauksella käyttäen anti-fosfo-tyrosiini 4G10 Platinum-vasta-aine (Millipore).

immunosaostus-kinaasi-määritys

Solut transfektoitiin HA-merkitty PUMA plasmidit ja solulysaatit kerättiin kuten edellä on kuvattu. Immunopresipitoidun tehtiin HA-vasta-aineen, kuten yllä on kuvattu. Pesujen jälkeen, proteiini A-agaroosi-pellettejä defosforyloitiin rekombinantti ihmisen PTP1 B seurasi inkubointi ihmisen rekombinantti-HER2 kuten edellä on kuvattu. Sitten näytteet keitettiin ja saatettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottauksella käyttäen anti-fosfo-tyrosiini 4G10 Platinum-vasta-aine (Millipore).

Colony Formation määritykset

transfektoinnin jälkeen osoitettujen plasmidien solut ympättiin 6 kuoppaiset elylevyillä määrittää ankkurointi riippuvan klonogeeniset kasvua me aiemmin on kuvattu [27]. Transfektion jälkeen, solut myös ympättiin 6-kuoppaisille levyille agaroosilla määrittää kiinnittymisestä riippumaton klonogeenisten kasvua. Wells esipäällystetty pohjakerros 0,5% agaroosia ja solut ympättiin pintakerroksen 0,35% agaroosia. Jälkeen 2-4 viikkoa, pesäkkeitä kanssa tai ilman agaroosi- värjättiin kristallivioletilla sininen liuos (Sigma) 1 tunnin ajan ja pesäkkeet laskettiin mikroskoopilla. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

arviointi Apoptosis

Solut transfektoitiin osoitettujen plasmidien, käsiteltiin osoitetulla yhdisteitä, ja kerättiin trypsiini /EDTA: lla. Apoptoosi määritettiin sitten käyttämällä FITC-anneksiini V /propidiumjodidia havaitseminen pakki BD Pharmingen (San Jose, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten solut analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen BD FACSCalibur-virtaussytometrillä. PARP-1 lohkaisu määritettiin käyttämällä immuno- solulysaateista seuraavassa mainittu transfektion ja hoitoon.

määritys PUMA mitokondrio-tasot

Mitokondrioiden suoritettiin fraktiointi käyttämällä määritystä kit Pierce /Thermo Scientific (Rockford, IL), mukaisesti valmistajan ohjeiden kuten olemme aiemmin on kuvattu [26]. Lyhyesti, proteiini eristettiin mitokondrion uute (ME) ja ei-mitokondrioiden uute (NME). ME ja NME tehtiin sitten SDS-PAGE ja immunoblottaus. Juovien voimakkuudet mitattiin sitten käyttäen NIH ImageJ ohjelmistoa. Laajuus PUMA mitokondrioiden lokalisointi (mtPUMA Index) laskettiin käyttäen bändi tiheydet seuraavalla kaavalla:% ME on prosenttia koko ME ladattu ja% NME on prosenttia koko NME ladataan immunoblottauksella.

immunohistokemia Kliininen kasvaimen Näytteet

Objektilasit hankittiin US Biomax (Rockville, MD). Arviointi HER2 intensiteetti (0-3 +) valmistui Yhdysvaltain Biomax. PUMA havaitseminen suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [28]. Laseja inkuboitiin PUMA vasta-aineella (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Histologinen tulokset (H-Scores) laskettiin kummastakin prosenttia positiivisuus (A%, A = 1-100) ja intensiteetti (B = 0-3 +) käyttäen seuraavaa yhtälöä: H-Score = a × B. Chi-square analyysiä käytettiin määrittämään suhdetta HER2 intensiteetti ja PUMA H-Score.

TILASTOANALYYSI

Data esitetään keskiarvona ± SE. Erot määritettiin kautta One-Way ANOVA kanssa Tukeyn post-hoc testin tai opiskelijan t-testissä tarvittaessa. Chi-Square-analyysi suoritettiin IHC tuloksia. Merkitys asetettiin p 0,05.

Tulokset

HER2 Fyysisesti Associatesin PUMA

Sen tutkimiseksi, HER2 ole mitään vuorovaikutus PUMA, ensin arvioitava, HER2 voi fyysisesti vuorovaikutuksessa kanssa PUMA käyttäen immunosaostus /western blotting (IP /WB). Käytimme SK-BR3 ja BT-474 rintasyövän soluja kuin ne yli-ilmentävät HER2 vuoksi HER2-geenin monistaminen. Me immu- HER2 näistä soluista ja totesi, että PUMA voitiin havaita HER2 kaatavat molemmissa solulinjoissa (kuva 1a). Tämä osoitti romaani löytää joka HER2 fyysisesti vuorovaikutuksessa PUMA. On syytä huomata, että emme havaitse vuorovaikutusta HER2 ja Bad tai BMF, muut BH3 vain proteiineja, mikä viittaa vuorovaikutusta HER2 on nimenomaan PUMA (kuva 1a). Me seuraavaksi arvioi HER2 -kinaasiaktiivisuus tarvitaan vuorovaikutusta PUMA. Tätä varten solut käsiteltiin tai ei hereguliinin keinona aktivoida HER2-kinaasiaktiivisuutta. Huomattavaa on, että HER2 ei ole ilmeinen ligandien ja vetoaa sitoutumiseen hereguliinin sidottu HER3- aktivointia varten; HER3- ei ole kinaasiaktiivisuutta [5]. Kuten kuviossa 1b, HER2 aktivoitiin hereguliinin mutta tämä ei merkittävästi muuta vuorovaikutusta HER2 kanssa PUMA. Sitten soluja käsiteltiin kanssa tai ilman lapatinibi joka estää HER2-aktivointi [29]. Lapatinibin väheni HER2 aktivointi mutta myös ei vaikuttanut merkittävästi vuorovaikutusta HER2 ja PUMA (kuva 1c). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että HER2 voi fyysisesti vuorovaikutuksessa PUMA ja tämä vuorovaikutus ei riipu kinaasiaktiivisuutta HER2.

a) SKBR3- ja BT-474 solut hajotettiin ja kokonaisproteiinin altistettiin immunosaostus joko kontrolli-lgG tai HER2-vasta-aineiden seurasi immunoblottaus osoitti vasta-aineita. Kokosolulysaateille altistettiin myös immunoblottauksella mainituilla vasta-aineilla. b) MDA-MB-453-soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa 16 tunnin ajan, jota seuraa käsittely hereguliinin (100 ng /ml) 30 minuutin ajan. Sitten solut hajotetaan ja kokonaisproteiinin suoritettiin immunosaostus joko kontrolli-IgG tai HER2-vasta-aineita, jota seuraa immunoblottaus osoitti vasta-aineita. Kokosolulysaateille altistettiin myös immunoblottauksella mainituilla vasta-aineilla. c) MDA-MB-453-soluja inkuboitiin lapatinib (10 uM) kahden tunnin ajan. Sitten solut hajotetaan ja kokonaisproteiinin suoritettiin immunosaostus joko kontrolli-IgG tai HER2-vasta-aineita, jota seuraa immunoblottaus osoitti vasta-aineita. Kokosolulysaateille altistettiin myös immunoblottauksella mainituilla vasta-aineilla. d) mitokondrion (ME) ja ei-mitokondrioiden uute (NME) eristettiin BT-474-soluissa, ja molemmat uutteet altistettiin immunosaostukselle mainituilla vasta-aineilla. ME ja NME suoritettiin myös immuuni-vasta-aineiden kanssa.

PUMA ensisijaisesti paikantuu mitokondriot, koska se sisältää mitokondriaalisen lokalisaatiosignaaliin [12], [16], mutta PUMA on havaittu myös edistää apoptoosia ilman mitokondrioiden lokalisointi [15]. Lisäksi, HER2 ensisijaisesti paikallistettu plasmamembraanin, mutta on viime aikoina havaittu paikallistaa mitokondriot, jossa se vaikuttaa solujen aineenvaihduntaan ja edistää vastus trastutsumabi [30]. Siksi me seuraavaksi määritellään, missä PUMA ja HER2 fyysisesti vuorovaikutuksessa. Mitokondrioiden (ME) ja ei-mitokondrioiden uutteet (NME) eristettiin BT-474-soluja ja immunoblottaus ja α-tubuliinin ja COX IV vahvistaneet, että tehokas eristäminen mitokondrioiden ja ei-mitokondrioiden fraktiot (kuvio 1 d). Kuvassa 1 d on esitetty, että PUMA ja HER2 havaittiin sekä ME ja NME vahvistaa aiempien huomautusten [30]. Huolimatta lastaus on yhtä suuret määrät proteiinia (60 ug), näytti olevan enemmän PUMA ja HER2 tasoilla ME kuin NME. Kuitenkin tämä ilmeinen epätasapaino johtuu siitä, että 60 ug: 80% ME korjattu, mutta vain 2%: n NME korjattu. Määrittää vuorovaikutuksen HER2 ja PUMA, HER2 immunosaostettiin yhtä suuret määrät ME ja NME seurasi immunoblottaus. Havaitsimme vuorovaikutus HER2 ja PUMA sekä ME ja NME (kuvio 1 d). Nämä ovat ensimmäiset tiedot osoittavat HER2 fyysisesti vuorovaikutuksessa PUMA ja että tämä vuorovaikutus tapahtuu ja ulos mitokondrioiden osaston.

HER2 fosforyloi suoraan PUMA

havaitsemisen jälkeen suoran vuorovaikutuksen HER2 ja PUMA meidän seuraava ratkaistava, onko PUMA voitaisiin fosforyloida HER2. Parhaan tietomme mukaan PUMA tyrosiinifosforylaatio ei ole aikaisemmin raportoitu. Jotta ensin arvioitava PUMA voidaan tyrosiinifosforyloituu solunsisäisesti, me nälässä HER2-yli-ilmentävät solut 16 tuntia ja käsiteltiin sitten solut tai ilman hereguliinin aktivoida HER2. Me altistetaan solulysaateista IP /WB käyttämällä PUMA vasta-IP ja immunoblotattu anti-fosfo-tyrosiini vasta-aineita. Kuten kuviossa 2a on esitetty, tyrosiinifosforyloitunut PUMA oli helposti havaittavissa hereguliinin stimuloidut solut, jotka ilmensivät aktivoitua fosforyloidun HER2 (p-HER2). Kuitenkin, MCF-7-soluissa, jotka ilmentävät alhaisia ​​HER2, ei vastannut hereguliini ja eivät osoittaneet merkittäviä PUMA tyrosiinifosforylaation (kuvio 2b). Sen sijaan, MCF-7-soluja, joilla on stabiili, pakko yli-ilmentävät HER2 (MCF-7 /HER2-solut) esittää PUMA tyrosiinifosforylaatio vasteena hereguliinin (kuvio 2c). Nämä tulokset ovat ensimmäinen osoittaa, että PUMA voidaan fosforyloitiin tyrosiinitähdettä ja tämä tapahtui HER2 stimulaation hereguliinin.

MDA-MB-453 (a), tai MCF-7 (b), tai MCF- 7 /HER2 (c) soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa 16 tunnin ajan, jota seuraa käsittely hereguliinin (100 ng /ml) 30 minuutin ajan. Sitten solut hajotetaan ja kokonaisproteiinin suoritettiin immunosaostus joko kontrolli-IgG tai puma-vasta-aineiden ja sen jälkeen immunoblottauksella, jossa mainituilla vasta-aineilla. Kokosolulysaateille altistettiin myös immunoblottauksella mainituilla vasta-aineilla. Tyrosiinifosforyloitunut PUMA havaittiin 4G10 fosfo-tyrosiini vasta-aineita. Rekombinantti PUMA proteiini saatettiin HER2 kinaasimääritys (esitettyjä Methods Materials) läsnä ollessa tai puuttuessa lapatinibille (d) tai lisääntyvää rekombinantti PUMA proteiini (e). f) Rekombinantti HER2 immunosaostettiin läsnä ollessa tai poissa ollessa puhdistettua PUMA seurasi immunoblottaus vasta-aineiden kanssa.

halusimme seuraavaksi onko HER2 voi suoraan fosforyloimaan PUMA. Tätä varten käytimme kaupallisesti saatavilla puhdistettua rekombinanttista PUMA ja HER2-proteiinien suorittaa soluttoman -kinaasimäärityksessä. Kuten on esitetty kuviossa 2d, PUMA oli vahvasti fosforyloitiin tyrosiinitähteiden läsnäolo HER2. Kuten odotettua, HER2 tehtiin automaattinen fosforylaatiota. Läsnä ollessa lapatinibi HER2 fosforylaatio oli kadonnut, ja näin ollen ei ollut tyrosiinifosforylaation PUMA. Havaitsimme myös annos-vaste kasvu tyrosiinifosforylaation PUMA noustessa PUMA proteiinin läsnä ollessa HER2 (kuvio 2e). Käyttämällä IP-WB, me osoittavat lisäksi, että avattavan rekombinanttisen HER2 johtaa myös avattavasta puhdistettua PUMA (kuvio 2f) vahvistetaan HER2 suoraan yhdistää PUMA yhteydessä solutonta -kinaasimäärityksessä. Nämä tulokset osoittavat ensimmäistä kertaa, että PUMA voidaan fosforyloitu tyrosiiniryhmää suoraan HER2.

HER2 fosforyloi PUMA Three tyrosiiniryhmien

Haku ihmisen PUMA proteiinisekvenssin paljasti kolme tyrosiinitähdettä, eli Y58, Y152, ja Y172 (kuvio 3a). Kaikki kolme tyrosiinitähteitä PUMA todettiin olevan konservoitunut useiden nisäkäslajien (kuva 3a), mikä osoittaa, nämä tähteet ovat mahdollisesti funktionaalisesti tärkeitä. Sen määrittämiseksi, mitkä erityiset PUMA tyrosiinitähde (t), jotka HER2 fosforyloi, teimme kohdennettua mutageneesiä muuttua jokaisen tyrosiini (Tyr, Y) fenyylialaniini (Phe, F) käyttämällä ekspressiovektoria kantaa HA-merkitty PUMA templaattina. Fenyylialaniini on sama R-ryhmän, kuten tyrosiini ilman happea sitovat fosfaattia ja näin ollen ei voida fosforyloida. Nämä PUMA mutantit (Y58F-, Y152F-, Y172F-PUMA), yhdessä villityypin PUMA (WT-PUMA), ilmennettiin soluissa, immunosaostettiin käyttäen HA-tag-vasta-ainetta, ja sille tehtiin HER2-kinaasimääritys. Kuten on esitetty kuviossa 3B, WT-PUMA voimakkaasti fosforyloitiin yhdistelmä-HER2, kun taas kaikki mutantit osoittivat vähäistä fosforylaation, mikä osoittaa, että kaikki kolme tyrosiineissa voidaan fosforyloida. Ymmärtää täysin biologinen seuraukset PUMA tyrosiinifosforylaation loimme lisäksi PUMA mutantti, kolminkertainen mutantti PUMA (TM-PUMA), jossa kaikki kolme tyrosiinien (Y58, Y152, ja Y172) mutatoitiin fenyylialaniinin. Käyttämällä solutonta HER2-kinaasimääritys (kuvio 3b), WT-PUMA osoitti fosfo-tyrosiini bändejä kun taas yksikään ei havaittu TM-PUMA, osoittaa TM-PUMA ei fosforyloitu HER2. Sulkea pois mahdollisuutta, että TM-PUMA ei voi tyrosiinifosforyloitunut koska se ei pysty vuorovaikutuksessa HER2, me seuraavaksi selvitettävä, TM-PUMA voi fyysisesti vuorovaikutuksessa HER2. IP /WB kanssa HER2-vasta-aineen (kuvio 3c), osoittivat, että HER2 vuorovaikutuksessa sekä WT-PUMA ja TM-PUMA yhtä osoittaa puute TM-PUMA fosforylaation HER2 ei alentuneen vuorovaikutuksen kahden proteiinin. Yhdessä tulokset kuvioissa 2 ja 3 ovat ensimmäiset todisteet siitä, että PUMA läpikäy tyrosiinifosforylaatio ja että HER2 voi suoraan fosforyloida PUMA.

a) Lineaarinen esitys PUMA proteiinin jokaisen tyrosiini, BH3: een, domain, ja mitokondrioiden lokalisaatiosignaaliin (MLS) domain merkitty (ylempi paneeli). Tyrosiinien 58, 152, ja 172 PUMA proteiini konservoitunut useiden nisäkäslajien, jotka on merkitty (alempi kuva). b) Villityypin HA-koodattu PUMA proteiinin mutatoitu siten, että kukin tyrosiini muutettiin fenyylialaniinin (Y58F, Y152F, Y172F) tai kaikki tyrosiineilla mutatoitiin (triple mutantti: TM). MCF-7-solut transfektoitiin WT-PUMA tai kunkin PUMA mutantin ja kokosolulysaatissa altistettiin immunosaostus joko kontrolli-IgG tai HA-suunnattu vasta-aineita. Immunosaostuksen, tuote saatettiin HER2 kinaasimääritys kuten Materiaalit ja menetelmät osassa. c) WT-PUMA tai TM-PUMA transfektoitiin MDA-MB-453-soluja. Solut hajotettiin ja kokonaisproteiinin altistettiin immunosaostus ja immunoblottauksen kanssa osoitti vasta-aineita. Kokosolulysaateille altistettiin myös immunoblottauksella mainituilla vasta-aineilla.

TM-PUMA on pidempi puoliintumisaika kuin WT-PUMA

halusimme seuraavaksi onko PUMA fosforylaation HER2 muuttunut PUMA vakautta. Tätä varten meidän arvioida proteiinin puoliintumisaika käyttäen sykloheksimidiä, joka estää proteiinisynteesiä mahdollistaa havaitsemisen, kun proteiineja heikkenee. Sykloheksimidi on yleinen tapa määrittää proteiinin vakauden useat asiaankuuluvat paperit ovat käyttäneet tätä menetelmää viime vuosina [31] – [34]. Näin ollen, HER2-yli-ilmentävät MDA-MB-453-soluja käsiteltiin sykloheksimidillä jopa 16 tuntia, kun läsnä tai poissa ollessa hereguliinin aktivoida HER2. Kuten kuviossa 4a on esitetty, hereguliinin indusoimaa aktivoitumista HER2 näissä soluissa ja johtanut myös parannettu PUMA proteiinien hajoaminen. Tutkimaan edelleen vakauden PUMA, arvioimme PUMA puoliintumisaika käyttäen MCF-7-solut, joilla on alhainen HER2 lauseke tai MCF-7 /HER2 soluja, joilla on vakaa HER2. Kuvassa 4b on esitetty, että PUMA hajoaa nopeammin MCF-7 /HER2 soluja verrattuna MCF-7-soluissa osoittaa yli-ilmentävät HER2 vähentää PUMA vakautta. Me seuraavaksi määritetään, onko puoliintumisaika TM-PUMA, joka ei voi olla tyrosiinifosforyloidulla, eroaa WT-PUMA. Solut transfektoitiin joko WT-PUMA tai TM-PUMA seuraa sykloheksimidikäsittelylle. Kuten kuviossa 4c, WT-PUMA tasot laskivat merkittävästi 16 tuntia kun taas TM-PUMA tasot eivät merkittävästi laskevan. Sen jälkeen kvantifiointi PUMA kaistan signaalit ja merkitsemällä ne ajan mittaan, huomasimme, että puoliintumisaika WT-PUMA oli noin 7 tuntia kun taas TM-PUMA oli pidempi kuin 16 tuntia. Aiemmin on osoitettu, että puma voi kohdistaa proteasomia heikentymisen [31]. Sen määrittämiseksi, WT-PUMA tai TM-PUMA säätelee proteasomin, suoritimme puoliintumisaika kokeilu läsnäollessa proteasomin estäjä MG132. Kuten on esitetty kuviossa 4d, me havaitsimme, että WT-PUMA puoliintumisaika voidaan pidentää estämällä proteasomin vahvistaa aiemmat tulokset [31]. Nämä tulokset viittaavat siihen, HER2-välitteisen fosforylaation vähentää puoliintumisaika PUMA.

a) MDA-MB-453-soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa 16 tunnin ajan, jota seuraa käsittely hereguliinin (100 ng /ml) ja sykloheksimidi (10 ug /ml). Kokosolulysaatti suoritettiin immunoblottaus osoitti vasta-aineita. b) MCF-7 ja MCF-7 /HER2-soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa 16 tunnin ajan, jota seuraa käsittely hereguliinin (100 ng /ml) ja sykloheksimidillä (10 ug /ml). Kokosolulysaatti suoritettiin immunoblottaus osoitti vasta-aineita. c, d) MCF-7-solut transfektoitiin HER2 ja joko WT-PUMA tai TM-PUMA. Soluja inkuboitiin seerumivapaassa väliaineessa 16 tunnin ajan, jota seuraa käsittely hereguliinin (100 ng /ml) ja sykloheksimidillä (10 ug /ml) ilman (c) tai MG132 (10 uM) co-hoitoa (d). Kokosolulysaatti suoritettiin immunoblottaus osoitti vasta-aineita. e) MCF-7-solut transfektoitiin WT-PUMA tai TM-PUMA ja mitokondrioita eristettiin. ME ja NME tehtiin immunoblottaus osoitti vasta-aineita. f) Chi-square pöytiä analyysi syövän kliininen näytteistä. Med-High HER2 = 2-3 +. Matala HER2 = 0-1 +. g) Näyte IHC kuvia kliinisten syöpänäytteissä High HER2 + Matala PUMA (tapaus 1) ja Low HER2 + Korkea PUMA (tapaus 2).

Seuraava kysyttiin TM-PUMA säilyy kyky läpikäydä translocalization mitokondriot, jossa PUMA edistää apoptoosia. Näin ollen, WT-PUMA tai TM-PUMA transfektoitiin soluihin, jota seuraa eristäminen ME ja NME myöhempien immunoblottauksella. Kuten kuva 4e osoittaa, TM-PUMA säilytti mahdollisuuden läpi mitokondrioiden lokalisointi. Lisäksi havaitsimme suurempaan TM-PUMA verrattuna WT-PUMA siinä ME, joka vahvistettiin laskemalla mtPUMA Index (katso materiaalit ja menetelmät) johtaen 3,3 kertaa enemmän TM-PUMA mitokondrioissa kuin WT-PUMA. Suurempi TM-PUMA tason mitokondrioissa on todennäköisesti seurausta tehostetun proteiinin stabiilisuutta TM-PUMA proteiinin läsnä ollessa HER2. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että PUMA proteiini vakaus on vähentynyt HER2 aktivointi ja esto PUMA tyrosiinifosforylaation parantaa PUMA vakautta ja aiheuttaa enemmän mitokondrioiden tasoilla PUMA.

Sen arvioimiseksi, onko tämä suhde säilyy

in vivo

teimme immunohistokemia joukko syövän kliininen näytteistä (n = 93) havaitsemiseksi HER2 ja PUMA. Sen jälkeen pisteytys, jaoimme näytteet alhainen HER2 (0-1 + voimakkuus) tai keskisuuri tai suuri HER2 (2-3 + intensiteetti). PUMA jaettiin korkea PUMA (joko ≥150 H-Pisteet tai ≥100 H-Score) tai matala PUMA (joko 150 H-Pisteet tai 100 H-Score). Suoritimme sitten chi-neliö analyysi määrittää suhdetta HER2 ja PUMA ilmaisu (kuvio 4f). Chi-neliö analyysi käyttäen joko PUMA este (150 H-Score tai 100 H-Score) johti tilastollista merkitystä (p = 0,045 ja p = 0,027, tässä järjestyksessä). Nämä tiedot viittaavat siihen, kudoksista korkealla HER2 ilme ovat alhaisemmat PUMA ilmaisun

in vivo

(kuvio 4g) tukevat meidän tietoja solulinjoista että HER2 voi downregulate PUMA ilme.

TM-PUMA on voimakkaampi vaikutus kuin WT-PUMA estäminen klonogeeninen Growth

Kuva 4 osoitti, että TM-PUMA oli enemmän proteiinia vakautta ja suuremman proteiinin tasot mitokondrioissa, mikä saattaa tarkoittaa, että TM-PUMA on parannettu kyky edistää apoptoosia . Jotta voidaan tutkia vaikutus TM-PUMA solujen elinkelpoisuuteen, meidän ilmaistuna tyhjän vektorin, WT-PUMA tai TM-PUMA kahdessa eri HER2 yli-ilmentyvä rintasyövän solulinjoissa, eli BT-474 (kuvio 5e) ja MDA-MB-453 (kuvio 5f) soluja, ja niitä seurataan kyky näiden solujen muodostamiseksi pesäkkeitä.