Krooninen sairaus

tiivistelmä

Raskaus liittyvä plasma proteiini-A (PAPPA) on raportoitu säätelevät insuliinin kaltaisen kasvutekijän (IGF) signaalireitin kautta proteolyyttisen hajoamisen IGF sitovia proteiineja (IGFBP) siten lisätä paikallinen pitoisuus vapaan IGF käytettävissä oleviin reseptoreihin. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että PAPPA erittyy kahteen seitsemästä keuhkosyövän solulinjat tutkittiin. Mikään kuolemattomaksi normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa (HBE) testattu salaisuuksia PAPPA. Ei ole mitään korrelaatiota ilmentymisen taso ja eritystä PAPPA näissä soluissa. Solulinja yli-ilmentäviä PAPPA mukana eritystä ei osoita merkittäviä muutoksia lisääntymistä alle soluviljelmässä olosuhteissa

in vitro

, mutta näyttää huomattavasti lisäämisen kasvaimen kasvua

in vivo

in ksenograftimallia. Sitä vastoin solulinja yli-ilmentävät PAPPA ilman eritystä esittelee väheneminen kasvaimen kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

. Down-säätely PAPPA ilmaisun ja erityksen RNAi Knockdown vähenee kasvaimen kasvua jälkeen istutettu

in vivo

. Kasvaimen edistävää vaikutusta PAPPA näyttää välittävän pääasiassa lisäämisen IGF signalointireitin kuten on esitetty merkittävä nousu loppupään Akt-kinaasin fosforylaation tuumorinäytteissä. Tuloksemme osoittavat, että PAPPA eritys voi olla tärkeä rooli keuhkosyövän kasvuun ja etenemiseen.

Citation: Pan H, Hanada S, Zhao J, Mao L, Ma MZ-Q (2012) Protein eritys vaaditaan Raskaus-Associated Plasmaproteiinin-A edistävä Keuhkosyöpä kasvu

In Vivo

. PLoS ONE 7 (11): e48799. doi: 10,1371 /journal.pone.0048799

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 01 lokakuu 2012; Julkaistu: 09 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Pan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tuettiin osittain National Institute of Health myöntää R01 CA126818 ja R01 CA136635. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Insuliinin kaltaiset kasvutekijät (IGF: t) pelata tärkeä rooli monissa biologisissa prosesseissa, kuten solujen kasvua, transformaatio, erilaistumisen, selviytyminen ja muuttoliike [1], [2]. Lisäksi niiden kriittisiä rooleja kehitysbiologian kuin ilmeinen geneettinen null mutaatioita [3], [4], [5], IGF: t ovat selvästi mukana säätelyssä kasvaimen muodostumisen ja etenemisen [6], [7]. On hyvin tunnettua, että seerumin IGF-1 korreloi syövän ilmaantuvuus ihmisillä [8], [9]. Hiiren alkion fibroblasteissa, joissa on nolla-mutaation

Ifgf1r

ovat resistenttejä induktion solun transformaatio [10]. Molekyylitasolla, IGF: t sitoutuvat reseptorityrosiinikinaasit (IGF1 R, IR-A) aktivoi useita solunsisäisiä signalointireittien, kuten phosphatidylinositide-3′-kinaasi (PI3K) /Akt ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) signa- [ ,,,0],11], [12]. Kuitenkin pääsy IGF: ien ja niiden reseptoreiden tiukasti kontrolloitua IGF-sitovat proteiinit (IGFBP: t), jotka sitoutuvat IGF: t, joilla on suurempi affiniteetti kuin IGF1 R [13]. Hajoaminen IGFBP lisää vapaata aktiivista IGF: t käytettävissä reseptoreihin solunulkoisessa mikroympäristössä mikä parantaa IGF toimintaa [14]. Monipuolinen ryhmä proteaaseja kuten plasmiini, matriksimetalloproteaaseja (MMP-1, -2 ja -3), katepsiini D ja eturauhasen antigeenin (PSA) on raportoitu osallistumaan proteolyysin IGFBP eri teho ja spesifisyys [15].

Raskaus liittyvä plasma proteiini-A (PAPPA) on toinen proteaasi, joka on raportoitu pilkkovan IGFBP4 [16]. PAPPA alun perin löydetty istukan ja lisääntymiskudosten, ja on ehdotettu biomarkkerina raskauden geneettinen poikkeavuus [17]. Äskettäin proteolyyttisen aktiivisuuden PAPPA on tunnistettu normaaleissa ihmisen fibroblasteissa, viljeltiin osteoblastien [18], [19], verisuonten sileän lihaksen soluissa [20] ja munasarjan soluihin [21]. Mukaisesti Näiden havaintojen lisääntynyt ilmentyminen PAPPA on havaittu

in vivo

aktiivisessa ateroskleroosiplakkien ihmisen sepelvaltimoissa [22] ja haavan paranemista ihmisen ihon [23]. Niinpä PAPPA osallistuu säätelyyn IGF välittämän patofysiologisia prosesseja näitä sairauksia. PAPPA on myös todettu pilkkomiseksi ja inaktivoida IGFBP2, IGFBP3 ja IGFBP5 [24].

Useat riviä todisteet osoittavat, että PAPPA on sekaantunut kasvainmuodostusta. PAPPA geeni on lokalisoitu kromosomialueella liittyy korkea taajuus heterotsygoottisuuden menetys munasarjojen kasvaimia. Useimmat munasarjasyövän solulinjoissa ja primaaristen kasvainten osoittaa osittainen tai täydellinen menetys ilmentymisen PAPPA [25]. PAPPA ilmentyminen osoitettiin olevan johdonmukaisesti korkeat normaaleissa munasarjan näytteitä ja tukahdutettiin SV40: n suuren T-antigeenin [25], [26]. Päinvastoin, hiiret, jotka kantavat mutaatiota on PAPPA geenin elävät pidempään ja osoittaa vähemmän ilmaantuvuus kasvaimen muodostumisen elämänsä aikana [27]. Lisäksi seerumin PAPPA taso on raportoitu olevan suurentunut potilailla keuhkosyöpä verrattuna terveillä henkilöillä [28]. Kun otetaan huomioon kiistanalainen roolit PAPPA raportoitu syövän kehittymisessä, päätimme yliekspressoivat PAPPA keuhkosyövän solulinjoja arvioimaan rooliaan kasvaimen kasvuun ja etenemiseen. Kirjoittajat raportoivat, että kohdunulkoinen yli-ilmentyminen PAPPA vuonna H1299 keuhkosyövän solujen edistää kasvaimen kasvua

in vivo

in ksenograftimallia taas alas sääntely endogeenisen PAPPA A549 keuhkosyövän soluista pienenee kasvaimen kasvua. Kasvaimen kasvu liittyy PAPPA eritystä. Kasvainten PAPPA yli-ilmentävät H1299-solut osoittivat lisääntynyt määrä mitoottisia soluja ja vähentää apoptoosia. Signalointireitin analyysi osoitti kohonneita Akt signalointi. Tuloksemme viittaavat siihen, että erittyvä PAPPA syöpäsoluissa voisi edistää kasvaimen kehitystä potensoiva IGF signalointireitin.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit saatiin seuraavilta toimittajilta: Solulinjat H1299, A549, H460 , H596, H1792, H1944 ja H522 alun perin ostettu ATCC: ltä. HBE1, HBE2 ja HBE4 saatiin John Minna (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas), joista kukin edustaa HBEC1, HBEC2 ja HBEC4 kuolemattomiksi Cdk4 ja hTERT vastaavasti [29]. Alkuperä käytettävien reagenssien kokeissa on listattu seuraavasti: Human PAPPA täyspitkä cDNA-klooni (ATCC, Tuote nro: 10625309); Hiiren monoklonaalinen anti-PAPPA-vasta-aine (Novus, Littleton CO); IGF2-proteiinia, IGFBP4 proteiinia ja Kanin polyklonaalista anti-IGFBP4-vasta-aine (Abcam, Cambridge, MA); Fosfo-P44 /42 MAPK rabbit mAb, p44 /42 MAPK rabbit mAb, fosfo-Akt kani mAb, Akt (pan) kani mAb, β-tubuliinia vasta-ainetta (Cell Signaling, Danvers, MA); Anti-hiiri-IgG, anti-kani-IgG (Thermo Scientific, Rockford, IL); Biotinyloitua anti-kani-IgG, biotinyloitu anti-hiiri-IgG, (Vector Lab, Burlingame, CA); Rekombinantti ihmisen epidermaalinen kasvutekijä (EGF), rekombinantti ihmisen transformoivan kasvutekijä-β1 (TGF-β1) (Invitrogen, Camarillo, CA); Rekombinantti ihmisen insuliinin kaltainen kasvutekijä I (IGF1) (R CellTiter-Blue (Promega, Madison, WI); Anti-fosfo histoni H3 (Millipore, Temecula, CA); RIPA-puskuri (Sigma, Saint Louis, MI); PAPPA ELISA Kit (Diagnostic Systems Lab, Webster, TX); Proteaasiestäjäseostabletit tabletit (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) B

Soluviljely

H1299, H460, H596, H1792, H1944 ja H522-solulinjoja pidettiin RPMI1640 ja A549-solujen viljelmiä pidettiin DMEM. Sekä PRMI1640 ja DMEM täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Atlanta, Lawrenceville, GA), L-glutamiinilla (4 mM), penisilliiniä (100 U /ml), ja streptomysiinillä (100 ug /ml), kaikkea Invitrogen. HBE1, HBE2 ja HBE4 pidettiin täydellisessä keratinosyyttien seerumivapaassa väliaineessa (SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Soluja viljeltiin kostutetussa kudosviljelyinkubaattorissa 37 ° C, 5% CO

2. Seerumitonta soluravintoliuoksista (CM) valmistettiin yksikerrosviljelmiä on 80-100% konfluenssiin. Seerumia sisältävällä elatusaineella imettiin pois ja yksisolukerrokset pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Täydellinen keratinosyyttien-SFM lisättiin ja inkuboitiin 24 tuntia. Sadonkorjuun, CM siirrettiin sentrifugiputkeen ja sentrifugoitiin 2500 rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ennen pakastamista pienissä erissä -20 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin määrityksissä. Kokonaisten solu-uutetta (CE), väliaine poistettiin ja pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja lyysattiin RIPA-puskuriin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), joka sisälsi proteaasi-ja fosfataasinestäjällä cocktail tabletit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) ja sentrifugoitiin 12500 rpm: ssä 5 min. Tämä supernatanttia käytettiin määrityksiin.

Expression analyysi syöpäsolulinjojen reaaliaikaisella PCR

RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) käytettiin valmistamaan kokonais-RNA: soluviljelmästä . Kokonais-RNA käsiteltiin DNaasi mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Qiagen). Synteesi cDNA luotiin käyttäen TaqMan RT-PCR reagenssit Applied Biosystems (Life Technologies, Grand Island, NY). PAPPA geenin ilmentyminen määritettiin TaqMan geeniekspression määritystä, jossa on 7900HT Real-Time PCR System ilmaisimen (Applied Biosystems). Spesifisten alukkeiden monistamiseen kohdegeenien ja spesifistä koetinta varten monistumisen havaitsemiseksi ovat suunnitelleet Applied Biosystems (Cat #: Hs00361692_m1). Human PPIA (Syklofiliiniesimerkkeihin A) käytettiin sisäisenä kontrollina normalisointia geenin ilmentymisen (Cat #: 4333763F, Applied Biosystems).

Generation keuhkosyövän solulinjoja stabiilisti yli-ilmentävät PAPPA tai säätelyä alaspäin endogeenisen PAPPA ilmaisu

Human PAPPA täyspitkän cDNA (ostettu ATCC: ltä, kohta nro: 10625309) vapautettiin pBluescript-vektoriin Sfil (täytetty) Xbal ruoansulatusta ja subkloonattiin EcoRV: llä ja Xbal-kohtiin pCR3.1 (Invitrogen ) rakentamiseksi PAPPA ekspressiovektoriin. Ekspressiovektoriin varmistettiin sekvensoimalla. H1299-solut transfektoitiin joko PAPPA ekspressiovektorilla tai tyhjän vektorin valittiin alle valinta-alustalla sisältävät 0,5 mg /ml G418: aa (Sigma). G418 resistentit kloonit testattiin ekspressiota PAPPA ja sitten laajennetaan tuottamaan H1299 PAPPA yli-ilmentyminen line (H1299 /PAPPAov) ja tyhjän vektorin ohjaus solulinja (H1299 /pCR3.1). Sillä PAPPA Knockdown kokeita lentivirus- hiukkaset # 81 (Cat #: VGH5523-101126912, Clone ID: V3LHS_355181), # 82 (Cat #: VGH5523-101130068, Clone ID: V3LHS_355182), # 83 (Cat #: VGH5523-101132535, Clone ID: V3LHS_355183), jotka sisältävät shRNAmir on PAPPA ja ei-hiljentäminen shRNAmir (Cat #: RHS4348) ostettiin Thermo Scientific (Lafayette, CO) ja käytettiin infektoimaan A549 syöpäsoluja. Kypsä sekvenssejä näistä klooneista on lueteltu seuraavasti: V3LHS_355181: CGACAAGAAGTCTCCTTCA; V3LHS_355182: AGAGCCTACTTGGATGTTA; V3LHS_355183: GGGCAGTTCATGAAGCTCT; Non-hiljentäminen: TCTCGCTTGGGCGAGAGTA. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia infektion jälkeen, solut valittiin valinta alustalla, joka sisälsi 2 ug /ml puromysiiniä (Invitrogen). Kloonit tutkittiin reaaliaikaisella PCR potenssi PAPPA mRNA Knockdown ja laajennettiin tuottamaan PAPPA pudotus solulinjan (A549 /PAPPAkd) ja ei-hiljentäminen ohjaus solulinja (A549 /sc).

PAPPA ELISA

Vakioitu alusta (CM) ja kokosolu-uute (CE) valmistettiin kuten edellä on kuvattu. PAPPA mitattiin käyttäen ultraherkät PAPPA ELISA kit saatu Diagnostic Systems Laboratories mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pienin herkkyys on 0,24 mIU /l, jossa sisäinen ja määritysten välinen variaatiokertoimet 4,7 ja 4,2%, vastaavasti.

mittaus IGFBP proteolyyttisen aktiivisuuden

proteolyyttinen aktiivisuus PAPPA analysoitiin inkuboimalla seerumittomassa kasvualustassa (CM), jossa alustan proteiinin IGFBP4. Lyhyesti, jäljitellä reaktiot perustettu sekoittamalla 25 ui CM 40 ng IGFBP4 substraatin läsnä ollessa tai puuttuessa IGF2 (75 nM lopullinen pitoisuus), mitä seurasi inkubointi 37 ° C: ssa 4 tunnin ajan. Ehjä ja katkaistun proteiinin IGFBP4 reaktioseoksissa erotettiin sitten ei-pelkistävällä 10% SDS-PAGE: lla ja visualisoitiin Western blot-analyysillä käyttämällä polyklonaalisia anti-IGFBP4-vasta-aine (Abcam).

Kasvaimen vierassiirrekokeissa

Neljä viikkoa vanhoja naaraspuolisia severe combined immuunikato (SCID /NOD) hiirissä tai nu /nu kateenkorvattomia hiiriä (Charles River) käytettiin tässä tutkimuksessa, ja kaikki hiiret pidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa. 5 x 10

6 H1299 /PAPPAov, H1792 /PAPPAov tai sen tyhjän vektorin kontrollisoluja (H1299 /pCR3.1 tai H1792 /pCR3.1) suspendoitiin 0,1 ml: aan 1 x PBS: ää, joka sisälsi 50% matrigeeliä ja injektoidaan ihonalaisesti viiteen hiirtä ryhmää kohti käyttämällä 26 gaugen neulojen ja annettiin lisääntyä muodostaa käsin kosketeltava kasvaimia. Kasvaimet tarkkailtiin ja mitattiin sitten kahdesti viikossa kolmiulotteisesti käyttäen paksuus. Samoin PAPPA knockdown A549-solut A549 /PAPPAkd ja ei-hiljentäminen ohjaus A549sc laajennettiin viljelmässä. 1 x 10

6 solua suspendoituna 0,1 ml 1 x PBS: ää ihonalaisesti neljän viikon ikäisten nu /nu kateenkorvattomissa hiirissä. Kasvava kasvaimia tarkkailtiin ja mitattiin kaksi kertaa viikossa, kuten on kuvattu edellä. Kasvaintilavuudet lasketaan kaavalla (π /6) x pituus (

L

) x leveys (

W

) x korkeus (H) kasvainten jossa

L

ja

W

edustaa pisin ja lyhin kasvaimen mitat, vastaavasti. Hiiret lopetettiin samalla tavalla, kun suurin kasvain saavutti tutkimuksen päättyessä määritelty kasvaimen taakkaa 10% hiiren kehon painosta.

Ethics lausunto

Kaikki hiiret käsiteltiin mukaisesti opas Care ja koe-eläinten käytön. Kaikki eläinkokeet suoritettiin seuraavan hyväksymiä Institutional Animal Care ja Käytä komitean Marylandin yliopistossa School of hammaslääketieteen. Nimetty Institutional Review Board tai eettisen komitean erikseen hyväksynyt tätä tutkimusta.

Western Blot analyysi

Protein kokosoluseerumista uuttoja kvantifioitiin käyttäen BCA-määrityksellä (Pierce). Yhteensä 25 ug proteiinia fraktioitiin NuPAGE 10% Bis-Tris-geelillä (Invitrogen) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVD) kalvon iBlot geeli siirtojärjestelmä (Invitrogen). Membraani blokattiin TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1% (v /v) Tween-20), joka sisälsi 5% (w /v) rasvatonta maitojauhetta yhden tunnin ajan ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden (1:1000) joko TBST /1% (w /v) rasvatonta maitojauhetta tai TBST /1% (w /v) BSA: ta (naudan seerumin albumiinia). Membraanit pestiin kuusi kertaa TBST-liuoksella, inkuboitiin 1:5000 piparjuuriperoksidaasi konjugoitu anti-hiiri tai anti-kani-lgG-vasta-ainetta TBST /1% (w /v) rasvatonta maitojauhetta yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kun toinen Kuuden pesun TBST, vasta-aine-kompleksit havaita käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (Amersham Biosciences). Molekyylipainot arvioitiin käyttäen edeltä käsin värjätty koko raivoa Rainbow molekyylipainomarkkereita (GE Healthcare).

immunohistokemiallinen värjäys

parafinoidut, 5 um: n paksuinen kudososat kasvainkudoksista käytettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä . Lyhyesti, leikkeet parafiini sarjassa ksyleeniä kylpyammeet ja sitten uudelleenhydratoitu käyttämällä asteittaisella alkoholi sarja. Sitten leikkeitä inkuboitiin sitraattipuskurissa (pH 9) 15 minuutin ajan mikroaaltosäteilyä, jotta antigeenin haku. Jälkeen estää normaalin salpauspuskurilla (Vectastain kit) 30 minuuttia, leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden (Phospho-histoni H3 mAb: 1:000; Phospho-Akt mAb: 1:100; Phospho-p44 /42 MAPK mAb: 1:100). Sitten leikkeet käsitellään käyttäen standardia avidiini-biotiini immunokemiallinen tekniikoita (ABC) mukaan valmistajan suositusten (Vector Laboratories). Diamnobenzidine käytettiin kromogeenina ja hematoksyliinillä käytettiin counterstaining.

Tulokset

eritys toiminnallisia aktiivisen PAPPA keuhkosyövän soluja

testattiin ensin hypoteesia siitä, lisääntynyt plasman pitoisuus PAPPA havaittu keuhkosyöpäpotilaita [28] johtuu eritys PAPPA suoraan keuhkojen syöpäsoluja. Tutkimme proteiinipitoisuus ja eritys PAPPA useissa yleisesti käytetty ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat verrattuna kuolemattomaksi normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelin (HBE) solulinjat. PAPPA sisältö syöpäsolulinjoissa on verrattavissa (tapauksissa A549 ja Calu-1) tai vähemmän (jos H460, H596, H1299, H1792 ja H19444) kuin HBE solulinjat yleensä. Kuitenkin PAPPA eritystä A549 ja H460 on huomattavasti enemmän kuin HBE soluja on osoituksena huomattava korkea PAPPA kunnostetussa alustassa näistä kahdesta solulinjoista. Tulokset viittaavat siihen, PAPPA proteiinin eritys voi olla erilaiset HBE solujen ja A549, vaikka kokonaisproteiinia tasot PAPPA ovat samankaltaisia ​​(Fig. 1A). Siten erittyvän muodon PAPPA syöpäsoluista voidaan edistää kasvua ja etenemistä joidenkin keuhkosyöpään.

(A) PAPPA proteiinipitoisuus eri keuhkosyövän solulinjat (CE) ja väliaine (CM) . Esitetyt tiedot ovat keskiarvo kahdesta riippumattomasta määrityksissä kahtena kappaleena. (B) IGF riippuvainen proteaasiaktiivisuutta kunnostetussa alustassa A549 keuhkosyövän soluja. Mittaus IGFBP proteolyyttisen aktiivisuuden suoritetaan, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Nuolet osoittavat ehjä IGFBP4 ja 18 kD: n ja 14 kD: n proteolyyttisiä fragmentteja.

edelleen osoite, jos eritetään PAPPA on toiminnallisesti aktiivinen, proteaasiaktiivisuutta PAPPA tutkittiin käyttäen IGFBP4 substraattina kunnostetussa alustassa päässä HBE1 ja A549 . Kuten kuviossa 1B on esitetty, väliaine A549 voitaisiin tehokkaasti hajottaa IGFBP4 läsnä ollessa IGF2, mikä osoittaa, että PAPPA erittää A549 on toiminnallisesti aktiivinen. PAPPA in HBE1 ei ole salainen tai toiminnallista koska ei IGFBP4 hajoamista havaittiin väliaine HBE1 (Fig. 1 B). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että kyky syöpäsolujen salainen PAPPA sijaan solujen PAPPA sisältö liittyy kasvaimen kasvuun ja etenemiseen. Funktionaalinen määritys PAPPA proteolyyttisen aktiivisuuden IGF2 riippuvainen IGFBP4 hajoaminen on erityinen, herkkä ja luotettava. Käytimme tätä määritystä sen jälkeen kun välineet havaitsemaan PAPPA seerumittomalla väliaineella, kuten on raportoitu muiden [26], [27], [30].

vähentäminen PAPPA eritys vähenee kasvaimen kasvua in vivo ksenografti malli, mutta ei in vitro soluviljelmässä

arvioimiseksi, että erittyvän muodon on tärkeää PAPPA edistää solujen kasvua me syntyy vakaa solulinjan A549 transdusoitu lentivirus- partikkeleita, jotka sisältävät shRNAmir on PAPPA (A549 /PAPPAkd) in tavoitteena on pudotus ilmentymistä ja eritystä PAPPA. Yli 50% alas säätely PAPPA mRNA on saavutettu klooni # 82 shRNAmir jotta PAPPA vahvistama reaaliaikainen PCR kvantifiointiin (Fig. 2A). Mikä tärkeintä, lähes kaikki eritystä PAPPA A549 /PAPPAkd solut poistettiin, kuten ilmeistä, ettei proteaasin aktiivisuuden kunnostetussa alustassa (Fig. 2B). PAPPA tiedetään hajoavan IGFBP: ihin ja lisätä hyötyosuutta IGF: t

in vivo

. On hyvin mielenkiintoista tietää, onko vähentämiseen PAPPA erityksen vaikuttaisi solujen kasvuun

in vitro

soluviljelmässä. Vaikutus PAPPA Knockdown A549 solujen kasvuun arvioitiin ensin

in vitro

verrattuna ilman hiljentäminen shRNAmir ohjaus soluja. Huomattavaa muutosta soluproliferaatioon ja kasvuun A549 /PAPPAkd havaittiin

in vitro

soluviljelmässä kunnossa (Fig. 2C). Vika voidaan havaita vaikutus PAPPA pudotus solun kasvuun viittaa siihen, että soluviljelmässä

in vitro

ei ehkä ole oikea malli järjestelmä, koska se ei ole oikea ympäristö PAPPA toimia proteaasi lisätä hyötyosuutta IGF ja solut altistuvat jatkuvasti monia ilmaisia ​​kasvutekijöitä kuten IGF viljelyväliaineessa. Päätimme tutkia roolia PAPPA kasvaimen kasvussa

in vivo

ksenograftimalleissa. Kuten odotettua, kasvainten tuotettu A549-solulinjan PAPPA pudotus (A549 /PAPPAkd) oli merkittävä väheneminen kasvaimen kasvua verrattuna A549 valvonta-solulinjassa (kuvio. 3A ja B). Keskimääräinen kasvaimen märkäpaino A549 /PAPPAkd lopussa kokeessa oli 214 mg, joka on merkittävästi alempi kuin 360 mg kontrolliryhmän (Fig. 4C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat PAPPA erittyy kasvainsoluista on keskeinen rooli edistämisessä keuhkosyövän solujen lisääntymisen ja eteneminen

in vivo

.

A549-solut transdusoitiin lentiviraalinen sisältävät hiukkaset shRNAmir (# 81 # 82 ja # 83) ja PAPPA ja ei-hiljentäminen shRNAmir (SC) ja valitaan puromysiinin. (A) PAPPA mRNA-tasot näistä solulinjoista määritettiin reaaliaikaisella PCR kvantifiointi ja kuvattu suhteellinen taso ei-hiljentäminen ohjaus. (B) IGF riippuvainen proteaasiaktiivisuutta kunnostetussa alustassa alkaen PAPPA Knockdown A549-soluja linjat. (C) Growth käyrä PAPPA Knockdown A549-solut linja # 82 ja ei-hiljentäminen ohjausjohto.

(A) Kuva kasvaimen koon aikaan leikkelyn. (B): n kasvu- käyrä on ksenograftin kasvaimen. PAPPA pudotus A549-solut linja A549 /PAPPAkd ja ei-hiljentäminen ohjaus A549sc injektoitiin ihonalaisesti 4 viikkoa vanhoja

nu /nu

kateenkorvattomissa hiirissä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset ilmaistiin kasvaimen keskimääräinen tilavuus (mm

3) ± SD (n = 5). (C) Wet kasvaimen painon ajankohtana leikkelyn. *:

p

0,05 (opiskelija

t

testi).

(A) Protein tasot PAPPA vuonna H1299 soluissa yli-ilmentävät PAPPA. PAPPA tasot uutteissa H1299 stabiilisti transfektoitujen solulinjojen kanssa PAPPA ekspressiovektorilla (H1299 /PAPPAov) ja tyhjän kontrollivektorin (H1299 /pCR3.1) määritettiin ELISA-kitillä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SE kolminkertaisten määritysten. (B) IGF riippuvainen proteaasiaktiivisuutta kunnostetussa alustassa alkaen H1299 /pCR3.1 ja H1299 /PAPPAov. (C) kasvukäyrän H1299 /pCR3.1 ja H1299 /PAPPAov solulinjoilla. Elävät solut eri aikapisteissä mitattiin CellTiter-Blue, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SE kolminkertaisten määritysten Suhteellinen fluoresenssi-yksikkö (RFU) kolmen riippumattoman kokeen. (D) Protein tasot PAPPA vuonna H1792 soluissa yli-ilmentävät PAPPA. PAPPA tasot uutteissa H1792 stabiilisti transfektoitujen solulinjojen kanssa PAPPA ekspressiovektorilla (H1792 /PAPPAov) ja tyhjän kontrollivektorin (H1792 /pCR3.1) määritettiin ELISA-kitillä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SE kolminkertaisten määritysten. (E) IGF riippuvainen proteaasiaktiivisuutta kunnostetussa alustassa alkaen H1792 /pCR3.1 ja H1792 /PAPPAov. (F): n kasvu- käyrä on H1792 /pCR3.1 ja H1792 /PAPPAov solulinjat.

eritys PAPPA yli-ilmentynyt syöpäsoluissa edistää kasvaimen kasvua ksenograftimallissa, mutta ei in vitro solujen lisääntymisen

edelleen arvioida asema PAPPA ilmentymisen keuhkosyöpä kehittämiseen, H1299 ja H1792 keuhkosyövän solulinjat, jotka oli alhainen endogeenisen PAPPA ilmaisun, valittiin yli-ilmentyminen PAPPA. Sekä H1299 ja H1792-solut transfektoitiin stabiilisti PAPPA ekspressiovektori (H1299 /PAPPAov ja H1792 /PAPPAov) saavutetaan noin kaksi kertainen lisäys PAPPA proteiinin taso verrattuna niiden emovektori kontrollisoluja (H1299 /pCR3.1 ja H1792 /pCR3.1) (Fig. 4A ja D). Tärkeää on, väliaine H1299 /PAPPAov solujen pystyi pilkkomaan IGFBP4 substraattiin IGF2 riippuvaisella tavalla, kun taas ei ole proteaasia aktiivisuutta havaittiin vanhempien vektorisäätö soluja, mikä viittaa siihen, että PAPPA voitiin erittää H1299 /PAPPAov soluissa ja oli funktionaalisesti aktiivinen ( kuva 4B). Saman määrityksen kunnossa, väliaine H1792 /PAPPAov solujen aiheutti vähän hajoamista IGFBP4 alustan, mikä viittaa puute PAPPA eritys H1792 /PAPPAov soluja (Kuva. 4E).

The effect of PAPPA yli-ilmentymisen solujen kasvua arvioitiin sitten sekä H1299 /PAPPAov ja H1792 /PAPPAov soluja. Ei merkittäviä muutoksia solujen kasvun havaittiin H1299 /PAPPAov soluja verrattuna niiden vanhempien vektorisäätö solu, jälleen luultavasti johtuu puutteellisesta mikroympäristön soluviljelmässä olosuhteissa kuin edellä on kuvattu (Fig. 4C). Mielenkiintoista on, että H1792 /PAPPAov solut osoittivat merkittävää vähenemistä solun kasvun verrattuna sen vektorisäädön solut (Fig. 4 F), mikä viittaa siihen, että nousu ei-salaisia, solunsisäinen PAPPA voi käyttää erillistä roolia syöpäsolujen kasvun.

Samanlainen PAPPA knockdown vuonna A549-soluja, vaikutus PAPPA yli-ilmentyminen arvioitiin ksenograftimallia. H1299 /PAPPAov solut, jotka yli-express ja salainen PAPPA, ja H1792 /PAPPAov solut, jotka yli-express PAPPA ilman PAPPA eritys oli ihonalaisesti immuuni-puutosta NOD /SCID tai

nu /nu

atymisiin female hiirille . Kuten on esitetty kuviossa 5, kasvaimet syntyvät PAPPA yli-ilmentyminen solulinja H1299 /PAPPAov kasvoi paljon nopeammin kuin vektori ohjauslinjan (Fig. 5A ja B). Kaksikymmentäseitsemän päivää inokulaation jälkeen, keskimääräinen märkäpaino H1299 /PAPPAov kasvaimissa oli 630 mg kun taas H1299 valvonta oli 84 mg (Fig. 5C). Seerumin taso PAPPA kasvaimen kantavien hiirten lopussa kokeen mitattiin sekä H1299 /PAPPAov ryhmä ja vastaavan kontrolliryhmän. PAPPA seerumin taso oli merkittävästi koholla H1299 /PAPPAov ryhmä (Fig. 5D). Toisin kuin H1299 /PAPPAov soluja, ksenograftikasvaimissa mistä H1792 /PAPPAov solut kasvoivat paljon hitaammin kuin vektorisäätö linjan (Kuva. 5E ja F). Kuusikymmentä päivää inokulaation jälkeen, keskimääräinen märkäpaino H1792 /PAPPAov kasvain oli 112 mg, huomattavasti vähemmän kuin 644 mg kasvaimen painoa peräisin H1792 /pCR3.1 kontrollisoluja (Fig. 5G). Tulokset PAPPA yli-ilmentyminen ja alas sääntelyn keuhkosyövän solulinjat yhteenveto taulukossa 1. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että eritetty muoto PAPPA on kriittinen sen kasvaimen edistämisen aktiviteetti

in vivo

.

(A) Kuva kasvaimen koon H1299 soluista ajankohtana leikkelyn. (B): n kasvu- käyrä on ksenograftin kasvaimen. H1299 /pCR3.1 ja H1299 /PAPPAov solua injektoitiin ihonalaisesti 4 viikkoa vanhoja NOD /SCID naisilla. (C) Wet kasvaimen painon ajankohtana leikkelyn. (D) PAPPA seerumin kasvaimen kantavien hiirten määritettiin ELISA: lla lopussa kokeissa. (E) Kuva kasvaimen koon H1792-solujen aikaan leikkelyn. (F) Kasvu käyrä ksenograftin kasvaimen. H1792 /pCR3.1 ja H1792 /PAPPAov solua injektoitiin ihonalaisesti 4 viikkoa vanhoja

nu /nu

kateenkorvattomissa hiirissä. (G) Wet kasvaimen painon ajankohtana leikkelyn. Kasvainten koot mitattiin ja laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset ilmaistiin kasvaimen keskimääräinen tilavuus (mm

3) ± SD (n = 5). *:

p

0,05; **:

p

0,01 (opiskelija

t

testi).

tehostaminen AKT signaalitransduktion lisääntyneeseen kasvaimen kasvua PAPPA

Lisääntynyt kasvaimen kasvu PAPPA erittävä solulinjoissa voisi johtaa parannetun IGF signalointi aiheuttaman hajoamisen IGFBP4 ja lisää siten hyötyosuutta IGF: t. Tämän hypoteesin testaamiseksi, kasvaimen leviämisen ja apoptoosin tutkittiin käyttäen histoni H3 kuin mitoosi merkki ja TUNEL määritys apoptoosin. Huomattavasti enemmän mitoosi soluja, havaittiin kasvaimen kudoksissa H1299 /PAPPAov soluja kuin niillä, H1299 /pCR3.1 valvontaa. Kuten apoptoosin, vähemmän TUNEL-positiivisia soluja havaittiin kasvainten H1299 /PAPPAov soluja kuin niillä, H1299 /pCR3.1 valvontaa (Fig. 6). Esitetään mahdolliset signaalintransduktioreitteihin pääasiassa vastuussa kasvaimen kasvun edistämiseksi, tilan fosfori-Akt ja fosfori-P43 /44 MAPK-kinaasin tutkittiin. Kuten kuviossa 7 on esitetty, merkittävästi suurempi määrä fosfo-Akt positiivisia soluja havaittiin kasvaimen osastoja H1299 /PAPPAov soluja kuin kasvainten H1299 /pCR3.1 kontrollisoluihin. Tämä tulos varmistettiin lisäksi Western blot -analyysillä käyttäen proteiinia suoraan uutetaan kasvainkudoksista näiden kahden ryhmän. Fosforin määrä-Akt lisääntyi merkitsevästi uutteissa H1299 /PAPPAov kasvainnäytteestä kuin niillä, H1299 /pCR3.1 ohjaus soluja. Huomattavaa eroa ei havaittu fosfo-p42 /44 MAPK tila välillä H1299 /PAPPA ja heidän kollegansa.

A, C ja E: ksenograftikasvaimissa alkaen H1299 /pCR3.1 soluja; B, D ja F: ksenograftikasvaimissa alkaen H1299 /PAPPAov.

Vasen paneeli: immuunivärjäytyminen fosfori-Akt (A ja B) ja fosfori-p42 /44 MAPK (C ja D) kasvainkudoksen alkaen H1299 /pCR3.1-soluja (A ja C) ja H1299 /PAPPAov soluja (B ja D). Oikea paneeli: western blot määrällinen proteiinien liittyvän IGF signaalinvälitysreitin: P-Akt ja P-p42 /44 MAPK proteiiniextraktien kasvain kudoksista. P-: fosfori-proteiini.

Keskustelu

Tuloksemme osoittavat, että ilmentyminen PAPPA keuhkosyövässä solulinjoissa vaihtelee suuresti. Solunsisäinen taso PAPPA proteiini näyttää suurempi kuolemattomaksi normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelin yleensä kuin useimmat keuhkosyövän soluja tutkittiin, mikä näkyy sopusoinnussa raportissa että PAPPA kromosomilokuksen liittyy tiheä Heterotsygotian menetys ovarioiden [25 ]. Yli-ilmentyminen PAPPA kahdessa eri keuhko- syöpäsoluja, H1299 ja H1792 samoilla proteiini tasolla, johti kuitenkin erilaisiin tuloksiin. Yli-ilmentyminen PAPPA vuonna H1299 ei selvää vaikutusta solujen kasvuun

in vitro

mutta lisää merkittävästi kasvaimen kasvua

in vivo

kuin ksenograftimallia. Sitä vastoin yli-ilmentyminen PAPPA in H1792 aiheuttama merkittävä vähentäminen solujen kasvun sekä

in vitro

ja

in vivo

kuin ksenograftimallissa. Tarkastamalla molemmat yli-ilmentyminen solulinjoissa huomasimme, että H1299 salaisuuksia toiminnallinen PAPPA kunnostetussa alustassa taas H1792 ei. Vaikka H1299 ja H1792 saattaa olla erilainen geneettinen meikki, joka voi tehdä niistä riippuvaisia ​​eri signalointi transduktioreittejä kasvua, näyttää siltä, ​​että toiminta PAPPA edistämisessä kasvaimen kasvua on sidottu kyky solujen salaisen toiminnallisen PAPPA. Yhdenmukainen roolin PAPPA erityksen kasvaimen kasvussa, PAPPA knockdown A549 johti huomattavaan vähenemiseen kasvaimen kasvua, kun soluja istutettiin immuuni-hiirillä. Molekyylimekanismin (t) taustalla estävä vaikutus solunsisäisten PAPPA kasvun ja H1792-solujen on määriteltävä.

PAPPA toimii IGFBP proteaasi valvoa paikallinen pitoisuus vapaan aktiivisen IGF: t käytettävissä niiden reseptoreihin IGFBP hajoaminen ja välillisesti parantaa IGF signalointireitille. Meidän

in vitro

ja

in vivo

Tulokset näkyvät yhdenmukaisia ​​tämän mallin.