Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Vaikka Sox2 ilme on havaittu useiden syöpätyyppien, se ei ole vielä käyttää tunnistamaan tai eristämään CSCS somaattisilla syöpä.

menetelmät

SiHa ja C33A-solut transfektoitiin stabiilisti plasmidilla, joka sisältää ihmisen Sox2 transkription tekijöitä ajo tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (EGFP) toimittaja oli lajiteltu osaksi Sox2-positiivisia ja Sox2-negatiiviset populaatiot FACS, ja Sox2 ilmaisun havaittiin western blot ja immunohistokemia. Erilaistumista, itseuudistumiseen ja kasvainten muodostumisen kykyjä, sekä ilmaus stemness ja EMT liittyvien geenien Sox2-positiivisten ja Sox2-negatiivinen kohdunkaulan syöpäsolut leimasi

in vitro

ja

in vivo

.

tulokset

pSox2 /EGFP järjestelmää käytetään erottamaan Sox2-positiivisten ja Sox2-negatiivisia soluja kohdunkaulan syövän solulinjoista, SiHa ja C33A soluja. Verrattuna Sox2-negatiivinen soluissa Sox2-positiivisten SiHa ja C33A solut osoittivat suurempaa kapasiteettia itseuudistumiseen, erilaistumiseen ja kasvainten muodostumiseen. Lisäksi Sox2-positiivisia SiHa ja C33A solut ilmensivät korkeampia tasoja stemness liittyviä geenejä, kuten Sox2 /BMI-1 /Oct4 /ALDH1 ja EMT liittyviä geenejä, kuten vimentiinistä /etana /β-kateniinin. Yhdessä kaikki nämä tulokset osoittivat, että solut, jotka ilmentävät endogeenista Sox2 ovat CSCS kohdunkaulan karsinoomat.

Johtopäätös

Tämä tutkimus on ensimmäinen vahvistaa toimiva yhteys endogeenisen Sox2 ilmaisun ja CSCS kohdunkaulan karsinoomat . Lisäksi tämä tutkimus osoitti, että on mahdollista kehittää väline eristää CSCS somaattisten kasvaimia perustuu ekspressiota endogeenisen tumaproteiini Sox2 sijaan solun pinnan markkereita.

Citation: Liu XF, Yang WT, Xu R, Liu JT, Zheng PS (2014) kohdunkaulan syöpäsolut Positive Sox2 Expression Näyttelytilat Properties of Cancer Stem Cells. PLoS ONE 9 (1): e87092. doi: 10,1371 /journal.pone.0087092

Editor: Eric Asselin, University of Quebec Trois-Rivieres, Kanada

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 18 joulukuu 2013; Julkaistu: 28 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat yleinen avustusta National Natural Science Foundation of China professori Peng Sheng Zheng (nro 30571951), erityinen tieteellinen Distinguished nuorten tutkijoiden Fund apuraha (nro 30725043). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä kantasolu (CSC) hypoteesi viittaa siihen, että kasvain massat voivat johtua yhdestä syöpäsolu kara kaltaisia ​​ominaisuuksia. Nämä CSCS ovat oletettuja on valmiuksia itseuudistumisen ja erilaistumista, ja ne voivat elvyttää kasvain massa ja kaikki kasvainsolutyypit löydetty. Kokeelliset todisteet tukevat oletusta valmistettiin ensin vuonna 1997 Dick ryhmä, joka osoitti, että ihmisen leukemia ohjaa pieni väestö Leukeemisten kantasolujen joka pystyy siirtämään taudin NOD /SCID-hiiriin [1]. Tämä käsite laajennettiin kiinteitä kasvaimia Clarke ja Wicha, jotka osoittivat, että ihmisen rintasyövän sisältää alapopulaation solujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia pintamerkkiaineita CD44

+ /CD24

– /lin

– [ ,,,0],2]. Sen jälkeen, CSCS on tunnistettu ja takautuvasti eristettiin erilaisia ​​maligniteetteja, mukaan lukien aivojen syövät [3], eturauhassyöpä [4], melanooma [5], multippeli myelooma [6], paksusuolen syöpä [7], [8], haiman syöpä [9] ja pään ja kaulan alueen syövät [10]. Kuitenkin, CSCS ei ole tunnistettu kohdunkaulan karsinoomat.

Useimmat syövän kantasoluja määritykset ovat tähän mennessä riippuu erilaisia ​​solun pinnan markkereita, mukaan lukien CD133, CD44, CD166, ja CD24. Käyttämällä näitä pintamarkkerit, CSCS alkaen primäärikasvain kudoksista voidaan rikastaa käyttäen FACS teknologiaa, ja niiden leviämistä voidaan testata immuunipuutteisilla hiirillä. Kuitenkin, pinta-markkereita voidaan käyttää eristämään yleisin CSCS, ja nämä merkit ovat usein epästabiileja monissa somaattisissa syövissä [11]. CSCS rikastetaan primääriviljelmistä perustuu serial ksenografti passage

in vivo

on raportoitu sisältävän epäjohdonmukainen subpopulaatio eristyksen jälkeen käyttämällä pintamerkkiaineita CD133 ja CD44 [12]. Lisäksi, tulokset, jotka saatiin CSCS eristettiin käyttämällä samaa pintamerkkiaine eivät ole johdonmukaisia ​​laboratorioissa. Näin ollen on yhä tarpeen etsiä sytoplasmista tai ydin- päättäjät, joita voidaan käyttää eristämiseen CSCS [13].

Aikaisemmassa tutkimuksessa olemme tunnistaneet ilmentymisen alkion kantasoluilla-specific transkriptiotekijä Sox2 perus kohdunkaulan syövän kudoksissa ja tumorspheres muodostama ensisijainen kohdunkaulan syöpä soluja, ja huomasimme, että Sox2 toimii onkogeenin kohdunkaulan syövän synnyn edistämällä solujen kasvuun ja kasvainten muodostumiseen [14], [15]. Tuloksemme viittaavat siihen, että Sox2 voi olla mahdollinen merkki kohdunkaulan CSCS. Lisäksi Sox2 ohjaa pluripotenttisuus, itseuudistumisen ja leviämisen alkion kantasoluja. On osoitettu, että hiiren ja ihmisen alkion kantasolujen ja hermoston kantasoluja on korkea Sox2 aktiivisuus [16], [17], [18], ja lisääntynyt Sox2 ilme on löydetty myös rinta- ja glioblastooma CSC populaatiot [19], [ ,,,0],20]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Sox2 on ehdokas ydin- merkkiaine CSCS.

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme stabiilisti transfektoitu kaksi kohdunkaulan syövän solulinjat, SiHa ja C33A, jossa on plasmidi, joka sisältää ihmisen Sox2 transkription elementtejä ajo EGFP ilme. Olemme osoittaneet, että Sox2-positiivisten kohdunkaulan syöpäsolut jakoi kaikki ominaisuudet CSCS.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjoissa SiHa-, HeLa, C33A, ja CaSki ostettiin kaikki American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). SiHa-, HeLa, ja C33A-solut ylläpidettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM, Sigma-Aldrich, St Louis, MO), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA). CaSki-soluja viljeltiin McCoyn 5A-alustassa (Sigma-Aldrich), jossa oli 10% FBS: ää.

rakentaminen pSox2 /EGFP

~11.5 kb ihmisen Sox2-promoottori monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR ) alkaen SiHa genomisesta DNA: sta seuraavilla alukkeilla: eteenpäin, 5′-gctagcgaccacatctggctgcttgtatatttaac-’3 ja taaksepäin, 5’-catgcggggcgctgtgcgcg-’3. Lisäksi 3′-alueen (3’-UTR), poly (A) häntä, ja 3 ’tehostaja Sox2 myös monistetaan PCR: llä seuraavilla alukkeilla: eteenpäin, 5’-tgagggccggacagcgaac-’3 ja taaksepäin, 5’ gtcgacatgagaggtgagtgcagtgcaattac-’3. Vektori kiinnostavan sekvenssin, mukaan lukien riippumaton SV40-promoottori-driven neomysiiniresistenssin kasetti, ja EGFP-sekvenssin myös monistettiin pIRES2-EGFP-vektoriin (Invitrogen). Sen jälkeen nämä fragmentit kloonattiin TOPO-vektorit (Invitrogen), ja tarkkuus DNA-sekvenssi varmistettiin sekvensoimalla. Oikea ihmisen Sox2 promoottori, UTR /tehostajana, EGFP, ja vektori sittemmin kloonattiin käyttämällä In-Fusion PCR Kloonaus Kit, ja tuloksena vektori nimettiin phSox2 /EGFP (Takara Bio Inc., Dalian, Kiina).

Immunohistokemia ja Immunosytokemia

Immunohistokemia suoritettiin 4-um: n osat parafiiniin upotetut kudokset. Kasvainkudossektioista peräkkäin parafiini ja rehydratoitiin ennen hoitoa edeltävälle 10 mM natriumsitraattia antigeenin haku-puskuria (pH 6,0), joka höyrynpaine liesi. Käsittelyn jälkeen 3% H

2O

2, seuraavilla vasta-aineilla inkuboitiin osien yön yli 4 ° C: anti-Sox2 (1:100), anti-Ki67 (1:500), anti-ALDH1 (BD Biosciences, 1:50), anti-Bmi1 (1:100), anti-Oct4 (1:100), anti-Nanog (1:100), anti-Ki67 (1:80), anti-vimentiinistä (1 :200), anti-etana (1:150), anti-β-kateniinin (1:250), ja anti-E-kadheriini (1:200). Kaikki vasta-aineet saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) ellei toisin mainita. Kudos Leikkeitä inkuboitiin sitten biotinyloidun immunoglobuliini G (IgG) 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin streptavidiini-peroksidaasi-kompleksi 30 minuuttia, ja immunovärjäys suoritettiin käyttäen 0,05% 3′-diaminobentsidiini seurasi counterstaining hematoksyliinillä. Sera ei-immunisoiduista vuohista tai hiiriä käytettiin negatiivisina kontrolleina.

Lisäksi, soluja viljeltiin lasipeitinlevyille 48 tunnin ajan, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 minuutin ajan, ja läpäiseviksi 0,3% Triton X-100 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Ilmentymisen tasoja eri proteiinien näissä soluissa määritettiin immunosytokemialla kuten edellä on kuvattu.

TUNEL-määritys

Parafiini-upotetun kudoksen kalvot valmistettiin ksenograftikasvaimissa. TUNEL värjäys havaittiin TUNEL iinianalyysikitissä (Roche) mukaan valmistajan ohjeiden. Apoptoottiset tumat analysoitiin laskemalla kokonaismäärä TUNEL-positiivisia ytimet, lukuun ottamatta läpikäyvien solujen mitoosin 10 satunnaisessa aloilla.

Western-blottaus

Solulysaatit eroteltiin 10% natriumdodekyylisulfaattia (SDS ) polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF). Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, seuraavia vasta-aineita käytettiin Western blotting: anti-Sox2 (1:500), anti-ALDH1 (BD Biosciences, 1:500), anti-Bmi1 (1 :500), anti-Oct4 (1:500), anti-Nanog (1:500), anti-vimentiinistä (1:500), anti-etana (1:500), anti-β-kateniinin (1:500) , anti-E-kadheriini (1:500), ja anti-β-aktiini (1:1000) yön yli 4 ° C: ssa. Kaikki vasta-aineet saatiin Santa Cruz Biotechnology, ellei toisin mainita. Pesun jälkeen sitoutuneet vasta-aineet visualisoitiin käyttäen piparjuuriperoksidaasikonjugoitua anti-vuohi, ant-kani tai anti-hiiri-IgG (Thermo Fisher Scientific Inc., New York, NY) ja Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA) ja sen jälkeen visualisoidaan röntgenfilmit [21].

virtaussytometria ja erottaminen EGFP

+ ja EGFP

– populaatiot FACS

Kohdunkaulan syöpä solulinjoja viljeltiin 48 tunnin kuluttua transfektiosta pSox2 /EGFP. Solut hajotettiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään, jota oli täydennetty 2% FBS: ää, ja prosenttiosuus EGFP

+ soluihin määritettiin käyttäen FACSCalibur-virtaussytometriä (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Solusyklianalyysiä suoritettiin käyttäen FACS mukaan valmistajan protokollaa. Solut kerättiin ja kiinnitettiin 70% etanolilla yön yli 4 ° C: ssa. Kolmekymmentä minuuttia ennen FACS-analyysiä varten solut käsiteltiin RNaasiA ja sen jälkeen värjättiin propidiumjodidilla (PI, Sigma-Aldrich). Solusyklin jakelu analysoitiin FACSCalibur virtaussytometrillä käyttäen Mod-Fit LT ohjelmisto.

saamiseksi EGFP

+ ja EGFP

– populaatiot, SiHa ja C33A-solut transfektoitiin pSox2 /EGFP plasmidista käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Valinta suoritettiin käyttäen standardia viljelyalustaa 1 mg /ml G418: aa. Sukupolven yhden solun johdettu viljelmistä suoritettiin käyttäen FACSAria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Lajittelutestissä portit perustettiin ylin ja alin 10% EGFP-ilmentävien solujen. Soluja viljeltiin DMEM /F12: 1x B-27 seerumitonta lisä (Invitrogen), 20 ng /ml epidermaalinen kasvutekijä [22], ja emäksinen fibroblastikasvutekijä (PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ).

Tumorsphere muodostumisen määritys

lajitellut solut pidettiin kantasolujen media, joka koostuu DMEM /F12 pohjapinta media, N2 ja B27 täydentää (Invitrogen), 20 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF) ja 20 ng /ml perus-fibroblastinen kasvutekijä (bFGF; PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ).

tumorsphere muodostumista määrityksessä, solut maljattiin tiheydellä 200 solua /kuoppa 24-kuoppaisille ultra -matala kiinnityslevyt tai tiheyteen 1 solu /kuoppa 96-kuoppaisille levyille ja niitä ylläpidetään kantasolujen media. Tumorspheres joka syntyi 2 viikon kirjattiin. Serial tumorsphere muodostumisen määritykset, palloja kerättiin, eritellyt 0,25% trypsiini /EDTA, suodatetaan 40 um mesh ja uudelleen pinnoitettu edellä kuvatulla tavalla.

Reaaliaikainen PCR

Yhteensä RNA uutettiin alin ja ylin 10% EGFP-ilmentävien solujen kanssa TRIzol reagenssia (Invitrogen). RNA-pitoisuus määritettiin, ja yhteensä cDNA: ta käytettiin templaattina PCR-monistuksessa. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin kolminkertaisesti kullekin alukesarjan käyttäen iQ5 monivärinen Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA). Protokolla reaaliaikainen PCR-oli 1 sykli 95 ° C 30 sekuntia, jota seuraa 40 sykliä 95 ° C 5 sekuntia ja 60 ° C: ssa 30 sekuntia myöhemmin dissosiaatio vaiheessa. Syklin kynnysarvo määritettiin piste, jossa fluoresenssi ylitti asetetun raja määräytyy instrumentin ohjelmisto.

-tuumoriksenografti Pitoisuus

Kuuden viikon ikäiset naaras NOD /SCID-hiiriä käytettiin arvioida kantasolujen ominaisuudet

in vivo

. Solut injektoitiin ihonalaisessa on dorsum seoksella 01:01 Matrigel. Kasvaimen tilavuus (V) määritettiin pituus (a) ja leveys (b) V = ab

2/2. Kokeelliset protokollat ​​arvioitiin ja hyväksyttiin Animal Care ja käyttö komitea Medical School of Xi’an Jiaotong yliopisto.

Cell Growth ja Cell Elinkykymääritykset

Solut (2 x 10

4) viljeltiin kolmena rinnakkaisena 35-mm: n viljelymaljoissa ja 7 päivää. Solut kerättiin pituussuunnassa ja laskettiin käyttäen hemosytometria ja valomikroskoopilla. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsoli-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT, Sigma-Aldrich), väriaine mukaan protokollaa. Useita elävien solujen määritettiin mittaamalla absorbanssi 490 nm: ssä.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 16.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL). Kaksi-tailed Khin neliö testiä käytettiin määrittämään merkitystä eroja kovariantteja. Studentin t-testiä käytettiin sen määrittämiseksi, tilastollisen merkittävyyden, kun kaksi ryhmää verrattiin. Tutkia suhdetta kahden määrällisten muuttujien, Pearsonin lineaarinen regressioanalyysi suoritettiin. Kaikissa testeissä, p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Kehittäminen EGFP ilmentävien Plasmidi Driven by Human Sox2 Transkription Elements

eristämiseksi selvä endogeeninen Sox2 ilmentävää alaryhmässä ja onko se on ominaisuuksiltaan CSCS rakensimme plasmidin pSox2 /EGFP, joka sisältää 11,5 kb ihmisen Sox2 promoottorisekvenssi ylävirtaan EGFP reportteri. Tämä plasmidi sisältää myös ihmisen Sox2 3′-UTR, 3 ’poly (A) häntä, ja 3’ tehostaja on sijoitettu alavirtaan EGFP reportteri. Lisäksi itsenäinen SV40-promoottori-, jota ohjaa neomysiini resistenssi kasettia on käytetty, jotta positiivisen valinnan solujen saanut plasmidin riippumatta niiden kyvystä aktivoida Sox2-promoottori (Fig. 1).

Kaaviokuva pSox2 /EGFP toimittaja järjestelmässä. HSox2 promoottori ja transkription tekijöitä, mukaan lukien 3′-UTR, poly (A) häntä, ja 3 ’edistäjän kloonattiin pEGFP vektoriin.

Sorting Living Endogeeninen Sox2-ilmentävien kohdunkaulan syövän solujen käyttäminen pSox2 /EGFP System

Sox2 ilmentymistä tunnettu ihmisen neljän kohdunkaulan syövän solulinjoista (HeLa, SiHa-, CaSki-, ja C33A) käyttäen pSox /EGFP järjestelmä sekä western blot ja immunosolukemiallisten analyysi (Fig. 2A). Sox2 näkyi tumavärjäystä immunokemialla yhden tai ryhmittyneet SiHa ja C33A soluja (Fig. 2B). Kuitenkin, Sox2 ei ollut havaittavissa HeLa tai CaSki solujen Western blot tai immunokemiallinen analyysi (Fig. 2A ja 2B). Kun pSox2 /EGFP transfektoitiin väliaikaisesti ihmisen neljän kohdunkaulan syövän solulinjat, 6,31% ja 4,10% EGFP-positiiviset solut olivat havaittavissa FACS transfektoiduissa SiHa ja C33A-solut, vastaavasti (Fig. 2C). Kuitenkin vain 0,84% ja 0,69% EGFP-positiivisten solujen olivat havaittavissa transfektoiduissa HeLa ja CaSki soluja, tässä järjestyksessä (Kuva. 2C). EGFP-positiivisten solujen käsittää alle 0,2% kustakin transfektoimattomissa kontrolli kohdunkaulan syövän solulinja (Fig. 2C), mikä tarkoittaa, että useimmat EGFP-positiivisten solujen pSox2 /EGFP-transfektoitujen kohdunkaulan syövän soluja endogeenisen Sox-ilmentäviä soluja. Kaiken kaikkiaan tulokset saatiin käyttämällä pSox2 /EGFP-järjestelmä olivat yhdenmukaisia ​​Sox2 ilmaisun tulokset Western blot ja immunosytokemialliset analyysin kaikki neljä kohdunkaulan syövän solulinjat. Nämä tulokset viittaavat siihen, että pSox2 /EGFP-plasmidi-järjestelmä soveltuu eristämiseksi endogeenisen Sox2-ilmentävien kohdunkaulan syövän soluja. Lisäksi, koska enemmän SiHa ja C33A solujen endogeenisesti ilmaisi Sox2 verrattuna HeLa ja CaSki solujen SiHa ja C33A solulinjat valittiin arvioida endogeenisen Sox2 ilmentäviä soluja ovat CSCS kohdunkaulan karsinoomat.

Sox2 -proteiiniekspressio havaitaan western blot (A) ja immunohistokemia (B) kohdunkaulan syövän solulinjoista HeLa, SiHa-, CaSki-, ja C33A. (C) runsaus EGFP-positiivisia kasvainsoluja kohdunkaulan syövän solulinjoissa transfektoitu pSox2 /EGFP toimittaja. (D) immunohistokemiallinen analyysi EGFP

+ ja EGFP

– soluja. (E) Sox2 proteiinin ilmentymistä Yksikerroksisena tumorsphere soluja, ja lajitellaan EGFP

+ ja EGFP

– soluja.

Jos haluat saada elävä Sox2 ilmentäviä soluja, SiHa ja C33A soluja transfektoitu pSox2 /EGFP plasmidista. Valinnan jälkeen viljelmässä 1000 ug /ml G418: aa kaksi viikkoa, kaikki G418-resistentit solut kerättiin ja lajiteltiin käyttäen FACSAria I; solut, jotka putosi 10

th ja 90

th persentiilit EGFP ilmaisun lajiteltiin ja kerättiin kahteen erilliseen putkiin. Ensimmäisen putken, joka sisälsi solut, joilla on korkein EGFP ilmaisua, havaittiin sisältävän enemmän kuin 90% kaikista EGFP-ilmentävien solujen ja sen kutsutaan EGFP-positiivisia väestöstä. Toinen putki, joka sisälsi solut alin 10% EGFP ilmaisun, sisälsi vain EGFP-ei-ilmentävien solujen ja sen kutsutaan EGFP-negatiivinen väestöstä (Fig. 2D). Lisäksi western blot ja immunosolukemiallisten analyysi paljasti, että vain EGFP

+ SiHa ja EGFP

+ C33A solut ilmensivät Sox2 proteiini; EGFP

– SiHa ja EGFP

– C33A solut eivät sisältäneet havaittavissa Sox2 proteiinia (kuvio. 2E). Nämä tulokset osoittavat, että pSox2 /EGFP järjestelmää voidaan käyttää menestyksellisesti lajitella eläviä soluja, jotka ilmentävät endogeenisesti Sox2 kohdunkaulan syövän solulinjoista.

EGFP-positiiviset solut on suurempi kapasiteetti tuumoreita kuin EGFP-negatiiviset solut

Yksi tärkeimmistä ominaisuuksista CSCS on niiden voimakas kyky muodostaa kasvaimia. Testata kasvaimen muodostumisen kyky EGFP + kohdunkaulan syövän soluja, EGFP-positiivisia ja EGFP- solupopulaatioiden lajitellaan sekä SiHa ja C33A solulinjoja ihon alle ruiskutettiin NOD /SCID-hiiriin. Kun 10

5 inokuloitiin NOD /SCID-hiiriin, sekä EGFP + ja EGFP- populaatioiden SiHa ja C33A solut muodostivat kasvaimia. Kuitenkin kasvaimia muodostama SiHa-EGFP

+ solut kasvoivat paljon nopeammin (Fig. 3A) ja olivat paljon suuremmat (Fig. 3B ja 3C) kuin muodostaman SiHa-EGFP

– soluja (kuva. 3A, B, ja C; p 0,05). Samoin C33A-EGFP

+ solut muodostivat kasvaimia, jotka kasvoivat paljon nopeammin ja olivat paljon suurempia kuin ne, muodostetaan C33A-EGFP

– soluissa (kuvio. 3D, E ja F; p 0,05). Kasvaimen muodostumisen funktiona siirrostamalla eri laimennoksia EGFP

+ ja EGFP

– SiHa ja C33A-solut on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. kasvain-aloitetaan taajuus SiHa-EGFP

+ -soluja oli 1/402 , joka oli 17,7 kertaa korkeampi kuin SiHa-EGFP

– soluja (1/7114; p 0,001). Kasvain-aloitetaan taajuus C33A-EGFP

+ soluja oli 1/3058, joka oli 23,8 kertaa korkeampi kuin C33A-EFGP

– soluja (1/72860; p 0,001), mikä viittaa siihen, että EGFP-positiivisia SiHa ja C33A väestö sisälsi enemmän CSCS kuin EGFP-negatiivinen populaatio. Lisäksi apoptoosin /lisääntymiseen solun nopeus arvioitiin vierassiirrekokeissa (TUNEL /Ki67 värjäys) sulkea pois mahdollisuutta, että laski kasvaimen kasvua EGFP- solujen johtuu vähemmän solujen elinkykyä, TUNEL ja Ki67 värjäyksen tulokset Ksenograftikudoksista by SiHa ja C33A solujen kuviossa 3G ja koottu kuvioon. 3H. Ei ole mitään eroja TUNEL ja Ki67 positiivisten solujen korko Ksenograftikudoksista muodostettu Sox2-positiiviset ja negatiiviset SiHa ja C33A soluja, mikä viittaa väheni kasvaimen kasvua EGFP- solu ei johtunut vähemmän solujen elinkykyä. Yhdessä kaikki nämä tulokset osoittavat, että endogeeninen Sox2-ilmentävien kohdunkaulan syöpäsolut ovat merkittävästi parannettu kasvaimen muodostumisen mahdollisuuden, koska EGFP + SiHa ja C33A-solut sisälsivät enemmän CSCS kuin EGFP- soluja.

Kasvaimen kasvu käyrät (A) ja kasvaimen painot (B, C) NOD /SCID ympätty SiHa-EGFP

+ ja SiHa-EGFP

– soluja (1 x 10

5 solua). Kasvaimen kasvukäyrät (D) ja kasvaimen painot (E, F) NOD /SCID ympätty C33A-EGFP

+ ja C33A-EGFP

– soluja (1 x 10

5 solua). Apoptoosi /lisääntymiseen solun nopeus arvioitiin Tunel määrityksiä ja Ki67 värjäytymistä vierassiirrekokeissa (G ja H) EGFP + ja EGFP- soluja. Bars = SE. *, P 0,05. ns, p 0,05.

EGFP-positiivisia soluilla suurempi kapasiteetti Self-uudistamiseen ja Differentiation kuin EGFP-negatiiviset solut

lisäksi kasvaimen muodostumisen kyky, CSCS jakaa kaksi kriittistä ominaisuuksia kantasolujen: itseuudistumisen ja erilaistumista. Tumorsphere muodostuminen määrityksessä on tunnustettu klassinen määritys itseuudistumisen. EGFP-positiivisia ja EGFP-negatiivinen SiHa ja C33A kohdunkaulan syövän soluja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa olosuhteissa, jotka olivat optimaalisia kasvaa tumorspheres. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, EGFP-positiiviset solut eristetään SiHa ja C33A solulinjojen tuottamat klassisen tumorspheres, kun taas EGFP-negatiiviset solut muodostivat joitakin soluaggregaatteja, mutta ei muodosta tumorspheres. Poissulkemiseksi vaikutuksia solujen aggregaatiota, joka voi tapahtua alhaisen tiheyden viljelmiä, soluja viljeltiin tiheytenä 1 solu /kuoppa sen jälkeen, kun yhden solun lajittelu FACS testata niiden kyky tumorsphere muodostumista 96-kuoppaisilla levyillä. Noin 6% EGFP-positiivisia SiHa solut muodostivat tumorspheres, joka oli huomattavasti korkeampi kuin prosenttiosuus EGFP-negatiivisten SiHa-soluja, jotka on muodostettu tumorspheres (noin 1,6% tumorsphere muodostumista; p 0,05). Vastaavasti, lisää EGFP-positiivisia C33A-solut muodostivat tumorspheres (noin 12%) verrattuna EGFP-negatiivinen C33A-soluja (noin 3%) (Fig. 4B; p 0,05). Lisäksi sekä EGFP-positiivisia SiHa ja C33A-solut pystyivät muodostamaan tumorspheres kolmessa peräkkäisessä kohdissa tumorsphere kulttuureissa, ja nämä solut muodostivat paljon enemmän tumorspheres kuin EGFP-negatiiviset solut kutakin viljelmää passage (Fig. 4C; p 0,05). Lisäksi apoptoosin /lisääntymiseen solun nopeus arvioitiin tumorsphere (TUNEL /Ki67 värjäys) sulkea pois mahdollisuutta, että laski kasvaimen kasvua EGFP- solujen johtuu vähemmän solujen elinkykyä. TUNEL ja Ki67 värjäyksen tulokset tumorspheres mukaan SiHa ja C33A solujen kuvassa 4D ja koottu kuvioon. 4E, jossa ei ole mitään eroja TUNEL ja Ki67 positiivinen solu verokannan tumorspheres välillä Sox2-positiiviset ja negatiiviset SiHa ja C33A soluja, mikä viittaa siihen, että vähentynyt tumorsphere muodostumista kapasiteettia EGFP- soluja ei ollut johtuen vähemmän solujen elävyyden . Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että endogeeniset Sox2 ilmentäviä SiHa ja C33A solut mahdollisesti sisältävät enemmän soluja, jotka ovat itseuudistumisen kyky.

(A, B) Tumorsphere muodostumisen määritys valokuvia ja määrä tumorspheres muodostaman SiHa ja C33A solujen alhaisen tiheyden viljelmiä. (C) Tumorsphere muodostuminen määrityksessä EGFP

+ solujen aikana -jaettuja kulttuuri seuraavat yksisoluiset lajittelu FACS. Apoptoosi /lisääntymiseen solun nopeus arvioitiin Tunel määrityksiä ja Ki67 värjäytymistä vierassiirrekokeissa (D ja E) EGFP + ja EGFP- soluja. Bars = SE. *, P 0,05. ns, p 0,05.

Jotta tunnistamiseksi itseuudistumisen kyky

in vivo

, sarja- elinsiirrot määritys suoritettiin 10

2 Sox2 positiivisen ja negatiivinen SiHa ja C33A soluja, tässä järjestyksessä. Sox2-positiivisten SiHa ja C33A solut voisivat muodostaa kasvaimia sarja kolmen kanavan elinsiirtojen kokeiluja. Kuitenkin 10

2 Sox2 negatiivisia soluja ei muodosta mitään kasvain ensimmäisen elinsiirron kokeilu. Siksi Sox2 positiivinen SiHa ja C33A solut ovat enemmän itseuudistumisen kyky kuin negatiiviset solut

in vivo

. Lisäksi Sox2 proteiini havaittiin immunohistokemiallisella värjäyksellä -tuumoriksenografti kudoksissa muodostuvat EGFP-positiivisten ja EGFP-negatiivisten SiHa ja C33A soluja (kuvio 5A). Sekä Sox2-positiivisia ja Sox2-negatiiviset solut löydettiin tuumoriksenografteja muodostettu EGFP-positiivisia soluja. Kuitenkin vain Sox2-negatiivisia soluja voitiin havaita kasvaimen kudokset muodostetaan Sox2-negatiivinen kohdunkaulan syövän soluja. Nämä tulokset edelleen tukevat että Sox2-positiivisten SiHa ja C33A soluja ei vain ole itseuudistumisen kyky toistaa Sox2-positiivisia soluja, vaan myös erilaistumista kyky tuottaa Sox2-negatiiviset solut

in vivo

.

(A) Sox2 ilmentymistä havaittiin IHC vuonna Ksenograftikudoksista muodostama SiHa-EGFP +, SiHa-EGFP-, C33A-EGFP + ja C33A-EGFP- soluissa. (B) prosenttiosuudet EGFP + solujen ensimmäinen, toinen ja kolmas kanava erilaistumisen elatusaineessa. Bars = SE. *, P 0,05.

Kun EGFP-positiivisia SiHa ja C33A-soluja viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää, prosenttiosuus EGFP-positiivisia SiHa-soluissa laski 95,78% ensimmäisellä siirtymistä 77,16% toisella passage ja 34,82% kolmannella passage. Samoin prosenttiosuus EGFP-positiivisten C33A solujen laski 90,32% ensimmäisellä kulku 44.56% ja 12.01% toisella ja kolmannella kohtia erilaistumiseen media, vastaavasti (kuvio. 5B). Lisäksi EGFP-negatiivinen SiHa ja C33A solut voivat ainoastaan ​​tuottaa EGFP-negatiiviset solut ja ei tuota EGFP-positiivisia soluja (kuvio. 5B). Nämä tulokset osoittavat, että vain endogeenisen Sox2 ilmentäviä kohdunkaulan syöpäsolut ovat erilaistumista kyky in vitro.

EGFP-positiivisten kohdunkaulan syövän solut ilmentävät Lisää Stem Cell liittyvät proteiinit kuin EGFP-negatiiviset solut

Sox2, Oct4, Bmi1, ja Nanog kirjataan kantasoluja itseuudistumisen liittyvät ydinvoiman transkriptiotekijöiden. Vertasimme ilmentymistä näiden transkriptiotekijöiden EGFP-positiivisten solujen, EGFP-negatiivisia soluja, ja tuumoriksenograftien. Kuten kuviossa 6 on esitetty, reaaliaikainen PCR (Fig. 6A), western blot-analyysi (Fig. 6B ja C), ja immunohistokemiallinen analyysi (Fig. 6D) paljasti, että EGFP-positiiviset SiHa-soluissa ja kasvaimia näiden solujen muodostamat ilmaistuna korkeammat tasot Bmi1, Oct4, ja Sox2 proteiineja kuin EGFP-negatiivinen SiHa-soluissa sekä transkriptionaalisella tasolla (Fig. 6A) ja translaation tasolla (Fig. 6B, C ja D). Kuitenkin Nanog proteiinin ilmentyminen oli ennallaan.

(A) Differential ilmentyminen useiden kantasolun liittyvien geenien SiHa-EGFP

+ ja SiHa-EGFP

– jakeet validoitu qPCR. (B) havaitseminen kantasolun liittyviä tekijöitä lajiteltu SiHa-EGFP

+ ja SiHa-EGFP

– solujen Western blot. (C) Semi-kvantitatiivinen analyysi kantasolujen liittyviä tekijöitä suhteessa P-aktiini. (D) Kantasolujen liittyviä geeniekspression tuumoriksenografteja havaittiin immunohistokemiallisesti. ALDH1 havaittiin immunohistokemiallinen (E), western blot (F), ja puolikvantitatiivinen analyysi (G) SiHa–EGFP

+ ja SiHa-EGFP

– kasvaimia. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus RT-PCR: ää ja western-blottauksella. Virhe pylväät edustavat S.D. (N = 3). * P 0,05.

Lisäksi viime vuosina yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että ALDH-positiivisten solujen edustavat CSCS monissa somaattisissa kasvaimissa [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa, immunokemiallinen värjäytymistä (kuvio. 6E, vasemmalla) ja western blot määritykset (Fig. 6F ja G) osoittivat, että EGFP-positiiviset solut ekspressoivat ALDH, kun taas EGFP-negatiiviset solut eivät. Immunohistokemiallinen analyysi paljasti myös, että kasvaimen kudokset muodostetaan EGFP-positiivisia SiHa-soluissa, ei niitä muodostuu EGFP-negatiivinen SiHa-soluja, värjättiin ALDH1 vasta-aineella (Fig. 6E, oikealla). Vuonna C33A soluissa, kantasolu liittyviä geenejä Bmi1, Oct4 ja Nanog havaittiin myös Western blot. Tulos osoitti, että C33A-EGFP + alaryhmän solut ilmensivät huomattavasti vahvempi kuin C33A-EGFP- soluja, odottaa Nanog, joka oli samanlainen kuin SiHa-soluja (kuvio S1, A ja B). Lisäksi, ALDH1 oli havaittavissa EGFP + soluissa, mutta ei EGFP- soluissa Western blot ja IHC (kuvio S1, A-C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että EGFP-positiivisten kohdunkaulan syövän solut ilmentävät myös joitakin kantasoluja liittyvät tekijät, kuten Oct4, Bmi1, ja ALDH1.

EGFP-positiivisten kohdunkaulan syövän solut Näytteillä Enemmän EMT ominaisuudet kuin EGFP- negatiivinen solut

EMT induktio on raportoitu tuottaa solujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia [24], ja CSCS jakaa joitakin ominaisuuksia solujen joille EMT [25], [26]. Täällä arvioi aseman EMT merkkiaineiden Sox2-positiivisten solujen, Sox2-negatiivisia soluja, ja kasvaimen kudokset muodostetaan näiden solujen (Fig. 7). SiHa–EGFP

+ solujen ja kasvaimen kudokset, real-time PCR osoitti, että mesenchyme proteiineja, kuten vimentiinin, etana, ja β-kateniinin oli merkittävästi voimistunut mRNA-tasolla (Fig. 7A). Vastaavasti, Western blot (kuvio. 7B), immunosytokemialliset (Fig. 7C), ja immunohistokemiallinen analyysit (Fig. 7D) osoittivat, että ne olivat myös voimistunut proteiinitasolla. Sitä vastoin E-kadheriinin, tunnettu epiteelin markkeri, säädeltiin vähentävästi in EGFP-positiivisia SiHa-soluja ja yliaktiivista EGFP-negatiivisissa soluissa, ja kasvainksenografteja (Fig. 7A-D). Olemme myös havainneet, että EMT liittyviä geenejä, vimentiinistä ja β-kateniinin, ilmaistiin korkeammalla tasolla EGFP-positiivisten C33A soluja kuin että EGFP-negatiivisten solujen Western blot ja immunosytokemiallista värjäystä. Epiteeli- markkeri E-kadheriinin oli havaittavissa C33A-EGFP- soluja, mutta ei C33A-EGFP + solut. Kuitenkin Snail-proteiini ei ollut ilmaistu sekä EGFP-positiivisia ja EGFP-negatiivisia soluja. (Kuva S2).