Krooninen sairaus

tiivistelmä

Calcyclin sitovan proteiinin (CacyBP /SIP), tunnistettiin sen perusteella, sen kyky olla vuorovaikutuksessa S100 proteiinien kalsiumista riippuvalla tavalla, aiemmin todettu estävän lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen mahalaukun syöpäsolujen laboratoriossamme. Tärkeää on, että vaikutukset S100 proteiinien biologisesta käyttäytymisestä CacyBP /SIP mahasyövän jää epäselväksi. Tässä me raportoimme rakentaminen eukaryoottiekspressiovektoreihin villityypin CacyBP /SIP ja katkaistu mutantti, josta puuttuu S100 proteiinia sitovan domeenin (CacyBP /SIPΔS100). Ilmaukset villityypin ja katkaistun rekombinanttiproteiinien osoitettiin transfektoimalla MKN45 mahalaukun syöpäsoluja. Co-immunopresipitaatiomäärityksiä osoittivat vuorovaikutusta S100A6 ja villin tyypin CacyBP /SIP sisään MKN45 soluissa. Poistaminen S100 proteiinin sitova alue vähentänyt dramaattisesti affiniteetti CacyBP /SIP S100 proteiineja kuten alennetun yhteistyössä immuunisaostuksessa S100A6 mukaan CacyBP /SIPΔS100. MTT-määritystä, FACS määritys, klonogeeniset määritys ja -tuumoriksenografti koe tehtiin arvioimaan vaikutuksen CacyBP /SIP solun kasvuun ja kasvaimen kehittymisen

in vitro

ja

in vivo

. Yliekspressio CacyBP /SIP inhiboivat ja kasvaimen kehittymisen sekä MKN45 mahalaukun syöpäsolujen; leviämisen ja kasvaimen kehittymisen hinnat olivat edelleen vähentää ilmentymistä CacyBP /SIPΔS100. Osoitimme myös, että S100 proteiinit säätelemään negatiivisesti CacyBP /SIP-estoa mahasyövän solujen lisääntymistä, vaikuttamalla β-kateniinin proteiinin ilmentymisen ja transkription aktivoituminen Tcf /LEF. Vaikka taustalla vaikutusmekanismi vaatii lisätutkimuksia, tämä tutkimus antaa uutta tietoa vuorovaikutuksesta S100 proteiinien ja CacyBP /SIP, mikä saattaa rikastuttaa tietomme S100 proteiinien ja olla avuksi ymmärrystämme kehittymisen mahasyövän.

Citation: Ning X, Sun S, Zhang K, Liang J, Chuai Y, Li Y et ai. (2012) S100A6 Protein säätelee negatiivisesti CacyBP /SIP-estoa mahasyövän Cell Proliferation ja kasvaimen kehittymisen. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10,1371 /journal.pone.0030185

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italia

vastaanotettu: 27 lokakuu 2011; Hyväksytty 15 joulukuuta 2011; Julkaistu: 25 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Ning et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Nature Science Foundation of China (nro 30872964, nro 30772461). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

S100 proteiinit ovat suurimmat alaryhmä EF-käden Ca

2 +: aa sitova proteiini perhe ja on ominaista niiden solu- ja kudosspesifisiä ekspressiokuvioiden. Nämä proteiinit ovat tiedetään säätelevän solunsisäisiä prosesseja, kuten solusyklin siirtymistä ja solujen kasvua, erilaistumista ja liikkuvuus [1]. Ainutlaatuinen piirre näiden proteiinien on, että yksittäiset jäsenet ovat paikallisia erityisissä solun osiin, joista jotkut pystyvät muuttamaan upon Ca

2+ aktivointi [2], [3]. Kun translokaatio nämä proteiinit voivat transduktion Ca

2 + signaalin ajallinen ja paikallinen tavalla vuorovaikutuksessa eri S100 proteiini-erityisiä tavoitteita. Mielenkiintoista, useimmat S100 geenit sijaitsevat geenin klusterin ihmisen kromosomissa 1q21, sivuston usein kromosomipoikkeavuuksien [4]. Tämä yhdistys viittaa yhteyden kromosomipoikkeavuuksien ja avautumisen S100-geenin ilmentymisen erilaisissa kasvaimissa. Ajan tasalla, monet jäsenet S100 perhe on tunnistettu liittyvän kasvainten kehittymiseen ja etäpesäkkeiden [5], [6]. Kuitenkin tarkka roolit ja merkitys S100 proteiinien kehittämiseen ja edistämiseen syövän huonosti. Ymmärtäminen biologisen toiminnan (t) S100 proteiinien riippuu tunnistamiseen S100 proteiinin tavoitteita. Tähän asti useita mahdollisia proteiini tavoitteita, mukaan lukien glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, anneksiini II, anneksiini VI, anneksiini XI caldesmon ja CacyBP /SIP, on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa S100 proteiinien

in vitro

on Ca

2 +: sta riippuvainen tavalla [5], [7].

Calcyclin sitovan proteiinin (CacyBP /SIP), 30 kDa: n proteiini tunnistettiin sen perusteella, sen kyky olla vuorovaikutuksessa S100A6 on Ca

2 +: sta riippuvainen tavasta, Ehrlich askites kasvain (EAT) solut [8], on aiemmin ajateltu monilääkeresistenssi- (MDR) liittyvien molekyylin mahasyövän laboratoriossamme [9]. Käytön kautta monoklonaalisen vasta-aineen CacyBP /SIP [10], olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen CacyBP /SIP estää proliferaatiota ja tumorgenesis Munuaissyöpäsolujen [11]. Lisäksi tutkimus on ehdottanut, että CacyBP /SIP estää kasvua mahasyövän [12]. Tästä edistyksestä huolimatta vaikutukset S100 proteiinien CacyBP /SIP mahasyövän jää epäselväksi. Lisäksi, CacyBP /SIP havaittiin myös olevan osa ubikinaation kompleksin sitoutumisen kautta Siah1 ja Skp1 [13]. Ja tämä ligaasi kuvattiin säädellä hajoamista ei-fosforyloitua β-kateniinin [13].

CacyBP /SIP voisi sitoa S100, Siah1 ja Skp1 eri alueilla. N-terminaalinen alue (aa 1-80) on CacyBP /SIP on osoitettu olevan affiniteettia Siah1. C-terminaalinen alue CacyBP /SIP (aa178-229) tunnetaan muodostamiseksi α-heliksin; verkkotunnuksen voi vuorovaikutuksessa S100 proteiineihin, S100A6 [14]. Skp1 sitova domeeni ei mene päällekkäin S100 sitova alue ja Skp1 sitoutuu keskiosan (aa78-155) on CacyBP /SIP [15], [16]. Tarkkailla vaikutuksia S100 proteiinien biologista käyttäytymistä CacyBP /SIP mahasyövän, eukaryoottiekspressiovektoreihin villityypin CacyBP /SIP ja sen katkaistun mutantti, josta puuttuu S100 proteiinia sitovan domeenin (CacyBP /SIPΔS100) onnistuneesti rakennettu ja tehokkaasti ilmaistuna in MKN45 soluissa. MTT-määritys, FACS määritys, klonogeeniset määritys ja -tuumoriksenografti koe suoritettiin vaikutusten arvioimiseksi CacyBP /SIP solun kasvuun ja kasvaimen kehittymisen sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tulokset näistä tutkimuksista voivat edistää selvittää sellaisten vaikutusten S100 proteiinien biologisesta käyttäytymisestä CacyBP /SIP mahalaukun syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja eläimet

mahasyöpä solulinja MKN45, jonka todettiin olevan alhaisin ilmentymä CacyBP /SIP edellisessä tutkimuksessa [12], oli säilynyt laboratoriossamme. Soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (GIBCO, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 10% lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia, penisilliiniä (100 U /ml), ja streptomysiinillä (100 ug /ml) CO

2-inkubaattorissa (Forma Scientic, Marjetta, OH, USA). BALB /c-nude-hiiriin 4-6 viikon iässä toimittivat Shanghai Cancer Institute for

in vivo

kasvainten synnyssä tutkimus. Tämä tutkimus suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden neljännen Military Medical University (Luvan numero: 11016). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja jokainen pyrittiin minimoida kärsimyksen.

immunofluoresenssi

Solut maljattiin puhdistettu peitelaseja ja kiinnitettiin 95% alkoholia 20 minuuttia huoneen lämpötila. Solujen peitinlaseilla pestiin PBS: llä ja läpäiseviksi 10 minuuttia 0,5% Triton X-100 PBS: ssä. Soluja inkuboitiin anti-S100A6-vasta-ainetta (laimennettu 1:2000) sen jälkeen, kun esto 3% naudan seerumin albumiinia 1 tunnin ajan. Sitten soluja inkuboitiin FITC-konjugoidun anti-hiiri-IgG: tä (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, USA) ja asetettiin lasilevyille, jossa glyserolin ja polyvinyylialkoholin sisältävien DABCO (1,4 diazobicylo- [2,2 , 2,] – oktaani). Immunofluoresenssikoe analysoitiin kanssa MRC-1024 laserskannaus konfokaali Imaging System (Bio-Rad).

Plasmidin rakentaminen ja solujen transfektio

oligonukleotidialukkeita, jotka sisältävät

Eco

RI tai

Eco

RV-restriktiokohta syntetisoitiin vastaavasti, monistamiseen CDS sekvenssin CacyBP /SIP tai C-pään deleetion (aa178-229) mutantti CacyBP /SIP (liittymistä AF_314752). Kaksi alukkeet olivat: 5 ’gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3’ (sense) ja 5 ’gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3’ (anti-sense); 5 ’gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3’ (sense) ja 5 ’ccgatatcacacaatataagaactgta 3’ (anti-sense), vastaavasti. PCR-olosuhteet olivat: 5 min 94 ° C: ssa alkudenaturaation, jota seurasi 35 sykliä 45 s 94 °, 45 s 60 °, ja 60 s 72 °, ja lopullinen laajennus 10 minuutin ajan 72 °. Pituudet PCR tuotteet olivat 687 bp CDS, ja 534 bp: n C-terminaalinen deleetio. Kukin PCR-tuote leikattiin

EcoRI

I ja

EcoRI

V restriktiopilkkomisella ja kloonattiin samoin pilkottu pFLAG-CMV. Uudet vektorit nimettiin pFLAG-CacyBP (villityypin) ja pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). Insertin sekvenssit varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Solun transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), kuten valmistaja on kuvannut. Lyhyesti, solut maljattiin ja kasvatettiin 70-90% konfluenssiin ilman antibiootteja. Sitten ne transfektoidaan 1 ug pFLAG-CacyBP tai pFLAG-ΔS100. 24 h transfektion jälkeen, G418 (350 mg /ml) lisättiin viljelmään median transfektoitujen solujen valinnan. Mixed kloonit laajennettiin vielä 6 viikkoa. Solut transfektoitu tyhjällä vektorilla, pFLAG-CMV, käytettiin negatiivisena kontrollina. Nämä stabiilit solulinjat nimettiin MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 ja MKN45-pFLAG varten villityypin, katkaistu ja negatiivinen kontrolli-transfektanteissa, tässä järjestyksessä.

Co-immunosaostus

MKN45 transfektantit olivat pestiin PBS: llä, kerättiin ja lyysattiin jäillä puskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 8 mM MgCl

2, 150 mM NaCl, 0,2 mM EGTA: ta, ja 1% Nonidet P-40. Uutteet sentrifugoitiin 12000 rpm 25 minuutin ajan 37 ° mikrosentrifugissa. Supernatantit käytettiin im- määrityksessä lisäämisen jälkeen proteaasi-inhibiittoreita (10 mg /l leupeptiiniä, 5 mg /l aprotiniini, 20 mg /l soijapavun trypsiini-inhibiittori, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia) ja kvantifioitiin Bradfordin menetelmällä. Supernatantteja inkuboitiin 30 ul proteiini-A /G-Sepharose ja 1 ug eivät liity vasta-aineen 1-3 tunnin ajan 37 ° (pre-puhdistuma). Sitoutumattoman fraktiot inkuboitiin sitten seerumin kanssa, joka sisältää vasta-aineita CacyBP /SIP 1,5 h 4 °. Sitten seosta inkuboitiin vielä proteiini A /G-Sepharose yön yli 4 °: ssa. Sitten hartsi pestiin kolme kertaa puskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) ja 150 mM NaCl: a, kaksi kertaa puskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI (pH 7,5) ja 500 mM NaCl: a, ja lopuksi 20 mM Tris HCl: lla pH: ssa 7,5. Kaikki puskurit, joita käytettiin täydennetty proteaasinestäjien kanssa. Hartsi ja sitoutuneet proteiinit liuotettiin SDS-näytepuskuriin, keitettiin 5 minuutin ajan 98 °, ja lisättiin SDS-polyakryyliamidigeelillä. Ilmentyminen S100A6 analysoitiin western-blottauksella vasta-ainetta vastaan, S100A6.

Western blot

Solut kerättiin ja lyysattiin jäillä puskurissa, joka sisälsi [50 mmol /l Tris-CI (pH 7,5), 150 mmol /L NaCl, 0,2 mmol /l EDTA, 1 mmol /l PMSF ja 1% NP 40], ja sitten kvantitoida Bradfordin menetelmällä. Toimenpide 100 ug lysaatit ajettiin elektroforeesilla 10% SDS-PAGE: lla ja blotattiin nitroselluloosakalvolle. Membraanit blokattiin 10% rasvatonta maitoa huoneenlämmössä 2 h ja inkuboitiin anti-CacyBP (1:1500) ja anti-β-aktiini-vasta-ainetta (Sigma, 1:5000) 4 °: ssa yön yli. Kolmen pesun jälkeen 15 min kukin TBS täydennetty 0,1% Tween 20 (TBST), kaivoa inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri /kani-lgG-vasta-ainetta (Amersham-Pharmacia Biotech, Peking, Kiina) 2 tunnin ajan huoneen lämpötila. Enhanced chemiluminescence (Amersham, Freiburg, Saksa) käytettiin havaitsemiseen.

Metyyli-tiatsolyyli tetratsolium (MTT)

Solut ympättiin 96-kuoppaiselle levylle 2,5 x 10

3 solua /kuoppa RPMI 1640 elatusaineessa, joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia. Kukin näyte oli kolme toistoa. Elatusaine vaihdetaan 2 päivän välein, ja 6 päivää. Soluja inkuboitiin 50 ul: lla 0,2%: MTT: ssa 4 tunnin ajan 37 °: ssa 5% CO

2-ilmakehässä. Seuraavat MTT Inkuboinnin 150 ui: n näyte 100% DMSO: ta lisättiin kuhunkin viljelmään kiteiden liuottamiseksi. Elävät solut laskettiin joka päivä lukemalla absorbanssi 490 nm: ssä käyttämällä 96-levylukijalla, BP800 (Dynex Technologies, Chantilly, VA).

Solusyklianalyysiä

Subkonfluentit solut pestiin jääkylmällä PBS: llä, suspendoitiin 0,5 ml: aan etanolia, ja pidettiin sitten 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Suspensio suodatettiin 50 um nylonia mesh, ja DNA-pitoisuus värjättiin ytimien analysoitiin virtaussytometrillä (EPICS XL, Coulter, Miami, FL). Solusyklin profiili analysoitiin Multicycle-DNA Cell Cycle Analysoitu Software. Proliferatiivinen indeksit (PI) laskettiin seuraavasti: PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2).

klonogeeninen määritys

mittaamiseksi leviämisen nopeus yhden solun

in vitro

, levy klonogeeniset ja pehmeä agar klonogeeniset määritykset suoritettiin [17]. Lautasen klonogeenisten määrityksessä, 1 x 10

3-soluja ympättiin 9 cm: n maljaa, ja viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, kaksi viikkoa, jotta pesäkkeiden muodostumista. Pesäkkeet kiinnitettiin 70% etanolilla, värjättiin Giemsa-liuoksella ja laskettiin. Sillä pehmeä agar klonogeeniset määritystä, solut irrotettiin ja maljattiin 0,3% agaroosia, jossa on 0,5% agaroosi alustalle (1 x 10

3 /kuoppa 24-kuoppaisella levyllä). Määrä pesäkkeiden 100 um laskettiin 20 päivän jälkeen.

Kasvaimen kasvu nude-hiirissä

logaritmisesti kasvavia soluja (1 x 10

7 solua) trypsinoitiin, suspensoitiin uudelleen 0,1 ml D’Hanks liuosta, ja injektoitiin kaulan hypodermia kunkin kateenkorvattomiin nude mouse. Sitten hiiriä tarkkailtiin kasvaimen tilavuus, yleinen terveydentila ja koko kehon paino. Koko ihonalaisen kasvaimen massa mitattiin paksuus viiden viikon ajan. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: 0,5 x pituus x leveys

2. Jokainen koeryhmä koostui viidestä hiirestä.

reportterigeenimäärityksessä

vaikutuksen määrittämiseksi CacyBP /SIP ja CacyBP /SIPΔS100 on transkriptionaalista aktiivisuutta Tcf /LEF, reportterigeenin määritys suoritettiin kuten on kuvattu [18]. Lyhyesti, solut 24-kuoppalevylle (50000 solua per kuoppa) kotransfektoitiin kanssa tai ilman pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 ja reportteriplasmidilla, pTOPFLASH, jotka sisältävät villin tyypin Tcf /LEF sitoutumiskohtia käyttämällä Lipofectamine 2000 PRL-TK

Renilla

lusiferaasireportterista toimi kontrollina transfektiotehokkuuden. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin ja määrä määritettiin luminometrillä käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Southampton, UK). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kahdesti. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona välisen suhteen tulikärpäsen lusiferaasi toiminnan ja Renilla lusiferaasiaktiivisuus.

Tilastollinen

Kaikki tiedot analysoitiin SPSS tilastollista ohjelmistopaketti (SPSS, Inc., Chicago, Illinois), ja

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Merkitys ero taajuus CacyBP /SIP-positiivista värjäytymistä vierekkäisten kasvainnäytteestä ja kasvaimet analysoitiin chi-neliö testi. Opiskelijan

t

testi ja yksisuuntainen varianssianalyysi seurasi Dunnettin monivertailu testejä käytettiin analysointiin muita tietoja.

Tulokset

Endogeeniset ilmentymistä S100A6 mahasyövän solulinja MKN45

S100A6 valittiin malliksi tarkkailla vaikutus S100 proteiinien biologisen toiminnan CacyBP /SIP. Endogeeninen ilmentyminen S100A6 mahasyövän solulinjassa MKN45 havaittiin ensimmäisen Western blot ja immunofluoresenssivärjäyksen. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, S100A6 ilmennettiin MKN45 soluissa. Immunofluoresenssivärjäyksen osoittaa, että S100A6 lähinnä jaetaan tumakalvoa hyvin vähän löytyy ydinvoiman plasmassa MKN45 solujen (Fig. 1 B).

(A) Endogeeninen ilmentymä S100A6 vuonna MKN45 mahalaukun syöpäsoluissa havaittiin western blot. (B) Immunofluoresoivat värjäys S100A6 in MKN45 soluissa. (A) Immunofluoresoivat värjäys S100A6 anti-S100A6 vasta-aineella (vihreä); (B) havaitseminen ydinten propidiumjodilla (punaisella); (C) Yhdistetty kuva.

vuorovaikutus S100A6 ja CacyBP /SIP mahalaukun syöpäsoluissa MKN45

Edellisessä raportissa CacyBP /SIP, joka ilmaistiin suhteellisen alhaisella tasolla in MKN45 soluissa, on laajalti ilmaistu useita erilaisia ​​mahalaukun syövän solulinjat [12]. Jotta voitaisiin arvioida vuorovaikutusta S100A6 ja CacyBP /SIP, villityypin ja mutantti (aa178-229) CacyBP /SIP cDNA: t kloonattiin pFLAG-CMV vektoriin ja transfektoitiin stabiilisti MKN45 soluihin. Olemme arvioineet ilmaus CacyBP /SIP näissä vakaa solulinjojen western blot. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, FLAG-merkitty CacyBP /SIP havaittiin villityypin ja mutantti CacyBP /SIP-transfektantteja anti-Flag-vasta-ainetta, kun taas mitään signaalia havaittiin soluissa, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla.

(A) Western blot analyysi transfektanttien CacyBP /SIP ja CacyBP /SIPΔS100 transfektanttien anti-FLAG ja anti-CacyBP vasta-aineita. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) Co-immuunisaostustesti havaita vuorovaikutusta S100A6 ja CacyBP /SIP sisään MKN45 soluissa. Inkuboinnin jälkeen anti-CabyBP vasta-aineen sitoutumiskohtien havaittiin anti-S100A6-vasta-aine.

vuorovaikutus S100A6 ja CacyBP /SIP in transfektantti MKN45 soluissa arvioitiin sitten co-immunosaostus. Inkuboinnin jälkeen anti-CacyBP-vasta-aine, Immuunisaostuma havaittiin S100A6 vasta-aineella. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, välinen vuorovaikutus S100A6 ja villin tyypin CacyBP /SIP havaittiin MKN45-CacyBP solulysaateista; kuitenkin, mutantti CacyBP /SIP, joka oli katkaistu pois aa178-229 alueen tuotetaan pieni signaalin samanaikainen immunosaostus määritys. Siksi katkaistun mutantti CacyBP /SIP nimettiin CacyBP /SIPΔS100 ja on hyödyllinen työkalu tutkimus vaikutuksista S100A6 biologisesta käyttäytymisestä CacyBP /SIP mahalaukun syöpäsoluja.

Effects of S100A6 soluproliferaatioon aiheuttama CacyBP /SIP mahalaukun syövän solulinja MKN45

in vitro

MTT ja FACS määritykset suoritettiin vaikutusten tutkimiseksi S100A6 soluproliferaatioon indusoi CacyBP /SIP sisään MKN45 soluissa

in vitro

. Verrattuna tyhjän vektorin transfektantit, MKN45-pFLAG, sekä villin tyypin ja CacyBP /SIPΔS100 transfektantit osoitti merkittävästi vähentynyt hinnat soluproliferaation MTT-määritystä (

P

0,05) (Fig. 3A). Kuitenkin CacyBP /SIPΔS100 transfektantit ilmensivät huomattavasti vähentynyt kasvu verrattuna villin tyypin CacyBP /SIP transfektanteilla (

P

0,05).

(A) Detection solun kasvu

in vitro

. Solujen määrä arvioitiin absorbanssilla 490 nm: ssä käyttäen MTT-määritystä ilmoitettuina aikoina. Näyttämä arvo on kolmen määrityksen keskiarvo. (B) Cell cycle jakelu- ja proliferatiivinen indeksit (PI) transfektoitujen solujen. Solut pesuainetta uutettiin, värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrialla. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2).

tulokset solusyklin analyysi FACS vastaavasti osoittavat, että yli-ilmentyminen joko villi tai mutantti CacyBP /SIP vähentää MKN45 leviämisen. Kuitenkin keskimääräinen proliferatiivinen indeksit (PI) on MKN45-ΔS100 solujen (0,19 ± 0,03) oli alhaisempi kuin MKN45-CacyBP solujen (0,29 ± 0,02) (

P

0,05) (Fig. 3B) . Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että villin tyypin CacyBP /SIP estää leviämisen MKN45 solujen, kun taas CacyBP /SIPΔS100 tehostaa tätä lisäkasvun estäminen.

Effects of S100A6 on tumorigeneesin aiheuttama CacyBP /SIP on MKN45 mahasyöpä solulinja

in vitro

ja

in vivo

Anchorage riippumaton kasvu on tärkeä ominaisuus

in vitro

kasvaimen kasvua. Siksi me tutki säätelyä CacyBP /SIP ilmaus estivät MKN45 solukasvua median ja pehmeä agar. Kuten on esitetty kuviossa. 4A ja B, CacyBP /SIP ilmaus johti huomattavaan vähenemiseen MKN45 solukasvun pesäkemuodostusta, joiden keskimääräinen vähennys 32,1% väliaineessa ja 62,0% pehmeässä agarissa (

P

0,05) . Kuitenkin transfek- CacyBP /SIPΔS100 johti vielä suurempi lasku kasvu on keskimäärin lasku hinnat 84,2% väliaineessa ja 82,8% pehmeässä agarissa (

P

0,01).

(A) havaitseminen klonogeeniset muodostumista väliaineessa. (B) havaitseminen klonogeeniset muodostumisen pehmeässä agarissa. Solut sijoitettiin väliaineessa, joka sisälsi pehmytagar tai lautaselle ja inkuboitiin 20 päivää. Määrä pesäkkeiden 100 pm laskettiin. Pystypalkit edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kolmesta eri kokeesta, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (C)

In vivo

kasvainten muodostumiseen arvioitiin nude-hiirten määrityksessä. Hiiret injektoitiin ihonalaisesti 1 x 10

7 transfektoiduista soluista. Tilavuus kunkin kasvaimen laskettiin seuraavan kaavan mukaan 0,5 x pituus x leveys

2. Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin, ja kunkin koeryhmän koostui viidestä hiirestä.

*

P

0,05

vs.

MKN45-pFLAG,

**

P

0,01

vs.

MKN45 -pFLAG,

#

P

0,05

vs.

MKN45-CacyBP.

vahvista tämä vaikutus

in vivo

meidän ihon alle injektoidaan MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 ja MKN45-pFLAG solujen kaulaan hypodermia nude-hiirten. Kolmen viikon kuluttua, keskimääräinen kasvaimen tilavuus kussakin ryhmässä oli merkitsevästi erilainen kuin muut. Tällä 5

th viikolla, keskimääräinen kasvaimen tilavuus MKN45-pFLAG ryhmä oli 776,9 ± 90,9 mm

3, mikä on huomattavasti enemmän kuin MKN45-CacyBP ryhmä (578,9 ± 51,2 mm

3 ) (

P

0,05), ja jopa enemmän kuin MKN45-ΔS100 ryhmä (364,9 ± 71,9 mm

3) (

P

0,05) (kuvio. 4C).

vaikutukset S100A6 on CayBP /SIP-välitteisen β kateniinin hajoamiseen

Koska osa ubikitiinipromoottori ligaasia monimutkainen, CacyBP /SIP on mukana hajoamista fosforyloitumaton β-kateniini kautta sitova Skp1 ja Siah1. Joten ilmentyminen β-kateniini havaittu epäsuorasti arvioimaan vaikutusta S100 Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligaasia. Ensinnäkin, samanaikainen immunosaostus määritys osoitti, että katkaistun mutantti CacyBP /SIP sitoutuvat sekä Skp1 ja Siah1 (Fig. 5A), mikä viittaa siihen, S100A6 ei vaikuttanut muodostumista Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligaasia monimutkainen. Toiseksi, β- kateniinin proteiinia MKN45-ΔS100 solujen merkittävästi vähentynyt verrattuna MKN45-CacyBP soluja, kun taas mitään muutosta tapahtunut mRNA (kuvio. 5B). Lisäksi, koska β-kateniinin tarvitaan kofaktorina aktivoinnin transkriptiotekijän, Tcf /LEF, määritimme vaikutuksia CayBP /SIPΔS100 on Tcf /LEF aktiivisuus käyttäen lyhytaikaista transfektiota reportterigeenin määritykset. Expression of CacyBP /SIPΔS100 vähensi Tcf /LEF aktiivisuutta kuin villityypin CacyBP /SIP (Fig. 5C). MG132, estäjä proteasomin, voisi poistaa vaikutuksen sekä villin tyypin CacyBP /SIP ja CacyBP /SIPΔS100 päälle Tcf /LEF aktiivisuutta. Yhdessä me päätellä, että S100A6 voivat vaikuttaa CayBP /SIP välittämän β kateniinin hajoamisen kautta vuorovaikutuksessa CayBP /SIP.

(A) Co-immuunisaostustesti osoittivat, että typistetty mutantti CacyBP /SIPΔS100 sitoa sekä Skp1 ja Siah1, viittaa S100A6 ei vaikuttanut muodostumista Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligaasia monimutkainen. (B) Western blot ja semikvantitatiivinen RT-PCR käytettiin analyysiä varten β-kateniinin proteiini ja mRNA transfektoiduissa soluissa, vastaavasti. β-kateniinin proteiinin MKN45-ΔS100 solujen merkittävästi vähentynyt verrattuna MKN45-CacyBP soluja, kun taas mitään muutosta tapahtunut mRNA. (C) lusiferaasireportterigeenianalyysissä käytettiin arvioitaessa vaikutusta CacyBP /SIPΔS100 on Tcf /LEF toimittaja aktiivisuutta. Transfektio villityypin CacyBP /SIP vähentää Tcf /LEF aktiivisuutta, verrattuna kontrolliin plasmidi. Ja ilmaus CacyBP /SIPΔS100 vähensi Tcf /LEF aktiivisuutta kuin villityypin CacyBP /SIP. MG132 (estäjä proteasomeja) voisi poistaa vaikutuksen sekä villin tyypin CacyBP /SIP ja CacyBP /SIPΔS100 päälle Tcf /LEF aktiivisuutta. *

P

0,01, verrattuna kontrolliin;

#

P

0,05, CacyBP /SIPΔS100

vs.

Villin tyypin CacyBP /SIP. Nämä kokeet toistettiin kolmesti.

Keskustelu

S100 proteiinit ovat saaneet kiinnostavia johtuen niiden differentiaalikaavojen kasvainkudoksissa ja niiden osallistumista syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [19] – [ ,,,0],22]. S100 proteiinit vuorovaikutuksessa joidenkin tavoite proteiinien kalsiumista riippuvan tai kalsium-riippumattomalla tavalla ja edelleen säädellä tehtävä näiden tavoitteiden [5], [23]. CacyBP /SIP on uusi tavoite proteiinia, joka voi olla vuorovaikutuksessa S100 proteiinien, mukaan lukien S100A6, S100A1, S100B ja S100P, mutta ei S100A4, calbindin D, parvalbumiinia tai kalmoduliinia [8], [16]. Edellinen toimii meidän lab osoitti, että yli-ilmentyminen CacyBP /SIP voi estää proliferaatiota ja kasvaimen kehittymisen mahasyövän ja munuaissolukarsinooma [11], [12]. Tästä edistyksestä huolimatta vaikutukset S100 proteiinien CacyBP /SIP on vielä tutkittava.

Valaistaan ​​sääntelyssä S100 proteiinien CacyBP /SIP-toiminto, rakensimme katkaistun CacyBP /SIP mutantti ilman S100 proteiinia sitova alue siten, että mutantti-proteiini voisi olla vuorovaikutuksessa S100 proteiineja ja säilyttää kyky olla vuorovaikutuksessa Siah1 ja Skp1. Tässä tutkimuksessa, eukaryoottiekspressiovektoreihin villityypin CacyBP /SIP ja sen katkaistujen mutantti oli tehokkaasti ilmaistu MKN45 soluissa. Samanaikainen immunosaostus osoittivat vuorovaikutusta S100A6 ja villin tyypin CacyBP /SIP sisään MKN45 soluissa. Kuitenkin CacyBP /SIPΔS100 ei juuri signaaliksi samanaikainen immunosaostus määritys, joka osoittaa vähän tai ei lainkaan vuorovaikutusta S100A6. MTT-määritystä, FACS määritys, klonogeeniset määritys ja -tuumoriksenografti kokeilu nude-hiirissä suoritettiin testata vaikutusta villi ja mutantti CacyBP /SIP solun kasvuun ja kasvaimen kehittymisen sekä

in vitro

ja

in vitro

. Nämä kokeet osoittivat, että yli-ilmentyminen CacyBP /SIP voi estää proliferaatiota ja kasvaimen kehittymisen sekä MKN45 mahalaukun syöpäsoluja. Tärkeää on, transfektoidut solut CacyBP /SIPΔS100 esillä voimakkaampi vaikutus verrattuna villityypin transfektantit, viittaa siihen, että S100 proteiinit saattavat säädellä negatiivisesti soluproliferaation inhibointi indusoi CacyBP /SIP mahalaukun syöpäsoluja.

mekanismia käytetään by S100A6 modulointiin CacyBP /SIP-toiminto saattaa olla proteiinia vuorovaikutusta ja toimintoja. CacyBP /SIP tunnistetaan olla mukana ubikinaation ja hajoamista β-kateniinin [24] – [28]. β- kateniinin havaittiin yliekspressoituvan tai aktivoida jakautuvat solut ja monissa kasvaimissa [29] – [31]. Fukushima et ai. [32] mukaan CacyBP /SIP Knockout solut näyttävät heikentynyt (kateniinin hajoamiseen ja puutteellisen G1 solusyklin Checkpoint, mikä osoittaa, että β-kateniinin hajoamisreitit välittämiä CacyBP /SIP määritellään olennainen tarkistuspisteen tymosyyttien kehitys- ja solusyklin etenemisen. Meidän aiemmat tutkimukset osoittivat myös, että CacyBP /SIP estää kasvua ja lisääntymistä mahasyövän solujen osittain kautta hajoamista β kateniinin. Olipa S100 säätelee CacyBP /SIP-välitteisen ubikitiinipromoottori ligaasilla säilyttää tuntematon. Kertyvät todisteita osoitti, että useat jäsenet S100 proteiinin perhe voisi säädellä aktivointia niiden kohdeproteiinien [33], [34]. hiljattain löydetty hiivan homologi CacyBP /SIP, Sgt1, ei vain vuorovaikutuksessa S100 proteiinien kalsium- säädellään-tavalla, mutta myös on yhteydessä Skp1 muodostamiseksi Skp1 /cullin1 /F – box ubikitiinipromoottori ligaasilla kompleksi [35]. on havaittu, että S100A6 voi estää fosforylaation Sgt1 mukaan kaseiinikinaasi II vaikuttaa toimintaa [36]. meidän olevassa kokeessa, myös tunnistettu, että CacyBP /SIPΔS100 säilyttävät kyvyn yhdistää Skp1 ja Siah1, mikä viittaa siihen, S100-molekyyli ei välttämättä ole vaikutusta muodostumiseen Siah1 /Skp1 /CacyBP ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen. Kuitenkin, β-kateniinin proteiinia ilman muutoksia mRNA: n taso CacyBP /SIPΔS100 transfektoitujen solujen on huomattavasti pienempi kuin villityypin transfektanttisoluilla. Transkriptionaalista aktiivisuutta Tcf /LEF, kohdegeenin on β-kateniinin, väheni yhdessä mutantti CacyBP /SIP ilman S100 sitovia, verrattuna villin CacyBP /SIP. Accoding Näiden tulosten me olettaa, että S100-proteiini voisi säädellä negatiivisesti aktiivisuutta Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ubikitiinipromoottori ligaasilla vuorovaikutus CacyBP /SIP. Estämällä yhdistelmä S100 ja CacyBP /SIP voisi edistää β kateniinin hajoamiseen, johtaa estämällä syöpäsolujen lisääntymistä. Tämä keinottelu voidaan osittain tukevat Lee et ai että solujen vähentynyt taso S100A6 määrästä β kateniinin pienenee [26]. Tulokset ovat yhtäpitäviä koskien säätely ylöspäin S100 proteiinien ja puutteellinen hajoaminen β kateniinin kasvain- ja jakautuviin soluihin [37]. Lisäksi CacyBP /SIP osoitettiin olevan vuorovaikutuksessa tubuliinia ja ERK1 /2 ja on tärkeä rooli uudelleenjärjestelyjä solun tukirangan, solujen erilaistumiseen tai rappeutumista [38] – [42].

Johtopäätökset

S100A6 proteiini säätelee negatiivisesti CacyBP /SIP-estoa mahasyövän solujen lisääntymistä, osittain vaikutus β-kateniinin hajoamiseen ja transkription aktivoituminen Tcf /LEF. Kuitenkin taustalla mekanismeja sääntelyn S100A6 proteiinien ubikinaation ja muita toimintoja kautta CacyBP /SIP-riippuvaisen reitin edellyttävät lisätutkimuksia.