Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy gynecologic syöpien ja on viidenneksi suurin syy kaikki syöpään liittyvien kuolemien naisten keskuudessa. Kehittää uusia molekyyli tavoitteiden vuoksi on tärkeää monille potilaille. Äskettäin SRY liittyvä transkriptiotekijä Sox2 on laajalti raportoitu olevan mukana useita patofysiologisiin sairauksiin, mukaan lukien ylläpito kantasolujen ominaisuuksia ja syövän syntymistä. Asti, Sox2 on lähinnä osoitettu edistää syövän, vaikka sen estävä roolista syövässä, on myös raportoitu. Kuitenkin rooli Sox2 munasarjasyövän ei juuri tunneta. Esillä olevassa tutkimuksessa havaitsimme ilmaus Sox2 64 ihmisen vakavien munasarjasyöpäpotilailla (SOC) kudoksiin ja pariksi vastaava metastasoituneen näytteitä käyttäen immunohistokemiallista määritystä. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen Sox2 in primaaristen kasvainten on paljon alhaisempi kuin vastaavassa etäpesäkeleesioita. Olemme lisäksi havainneet, että Sox2 yliekspressio edistää proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota, kun taas estämällä tarttumisen kyvyt SOC soluja. Lopulta huomasimme, että Sox2 tavoitteet Src ei-reseptori tyrosiinikinaasin, joka säätelee solujen vaeltaminen, invaasio ja tarttuvuus SOC soluissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Src on keskeinen molekyyli Sox2 välittämän muuttoliike ja invaasion SOC soluja.

Citation: Wang X, Ji X, Chen J, Yan D, Zhang Z, Wang Q, et al. (2014) Sox2 Parantaa Migration ja Invasion munasarjasyöpäsoluja kautta Src. PLoS ONE 9 (6): e99594. doi: 10,1371 /journal.pone.0099594

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 helmikuu 2014; Hyväksytty: 15 toukokuu 2014; Julkaistu: 17 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (NSFC nro 81272883, No. 81020108027 ja nro 81172478). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjojen epiteelin syöpä vastaa 80-90% kaikista munasarjojen syöpien ja on johtava tappaja kaikkien gynekologisia maligniteetteja [1]. Koska puute varhaiset oireet, munasarjakarsinooma diagnosoidaan yleensä edennyt etäpesäkkeitä. Laajalle levinnyt etäpesäkkeet ovat tärkeimmät syyt huonon ennusteen potilaita, joilla on munasarjasyöpä. Vaikka selviytyminen on hieman lisääntynyt viimeisten 25 vuoden aikana, viiden vuoden eloonjäämisluvut jäävät alle 50% [1]. Siksi opiskelu metastaattisen mekanismien munasarjasyöpä on ollut painopiste maailmanlaajuinen.

Sox2, jäsen SRY liittyvän suuren liikkuvuuden ryhmä laatikko perhe, oli alun perin havaittiin säilyttää alkion kantasoluilla pluripotenttisuus [2] . Hiljattain Sox2 osoitettiin olevan mukana useita syöpäsairauksia. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että Sox2 edistää solujen proliferaatiota, migraatiota, invaasio ja kasvainten etäpesäkkeiden useissa kasvaintyypeissä kuten glioblastomas [3], peräsuolen syöpä [4], eturauhassyöpä [5], rintasyövän [6], [7] ja osteosarkoomia [8]. Lisäksi korkeat ekspressiotasot Sox2 korreloi kasvaimen etenemisen tai huonon ennusteen useita syöpiä. Sen sijaan, kasvain-suppressiivinen rooli Sox2 raportoitiin myös mahasyövän [9], ja okasolusyöpä keuhkosyöpä [10].

Viime aikoina useat tutkimukset ovat osoittaneet, että Sox2 ilmentyminen on merkittävästi lisääntynyt munasarjasyövän kudokset verrattuna normaaliin munasarja kudoksiin käyttämällä immunohistokemia [11], [12]. Monimuuttujamenetelmin osoittivat lisäksi, että Sox2 yli-ilmentyminen on huono ennustetekijä munasarjasyöpä [13], [14]. Nämä havainnot ehdottivat, että Sox2 saattaa toimia kasvaimen edistää geenin munasarjasyöpä. Kuitenkin toiminnallisten roolien ja tarkka mekanismit ovat edelleen vaikeasti munasarjasyövän. Aseman selkeyttämiseksi ja taustalla mekanismeja Sox2 munasarjan epiteelin syövän, tutkimme ilmaus Sox2 vuonna vakavien munasarjasyöpäpotilailla (SOC) ja sovitetun metastaattisen kudoksiin, sekä SOC solulinjoissa. Lisäksi olemme analysoineet vaikutus Sox2 geenin leviämisen, migraation ja adheesion kyvyt SOC soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ihmisen SOC näytteet ja kliiniset tiedot

SOC ensisijainen ja Hyväksytty metastaattinen kudokset (omentum) saatiin patologian osaston ensimmäisen kansan sairaalan Shanghai. Käyttö näytteiden hyväksyttiin Human Investigation eettisen komitean ensimmäisen Kansan sairaalan Affiliated Shanghai Jiao Tong-yliopiston. Kaikki nämä näytteet saatiin kirjallinen suostumus. Erityiset näytteet tässä tutkimuksessa käytetyt on kuvattu edellisessä julkaisussa [15]. Kaikkiaan 64 serous kystadenokarsinooma kanssa omentum etäpesäkkeitä (vaihe III) tutkittiin. Ikä munasarjasyöpäpotilaalle vaihteli 34-81 vuotta (mediaani 61,2). On 55 tapauksissa vaihdevuodet. Formaldehydin-kiinteä ja parafinoidut kudosnäytteiden 64 tapausta SOC kerättiin tammi 2003 ja joulukuussa 2010. Potilaat, jotka aikaisemmin säteilyä tai kemoterapiaa suljettiin pois. Sairaalloinen diagnoosit edellä munasarjojen vaurioita tehtiin kaksi gynekologisten patologit käyttäen Maailman terveysjärjestön luokitus.

immunohistokemiallinen (IHC) värjäystä ja arviointia

IHC-analyysin Sox2 proteiinin ilmentyminen suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu. Lyhyesti, Sox2 ilmentyminen havaittiin käyttäen kanin monoklonaalista anti-ihmis-Sox2 (Cell Signal Technology, Danvers, MA, USA). Leikkeitä inkuboitiin anti-Sox2 (1:100 laimennus) kosteutta kammiossa 2 tuntia, jota seuraa 60 min inkubaatio biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen. Prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen ja intensiteetti värjäytyminen näissä objektilasit arvioitiin sokkona tavalla. Positiiviset solut osoitti, että läsnä ruskean värjäyksen sekä tumassa ja sytoplasmassa. IHC Tulokset arvioitiin valomikroskoopilla ja pisteytettiin seuraavasti: 0 5% positiivisia soluja; 5-25 01% positiivisia soluja; 2 26-75% positiivisia soluja; ja 3 76% positiivisia soluja. Stain intensiteetti pisteytettiin: 0, ei värjäystä; 1, heikko-keltainen; 2, ruskea-keltainen; ja 3, tummanruskea. Ilmaisu taso (plus kahden tulokset) luokiteltiin: – (0), + (1-2), ++ (3-4), ja +++ (5-6). Tulospalvelu ≥3 määriteltiin korkean tason ilmentymisen ja tulokset 3 määriteltiin matalan tason ilmentymistä. Yksittäiset IHC pistemäärät kussakin tapauksessa käytettiin tilastolliseen analyysiin. Kaikki IHC objektilasit uudelleen itsenäisesti kaksi tutkijaa.

Solulinjat ja soluviljelmä

Munasarjasyöpä solulinjoissa Hei, HO8910, ja HO8910-pm saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja viljeltiin perustuvat suuntaviivat arkistoon. Soluja pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM) /F12, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). MCV152 ja Moody solulinjoja ystävällisesti toimitti Dr. Wenxin Zheng (Arizona University, Tucson, AZ, USA). SKOV3- solut hankittiin Pekingin unionin Medical College (Peking, Kiina). Kolme SOC solulinjat ja HEK-293T-viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, natriumpyruvaattia ja L-glutamiinia, 37 ° C: ssa 5% CO2.

RNA ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad. CA USA). Ilmainen DNA (cDNA) syntetisoitiin kanssa Prime-Script RT reagenssia (Takara, Japani). Kertainen Indusoinnit lasketaan kaavalla 2- (ddCt) käyttämällä GAPDH sisäisenä kontrollina geeni. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Esiseos Ex Taq (TaKaRa, Japani). Geenispesifisillä alukepareilla olivat seuraavat: Sox2 (F) 5′-CGG CAA CCA GAA AAA CAG C-3 ’, Sox2 (R) 5′-TCT CCG TCT CCG ACA AAA GT-3′; GAPDH (F) 5’-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3 ’, GAPDH (R) 5′-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3’.

ohimenevä transfektoimalla Sox2 pieniä häiritseviä RNA (siRNA) ja Src siRNA

Ho8910-pm ja SKOV3- solua maljattiin kuuden kuoppalevyillä tiheydellä 4 x 10

5 solua /kuoppa. 24 tunnin viljelyn jälkeen alusta korvattiin Opti-MEM (Invitrogen) ilman antibiootteja ja viljellään. siRNA geeniä vastaava suunniteltiin ja syntetisoitiin Genepharma (Shanghai, Kiina). Yhteensä 100 pmol siRNA transfektoitiin käyttäen 5 ui lipofektamiinia RNAiMax reagenssia (Invitrogen). Kun oli inkuboitu vielä 48 tuntia, käsiteltiin soluja käytettiin vaikutuksen tutkimiseksi geeni ehtyminen käyttäen Western-blot-analyysi tai transwell ja adheesion määritykset. SiRNA-sekvenssejä vastaan ​​Sox2 sisältyvät: (1) 5′-CUGCAGUACAACUCCAUGATT-3 ’; (2) 5’-GGACAUGAUCAGCAUGUAUTT-3 ’; (3) 5’-CCA UGG GUU CGG UGG UCAA TT-3 ’. SiRNA-sekvenssejä vastaan ​​Src sisältyvät: (1) 5’-CAG GCU GAG GAG UGG UAU UTT-3 ’; (2) 5’-GCC UCA ACG UGA AGC ACU ATT-3 ’; (3) 5’-CUC GGC UCA UUG AAG ACA ATT-3 ’.

Plasmidi rakentaminen

Sox2 ORF-sekvenssi monistettiin Sox2 vektori, joka on tuotettu Shanghai R Sox2 (R) 5′-CCG GAA TTC GAT TTA TCG CGT CGA CTC ACA TG-3 ’.

lentivirustartunnat tuotannon ja solujen transduktio

pakkaus plasmidi psPAX2 ja kirjekuoren plasmidi pMD2.G olivat lahja Dr. T. Didier Trono. pWPXL-Sox2 vektori kotransfektoitiin psPAX2 ja pMD2.G osaksi HEK293T soluihin käyttäen Iipofectamine2000 (Invitrogen). Virukset kerättiin 48 h transfektion jälkeen, ja viruksen tiitterit määritettiin. Ho8910 solut infektoitiin 1 x 10

6 rekombinantti lentivirus transduktion yksiköiden läsnä ollessa 6 ug /ml polybreeniä (Sigma, MO. USA).

solu- soluväliaineen (ECM) adheesiomääritys

kyky munasarjakarsinoomasolut kiinni ECM komponenttien kvantitoitiin kuten aiemmin on kuvattu [16]. 96-kuoppaisia ​​levyjä päällystettiin 1 mg /ml matrigeeliä (BD, USA), 10 ug /ml plasmafibronektiinin (Millipore, Billerica, MA, USA), 10 ug /ml tyypin I kollageenin (Millipore, Billerica, MA, USA) , 10 ug /ml laminiinia (Millipore, Billerica, MA, USA), tai 100 ug /ml naudan seerumin albumiinia (BSA; Sigma, USA), ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Tämän jälkeen epäspesifiset sitoutumiskohdat salvattiin 1% BSA: lla fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 4 h 37 ° C: ssa tai yön yli 4 ° C: ssa, sitten levyt pestiin PBS: llä kahdesti. Solut (4,0 x 10

4cells /100 ui) laimennettiin DMEM lisättiin päällystetyn 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30~60 minitus CO 2-inkubaattorissa. Ei-tarttuvat solut poistettiin pesemällä PBS: llä. Kiinnittyneitä soluja analysoitiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden, ja optinen tiheys mitattiin 450 nm: ssä. Nämä kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kahdesti.

soluproliferaatiomääritykset

Solut ympättiin tiheydellä 2000 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin. Alikvootti 10 ui CCK-8, lisättiin kuoppiin ja inkuboitiin 2 h. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä laskea elinkykyisten solujen kuhunkin kuoppaan. Kukin mittaus suoritettiin kolmena kappaleena ja kokeet toistettiin kaksi kertaa.

pesäkemuodostusta määrityksiä, solut ympättiin kuudella-kuoppaisille levyille tiheydellä 200 solua kuoppaa kohti ja niitä viljeltiin 37 ° C: ssa kahden viikon ajan. Lopussa Inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin 100% metanolilla ja värjättiin 0,1% (w /v) Crystal Violet. Megascopic solujen pesäkkeet laskettiin käyttäen Image-Pro Plus 5.0 ohjelmisto (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Kukin mittaus suoritettiin kolmena kappaleena ja kokeet tehtiin kumpikin vähintään kolme kertaa.

Muuttoliike ja invaasio määritykset

Cell migraatiokokeessa: 4 x 10

4 solut suspendoitiin 200 ul seerumitonta DMEM-alustassa ja kylvetään saliin kunkin insertin. Sitten 500 ui DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, lisättiin 24-kuoppalevylle. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa (Ho8910: 12-14 h, Ho8910-pm: 12-14 h, SKOV3: 12-14 h), solut, jotka vaelsivat kiinnitettiin ja värjättiin 30 minuutin ajan 0,1%: Crystal Violet-liuosta PBS.

Cell invaasiomääritys: kammiot tasaisesti peitetty 60 ui matrigeelin laimennetaan DMEM tiettyä prosenttiosuutta ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2-4 tuntia. Sitten, 4 x 10

4 solut suspendoitiin 200 ui DMEM ja ympättiin ylä- kammioihin, ja 500 ui DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa (Ho8910:24-26 h; Ho8910-pm: 24-26 h; SKOV3 24-26 h), solut kiinnitettiin ja värjättiin.

Western blot-analyysi

Käsitellyt solut lyysattiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA) puskurissa (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoksikoolihappoa, natrium-, 0,1% SDS). Solulysaatit erotettiin 7,5-12,5% SDS-PAGE, siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Bio-Rad, USA), ja blokattiin PBS: llä, joka sisälsi Tween-20 ja 5% rasvatonta maitoa 1 tunti. Kiinnostavia proteiineja inkuboitiin vastaavan ensisijaisen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa. Ne pestiin sitten kolme kertaa pesupuskurilla (0,1% Tween-20: Tris-puskuroitu suolaliuos) ja inkuboitiin sopivan sekundaarisen vasta-aineen kanssa huoneenlämmössä 1 h. Vasta-aine kompleksi havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia (Pierce, Rockford, 1 L. USA). Seuraavat ensisijaiset vasta-aineet Sox2, FAK, fosfo-FAK (Y397), Src, fosfo-Src (Y416), p130cas, fosfo-p130cas, Erk1 /2, fosfo-Erk1 /2, MMP2 ja MMP9, ostettiin Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA).

tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Tilastolliset analyysit tehtiin Fisherin testiä taulukossa 1. selviytyminen analyysi, Kaplan-Meier selviytymisen konstruoitiin ja niiden väliset erot testattiin log-rank-testi. Muuten, ryhmien välisiä eroja analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä (two-tailed).

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmentäminen Sox2 vuonna primaarikasvainten ja vastaavat etäpesäkeleesioita SOC

Munasarjojen syöpä kudosnäytteitä 64 potilasta käytettiin tässä tutkimuksessa, ja ilmentyminen Sox2 analysoitiin näissä kudoksissa käyttämällä immunohistokemiallista (IHC) värjäys. Kuten on esitetty taulukossa 1, 21 ulos 64 (32,8%) ja primäärivamma kudosten oli suhteellisen vähäistä ekspressiotasot Sox2-proteiinin, kun taas 15: 64 (23,4%) metastaattisen kudosten osoitti heikkoa ilmentymistä ja Sox2-proteiinin. Kuitenkin 43 ulos 64 (67,2%) on primäärivamma kudoksista oli suhteellisen korkeat ekspressiotasot Sox2 proteiinia, kun taas 49 ulos 64 (76,6%) metastaattisen kudosten osoittivat korkeaa ekspressiotasot Sox2 proteiinia. Huomattavaa on, että ekspressiotasot Sox2 olivat korkeampia etäpesäkeleesioita kuin niiden pariksi primaarikasvaimen kudoksissa (kuvio 1A ja kuvio 1B).

(A), (B) esittävät kahta esimerkkiä 64 tapausta. Joukossa, vasemmassa yläkulmassa edustaa ensisijaista syövän kudosta, vasemmassa alakulmassa edustaa vastaava etäpesäkkeitä (omentum). Oikea, suurennus kudosten musta runko. Järjestelykuluja B on samanlainen kuin A. (C), (D) Kaplan-Meier eloonjäämiskäyrien analyysi osoittaa aihe korkean Sox2 ekspressiotaso on suurempi riski kuoleman. Munasarjasyöpä kudoksiin Sox2 ilme (score≥3) luokiteltiin Sox2 korkealla tasolla. Joukossa C, Potilaat, joilla Sox2 korkea (n = 43) oli merkittävästi huonompi selviytyminen kuin ne, joilla Sox2 alhainen (n = 21) SOC ensisijaisen kudoksen (

p

= 0,0358, log-rank-testi). Joukossa D, Potilaat, joilla Sox2 korkea (n = 49) oli merkittävästi huonompi selviytyminen kuin ne, joilla Sox2 alhainen (n = 15) SOC metastaattinen kudoksessa (

p

= 0,0029, log-rank-testi).

väliset korrelaatiot Sox2 ilmaisun ja kliinisiä patologisia tekijöitä ihmisen SOC tutkittiin tarkemmin. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että Sox2 ilmentyminen merkitsevästi liittynyt histologisia arvosana. Tarkemmin sanottuna Sox2 ilme oli suhteellisen korkea vähemmän eriytetty kasvaimia (taulukko 1). Positiivinen värjäytyminen Sox2 nousivat asteittain G2 G3 grade, mikä osoittaa, että Sox2 proteiini lisääntyi kehityksen aikana SOC. Muuten ei ollut merkittäviä assosiaatioita Sox2 ilmaisun ja iän tai seerumissa CA125 tasoilla.

yhdistys Sox2 ilmaisun kanssa OS (kokonaiselossaoloaika) kestot ja hinnat eri kuukausina tutkittiin. Potilaat, joilla on korkean tason Sox2 ilmentyminen oli lyhyempi OS kesto kuin matalan tason Sox2 ilmentymistä ensisijainen kasvainkudoksessa ja metastaattinen kudos, vastaavasti (kuvio 1 C ja 1 D). Yhdessä nämä havainnot ehdotti, että ilmaus Sox2 voisi ennustaa huonon ennusteen ihmisen munasarjakarsinooman.

Sox2 kasvattaa muuttavien ja metastaattisen potentiaalin ja vähentää tarttumista kykyä SOC soluja

Voit valita sopivan solulinjoja tutkia biologisen toiminnan Sox2, ensin analysoidaan proteiinin tasot Sox2 kuudessa munasarjojen kasvainsolulinjoissa. Olemme havainneet, että proteiini tasot Sox2 olivat hyvin vaihteli munasarjasyövän solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa 2A ja kuviossa 2B, ilmentyminen Sox2 on suhteellisen kasvoi SKOV3- ja erittäin metastaattinen solulinja Ho8910-pm verrattuna sen emo- munasarjasyövän solulinja Ho8910. Ilmaisu on Sox2 oli suhteellisen pieni hyvänlaatuinen munasarjojen serous cystadenoma eternalized solulinjan MCV152 ja kuolematon ihmisen munasarjan epiteelisolujen linja Moody.

Semi-kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi Sox2 kuudessa munasarjatuumorissa solulinjoissa. (B) Western blot analyysi Sox2-proteiinin ilmentymistä vastaava solulinjoissa. GAPDH käytettiin normalisointi. (C) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi ja Western blot-analyysi Sox2 in Ho8910-Sox2, Ho8910-pm-siSOX2, SKOV3–siSOX2 soluissa. GAPDH käytettiin normalisointi.

tutkimiseksi edelleen toimintaa Sox2 SOC solujen Sox2 geeni yli-ilmentää lentiviraalinen infektion Ho8910, joka vahvistettiin reaaliaikainen PCR ja Länsi-blottauksella (kuvio 2C). Myöhemmin me määritti Sox2 ilmentymisen vaikutus leviämisen SOC soluja. Tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen Sox2 geenin voisi edistää SOC soluproliferaatiota (kuvio 3A ja kuvio 3B). Lisäksi tutkimme vaikutus Sox2 ilmentymisen vaikutus muuttolintujen, invasiivisia ja liima kyvyt SOC soluja käyttäen siirtokuoppaan määrityksiä ja solu-ECM adheesiomäärityksiä. Tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen Sox2 proteiinin voisi merkittävästi edistää muuttoliikettä ja invaasion SOC soluja (kuvio 4A) ja vähentää tarttumista SOC solujen Matrigel, fibronektiiniin, tyypin I kollageenin ja laminiini (kuvio 5A).

Stable transfektoimalla Sox2 plasmidin edistävät solujen lisääntymistä ja klooni muodostuminen (A) CCK8 määrityksissä in HO8910. (B) Klooni muodostumisen määritykset HO8910. Ohimenevä transfektointi Sox2 siRNA estää soluproliferaatiota ja klooni muodostuminen (C) CCK8 määrityksissä HO8910-pm. (D) Klooni muodostumisen määritykset in HO8910-pm. (E) CCK8 määrityksissä SKOV3. (F) Klooni muodostumisen määritykset SKOV3.

(A) Stable transfektointi Sox2 plasmidin HO8910. Top, siirtokuoppaan muuttoliike määritykset; Pohja, TranswellTM invaasio määrityksiä. (B) ohimenevä transfektointi Sox2 siRNA HO8910-pm. Top, siirtokuoppaan muuttoliike määritykset; Pohja, TranswellTM invaasio määrityksiä. (C) ohimenevä transfektointi Sox2 siRNA SKOV3. Top, siirtokuoppaan muuttoliike määritykset; Pohja, siirtokuoppaan invaasio määrityksiä.

(A) Vähennä tarttuvuus jälkeen vakaa transfektion Sox2 plasmidin HO8910. (B) lisätä tarttumista jälkeen ohimenevän transfektion Sox2 siRNA HO8910-pm. (C) lisätä tarttumista jälkeen ohimenevän transfektion Sox2 siRNA SKOV3.

Seuraavaksi pudotti ilmentymisen Sox2 geenin käyttäen lyhytaikaista transfektiota siRNA: iden kahdessa solulinjoissa suhteellisen korkea ilmentymä Sox2, Ho8910 -pm ja SKOV3. Häiriö tehokkuus varmistettiin reaaliaikainen PCR ja Western blotting (kuvio 2C). Sen jälkeen, vaikutus pudotus on Sox2 on näiden solujen määritettiin käyttäen CCK-8 määrityksissä ja klooni muodostumisen määritykset. Tulokset osoittivat, että häiriöt Sox2 proteiinin vähentynyt proliferaatio näiden SOC soluja (kuvio 3C-3F). Lisäksi huomasimme, että knockdovvn Sox2 proteiinin ilmentymisen esti muuttavien ja invasiivisia kyvyt SOC solujen transwell määritykset (kuvio 4B ja kuva 4C), kun taas edistää solun tarttumisen Matrigel, fibronektiiniin, tyypin I kollageenin ja laminiini (kuvio 5B ja kuvio 5C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Sox2 geeni voi olla tärkeä rooli solujen lisääntymisen, muuttoliike, invaasion ja tarttumisen SOC soluja.

yli-ilmentyminen Sox2 johtaa lisääntyneeseen fosforylaation useita pro-matastatic proteiineja

tutkittava lisää molekyylitason mekanismeista Sox2 välittämä solujen vaeltamiseen ja kasvainmetastaasit. Huomasimme, että vakaa yliekspressio Sox2 lisännyt fosforylaatiota Src ja FAK ja niiden loppupään molekyylit (P130-cas) in Ho8910 soluissa (kuvio 6). Lisäksi, kohdennettua pudotus on Sox2 geenin johti vähentää fosforylaation näiden proteiinien Ho8910-pm ja SKOV3-soluja (kuvio 6).

(A) Vasen, western blot-analyysi proteiinien ekspression jälkeen stabiili transfektio Sox2 plasmidin in ho8910. Middle, western blot-analyysi proteiinien ilmentyminen jälkeen ohimenevän transfektion Sox2 siRNA HO8910-pm. Oikea, western blot-analyysi proteiinien ilmentyminen jälkeen ohimenevän transfektion Sox2 siRNA SKOV3. (B) toinen järjestelykuluja B on samanlainen kuin A.

pudotus Src edistää solujen adheesiota ja vähentää solujen vaeltaminen ja invaasion

Edellä tulokset viittaavat siihen, että aktivointi Src voi olla vastuussa tyrosiinifosforylaatiolle p130-cas SOC soluissa. Sen määrittämiseksi, onko Src aktiivisuutta tarvitaan Sox2 aiheuttama fosforylaation p130-cas, me pudotti Src-geenin siRNA Ho8910-vektoriin ja Ho8910-Sox2 soluissa. Häiriö tehokkuus vahvistettiin Western-blottauksella (kuvio 7B). Huomasimme, että knockdovvn Src-proteiinin ilmentymisen esti muuttavien ja invasiivisia kyvyt Ho8910-Sox2 solujen transwell määrityksissä (kuvio 7A), kun taas edistää solun tarttumisen Matrigel, fibronektiiniin, tyypin I kollageenia, mutta ei laminiini (kuvio 7C). Lisäksi olemme havainneet, että fosforylaatio p130-cas voidaan heikennetty Ho8910-Sox2 solun pudotus Src-geenin (kuvio 7B). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että Src on olennaisen tärkeää Sox2 välittämän adheesion ja migraation SOC soluja.

(A) TranswellTM maahanmuutto- ja invaasion määrityksissä. (B) Western blot-analyysi proteiinien ilmentyminen (C) adheesiomäärityksellä.

Keskustelu

Sox2 on avainsäätelijänä ylläpitämiseksi pluripotenttisuus ja itseuudistumisen Alkion kantasolujen ja edesauttaa uudelleenohjelmointi eriytetty somaattisten solujen takaisin pluripotenttien kantasolujen tilassa. Viime aikoina parannettu Sox2 ilmentyminen on todettu, että useissa pahanlaatuisia kasvaimia viittaa siihen, että Sox2 säätelee myös kasvaimien syntyyn [3] – [10]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että korkeat ilmentyminen Sox2 korreloi imusuonten ja verisuonten invaasio, huono erilaistuminen, ja laski tautivapaan elinajan [3] – [8].

Vaikka yhdistys Sox2 ilmaisun kanssa huono kliininen tulos munasarjasyövän on raportoitu [11], [12], toiminnalliset roolit ja mekanismit tämän kasvain oli vähemmän toteutettiin aiemmin, varsinkin tuumorimetastaasissa ja tarttuvuus. Tutkimuksessamme Sox2 yliekspressio edistänyt solujen lisääntymisen ja klooni muodostumista. Kuitenkin tulos ei ole täysin yhdenmukainen aikaisempien raporttien [13], [14]. Tämä voi johtua siitä, että eri munasarjasyövän solulinjoissa käyttää. Viime aikoina on raportoitu, että Sox2 tavoitteita fibronektiini edistää solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen munasarjasyövän [14]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että Src voi liittyä Sox2 aiheuttamat muutokset munasarjasyöpä. Lisääntynyt hyökkäys voi liittyä lisääntyneeseen fosforylaation useita pro-metastasoitunut proteiinien aiheuttama Sox2 yli-ilmentymisen.

Src on ei-reseptori tyrosiinikinaasin ja tiedetään pelata keskeisiä rooleja eri signalointireiteissä leviämisen, muuttoliike , tarttuvuus, ja angiogeneesin aikana kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen [17], [18]. Src-kinaasi yli-ilmentynyt tai aktivoitu useita kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rintasyövän [19], eturauhassyöpä [20], paksusuolen syöpä [21], mahasyöpä [22] ja haimasyövän [23]. Lisäksi on osoitettu, että Src liitettiin Sox2 ilmaisua ja itseuudistumisen varren kaltainen side-populaatio soluja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [24]. Vaikka etäpesäke on monitekijäinen prosessi, invaasio on kriittinen linkki syöpäsolujen etäispesäkkeitä. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että vakaa yliekspressio Sox2 johti ilmeisesti lisännyt fosforylaatiota Src ja lisääntynyt invaasio kyky, kun taas pudotus on Sox2 geenin vähentänyt fosforylaation tasoon Src ja hyökkäyksen kyky SOC. Myöhemmin hyökkäys kyky oli myös vähentynyt jälkeen knockdovvn Sox2 tai Src.

p130cas voidaan fosforyloida Src tai FAK: perheen kinaasien. Se toimii rakennustelineet molekyylin säännellä proteiinikomplekseina jotka kontrolloivat solujen migraation ja adheesion, apoptoosin, solukierron, erilaistumista ja jopa kantasolujen toiminto [25], [26], [27]. Tässä tutkimuksessa havaittiin myös, että fosforylaation taso p130cas säädeltiin Src SOC linjat.

valvonta soluväliainekonstruktissa tarttuvuus on myös tärkeä rooli valvoa syöpäsolun muuttoliike aikana etäpesäkkeiden [28]. Varhaisessa vaiheessa tuumorimetastaasin, alentunut pito kyky syöpäsoluja aiheuttaa syöpäsolujen leviämistä ja invaasio muihin sivustoihin. Tutkimuksessamme adheesion vähentäminen voi olla myös johtuen lisääntyneen ilmentymisen matriksin metalloproteinaasien (MMP2 ja MMP9), minkä jälkeen yliekspressio Sox2. Fak edistänyt muodostumista Src-p130cas-Crk-Dock180 signaloinnin monimutkainen, mikä johtaa selektiiviseen korkeus Ras GTPaasi ja JNK ja lisännyt MMP2 ja MMP9 ilmaisun [29]. Olemme havainneet, että pudotus Src-geenin ilmentymistä voidaan vähentää ilmentymistä MMP2 ja MMP9. MMP2 ja MMP-9 ovat tärkeitä metalloproteinaasientsyymien jotka hajottavat ECM ja vähentää soluadheesion kyky. Toinen syy tarttuvuuden väheneminen voi johtua lisääntyneestä fosforylaation taso Src ja Erk. Eräs tutkimus on osoittanut, että Src yli-ilmentyminen voi estää proteiinin ilmentymistason integriinin alayksikön, jonka Erk paksusuolen kasvainsoluissa [30]. Niinpä me päätellä, että Src yli-ilmentyminen voi muuttaa ilmaus tai toiminta integriinin alayksikön munasarjasyöpäsoluja. Tämä selittää myös, miksi korkea ilmentyminen FN aiheuttama Sox2 yli-ilmentymisen munasarjasyöpä [14], ei johtanut tarttumisen parantamiseksi [31], mutta alhaisempi tarttuvuus tutkimuksessamme. Tutkimuksessamme Sox2 moduloitu SOC tarttumisen Matrigel, fibronektiiniin, tyypin I kollageenia, ei laminiini. Erityisiä mekanismeja tarvitse tutkia tarkemmin.

Tässä tutkimuksessa, huomasimme, että yksi niistä mekanismeista, joilla Sox2 edistänyt SOC solujen vaeltamiseen ja kasvaimen etäpesäke on kautta fosforylaation ja aktivaation p130cas ja korkea ilmentymä MMP2 ja MMP-9 . On hyvin dokumentoitu, että Src-ryhmän kinaasit ovat merkittäviä kinaasien, jotka edistävät tyrosiinifosforylaation p130cas ja lisätä ilmentymistä MMP2 ja MMP9 [26], [32], [33]. Yhdessä olemme huomanneet, että Sox2 aiheuttama fosforylaatio ja aktivaatio on osittain riippuvainen aktivointi Src.

Yhteenvetona havaintomme ehdotti, että Sox2 on keskeinen rooli SOC solujen vaeltamiseen ja kasvaimen etäpesäke, ja src signalointiryöpyn voi olla keskeinen osa Sox2 pro-metastaattinen signalointiverkolla SOC soluissa.

Kiitokset

Olemme erittäin kiitollisia professori Didier Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, 1015 Lausanne, Sveitsi) tarjoamiseksi pWPXL, psPAX2 ja pMD2.G plasmideja. Kiitämme myös tohtori Deshui Jia (Shanghai Cancer Institute, Shanghai, Kiina) hänen suureksi avuksi kielen muokkaus.