Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kehittymistä ja etenemistä peräsuolen syöpä (CRC) liittyy monimutkainen prosessi useiden geneettisiä muutoksia. Tuumorisuppressori p53 pystyy määrittämään kohtalo CRC soluja. Kuitenkin rooli p53-indusoituvan modulaattori, ribosomaalinen proteiini S27-like (RPS27L), CRC ei tunneta.

Methods

Tässä ero ilmentyminen RPS27L tutkittiin ulosteet ja paksusuolen kudoksiin CRC potilaita, tutkia sen mahdollista korrelaatio potilaiden selviytymisen ja tutkia solujen mekanismeista niiden kliinisiä tuloksia. Kahdeksankymmentä välivaiheen CRC potilasta (42 vaiheessa II ja 38 vaiheessa III) jaettiin kahteen ryhmään niiden ulosteen RPS27L mRNA-tasoja. Selviytymisen todennäköisyydet ryhmien arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmällä. RPS27L proteiini paksusuolen kudoksiin vaiheen III potilaalla on eri ennusteiden tutkittiin tarkemmin immunohistokemiallisesti. RPS27L ilmentyminen LoVo soluissa manipuloitu tutkimaan mahdollisia soluvasteiden in vitro.

Tulokset

Kohonnut RPS27L ilmaisua, joko ulosteet tai kudoksia, liittyi parempaan ennusteeseen. In vitro, RPS27L ilmentäviä LoVo solujen lakkasi DNA-synteesin ja apoptoottista aktiivisuutta, kun taas ilmaus heidän DNA korjaukseen molekyylien säädelty.

Johtopäätökset

Kohonnut RPS27L voi parantaa ennusteita tiettyjen CRC potilaille tehostamalla DNA korjaus kapasiteetti niiden paksusuolen solujen, ja voidaan määrittää ulostetta. Integroimalla kliininen, molekyyli- ja solu- tiedot, meidän tutkimus osoittaa, että ulosteen RPS27L voi olla hyödyllinen indeksi ennustamiseen ennusteet ja ohjaavat yksilöllisiä hoitostrategioita, erityisesti potilailla, joilla välivaiheen CRC.

Citation: Huang CJ, Yang SH, Lee CL, Cheng YC, Tai SY, Chien CC (2013) ribosomaalinen proteiini S27-Like kolorektaalisyövässä: ehdokkaana ennustaminen Ennusteet. PLoS ONE 8 (6): e67043. doi: 10,1371 /journal.pone.0067043

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada ja Ottawan yliopisto, Kanada

vastaanotettu: 30 tammikuu 2013; Hyväksytty: 13. toukokuuta 2013. Julkaistu: 24 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NSC96-2320-B-281-001-MY3 ja NSC100-2320-B-281-001 National Science Council, ja CGH-MR-9919 alkaen Cathay General Hospital. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehittymistä ja etenemistä peräsuolen syöpä (CRC), joka on yksi yleisimmistä kohtalokas syöpiä, mukaan monimutkainen prosessi useiden geneettisten muutosten [1], [2]. Leikkaus on optimaalinen hoito CRC potilaille vaiheissa II ja III, mutta adjuvanttihoitoa on parantanut ennusteen joidenkin näiden välivaiheen potilaiden [3]. Kuitenkin hoidosta huolimatta, jopa 25%: lla potilaista vaiheessa II ja 30-40% vaiheessa III kehittää kaukainen etäpesäke tai paikallinen uusiutuminen [4]. Molecular merkkiaineiden CRC voidaan käyttää parantamaan koskevista päätöksistä adjuvanttihoitoa näillä potilailla [5], mutta ovat edelleen kiistanalaisia ​​[3].

Kun solut kohtaavat korostaa tuumorisuppressoriproteiinia p53 pystyy määrittämään niiden kohtalon helpottaa korjaus ja selviytymistä vaurioituneiden solujen tai poistamalla pahoin vaurioituneita soluja [6]. CRC tuumorigeneesiä on jo pitkään ollut liittyvät toiminnalliset menetys p53 ja sen seurauksena muutoksia p53 reagoiva geenien [7]. Eniten tutkittu näistä p53: een reagoiva vaikutuksia on vaurioituneen DNA: ta, jonka uskotaan olevan merkittävä tekijä kasvaimen etenemistä [8]. Havaitseminen muutoksia p53-reagoiva geenejä on ehdotettu tunnistusta potilailla on suuri riski toistumista ja ne, jotka olisi harkittava adjuvanttihoitoa [9].

ryhmä ribosomien proteiinien kliinisen merkitys monien ihmisen syöpien on tunnistettu, ja geenejä, jotka koodaavat useimmat näistä ovat herkkiä p53 [10], [11]. Itse asiassa sen lisäksi, että niiden asema kokoonpano, jossa rRNA rakentaa ribosomien uusia proteiinisynteesiä, ribosomaalinen proteiinien tiedetään olevan monia extraribosomal rooleja [12] – [14]. Yksi ribosomaalisen proteiinien, ribosomaalinen proteiini S27 kaltainen (RPS27L), ilmoitettiin vaimentua ulosteen ja kasvaimen kudokset joidenkin myöhäisvaiheen CRC potilaista [15], [16]. Tämä ribosomaalinen proteiini ja sen homologista proteiinia, RPS27, on katsoa laajennettu rooleja solujen kasvun säätelyssä ja DNA korjaukseen [17], [18]. Lisäksi, RPS27L on tunnistettu p53-indusoituvan modulaattori solun kohtalon [19], [20]. Siksi tutkimme kliininen merkitys ja solujen vaikutukset RPS27L ilmaisun ja mahdollisista mekanismeista sen osallistumista kliinisiä tuloksia CRC.

Käytimme kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR (qRT-PCR) määrällisesti heterogeenisyys ulosteen RPS27L tasoa välivaiheen CRC potilasta, ja ero ilmentymistä RPS27L korreloi niiden kliinisiä tuloksia. RPS27L ilmentyminen LoVo-solujen villityypin p53 manipuloitiin tutkimaan mahdollisia soluvasteita in vitro analysoimalla muutoksia solun vaiheessa, niiden apoptoottisen toimintoja, ja DNA korjaukseen.

Materiaalit ja menetelmät

ulosteen ja kudosnäytteiden

Kiinteä ulostenäytteistä 80 satunnaista CRC potilasta (42 vaiheessa II ja 38 vaiheessa III), saadaan Cathay General Hospital tai Taipei Veterans General Hospital, kerättiin ennen leikkausta tai kemoterapiaa. Ulosteen valmistettiin kokonais-RNA mukaan meidän aiemmin raportoitu protokollaa käyttäen RNA Kit (bioman Scientific, Taipei, Taiwan) muutamin muutoksin [21] (Methods S1). Solun vaiheet CRC kudosnäytteistä (n = 68) ja potilaan eloonjäämisen data (n = 71) hankittiin potilaat, joiden ulostenäytteet analysoitiin. Toinen kuuden vaiheen III CRC kudokset kerättiin immunohistokemiallisella värjäyksellä määrittämiseksi p53: n ja RPS27L proteiineja. Tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt Institutional Review Board of Cathay General Hospital. Eettisten komiteoiden, Institutional Review Board of Cathay General Hospital, hyväksyi tämän lupamenettelyssä. Kaikki osallistujat, jos niiden kirjallinen suostumus osallistua tähän tutkimukseen. Seuranta tulokset saatiin takautuvasti, ja keskimääräinen seuranta-aika oli 39,0 kuukautta (SD, 3,1, mediaani 28,3).

lentivirustartunnat-pohjainen RNA Interference (RNAi) ja yli-ilmentyminen RPS27L

Lentivirusvektorit partikkelien vaientaa RPS27L (NM_015920) (pLK0.1-RPS27L, TRCN0000117608: GCCTAGTACAAAGTCCAAATT), vaientaa RPS27 (NM_001030) (pLK0.1-RPS27, TRCN0000117596: GAAGAGGAAACACAAGAAG) tai yli-ilmentämään RPS27L (pLKO AS3w. puro, joka sisältää RPS27L cDNA) saatiin National RNAi Core Facility sijaitsee Institute of Molecular Biology /Perimän Research Center, Academia Sinica, Taiwan. pLK0.1-Luc (TRCN0000072246) käytettiin kontrollina. Eri paksusuolen solulinjat infektoitiin kunkin lentiviruksen käyttäen protokollaa RNAi Core Facility. Lyhyesti, 8,5 x 10

5 paksusuolen soluja kasvatettiin 10 cm: n levylle 24 tuntia, ja sitten infektoitiin lentiviruksen, jonka infektiokertoimella 3. Stabiili infektoidut solut valitaan ja pidettiin elatusaineessa, joka sisälsi 2 ug /ml puromysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA). Muutokset ilmaus kohdegeenien määritettiin qRT-PCR: llä tai immunoblottauksella (Methods s1).

Apoptosis Assay

24 tuntia ennen VP16 (tunnetaan myös etoposidi tai VP-16 -213, topoisomeraasin II: n estäjä) käsittelyn jälkeen solut ympättiin 16-kuoppaisille kammion dioja tiheydellä 5 x 10

3 solua kuoppaa kohti. Joko RPS27L-ilmentävien (shLuc) tai RPS27L-puuttuvat (shRPS27L) LoVo-soluja käsiteltiin 10 uM: n VP16: ssa 48 tuntia. Tunnistaa apoptoosin-positiivisia soluja, solut värjättiin anneksiini-V /PI kaksinkertainen värjäys määrityksessä, jossa FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences) mukaan valmistajan protokollaa, jossa on pieni muutos. Lyhyesti, solut pestiin pesupuskurilla (20 mM Tris [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1 mM CaCl

2) sen jälkeen, kun oli inkuboitu 15 minuutin ajan sitoutumisen, joka sisälsi 5 ui anneksiini V-FITC: tä ja 5 ui PI huoneenlämpötilassa pimeässä. Lisätodisteita esiintymisen apoptoosin saatiin käyttäen mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨ) ja pilkotaan poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP). Vaihtelut ΔΨ paljastui kautta mikroskooppinen fluoresenssi käyttäen MitoLight Apoptosis Detection Kit (Millipore, Billerica, MA), joka sisältää 5,5 ’, 6,6′-tetra- 1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidia (JC- 1) mukaan valmistajan ohjeiden, vähäisin muutoksin. Ensimmäinen, 6 x 10

4 paksusuolen solua kuoppaa kohti inkuboitiin ja käsiteltiin VP16, kuten edellä on kuvattu. Kun oli inkuboitu 24 tuntia VP16, kukin näyte käsiteltiin laimennettiin MitoLight reagenssia (0,2 ui MitoLight ja 180 ui: aan deionisoitua vettä) ja 20 ui 10 x inkubaatiopuskuria 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Erittäin negatiivinen kalvojännite- mitokondrioissa tuottaa oranssinpunainen fluoresenssin JC-1, ja menetys mitokondrion transmembraanisen potentiaalin tuloksia vihreän fluoresenssin, menetys punaisen fluoresenssin. Tasot katkaistun PARP-proteiinin määritettiin immunoblot (Methods s1).

γ-H2AX Foci muodostumisen määritys

jälkeen 5 x 10

4 LoVo solua kuoppaa kohti oli inkuboitu 24 tuntia, DNA kaksijuosteisen tauot (DSB: t) indusoitiin näissä soluissa 10pM VP16. Solut kyky korjata DSB: ihin määritettiin värjäämällä ne anti-γ-H2AX vasta-käyttäen OxiSelect DNA Double langanvalvoja Värjäys Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA), mukaan valmistajan ohjeiden, muutamia pieniä muutoksia. Lyhyesti, solujen annettiin toipua poistamalla DSB indusoijan ilmoitettu aikoja. DSB paljasti (kuten γ-H2AX pesäkkeitä) esiintyi vihreän fluoresenssin, ja tumat visualisoitiin counterstaining ne DAPI (4′-6-diamino-2-fenyyli). Vihreä fluoresenssi osoittaa γ-H2AX pesäkkeitä visualisoitiin Adobe Photoshop CS4 Extended (ver. 11,0, Adobe Systems, San Jose, CA) 100-200 satunnaisesti valitut solut. Kynnys määritettiin mittaamalla vastaavia tasoja vihreä väri soluissa, jotka oli toipunut eri aikoina (0 tuntia, 2 tuntia tai 4 tuntia). Tulokset esitetään prosenttiosuudet solujen säteilevät fluoresenssia kynnystason yläpuolelle.

Tilastollinen analyysi

Eloonjäämiskäyrät ja eloonjäämisen todennäköisyys arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä ja verrattiin käyttäen log-rank testata. Muuttujia

P

-arvoja ≤ 0,1 yksiulotteista analyysit sisältyvät monimuuttuja malli Coxin suhteellisten riskien analyysi käyttäen anna menetelmää selviytymisen analyysiä. Erot geenin ilmentymisen ja numerot γ-H2AX pesäkkeitä verrattiin käyttäen Studentin t-testiä. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 13.0 ohjelmistolla (SPSS, Somers, NY). MedCalc tilastollinen ohjelmistopaketti (MedCalc, Mariakerke, Belgia) käytettiin tuottamaan receiver operating (ROC) käyriä. Tiedot kuvassa edustavat ainakin kolmen kokeen kanssa samanlaisia ​​tuloksia, ja

P

-arvot 0,05 pidetään merkittävänä.

Tulokset

kliinistä merkitystä RPS27L vuonna CRC

taso ulosteen RPS27L korreloi positiivisesti prosenttiosuus CRC solujen välivaiheen CRC potilasta S-vaiheessa (r

s = 0,259;

P

= 0,033, Pearson korrelaatio testata). Suoritimme ROC-käyrä analyysin ja ositettiin potilaat kahteen ryhmään käyttäen ulosteen RPS27L tasolla 0,0014, jonka herkkyys on 0,80 (95%: n luottamusväli [CI], 0,28-0,99) ja spesifisyys 0,77 (95% CI, 0,66-0,86) saavutettiin, ennustaa ennusteeseen potilailla. Alue ROC-käyrän alla ulosteen RPS27L oli 0,733 (

P

= 0,017), jossa on 95%: n luottamusväli 0,623-,826 (kuvio 1A). Eloonjäämisluvut verrattiin välillä RPS27L

+ (n = 51; ≥ 0.0014) ja RPS27L

– ryhmät (n = 20; 0,0014); Viiden vuoden tautikohtaisia ​​eloonjäämisen (DSS) oli korkeampi RPS27L

+ ryhmässä (97,1% ± 2,8%) kuin RPS27L

– ryhmässä (69,6% ± 12,9%; p = 0,028, log -rank testi). Ei suhde oli ilmeinen välillä RPS27L

+ ryhmä ja muut kliinispatologiset parametrit (taulukko 1). Kuitenkin yhden ja usean Coxin suhteellisten riskien analyysit osoittivat, että ulosteen RPS27L taso oli itsenäinen ennustetekijä (vaarojen suhteen, 0,086; 95% CI, 0,009-0,852;

P

= 0,036) ja DSS on välivaiheen CRC potilasta (taulukko 2). Lisäksi kolme nonrecurrent potilasta (vaihe III), jossa suotuisa ennusteet (selviytymisen 8 vuotta) näkyy voimakas immunohistokemiallisella värjäyksellä p53 ja RPS27L kudosleikkeiden (kuvio 1 B, potilaat 1-3). Kolme muuta vaiheen III potilailla, jotka kärsivät uusiutuminen vuoden kuluessa leikkauksen ja kuoli ensimmäisen toistumisen (selviytymisen 4 vuotta), olivat positiivisia myös p53-proteiinin niiden kasvainsolujen, mutta ilmaus RPS27L proteiini oli heikko vastaaviin asemat (kuvio 1 B, potilaat 4-6).

(A) Kliiniset merkitys RPS27L mRNA ulostetta. Tasot RPS27L mRNA suhteellisen kvantifioitiin qRT-PCR. Pisteiden vastaanotin toimii ominaiskäyrä (musta upotus) edusti herkkyys ja (1-spesifisyys) DSS. Kaplan-Meier arvioitu DSS riippuvainen RPS27L mRNA (RPS27L-, 0,0014; RPS27L +, (0,0014) ulosteeseen CRC potilaista. (B) Protein tasot p53 ja RPS27L CRC kudoksissa. Jokainen näyte värjättiin anti- p53 ja anti-RPS27L vasta kahden vierekkäisen osaan. kertaluonteiset potilaat: potilaat 1-3, selviytymisen 8 y, toistuva potilaat: potilaat 4-6, selviytymisen 4 v. Kaikki objektilasit vasta- värjättiin hematoksyliinillä. sama alalla upotettavat pienellä suurennuksella (40 ×) näytettiin suuremmalla suurennuksella (200 x). Nuolet vastaava positiot kullekin potilaalle.

translokaatio RPS27L kolorektaalisyövän Cancer Cells

tutkimiseksi solun toimintaa RPS27L, me tartunnan LoVo-soluja, villityypin p53-ilmentävä solulinja alkaen vaiheessa vaiheessa III CRC käyttäen lentivirus-välitteisen lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) ja tehokkaasti kaataa RPS27L lauseke (shRPS27L) tai kontrolli shRNA (shLuc) (Kuva S1). immunosytokemi- värjäyksen endogeenisen RPS27L oli positiivinen sytoplasmassa shLuc-tartunnan LoVo soluissa, mutta oli negatiivinen soluissa tartunnan shRPS27L (kuvio 2A) . Sytoplasmisen RPS27L oli kulkeutua tumiin 10 uM: n VP16-käsiteltyjen LoVo-soluja, ja voimakas värjäytymisen RPS27L proteiinin ytimet on esitetty kuviossa 2B. Tämä VP16 aiheuttama muutos havaittiin myös aikana immuunidetektio RPS27L alkuperäisessä LoVo soluja (kuvio 2C).

(A) Cellular lokalisoinnin RPS27L. RPS27L oli immunologiseen värjätty eri LoVo soluissa. (B) Nuclear induktioon RPS27L käyttäen 10 (M VP16. Nuolet sisäkkeet (a ja b) ilmoitti tiivistyvät ydin- RPS27L-tahrat. (C) Immuno-havaitseminen RPS27L eri tumaekstraktien. Tumauute valmistettiin synkronoitu LoVo soluista jossa VP16 kuten. shLuc, RPS27L ilmentäviä soluja, shRPS27L, RPS27L-puuttuu soluja, overRPS27L, RPS27L yli-ilmentäviä soluja. Anti-RPS27L vasta-aine, 1:2000.

Cellular Effects of Down-säänneltyjen RPS27L in peräsuolen syövän solut

vieressä analysoitiin solujen vaikutuksia RPS27L yli-ilmentämällä RPS27L LoVo-soluja (overRPS27L) (kuvio S1). Samanlaisia ​​solusyklin sääntelyn havaittiin VP16-free-soluja (riippumaton RPS27L lauseke) kuten on raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa (kuvio 3A) [22]. Kun DNA synkronoitu solujen vahingoittui VP16 täydellisessä väliaineessa, numerot solujen S ja G

2 /M vaihetta lisäsi mukaan ilmaus RPS27L (shLuc tai overRPS27L). kuitenkin toinen samanlainen RP,

RPS27

, ei muuttanut koko S-vaiheen väestöstä, riippumatta tason

RPS27

ilmaisun jälkeen, VP16 käsittely (kuvio S2). Samanaikaiseen mittaukseen DNA sisällön ja määrän BrdU-leimattu DNA osoitti, että oli vähemmän soluja, joilla on aktiivinen DNA-synteesin joukossa RPS27L-puuttuu soluja (21% shRPS27L) hoidon jälkeen 10 uM VP16 (kuvio 3B). Sen sijaan, sekä RPS27L ilmentävien ja RPS27L yli-ilmentäviä soluja oli suurempi osuus solujen aktiivisen DNA-synteesin (32% shLuc ja 37% overRPS27L) samoissa olosuhteissa (kuvio 3B).

(A ) solukierron säätelyssä. Cell faasit määritettiin seuraavat indikoidun VP16 hoitoa. (B) Solut, joissa juuri syntetisoidun DNA alle VP16 hoitoa. Prosenttiosuus BrdU-positiivisten solujen (siniset täplät) määritettiin seuraavat indikoidun VP16 hoitoa. (C) anneksiini V /PI double-värjäys määrityksessä. Nuolten anneksiini V-FITC ja PI-positiivisia soluja. VL, näkyvää valoa; PI, propidiumjodidi. Green spot, anneksiini V-FITC; punainen täplä, PI. (D) Solut JC-1 tahra. Nuolet merkitty punaisella rakeinen kuvio JC-1 aggregaatiota. (E) Immuno-havaitseminen PARP pilkkominen. Lohkaista PARP, 89 kDa; GAPDH, 36 kDa. shLuc, RPS27L-ilmentävät solut; shRPS27L, RPS27L-puuttuvat solut; overRPS27L, RPS27L yli-ilmentäviä soluja.

apoptoottinen aktiivisuus RPS27L LoVo soluissa arvioitiin. Lyhyesti, ohjaus solut (shLuc) olivat negatiivisia anneksiini V-FITC. RPS27L-puuttuu soluja (shRPS27L) sisälsivät enemmän anneksiini-V-positiivisten solujen ja näytetään myöhäinen apoptoottiset (tai nekroottisen) vaiheessa, kun kaksinkertaisesti positiivisesti värjättyä (anneksiini V ja PI) (kuvio 3C). Lisäksi elävät solut, jotka ekspressoivat RPS27L havaittiin käyttämällä punaista rakeista kuvio JC-1 aggregaation soluissa, joita käsiteltiin 10 uM VP16 (kuvio 3D) ja kohonneet pilkotun PARP havaittiin kasvavien pitoisuuksien kanssa VP16 (kuvio 3E). Vuonna RPS27L-puuttuu soluihin, tämä punainen rakeinen kuvio ei ollut olemassa, ja korkein pilkotun PARP havaittiin (kuviot 3D ja 3E).

DNA Korjaustoiminto of RPS27L kolorektaalisyövässä solut

Me tarkemmin määrällisesti mRNA ilmentymistä E2F-transkriptiotekijän 1 (E2F1), RAD51, ja proteiinikinaasi, DNA-aktivoitu, katalyyttinen polypeptidi (PRKDC) tunnistaa aseman RPS27L in VP16-indusoidun DSB. In RPS27L-puuttuu soluja, käsittely 10 uM VP16 indusoi 63,6%: n vähennys (1,1- 0,4-kertaisesti) E2F1 ilmaisun ja 54,5%: n vähennys (1,1- 0,6-kertaisesti) RAD51 ilmentyminen (kuvio 4A). Samalla vähennetään ilmaus PRKDC (0.8- 0,5-kertainen) havaittiin myös samoissa käsittelyolosuhteissa. Prosenttiosuus solujen voimakas fosforyloidun histoni H2AX (γ-H2AX) pesäkkeitä väheni asteittain, kun korjaus lisääntyi 0-4 tuntia, riippumatta siitä, onko LoVo solut ilmensivät RPS27L (kuvio 4B). Kuitenkin viive kinetiikka alenevan intensiteetin γ-H2AX pesäkkeitä havaittiin soluissa, joista puuttuu RPS27L ilmaisua. Jopa 61% RPS27L-puuttuu soluista sisälsi suuren tiheyden γ-H2AX pesäkkeitä korjauksen jälkeen 4 tuntia, kun taas vain 17% RPS27L ilmentävien solujen ylittivät tiheys kynnystä γ-H2AX pesäkkeitä tuolloin (kuvio 4C) .

(A) Suhteellinen ilmaisuja DNA korjaus geenit. MRNA tasot

E2F1, RAD51

, ja

PRKDC

kvantitoitiin käyttäen qRT-PCR seuraavista solujen osoitetun VP16 hoitoon. Suhteellinen ekspressio kunkin geenin laskettiin vertaamalla että shLuc soluja ilman VP16 hoitoa. (B) edustaja valokuvia solujen γ-H2AX pesäkkeitä. Solujen annettiin toipua poistamalla DSB indusoijan 4 h (100 x). Kynnys määritettiin mittaamalla vastaavia tasoja vihreän fluoresenssin (γ-H2AX pesäkkeitä, paljastui DSB: t) välillä shLuc ja shRPS27L soluja. Sisäkkeet (200 x): 1 ja 4, γ-H2AX pesäkkeitä (myös osoitettu kynnys); 2 ja 5, DAPI; 3, yhdistää 1 ja 2; 6, yhdistää 4 ja 5 (C) tilastollinen ero γ-H2AX pesäkkeitä soluissa. Soluja käsiteltiin 10 uM VP16 1 h ja otetaan talteen määritettynä ajankohtana. Prosenttiosuus 100-200 satunnaisesti valitun soluja, joiden vihreä fluoresenssi oli korkeampi kuin kynnys oli ilmoitettu. shLuc, RPS27L-ilmentävät solut; shRPS27L, RPS27L-puuttuvat solut. Tiedot ovat keskiarvo ± SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01. Toinen tai kolmen erillisen kokeen tehtiin.

Keskustelu

molekyylimerkit voi muodostaa paremman perustan valittaessa hoitoa kuin kliiniset ja histopatologiset kriteerien [23]. Karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) ja syövän antigeeni 19-9 (CA19-9) ovat laajimmin käytetty merkkiaineina CRC [24]. Kuitenkin korkea joko seerumin CEA tai CA19-9 katsotaan osoittavan epäedulliseen ennusteeseen CRC potilaalla on välivaiheen tauti [25], [26].

Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet CRC potilaiden väli- taudin vaiheessa, koska adjuvanttihoitona on tärkeää näille potilaille. Olemme aiemmin raportoitu, että ilmaisu lukuisten RP, kuten RPS27L, erosivat merkittävästi ulosteet CRC potilaiden; mutta ei merkittävää ilmaisu eroa löydettiin RPS27, jäsen samaan perheeseen kuin RPS27L [15]. Olemme nyt osoittaneet, että välivaiheen potilailla, joilla on lisääntynyt ulosteen RPS27L ilme oli korkeampi DSS korko ja paljon pienempi vaaroja suhde.

Tällä hetkellä seurataan toimiva p53 määrittämällä ulosteiden RPS27L tilan potilaalla on välivaiheen CRC. Kliinistä merkitystä RPS27L ei ollut ainoastaan ​​osoitettu ulostenäytteistä, mutta myös CRC kudosnäytteistä. In välivaiheen CRC, voimakas RPS27L värjäys, kasvun kanssa p53-proteiini, CRC kudoksessa havaittiin potilailla, näytetään elinajan pitenemiseen. Kuitenkin potilaat, joiden p53-proteiini ei aktivoida ilmentymistä RPS27L oli huono ennusteet, joiden tauti uusiutui ja lyhyempiä selviytymistä. Tämä tarkoittaa, että välivaiheen CRC potilailla, joilla on korkeampi RPS27L tasoilla, olipa kyse ulosteet tai kudoksiin, ovat edullisempia ennusteeseen, ja johdonmukainen p53 ja RPS27L oli näillä potilailla, joilla on paremmat ennusteet.

Tämä on ensimmäinen raportti osoittaa, että RPS27L on potentiaalinen prognostinen merkkiaine CRC. Meidän kliiniset näytteet, taso ulosteen RPS27L korreloi positiivisesti prosenttiosuus CRC solujen S-vaiheessa. Nämä kliiniset tiedot ovat johdonmukaisia ​​sen tuloksia synkronoitu LoVo soluista, jotka ilmensivät RPS27L. RPS27L ja sen homologista proteiinia, RPS27, voivat olla vuorovaikutuksessa p53-MDM2-akselilla eri solutyypeissä [20]. Tässä tutkimuksessa käytimme RNA-interferenssi (shRPS27L) kaataa RPS27L ilmentymistä LoVo soluissa. Olemme havainneet, että mitään eroa RPS27 ilmentymistä havaittiin soluista kanssa tai ilman RPS27L hiljentäminen (meidän julkaisematon data), ja ei ole yhtenäisiä solujen vaikutus havaittiin RPS27L- ja RPS27-puuttuu LoVo-soluihin. Edelleen, shRPS27L ei vaikuta ilmaisua muiden geenien, vaikka ne (klotho, NM_004795, archaelysin perheen metallopeptidaasi 1, NM_133463) ja mRNA-sekvenssien, jotka on osittainen vastineita shRPS27L (kuva S3). Itse asiassa, klotho ja archaelysin perheen metallopeptidaasi 1 luonnollisesti ilmaistaan ​​alhaisilla tasoilla tavoitteemme CRC-solulinja, LoVo (tuloksia ei ole esitetty) [27], [28]. Kaiken kaikkiaan meidän tulokset vahvistavat, että vaikutukset shRPS27L ovat erityisiä. Lisäksi proteiinisekvenssin RPS27L on tarkastettava ihmisen genomin UCSC genomin palvelin [29]. Kaksikymmentäyhdeksän proteiinisekvenssien kanssa eriasteista identiteetin (61,6% -98,8%) ja RPS27L tunnistettiin, mutta mikään näistä tippuu alas shRPS27L, sen erityisten järjestyksessä. Tämä osoittaa jälleen kerran korostaa, että mitään muuta proteiinia kuin RPS27L voidaan tippuu alas shRPS27L.

jälkeen vahvistuksen spesifistä vaikutusta shRPS27L, me arveltu, että p53: een reagoiva RPS27L aiheuttaa pidätys solujen S-vaiheessa kun solun DNA vaurioituu. Sen jälkeen, kun DNA-vaurioita ja p53 indusoitiin lisäämällä VP16, BrdU-positiivisten solujen S-vaiheessa kertynyt joukossa RPS27L ilmentävien LoVo-soluihin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että RPS27L aiheuttaa solujen pidättämään S-vaiheessa seuraavia vaikuttavia DNA-synteesiä, ja ei salli näiden solujen tulla M vaiheeseen. Se havainto, anneksiini-V-positiivisten ja JC-1-yhteen-soluissa viittaa vahvasti siihen, että DNA-vaurioittava aine, VP16, indusoi antiapoptoottista vaikutusta soluissa, jotka ilmentävät sekä villityypin p53 ja RPS27L. Tämä antiapoptoottisten vaikutus heijastui myös korkeammilla tasoilla pilkkoa PARP on RPS27L-puuttuvat solut. Aktivointi PARP on myös olennaista säätelyyn monissa solun prosesseja, mukaan lukien DNA: n korjaus- ja solukuolemaan [30].

Kuitenkin, aktiivisen DNA-synteesin ja antiapoptoottisten vaikutus havaittiin, vaikka solun DNA oli vaurioitunut, näyttävät ristiriidassa meidän kliinisiä tietoja, mikä osoittaa, että potilailla, joilla on korkeampi RPS27L ilmaisun on suotuisampi ennuste. Oletamme, että nonapoptotic solujen vaurioitunut DNA on saatava sopiva menetelmä DNA: n DSB korjaus, ja että kohdistaminen DNA korjaus proteiineja tulee käyttää mahdollisimman laajasti syövän hoidossa [31]. Tämä voidaan havainnollistaa määrällisesti kahden DNA: n DSB korjaavien geenien, RAD51 ja PRKDC [32], ja yksi geeni, joka koodaa osan korjausta komplekseja, E2F1 [33]. Heidän alennettu ilmaus samaan RPS27L Knockdown käsittelyn jälkeen pienellä annoksella VP16. Tämä vastaa tuloksia, jotka E2F1 näyttelee toiminnallista roolia tukahduttamaan apoptoosin ja edistää DNA korjaus in vivo DNA-vaurioita [34]. Näin ollen, RPS27L tarvitaan tukahduttaa apoptoosin ja DNA: n DSB korjaus koolonin soluihin, jotka ilmentävät villityyppistä p53: a. Lisäksi VP16 aiheuttama DSB voi aiheuttaa kertymistä RPS27L proteiinin ytimet LoVo-soluihin. Tämä viittaa siihen, että DNA: n DSB vaurioita on kriittinen rooli indusoimisessa liikkeen RPS27L proteiinin sytoplasmasta tumaan. Xiong et ai. myös raportoitu samankaltaisia ​​tuloksia tutkimuksessa ihmisen keuhkon adenokarsinooman epiteelisolujen [20]. Me spekuloida, että translokaatiota RPS27L proteiinin voisi olla ratkaiseva säätelyssä joidenkin DNA korjaavien geenien. Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään suhdetta RPS27L ilmaisun ja DNA: n DSB korjaavien geenien.

Ratkaiseva sääntely RPS27L DNA: n DSB korjaus voidaan myös arvioida mittaamalla kinetiikka muutosten lukumäärän γ -H2AX pesäkkeitä [35]. Yhdessä tulokset BrdU ehdotamme, että RPS27L osallistuu DNA: n DSB korjaus mekanismin kautta homologisen rekombinaation, koska useimmat BrdU-positiiviset solut rajoitettu myöhään S-vaiheeseen [36]. Tämä osittain vastaa havaintoja Miquel et al., Joka osoitti, että suuri osa CRC solut eivät pysty korjaamaan DNA muutosten takia yhden tai useamman komponentin kaksi DNA-korjaus mekanismeja, kuten homologinen rekombinaatio polku [37 ].

Johtopäätökset

Kohonnut p53-reagoiva RPS27L kertymistä tumassa voi parantaa ennusteita tiettyjen CRC potilaita, mahdollisesti sen vaikutus DNA: n korjautumista paksusuolen soluissa. RPS27L kertymistä voidaan havaita ulosteissa. Integroimalla kliininen, molekyyli- ja solu- tiedot, tutkimuksemme on osoittanut, että ulosteen RPS27L voi olla indeksi ennusteen CRC potilaille ja voi ohjata henkilökohtaista hoitostrategioita, erityisesti potilailla, joilla välivaiheen CRC.

tukeminen Information

Kuva S1.

tehokas muutokset RPS27L ilmaisun suorittamalla lentivirusta välittämä kokeita LoVo soluissa. Vakaa RPS27L ilmentäviä (shLuc), RPS27L-puuttuvat (shRPS27L), ja RPS27L yliekspressoivia (overRPS27L) LoVo solut hankittiin eri lentivirustartunnat. RPS27L, 9 kDa; GAPDH, 36 kDa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0067043.s001

(TIF) B Kuva S2.

vaikutus RPS27 ilmaisun virtaussytometrialla. LoVo-soluja, jotka joko vaiennetaan RPS27 (shRPS27) tai tartunnan ohjaus virus (shLuc) käsiteltiin DMSO: ssa tai 10 uM VP16. Lajittelu analyysit propidiumjodidia (PI) -stained solujen virtaussytometrialla. Noin 104 solua eri vaiheissa solusyklin määritettiin käyttäen FlowJo 8,7 ohjelmistoa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0067043.s002

(TIF)

Kuva S3.

mRNA-sekvensseihin osittaisella otteluiden shRPS27L. shRPS27L oli RNA-interferenssi kaataa RPS27L ilme. Jokainen piste tarkoitetaan identtinen nukleotidisekvenssin sekvenssin kanssa shRPS27L. Valikoimia Hyväksytty sekvenssit kussakin cDNA ilmoitettu. Ribosomaalinen proteiini S27 kaltainen (RPS27L): NM_015920; klotho: NM_004795; archaelysin perhe metallopeptidaasi 1 (AMZ1): NM_133463.

doi: 10,1371 /journal.pone.0067043.s003

(TIF) Tool Menetelmät S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0067043.s004

(DOC) B

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Drs. Jen-Kou Lin ja Shih-Ching Chang (molemmat Department of Surgery, Taipei-Veterans General Hospital) joka ilmoitti meille kliiniset tiedot joidenkin potilaiden ja Dr. Yih-Yiing Wu hänen erinomaisen tuen patologian. Kiitämme myös National RNAi Core Facility Institute of Molecular Biology /Perimän Research Center, Academia Sinica tarjota RNAi reagenssit, jotka tukivat National Research Program Perimän Medicine Avustukset NSC (NSC 97-3112-B-001-016) .