Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kantokääpä (Sw. Ex Fr. m) Karst

(FPK), joka kuuluu Basidiomycotasta sieni luokka on yksi suosituimmista lääketieteen sieniä Kiinassa. Sitä on käytetty monia sairauksia: syöpä, sydän ja verisuonitaudit, diabetes ja niin edelleen. Kuitenkin vähän tutkimusta pro-apoptoottinen vaikutus ja muuttoliike esto FPK kloroformiuutetta (FPKc) on raportoitu ja mahdollinen mukana mekanismia ei ole valaistu.

Menetelmät /Principal Havainnot

Chemical analyysi suoritettiin HPLC: llä, joka osoitti, ergosterolin (ES) pitoisuus oli 105 ug /mg. MTT-analyysi paljasti, että FPKc voi selektiivisesti inhiboida SW-480-soluja elinkelpoisuutta IC

50 190,28 ug /ml. Haavan paranemista ja transwell määritys osoitti, että FPKc voi estää migraation SW-480-soluja tietenkin FPKc voisi myös huomattavasti vähentynyt metalloproteinaaseja-2, 9 (MMP-2 ja MMP-9) ilmaisun. Anneksiini V-FITC /PI-värjäys, ydin- Hoechst 33342 värjäytymistä ja DNA pirstoutuminen analyysi osoitti, että FPKc ja ES voisi aiheuttaa SW-480-solujen apoptoosin. Apoptoosi prosessin tiiviisti mukana ROS kertymistä ja ehtyminen GSH, kaspaasi 3, poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) hajoaminen. FPKc voi myös säätää ylös P53 ilmaisun ja siten johtaa G1 vaiheen pysähtymisen. Kun SW-480-soluja esikäsiteltiin N-asetyylikysteiini (NAC), ROS sukupolvi, solujen elinkelpoisuuden ja apoptoottista suhde oli osittain vähentynyt, mikä osoitti, että ROS oli pystysuorassa pro-apoptoosi prosessi aiheuttama FPKc. Lisäksi koko prosessin, ES, joka on aiemmin löydetty FPKc oli samanlainen vaikutus kuin FPKc. Näin voisimme päätellä, että ES, koska yksi korkeimmista runsas komponenttien FPKc, voi olla yksi vaikuttavat ainesosat.

Päätelmä /merkitys

FPKc voi estää migraation SW-480 solut, aiheuttaa SW-480-solut G1 vaiheen pysähtymisen ja aiheuttaa ROS-välitteisen apoptoosin vaikutus. Ja ES voisi olla yksi tehokas ainesosien koko prosessissa.

Citation: Wang Y, Cheng X, Wang P, Wang L, Tuuletin J, Wang X, et al. (2014) tutkitaan kulkeutumistestis- ja apoptoottinen vaikutus

kantokääpä

kloroformiuutetta Human peräsuolen syövän SW-480 solut. PLoS ONE 9 (7): e101303. doi: 10,1371 /journal.pone.0101303

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 19 joulukuu 2013; Hyväksytty: 3 kesäkuu 2014; Julkaistu: 3. heinäkuuta 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kasvain fleetness kasvaa maailmanlaajuisesti joka vuosi. Joka vuosi lähes puolet diagnosoiduista potilaista olisi kuollut tautiin [1]. CRC pidetään kolmanneksi yleisin pahanlaatuinen kasvain ja kolmanneksi yleisin kuolinsyy syöpään Yhdysvalloissa [2]. Vaikka ilmaantuvuus CRC on huomattavasti alempi Aasiassa vertaamalla että USA: ssa, se on kasvanut nopeasti Kiinassa [3]. Vaikka perinteinen hoito CRC kirurgia, sädehoito, ja nykyinen kemoterapia-optiot ovat olleet poissa tehokkuuden ja on monia sivuvaikutuksia [4]. Kaikki nämä ongelmat korostavat selvittää uuden agentti CRC. Kuten perinteinen kiinalainen lääketiede on ollut yhä suositummaksi, sitä on pidettävä mahdollisina terapeuttisena aineena sen korkean tehokkuuden ja turvallisuuden [4].

kantokääpä (Sw. Ex Fr.) Karst

(FPK) joka kuuluu Basidiomycotasta sieni luokka on yksi yleisimmistä puun tonkia sienistä ja laajalti monissa maissa ympäri maailman, kuten Japani, Korea, Kiina ja Ruotsi [5]. FPK oli perinteisesti käytetty terveys ravinnonlähde kasvien kasvun säätelyssä ja diabetes Japanissa [6], [7]. FPK kuin myrkytöntä luonnollinen tuote on yhä houkuttelevampi tutkijoille, ja sen otteet on raportoitu olevan anti-inflammatorisia, anti-mikrobi, anti-sieni ja syövänvastainen vaikutus [8], [9], [10]. Syövän vastaista vaikutusta FPK, tutkimus lähinnä sen etyyliasetaatin ja etanolin otteita. Esimerkiksi Ren G osoittanut sekä bensiinin eetterillä ja etyyliasetaatilla otteita FPK on sytotoksisuutta joissakin kasvainsolulinjoja kuten Hela ja SMMC-7721 [11]. Hung-Tsung Wu Taiwanin on osoittanut F. pinicola etanoliuutos on syövän vastainen vaikutus S180 soluihin in vitro ja in vivo. Hän osoittaa myös, että se voisi laukaista Homo sapiens hepatooma (HepG2), keuhkosyöpä (A549), peräsuolen syöpä (HCT-116) ja rintasyöpä (MDA-MB-231) solujen apoptoosin [12]. Ja FPK kloroformiuutetta (FPKc), on vain yksi raportti osoittaa sen anti-sieni vaikutus [10]. Parhaan tietomme, vähän tietoa syövän vastaisen vaikutuksen FPKc on julkaistu. Siksi ensimmäinen Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko FPKc ominaisuudet pääsevät vaikuttamaan syövänvastainen vaikutus meidän koejärjestelmässä, sitten keskitytään pääasiassa tutkii kulkeutumistestis- ja pro-apoptoosin vaikutuksesta FPKc ja mahdolliset mukana mekanismeja.

lisäksi kemiallinen analyysi FPK otteita, jotka pääasiassa suuntaa n-heksaani ja metanoli otteita FPK sisältää joitakin triterpenoids kuten ergosterolia ergosterolin johdannaiset, lanostane triterpenes ja niin edelleen [13], [14]. Vaikka kemiallinen analyysi noin FPKc ei ole koskaan tutkittu. Koska ergosterolin (ES, kuva 1) on raportoitu laajasti jakaa monenlaisia ​​sieniä ja näkyä syövänvastainen vaikutus [15], [16]. Täten muut Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia kemiallisten komponenttien FPKc ja tutkia, ES toimi kun FPKc suorittaa sen syövänvastainen vaikutus.

Menetelmät ja materiaalit

kokoelma ja valmistelu Kloroformiuute

ei erityisiä oikeuksia tarvittiin sijainti jossa FPK kerättiin ja tässä tutkimuksessa ei liittynyt uhanalaisten tai suojeltujen.

tuoretta FPK kerättiin heinäkuussa 2011 Pingheliang, etelästä of Qinling Vuoria, Shaanxin maakunnassa Kiinassa (leveysaste, 33 ° 27’N, pituutta, 108 ° 30 ’itäistä pituutta; korkeus, 2305 m). Se oli todennettu professori Yaping Xiao ja talletetaan opetusministeriön, Key laboratorio lääkekasvi Resource (MPR) ja Natural farmaseuttisen kemian, Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi, PR China.

etanolia otteen FPK saatiin läpi ultraääni uuttomenetelmällä ja sitten konsentroitiin pyöröhaihduttimessa (RE-2000 A; Belong, Shanghai, Kiina). Kolmanneksi se kuivattiin kylmäkuivaajassa (ALPHA1-2, Kristus, Saksa) ja lopuksi lyofilisoidaan. Etanoliuute fraktioitiin sitten kloroformilla (CHCI

3). Kloroformi fraktio homogenoitiin 70% etanolia, ja supernatantti suodatettiin käyttämällä 0,22 mm: n suodattimia.

HPLC-analyysi

määritys FPKc ja ES arvioitiin läpi korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) analyysimenetelmä. LC koostui Shimadzu LC-20AT (Shimadzu Corp., Kioto, Japani), jossa kvaternaaripumpulla, termostaatti pylvästä ja Shimadzu LC ratkaisu ohjelmisto. Erottaminen phytochemicals saavutettiin on Shim-pack VP-ODS C18 (Shimadzu, 1504,6 mm; 5 mm raekoko). Liikkuva faasi koostui asetonitriilin ja veden. Gradienttieluutio ohjelmaa käytettiin 10-100% asetonitriiliä (v /v) on 0-80 min, 100% -85%: iin 80-90 minuutin aikana pitäen 85%: 90-100 min. Pylvään lämpötila pidettiin jatkuvasti 40 ° C: ssa, ja liikkuva faasi virtausnopeus oli 0,8 ml /min. Ja havainnointiaallonpituus oli 254 nm ja 20 ui näytettä injektoitiin. Re-tasapainotuksen kesto oli 15 min yksittäisten ajojen.

Kalibrointikäyriin

ES standardia tuotiin Sima, Tianjin, Kiina. Puhtaus osoitettiin olevan yli 98%. Kalibrointikäyrät rakennettu laimennoksilla 2000 1000, 500, 250, 125 ug /ml metanolissa. Tilavuus 20 ui injektoitiin jonka kolmena kappaleena ja kalibrointikäyrät perustuivat keskimäärin huippu alueilla jokainen kromatogrammi. Kalibraatiokäyristä osoittivat R

2 0,993 ES.

Soluviljely

SW-480, SW-620, Caco-2 ja HEK-293-solut hankittiin solu pankki Kiinan Academy of Science, Shanghai, Kiina. SW-480, SW-620 Caco-2 ja HEK-293-solulinjoja viljeltiin RPMI-1640, L-15 ja DMEM-alustassa, vastaavasti. Kaikki ne viljeltiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% penisilliini-streptomysiinillä (100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), ja 1% glutamiinia 100 cm

2 kudosviljelypulloissa kostutetussa 5% CO

2 ja 95% ilma-atmosfäärissä 37 ° C: ssa.

solun elinkelpoisuus

vaikutuksen arvioimiseksi FPKc SW-480, SW-620 ja Caco-2 cell elinkelpoisuus, solut ympättiin 96-kuoppalevyille (5 x 10

4, 1 x 10

5 ja 1 x 10

5). Eri pitoisuuksia FPKc käytettiin SW-480 (120, 160, 200, 240 ug /ml, 70%: sta etanolia käytettiin liuottimena kontrolli) ja SW-620 (40, 80, 120, 160, 200, 240 ug /ml) ja Caco-2 (40, 80, 120, 160, 200, 240, 280 ug /ml) soluihin. Eri annoksilla ES (0, 12, 24 ug /ml; 100% etanolia) lisättiin osaksi SW-480-soluja. Sen jälkeen kaikki solut inkuboitiin 48 ja 72 tuntia, vastaavasti. Human Embryonic Kidney

293

(HEK-293) soluja käytettiin normaaleihin soluihin toisin arvioida sytotoksinen syövän vastaisen aktiivisuuden FPKc. Elinkelpoisuus neljän solulinjan määritettiin käyttämällä MTT-määritystä [17]. Absorbanssi 570 nm: ssä rekisteröitiin käyttämällä mikrolevyn lukijaa (Bio-Tek ELX800, USA). Solujen elinkelpoisuus FPKc ja ES käsiteltyjen näytteiden saatiin sitten vertaamalla kontrolliin. (Kaikki pitoisuus mainittu tässä artikkelissa viitataan kuivapaino).

soluliikkuvuus

soluliikkuvuus arvioitiin tyhjästä haava ja Transvvell- määritys. Sillä naarmu haava määritys: SW-480 solua maljattiin 24-kuoppalevyillä 24 tuntia, sitten solut yksittäisissä kuopissa haavoittui raaputtamalla pipetillä kärjen ja soluja inkuboitiin ilmoitetun pitoisuuden FPKc ja ES 12 ja 24 h. Solut valokuvattiin faasikontrastimikroskopiaan (x 200 suurennus).

siirtokuoppaan määritystä, 5 x 10

5 solua ympättiin yläkammiossa seerumittomalla alustalla, joka sisälsi 0,3% BSA: ta ja keskisuurten joka sisälsi 10% seerumia, lisättiin alempaan kammioon Corning kammion (polykarbonaatti suodatin 8 mm huokoskoko insertit, Corning Pharmingen, San Diego, CA). Kun oli inkuboitu 36 tuntia, solut siirretään alapuolen kalvon havaittiin pyyhkimällä ylempää puolella pumpulipuikolla ja värjäämällä alapintaan solut 0,1% kristalliviolettiliuoksella. Solut siirretään alapuolen kalvon havaittiin mikroskoopilla, ja kristallivioletti liimattu alapintaan solut liuotettiin 33% etikkahappoon, OD suhde liuosta mitattiin 570 nm: ssä mikrolevylukijalla.

Immunofluoresenssi

kun FPKc inkuboitu 24 h, solut hävittää maininnat: kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, tehdään läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 ja blokattiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA), jokaisen vaiheen välillä solut pestiin PBS: llä kolme kertaa. Sen jälkeen solut tukossa, ne inkuboitiin anti-MMP-9 ja -MMP-2-vasta-aineita (hankittu Santa Cruz) yön yli ja värjätty kanssa johdetun vasta-aineen suorittaman immunoglobuliini FITC (Zhong Shan Golden Bridge Biotechnology Co., Peking, Kiina ) 37 ° C: ssa pimeässä 1 tunnin ajan, ja sitten solut kuvattiin kanssa fluoresenssimikroskoopilla (Nikon E 600).

Hoechst 33342 värjäystä

Hoechst 33342 värjäys suoritettiin havaita korjauksilla ytimet morfologia SW-480-solujen jälkeen FPKc ja ES hoitoa. Käsitellyt solut värjättiin 10 uM Hoechst 33342: ssa 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa, sitten värjättiin solut pestiin kolme kertaa PBS: llä, ja havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia standardin heräte-suodattimet (Nikon, Japani). Eksitaatioaallonpituus oli 346 nm ja emission aallonpituus oli 460 nm.

Virtaussytometrianalyysi DNA pirstoutuminen

menetelmä analysoida DNA pirstoutuminen oli virtaus fluorocytometric havaitsemiseen DNA hypoploidy lisäämisen jälkeen propidiumjodidi (PI; Sigma, St. Louis, USA) kuolevan solut ja läpäiseväksi ne pakastamalla ja sulattamalla [18]. Tutkia vaikutuksen FPKc ja ES DNA-vaurioita SW-480 ja HEK-293-solut, suoritimme oligonukleosomaalisiksi DNA pirstoutumista virtausta fluorocytometry. Solut 24-kuoppalevyille käsiteltiin eri pitoisuuksilla FPKc ja ES 12 tuntia, vastaavasti. Solut värjättiin sitten 5 ug /ml PI: n ja analysoitiin DNA-sisällön käyttämällä virtaussytometriaa.

Solusyklianalyysiä

SW-480 ympättiin 24-kuoppalevyille, ja sitten käsiteltiin FPKc ja ES (0, 240, ja 24 ug /ml) 24 tuntia. Sitten solut otettiin talteen ja hävittää seuraavat vaiheet: pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, joka sisälsi 1% BSA: ta (Sigma, St. Louis, USA), kiinnitettiin 70%: isella jääkylmällä etanolilla -20 ° C: ssa yön yli, pestiin sitten kahdesti kylmällä PBS: llä , inkuboitiin 100 ug /ml RNaasi A: ta (Sigma, St. Louis, USA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, jonka jälkeen värjättiin 50 ug /ml PI: ssa 30 minuutin ajan pimeässä ja lopuksi analysoitiin virtaussytometrialla (Millipore, USA).

anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen koe

fosfatidyyliseriini toimii herkkänä markkerina solujen apoptoosin, kun se on ulkoistettu ulomman pakkausseloste [19]. Näin ollen suhde apoptoottisten solujen mitattiin anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Invitrogen, USA) valmistajan protokollan. Lyhyesti, SW-480, SW-620, ja HEK-293-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla FPKc ja ES 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, sitten käsiteltiin solut otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen 200 ui sitomispuskuria. Kun oli lisätty 2 ui anneksiini V-FITC: llä ja 2 ui PI soluun suspensioon, näytteitä inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Apoptoottista indeksiä välittömästi määritettiin virtaussytometrialla.

Detection solunsisäisen reaktiivisen hapen (ROS) sukupolven

Jotkut syötävät sienet, kuten Pleurotus abalonus, voisi aiheuttaa ROS-välitteisen apoptoosin [20] . Tässä tutkimuksessa mitattiin myös muutoksia solun ROS tasolla oksidatiivista muuntaminen herkkä fluoresoiva koetin 2 ’, 7′-dikloorifluoreskiiniliuoksella-diasetaatti (DCFH-DA) loisteputki 2′, 7’-dikloorifluoreskiiniliuoksella (DCF). DCFH-DA helposti diffundoituu solukalvon läpi, ja entsymaattisesti hydrolysoitu solunsisäisten esteraasien muodostaa ei-fluoresoiva DCFH, joka sitten nopeasti hapettuu muodostaen erittäin fluoresoivaa DCF: n läsnä ollessa ROS, ja fluoresenssin intensiteetti on verrannollinen ROS. SW-480 ja HEK-293-soluja 24-kuoppalevyillä hoidettiin mainittu pitoisuus FPKc ja ES 3 ja 6 h (HEK-293-solut vain 6 h). Solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan 10 uM DCFH-DA (hankittu Molecular Probes Inc., Invitrogen, CA, USA) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä. Sitten näytteet havaita välittömästi virtaussytometrialla. Histogrammit analysoitiin FCS Express V3.

Glutathione määrittämiseksi

SW-480-soluja inkuboitiin 24-kuoppaisilla levyillä, ja sitten niitä käsiteltiin FPKc ja ES: ssa 3 h ja 5 h. Tämän jälkeen käsitellyt solut kerättiin ja pestiin kahdesti PBS: llä. Yhteensä glutationin pitoisuuksia suoritti Glutathione Kit (Nanjing Jiancheng biotekniikka instituutti, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vihdoin, näytteet mitattiin 405 nm: ssä mikrolevylukijalla (Bio-Tek ELX 800, USA).

Western blotting värjäystä

SDS-PAGE ja immunoblottaus suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Lyhyesti, sen jälkeen, kun käsiteltiin FPKc (240 ug /ml) ja ES (24 ug /ml) ja 0 h, 12 h, 24 h ja 48 h solut lyysattiin RIPA-puskurilla jäällä. Proteiini Näytteet erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä, ja sitten geeli siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Millipore, MA, USA) ja blotattiin primaarisilla vasta-aineilla (Caspase-3, pilkotaan-RARP, Bcl-2, P53 hankittiin Cell Signaling Technology, USA) yön yli 4 ° C: ssa. Sitoutunut ensisijainen vasta sitten koodattu IRDye 680 konjugoidulla IgG (Li-cor, biotieteiden) huoneen lämpötilassa 1 tunti. Ja infrapuna fluoresenssi havaittiin kanssa Odyssey infrapuna Imaging System (Li-Cor Bioscience, Lincoln, NE).

Tilastollinen

Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena, ja tiedot ilmaistiin tarkoittaa ± SD. IC50-arvot lasketaan regressioanalyysin. Tiedot tehtiin analyysi Duncanin moninkertainen kantama testiä (SPSS, versio 18,0). Merkittävä ero katsottiin esiintyvän tasolla ** p 0,01.

Tulokset

HPLC

HPLC-määritys on näytetty tunnistaa ES ja kemiallisten komponenttien FPKc. Tiedot on esitetty kuviossa 2, on samoissa koeolosuhteissa, ES standardi osoitti sen retentioaika oli 83,8 minuuttia (kuvio 2B); FPKc näkyy kuusi tärkeimmät huiput ja mukana huippu samalla retentioajalla ES, mikä ES voisi olla yksi tärkeimmistä komponenteista FPKc (kuvio 2A); Vuodesta piikkien pinta, se paljasti ES sijoittui toiseksi FPKc; Vuodesta kvantitatiivinen määritys ES in FPKc HPLC, me spekuloi ES hallussaan 105 ug /mg (noin 10% kokonaismäärästä FPKc).

FPKc ja ES standardi tunnistettiin HPLC-PDA 254 nm kuvatulla kokeellisessa osassa.

sytotoksiset vaikutukset FPKc ja ES

Kuva 3A-C osoittivat sytotoksisuutta FPKc SW-480, SW-620 ja Caco-2-soluissa, jotka oli annoksesta ja aikaa riippuvasti. Kun SW-480-soluja käsiteltiin 120 ja 240 ug /ml FPKc 48 h solujen elinkelpoisuuden menetys oli 34,99 ± 1,08% ja 65,20 ± 2,34%, IC

50-arvo laskettiin 190,28 ug /ml; SW-620-solut, solujen elävyys laski 74,61 ± 0,99% ja 29,52 ± 1,28%, kun pitoisuus oli 80 ja 160 ug /ml, vastaavasti, IC

50-arvo laskettiin 143,26 ug /ml. Caco-2 suoritetaan vähemmän herkkiä kuin edellä 2 solulinjoista. 72 tunnin kuluttua inkubaation FPKc, Caco-2 alkoi esiintyä elinkelpoisuuden menetys, solujen elinkelpoisuus oli 71,65 ± 0,003% 200 ug /ml FPKc, ja kun annosta nostettiin 280 ug /ml solujen elävyys laski 47,16 ± 0,011% ja IC

50 oli 371,5 ug /ml.

SW-480, SW-620, Caco-2, ja HEK-293-solujen elinkyky FPKc (A, B, C, D) ja ES (E) käsittely mitattiin MTT-määrityksellä. Kukin arvo ilmaistiin keskiarvona ± S.D. vähintään kolmen riippumattoman määrityksen. Yksisuuntainen ANOVA käytettiin vertailuissa useita ryhmä tarkoittaa mitä seurasi Dunnettin t-testi. * P 0,05 ** P 0,01 verrattuna kontrolliryhmään. (Virhepalkkeja = S. D., n = 3).

Kuva 3D osoitti sytotoksista aktiivisuutta ES, ja solujen vahinko oli 34,52 ± 0,58%, kun ES annos oli 24 ug /ml 48 tunnin inkubaation jälkeen. Vertailun, samoissa koeolosuhteissa, 240 ug /ml FPKc aiheuttama 65,20 ± 2,34% solujen elinkelpoisuuden menetys, mikä viittaa siihen, joidenkin muiden sytotoksisten olevat osat FPKc.

Vertailun, kuvio 3E heijastuu sytotoksisuutta FPKc ihmisten normaali Embryonic Kidney 293-solut (HEK-293), joka on suhteellisesti heikompi soluvaurioita havaittiin HEK-293-soluista, verrattuna SW-480-soluja alle sama annos FPKc, mikä viittaa siihen, FPKc on noin valikoiva tuumorisoluja tappava vaikutus.

Migration eston FPKc ja ES SW-480-solujen in vitro

Voit selvittää FPKc vaikutti muuttoliikkeen kykyä SW-480-solut, haavan paranemista ja siirtokuoppaan määritys tehtiin (kuvio 4A). Haavanparantamislaite solujen kykyä heijastuu niiden liikkumista ja muuttoliike pinnalle, jona ne ankkuroitu kasvun. SW-480-soluissa, verrattuna 0 h jälkeen haavoittaen, kuluttua 12 h inkuboinnin, joka tiheä solujen valvontaa vähitellen kasvoi välitilaan haavan; soluja 120 ug /ml FPKc käsitelty ryhmä osoitti Pieni ero valvonta; kun solut 240 ug /ml FPKc ja 24 ug /ml ES käsiteltyjen ryhmien harvoin kasvoi välitilaan haavan. Kun inkubaatioaika nousi 24 h solujen kykyä Migraatio laski jokaisen annoksen FPKc. Ja solujen lukumäärä 120 ug /ml FPKc ja 24 ug /ml ES ei muuttunut paljon vertaamalla kontrolliin, kun taas 240 ug /ml käsitellyssä ryhmässä väheni selvästi.

SW-480-soluja 24- kuoppalevyjä haavoittui raaputtamalla pipetin kärjen ja soluja inkuboitiin FPKc ja ES 12, 24 tuntia. Solut valokuvattiin faasikontrastimikroskopiaan (x 200 suurennos). Kuvio 4B, analyysi muutoksen muuttoliikkeen SW-480-soluissa Transvvell- määrityksessä. Solut kunkin ryhmän siirtyä alapintaan suodattimen värjättiin kristallivioletilla ja valokuvattiin valomikroskoopilla klo × 200. b) OD suhde kristalliviolettia mitattiin. Virhe pylväät edustavat SD keinoista kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 ** p 0,01 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

TranswellTM määrityksessä käytettiin edelleen vahvistaa kulkeutumistestis- aiheuttama FPKc on SW-480-soluissa. Ja kuvio 4B osoitti, että 24 tunnin kuluttua inkubaation FPKc, solujen liike- kyky laski 28,28 ± 0,07% verrattaessa kontrolliin; sekä ES ryhmä, siirtyminen oli 51,92 ± 0,85%, mikä vahvisti haavan paranemista määrityksessä. Molemmat tulokset osoittivat FPKc ja ES voi estää solujen vaeltamiseen ilmeisesti.

Immunofluoresenssikoe

MMP ovat pystysuorassa solujen vaeltamiseen ja liikettä. MMP-2 ja MMP-9 havaittiin immunofluoresenssilla kokeilua tässä tutkimuksessa. Kuva 5 paljasti MMP-2 ja MMP-9 oli korkea ilmaistiin kirkkaan vihreä fluoresenssi kontrolliryhmässä. Ja ES ja FPKc ryhmät, molemmat entsyymit laski jyrkästi kontrolliin verrattuna.

SW-480 solut kiinnitettiin ja käsitellään immunofluoresenssimenetelmällä, MMP-9 ja MMP-2 visualisoitiin käyttäen FITC-label toista vasta-ainetta ( vihreä). Mittaviivat 100 um.

morfologiset aiheuttamien muutosten FPKc ja ES SW-480-soluja

Morfologiset tutkimus suoritettiin Hoechst 33342. Kuten kuviossa 6 on esitetty, ytimet ohjaus solut tasaisesti värjätään, ja kontrasti vaihe osoitti normaalia SW-480 solumorfologiaan pieniä saaria epiteelisolujen. Kuitenkin solut jälkeen FPKc ja ES hoito 48 tuntia osoitti merkittäviä morfologisia muutoksia: kondensoidaan chromatin ja hajanainen pistemäinen sininen ydin- fluoresenssi havaittiin annoksesta riippuvaisella tavalla. Kun FPKc annos oli 240 ug /ml, ydin- värjäytyminen oli ilmeisesti ja vaihe kuvat osoittivat, että solut muuttuivat epänormaali pyöreä tyyppi, ja solujen lukumäärä väheni selvästi.

SW-480-soluja käsiteltiin 48 h värjättiin Hoechst 33342. morfologiset muutoksia havaittiin loisteputken mikroskoopilla.

DNA pirstoutuminen aiheuttama FPKc ja ES

PI-värjäys virtaussytometrialla käytettiin arvioimaan DNA-vaurioita aiheuttama FPKc ja ES. Kuten esitetty kuviossa 7A, FPKc 120 ug /ml laukaisi 1,8-kertainen nousu DNA-vaurioita SW-480-soluja, ja 240 ug /ml FPKc johti konsentraatiosta riippuvaisen lisäystä DNA: n fragmentoituminen 7,2-kertainen, verrattuna käsittelemättömiin soluihin (p 0,01). Samanlainen nousu 4,2-kertaisesti punaisen fluoresenssin intensiteetin SW-480-soluja saatiin myös kautta inkubaation ES (24 ug /ml). Kuva 7B osoitti 240 ug /ml FPKc indusoi 18,26 ± 0,28% DNA vahinkoa HEK-293 (noin 1,6-kertainen kontrollista), joka osoitti HEK-293 suoritetaan paljon vähemmän DNA-vaurioita (p 0,01) kuin SW-480-solut (p 0,01) samalla annoksella FPKc hoitoa.

Molemmat Soluja käsiteltiin FPKc ja ES 12 (PI) ja analysoitiin virtaussytometrialla.

solukierron pysähtymisen aiheuttama FPKc ja ES

syövän, solusyklin pysähtymisen on pidetty yhtenä tärkeimmistä tavoitteista. Kuten me kaikki tiedämme, syöpäsolut aina pitää hillitön solujen lisääntymistä, koska heidän geenin mutaatio, joka kontrolloi solun jakautumista [21]. Arvioida vaikutuksen FPKc hoidon jakamisesta solujen solusyklin, teimme DNA solusyklin analyysi virtaussytometrialla. Kuvio 8 osoitti vaikutuksia FPKc ja ES-solun syklin vaiheessa (G1, S, ja G2 /M) jakelu SW-480-soluja. Sen jälkeen FPKc hoitoon 24 h, kertyminen SW-480 soluja G1 nousi 39.27 ± 0,56%: sta 56,77 ± 0,5%; aikaa ES hoidon kertyminen oli jopa 65,22 ± 0,54%. Tulokset osoittivat, että FPKc ja ES voisi aiheuttaa SW-480-solut solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa.

SW-480-solut kerättiin ja kiinnitettiin 70% alkoholia ja sitten värjättiin PI. Lopuksi värjätyt solut analysoitiin virtaussytometrillä.

Apoptosis aiheutuvaa FPKc ja ES

solusyklin pysähtymisen liittyy läheisesti apoptoosia, ja häiriöt solusyklin etenemisen voi lopulta johtavat apoptoottista /nekroottista kuolema [22]. Arvioitava edelleen apoptoosin indeksi FPKc ja ES voisi aiheuttaa, Anneksiini V-FITC /PI kaksinkertainen värjäys käytettiin. Alkaen kuvio 9A, se oli selvästi havaittavissa FPKc voi laukaista SW-480-soluja apoptoosin annoksesta riippuvalla tavalla, sen jälkeen, kun on inkuboitu 24 tuntia. Myöhään apoptoosin suhde (ylhäällä oikealla) nousi 15,40 ± 0,53%: sta 31,82 ± 0,93% mukana lisääntyminen FPKc pitoisuuden 120-240 ug /ml, kun taas kontrolli oli vain 6,42 ± 0,5%. Mielenkiintoista, ES (24 mikrog /ml) saattaa myös aiheuttaa fosfatidyyliseriinin ulkoistamista suhde myöhään ja varhaisen faagi apoptoosin oli 28.90 ± 0,63% (ylempi ja alempi oikea).

Solut double-värjättiin anneksiini V- FITC ja PI, ja sitten analysoitiin virtaussytometrillä. Kaikki kokeet tehtiin itsenäisesti kolminkertaisina parametriyhdistelmää kohti, ja edustavia tuloksia on esitetty. Tulokset edustivat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05 ** p 0,01 osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna kontrolliryhmään.

Kuva 9B osoitti apoptoosin johtama FPKc on HEK-293-soluja. Inkubaation jälkeen 240 ug /ml FPKc 24 tuntia, apoptoosin määrä käsiteltyjen solujen oli 11,83 ± 3,2% ja kontrolliryhmässä oli 9,63 ± 3,7%, mikä paljasti, ei ollut paljon eroa kahden ryhmän välillä.

tässä SW-620-solut testattiin myös anneksiiniV /PI-kokeessa, ja kuvio 9C paljasti, että FPKc voivat aiheuttaa SW-620-soluja apoptoosin erityisesti varhaisen apoptoosin. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, jossa FPKc, suhde varhaisen apoptoosin soluissa olivat 3,13 ± 0,40%: sta 12,23 ± 0,51% ja 15,20 ± 0,40%, kun FPKc annos kasvoi 0-80 ja 160 ug /ml.

ROS kertymistä aiheuttama FPKc ja ES SW480-solujen

solunsisäinen ROS tuotanto analysoitiin virtaussytometrialla DCF värjäystä. Tiedot kuviossa 10A ehdotti solunsisäistä ROS kohoamiseen jälkeen FPKc ja ES hoitoa. 3 h, noin 34,33 ± 0,45%, 82,77 ± 1,05% ja 50.33 ± 0,53% solujen 120 ja 240 ug /ml FPKc ja 24 ug /ml ES hoidetuissa ryhmissä osoitti kirkas DCF fluoresenssia, kun taas vain 5,40 ± 0,45% soluista kontrolliryhmässä osoitti kirkas DCF fluoresenssia. Kun inkubaatioaika nousi 6 h, solujen prosenttiosuus kirkkaan DCF fluoresenssi ei muuttunut paljon FPKc käsitellyissä soluissa, ES-käsitellyissä soluissa kasvoi 71,10 ± 1,7%. Ja kuvio 10B osoitti jälkeen FPKc hoidon, HEK-293 osoitti hieman ROS kertymistä vertaamalla kontrolliin.

SW-480 (A) ja HEK-293-soluissa (B) käsiteltiin FPKc ja ES, ja ROS mitattiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen DCFH-DA. SW-480-soluja esikäsiteltiin NAC (5 mM) 1 h, sitten solunsisäinen ROS (C), DNA-vaurion (D), solujen elinkykyä (E) ja apoptoosin (F) havaittiin.

lisäksi vahvistaa, että ROS oli mukana FPKc aiheuttama apoptoottisen vaikutuksen SW-480-solut, ROS scavengers-NAC esikäsiteltiin SW-480-soluissa. Kuten odotettua, kun läsnä oli 5 mM antioksidantti NAC, kertyminen ROS laski 4,26-kertainen kontrolliin nähden, kun taas FPKc ryhmä oli 10,15-kertainen kontrolliin nähden (kuva 10C).

On raportoitu, että liiallinen määriä ROS voi aiheuttaa hapettumista lipidejä, proteiineja ja DNA: ta, mikä johtaa kasvaimien syntyyn tai solukuolemaan [23]. Tässä tutkimuksessa mittasimme DNA-vaurioita jälkeen yhteistyössä hoidon NAC. Ja tulokset osoittivat, että DNA-vaurioita voitaisiin tietysti päinvastainen NAC: DNA-vaurioita indeksi oli 38.85 ± 2,7%, kun soluja käsiteltiin 240 ug /ml FPKc 24 tuntia, NAC yhteistyössä hoitoryhmässä oli vain 8,20 ± 0,71%, kun taas valvonta oli vain 6,50 ± 0,5% (kuvio 10D). Tulokset paljastivat, että FPKc aiheuttama DNA-vaurioita saattaa liittyä ROS kertymistä.

sytotoksisuus vaikutus FPKc SW-480-soluissa oli pitkälti päinvastaiseksi NAC (p 0,01, kuvio 10E). Elinkelpoiset solut oli noin 85,73 ± 0,14% ja 69,62 ± 0,21% esikäsittelemällä NAC, verrattuna noin 55.42 ± 2,00% ja 39,44 ± 0,64% käsittelemällä 120 ja 240 ug /ml FPKc, vastaavasti.

anneksiini V-FITC /PI kaksinkertainen värjäys määritys paljasti myös, että esikäsittely NAC voi osittain suojata SW-480-soluja FPKc aiheuttaman apoptoosin (kuvio 10F). Nämä tulokset osoittivat, että kertyminen solunsisäisen ROS osallistui FPKc indusoiman apoptoosin SW480-soluja.

Alterations solunsisäisen glutationin pitoisuus aiheuttama FPKc

GSH ehtyminen on pidetty yhtenä tärkeänä aiheuttava tekijä kertyminen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) [24], pitoisuus GSH SW-480-soluja arvioitiin sen jälkeen, kun FPKc ja ES hoitoa (kuvio 11). Kun soluja käsiteltiin 3 h, solunsisäistä GSH pitoisuus laski 70,38 ± 1,50%, 29,23 ± 1,00% ja 50,14 ± 1,70% ja ohjaus 120, 240 ug /ml FPKc ja 24 ug /ml ES, vastaavasti. Ja kun inkubointiaika kasvoi 5 h, GSH pitoisuus SW-480 solut eivät muutu paljon, kun FPKc hoidon; kun taas ES käsiteltyjen näytteiden solujen GSH laski 42.18 ± 1,00%, mikä oli mukaisesti ROS sukupolvi.

solunsisäinen GSH pitoisuus SW-480-solujen jälkeen FPKc ja ES hoitoja mitattiin 405 nm: ssä mikrolevyn lukija.

tutkiminen proteiinien tasoja, jotka liittyvät solusyklin ja apoptoosin

taustalla olevan mekanismin FPKc aiheuttama muutos proteiinin ilmentymisen mukana solusyklin ja apoptoosin SW-480-soluja oli selvennetään edelleen Western blotting-määritys (kuvio 12). Tasot Actin toimi sisäisenä kontrollina. Todettiin, että ilmentymisen anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2 aleni, kun soluja käsiteltiin 240 ug /ml FPKc 48 h; ja ES (24 ug /ml) käsittelemällä soluja, Bcl-2-taso aleni, kun niitä inkuboidaan 24 ja 48 tuntia. Tässä tutkimuksessa lohkaista kaspaasi-3 ja halkaistut PARP arvioitiin, ja tulokset osoittivat molemmat olivat voimistunut jälkeen inkuboitiin FPKc ja ES 24 tuntia ja 48 tuntia.