PLoS ONE A H2S-Nampt Dependent energinen Circuit on kriittinen Survival ja solusuojaus vahingoittumiselta syöpäsoluissa
tiivistelmä
Olemme hiljattain osoittaneet, että syöpäsolut toipua vahinkoa näytteille lisääntynyt aerobinen Glykolyysivaiheen kuitenkin molekyylitason mekanismia, jolla syöpäsolut hengissä vahingot ja osoittaa lisääntynyt aerobinen Glykolyysivaiheen on edelleen tuntematon. Tässä osoitamme, että erilaiset syöpäsolut, jotka selviävät hypoksinen tai hapettumista osoittavat nopeaa solujen lisääntymistä, ja kehittää sietokyky vahinkoja liittyy lisääntynyt tuotanto rikkivedyn (H
2S), joka ajaa ylös-säätely nikotiiniamidi fosforibosyylitransferaasin (Nampt). Yhdenmukainen olemassaolo H
2S-Nampt energinen piiri, vahingoittaa takaisin syöpäsoluissa, H
2S, Nampt ja ATP tuotanto näytteille merkittävä korrelaatio. Lisäksi syövän solujen H
2S luovuttaja, NaHS, yhteistoiminnallisesti lisää Nampt ja ATP-tasot, ja suojaa soluja lääkkeen aiheuttama vahinko. Esto cystathionine beeta-syntaasi (CBS) tai cystathionase (CTH), entsyymejä, jotka ajavat sukupolven H
2S, pienenee Nampt tuotanto samalla suppressio Nampt-reitin FK866, pienenee H
2S ja ATP-tasot. Vahinko talteen eristetyt solut kasvaimia kasvanut ihon alle kateenkorvattomissa hiirissä osoittavat myös lisääntynyt tuotanto H
2S, Nampt ja ATP-tasot, jotka liittyvät lisääntyneeseen Glykolyysivaiheen ja nopeaan lisääntymiseen. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että kun toipuminen mahdollisten tappavia vaurioita, H
2S-Nampt ohjaa energiankulutusta ja aerobinen Glykolyysivaiheen syöpäsoluissa, johtaa niiden eksponentiaalista kasvua, ja aiheuttaa suurta sietokyvyn vaurioita. Tunnistaminen H
2S-Nampt kuin koulutusjakson vastuussa induktion vaurionsietokyky syöpäsoluissa voi toimia perustana vastustuskyvyn hoidon ja tarjoaa mahdollisuuden kohdistaa tämän reitin keinona on syövän hoidossa.
Citation: Sanokawa-Akakura R, Ostrakhovitch EA, Akakura S, Goodwin S, Tabibzadeh S (2014) AH
2S-Nampt Dependent energinen Circuit on kriittinen Survival ja solusuojaus vahingoittumiselta syöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (9): e108537. doi: 10,1371 /journal.pone.0108537
Editor: Stefan Strack, University of Iowa, Yhdysvallat
vastaanotettu: toukokuu 29, 2014; Hyväksytty: 27 elokuu 2014; Julkaistu 23 syyskuuta 2014
Copyright: © 2014 Sanokawa-Akakura et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.
Rahoitus: Kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.
Johdanto
viime vuosina on osoitettu, että gasotransmitters, typpioksidin (NO), hiilimonoksidi (CO) ja rikkivedyn (H
2S), on keskeinen rooli erilaisissa fysiologisiin toimintoihin, kuten verisuonitonus, isännän puolustuksen taudinaiheuttajia vastaan, neuromodulation, apoptoosin, ja energia-aineenvaihduntaa nisäkässoluissa [1]. Näistä kaasumaiset molekyylit, H
2S on tuotettu aminohappo aineenvaihduntaa laajuisten sulfuration ja kysteiini desulfuration polkuja [2]. Endogeeninen H
2S tuotanto katalysoi kolme entsyymiä, cystathionine beeta-syntaasi (CBS), cystathionase (CTH) tunnetaan myös cystathionine gamma-lyaasi, ja 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (MST) [3] – [5].
H
2S toimii stimulaattori solujen bioenergetics, edistää lisääntynyt riippuvuus syöpäsoluja on glykolyyttisellä koulutusjakson ATP tuotantoa ja edistää angiogeneesiä ja solusuojaus [6] – [8]. H
2S suojaa soluja oksidatiivista stressiä [9], se voi vaikuttaa soluvasteita vahinkoa [10], [11], ja sen osoitettiin ilmentävän sekä pro-apoptoottisen ja anti-apoptoottiset vaikutukset [12] – [14]. Vaikka jotkut ehdottivat, että H
2S on anti-syöpä vaikutuksia [15], toiset kertoi, että se edistää leviämisen HCT116 ja SW480 paksusuolen syöpäsoluissa [16]. Fu
et al.
Osoitti, että Ca
2+ stimulaatio aiheuttaa kasvavia CTH ilme ja lisää H
2S ja ATP tuotanto [17]. Osoitettiin, että endogeeniset H
2S tuotantoa ohjaavat 3-MST täydentää ja tasapainottaa solujen bioenergetiikan ja ylläpitää elektroni virtaus mitokondrioissa [18]. Paksusuolen syöpä-solujen on osoitettu olevan säädelty ilmentyminen CBS ja lisääntynyt muodostuminen H
2S, joka ohjaa solujen proliferaatiota ja angiogeneesiä paksusuolensyöpä [6].
On tunnettua, että kasvainsolut voivat toipua potentiaali tappavia aiheuttaman vaurion hypoksia, asidoosi, tai säteilyllä ja lääkehoito [19] – [22]. Me raportoi äskettäin, että syöpäsolut toipua vahingot aiheuttama hypoksia, asidoosi ja glukoosin poisto osoittavat mitokondrion remodeling, lisääntynyt aerobinen Glykolyysivaiheen, ja niillä on korkea ATP-tuottamista [23]. Tässä tutkimuksessa tutkimme rooli H
2S prosessissa elpyminen syöpäsolujen vaurioilta. Vaurioituneet syöpäsolut pakokaasu energiahuoltonsa takia korjausmekanismeja. Sekä ATP ja NAD
+ (nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi) ovat tärkeimmät energialähteet. Nikotiiniamidi fosforibosyylitransferaasin (Nampt), jota entsyymiä tarvitaan NAD synteettinen pelastus-reitin [24], on elintärkeää ylläpito solujen energiahuollon. Siksi tutkimme rooli Nampt yhdessä H
2S syöpäsoluissa, jotka toipua vahinkoa. Osoitamme, että H
2S ohjaa elpyminen syöpäsolujen vaurioilta säätelemällä Nampt suunnatun muutos energian kulutusta, joka ajaa hyväksyminen aerobinen Glykolyysivaiheen ja kasvusta ATP ja NAD
+ synteesi. Vuorovaikutus H
2S ja Nampt antaa syöpäsolut korkea proliferaationopeus ja korkea sietokyky vaurioita.
Materiaalit ja menetelmät
Materiaalit
H
2O
2, NaHS, bleomysiini,
O
– (karboksimetyyli) hydroksyyliamiinihemi- hydrokloridia (CHH) DL-propargylglycine (PAG) ja FK866 ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Vasta-aineita CBS (A-2), CTH (G-1) ja β-Actin (C-2) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineita Nampt (Visfatin, PBEF) ja Bax ostettiin Abcam (Cambridge, MA). Vasta-ainetta vastaan, γ-H2AX hankittiin Millipore (Bedford, MA). Toissijainen vasta konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin hankittiin Jackson Immuno- Laboratories (Baltimore, PA).
Soluviljely
HepG2, MDA-MB-231 ja MDA-MB-435S saatiin ATCC ( Manassas, VA) viljeltiin DMEM: ssa, jossa oli 2 mM glutamiinia, 25 mM glukoosia ja 10% naudan sikiön seerumia, 37 ° C: ssa inkubaattorissa 5% CO
2. Vahinko aiheutettiin syöpäsoluissa hypoksian, glukoosin poisto ja vetyperoksidia. Induktioon hypoksian (DR
H), soluja inkuboitiin 18 h 1% O
2. For glukoosin poisto (DR
G-), soluja viljeltiin 18 tunnin ajan väliaineessa ilman glukoosia läsnä 5% CO
2. Induktioon Vaurion vetyperoksidia (DR
H2O2), soluja käsiteltiin 800 uM H
2O
2: ssa 3 tuntia.
Eläinkokeet
Eläinten hoito ja kaikki toimenpiteet suoritettiin hyväksymisen jälkeen Institutional Animal Care valiokunnat University of California, Irvine (protokolla # 2012-3042). Kahdeksan viikon ikäisiä kateenkorvattomia nude (Nu /Nu) uroshiiriä (n = 10) hankittiin Charles River Laboratories (San Diego, CA). Hiiret nukutettiin isofluraani-inhalaatiolla ennen kasvainsolujen injektion. Kukin hiiri sai 1 x 10
5 kasvainsolujen kokonaistilavuudessa 100 ui ihon alle neljällä paikkakunnalla puolivälissä vatsan ja alemman kylki alueilla. Hiiriä tarkkailtiin 2 kertaa viikossa kasvaimen kasvun aikana kokeen. Kaksikymmentä päivää injektion jälkeen soluja, hiiret tapettiin hiilidioksidin käytön, kun kasvaimet kasvoivat koko 10-15 mm halkaisijaltaan. Kasvaimet poistettiin eristämiseksi elinkelpoisten syöpäsolujen (T
V) tai vaurio talteen soluja
in vivo
kasvanut kasvain (T
DR).
mittaus H
2S tuotanto extra ja sisäisten solujen
mittaus solunulkoisen H
2S tasolla tehtiin käyttämällä Free Radical Analyzer (TBR4100 ja ISO-H2S-2, maailma Precision Instruments, Sarasota, FL) seuraavat valmistajan ohjeen . Lyhyesti, solujen määrä säädettiin 1 x 10
6 elävää solua PBS: ssä ja solun suspensioita inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Sitten solut sentrifugoitiin ja supernatantit altistettiin mittauksia. Ennen jokaista mittausta anturin polarisoitui ja kalibroitu lisäämällä neljä alikvootit Na
2S kantaliuos viimeisessä pitoisuuksilla 0,25, 0,5, 1,0 ja 2,0 uM. Detection solunsisäisen H
2S suoritettiin H
2S fluoresoiva koetin HSN2 (ystävällinen lahja professori Michael D. Pluth, University of Oregon, Kemian laitos, Eugene, Oregon).
Koko solun proteiinin uutto ja Western blotting
proteiinit soluja uutettiin hajotuspuskuriin (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na
3Vo
4, 50 mM NaF, ja proteaasiestäjäseostabletit). Proteiini mittaukset suoritettiin Bio-Rad proteiinimäärityksellä perustuu Bradford väriaine-sitovaa menetelmää (Bio-Rad Lab, Hercules, CA).
pyyhkinyt vyöhykkeet havaittiin ECL tehostetun kemiluminesenssin (Amersham ECL Plus Western Blotting Detection reagenssit GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) käyttäen C-numeroinen Digital Imager (LI-COR, Lincoln, NE) ja densitometrinen analyysi suoritettiin käyttäen myImage Analyysiohjelmisto (Thermo Scientific). β-aktiini toimi latauskontrollina.
Solun elinkelpoisuus mittaus
Suhteellinen solujen määrä mitattiin XTT-määrityksellä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Soluja inkuboitiin XTT ja fenatsiinimetosulfaattia (PMS) 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan ja absorbanssi luettiin 450 ja 650 nm viitteenä.
Käänteinen transkriptio-polymeraasiketjureaktion (PCR) ja Kvantitatiivinen PCR ( qPCR) B
Kokonais-RNA eristettiin käyttäen GenElute Mammalian Kokonais-RNA Miniprep Kit (Siγma-Aldrich, St. Louis, MO). Käänteinen transkriptio suoritettiin käyttäen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). RT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita, jotka ovat spesifisiä ihmisen CBS (eteenpäin: GAACCAGACGGAGCAGACAA; käänteinen: GTCGCTCAGGAACTTGGTCA), ihmisen CTH (eteenpäin: AAAGACGCCTCCTCACAAGG; käänteinen: AAGGCAATTCCTAGTGGGATTTC) ja ihmisen MTS (eteenpäin: CGCCGTGTCACTGCTTGAT; käänteinen: CAGGTTCAATGCCGTCTCG ). Geenien ilmentyminen arvioitiin PCR: llä käyttäen
Taq
5 x Master Mix (New England Biolabs. Ipswich, MA), jossa ensimmäinen denaturaatiovaihe 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä kukin 94 ° C: ssa 30 s, 55 ° C 30 sekuntia, ja 68 ° C 1 min.
kvantitatiivinen arviointi suoritettiin käyttäen myImage Analyysiohjelmisto (Thermo Scientific, New Hampshire). Normalisoimiseksi tietojen
β-ACTIN
monistettiin spesifisiä alukkeita (eteenpäin: AAGCCACCCCACTTCTCTCT; käänteinen: GAGACCAAAAGCCTTCATACATCT). qPCR suoritettiin käyttäen Quanti Tect SYBR Green PCR Kit. qPCR suoritettiin käyttäen spesifisiä alukkeita ihmisen NAMPT (eteenpäin: ATC CTG TTC CAG GCT ATT CTG; käänteinen: CCC CAT ATT TTC TCA CAC GCA T).
XF (solunulkoinen flux) bioenergetic analyysi
XF24 Solunulkoisilla Flux Analyzer Seahorse Bioscience (N. Billerica, MA) hyödynnettiin ekstrasellulaarinestettä bioenergetic analyysi [25]. Tyypillisissä
in vitro
soluviljelmässä olosuhteissa, solunulkoinen happamoitumista rate (ECAR) on myötävaikuttanut maitohappo tuotannon poistamiseksi Glykolyysivaiheen. Tutkia aerobinen Glykolyysivaiheen, viisi biologista viljelmään valvonta (3 x 10
4) ja viisi itsenäisesti tuotettu DR soluja (3 x 10
4) maljattiin kuhunkin kuoppaan XF 24 viljelylevyltä ja soluja inkuboitiin yön yli 37 ° C: n läsnä ollessa 5% CO
2. Kaikkia viljelmiä tarkasteltiin XFAssay mediassa ilman CO
2. Taso ECAR oli normalisoitu proteiinipitoisuuden.
kvantitointi Nampt, ATP: n ja NAD
+ /NADH
Solunsisäiset Nampt tasot mitattiin käyttämällä Visfatin C-terminaalinen (Human) EIA kit (Phoenix lääkkeet, Belmont, CA, USA). ATP-tasot soluissa määritettiin käyttämällä Bioluminescent ATP Somaattisten solujen iinianalyysikitissä (FLASC, Sigma-Aldrich-yhtiö) ja kolorimetriset ATP iinianalyysikitissä (Abcam, Cambridge, MA) valmistajan ohjeiden. NAD
+ /NADH mitattiin käyttämällä NAD
+ /NADH iinianalyysikitissä (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan ja Bio Pitoisuus Systems, Hayward CA) seuraavat valmistajan ohjeita. Tasot Nampt, ATP: n ja NAD
+ /NADH normalisoituivat valkuaispitoisuus.
Tilastot
Kaikki määritykset tehtiin 3-6 replikoituu vähintään kolmen erillisen kokeen. Data näytetään keskimääräisenä ± SEM (standard keskivirhe).
p
arvot määritettiin vertaamalla tietoja kokeellisen verrattuna kontrollisoluihin vähintään kolmen itsenäisen kokeen tai kuusi rinnakkaisnäytettä samassa kokeessa. Keinot ja
p
arvot kokeelliset tiedot analysoitiin altistamalla datan kahden tailed t-testiä. Tiedot mukana enemmän kuin kaksi ryhmää olivat käsiksi yksisuuntainen ANOVA Bonferronin testi post hoc -analyysissä.
p
arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.
p
Arvot näkyvät 0,05 (*), 0,005 (**) tai 0,0005 (***).
Tulokset
Sukupolvi H
2S kasvaa vastauksena korostaa
toisin kuin aiemmissa raporteissa, joissa H
2S on mitattu solulysaatissa, käytimme H
2S-herkkä elektrodin mitata release H
2S ehjistä soluista. Olemme havainneet, että määrä H
2S vapautuu soluista oli merkittävästi suurempi kuin mitattu homogenisoidaan solu-uutteissa (tietoja ei esitetty). Verrattuna tasojen H
2S vapautuu 293 ja fibroblastien, syöpäsolujen (HepG2, MDA-MB-231, MDA-MB-435S) merkitsevästi enemmän H
2S (kuvio 1A). Me altistetaan epiteelisyöpäsolujen eri alkuperää (maksa, rinta-, ja melanosyyttien) ja ankarissa olosuhteissa, joita esiintyy kasvaimen mikroympäristössä, mikä kaikki johtaa soluvaurioita lukien hypoksia (
H), glukoosin poisto (
G-) ja vetyperoksidia (
H2O2). H
2S sukupolvi nostettiin syöpäsoluissa vastauksena akuutti stressi, kuten hypoksiaa, bleomysiini, vetyperoksidia ja glukoosin poisto (kuvio 1 B). Stressin nousu H
2S vapautunut syöpäsolujen liittyi kasvuun cystathionine beeta-syntaasi (CBS), yksi entsyymejä, joka ajaa H
2S tuotantoa, samanaikainen kasvu stressiä ja apoptoosiin liittyvien Bax ja γH2AX , joka on kriittinen tekijä S /G
2 DNA-vaurioita tarkastuspiste kompleksi (kuvio 1 C, D). Mielenkiintoista, stressin aiheuttama nousu H
2S tuotanto korreloi vaurion vakavuutta (kuvio 1 E).
(A) määrä H
2S vapauttaa 293-solut, fibroblastit (Fibro.), HepG2, MDA-MB-231 ja MDA-MB-435S-solut. (B) tasot H
2S HepG2, MDA-MB-231 ja MDA-MB-435S Pc soluja altistetaan hypoksia (0,5% O
2, 18 h), glukoosin poisto (glukoosi väliaineessa, 18 h) tai käsitellä bleomysiinin (35 nM, 18 h), H
2O
2 (800 uM, 3 tuntia). Data on ilmaistu prosentteina H
2S vapautuu käsittelemättömiä soluja. (C) Solunsisäiset CBS ja Bax (vasen paneeli) arvioitiin western blot analyysi MDA-MB-435S Pc soluja, ja Pc soluja käsiteltiin 400 tai 800 uM H
2O
2 3 tuntia. (D) taso CBS ja γH2AX kanssa tai ilman hoitoa H
2O
2 (800 uM, 3 h) in MDA-MB-435S-soluissa. Proteiini tiheys normalisoitiin käyttäen β-Actin. (E) määrä H
2S ja solujen elinkelpoisuus hoidon jälkeen pitoisuusalueella H
2O
2. *;
p
0,05, **;
p
0,005, ***;
p
0,0005.
lisääntynyt sukupolven H
2S vaurioitumiseen-talteen soluja kasvattaa sietokykyä vahingoittaa
Järjestelmä kuviossa 2A esittää menetelmä, joka meillä oli tapana tuottaa vahinkoa talteen syöpäsoluja. 24 tunnin kuluttua vaurioita, muutaman eläviä soluja jäi kiinni kulttuuriin pulloon samalla suurin osa soluista irrotettiin viljelypinta. Vaurioituneet irrottaa soluilla korkeatasoinen H
2S todennäköisesti rajoittaa vahinkoa ja voi parantaa selviytymistä potentiaali (kuva S1). Voit poistaa mitoosi soluissa, me viljellä soluja uudenlaista aluksia 24 tunnin ajan. Eristää vaurioituneita soluja, jotka ei onnistunut sitoutumaan kasvatusastiat mutta oli mahdollista toipua vahinkoa, siirsimme kelluvat solut uusiin kasvatusastiat sallia soluja, jotka toipua vahinkoa sitoutua kulttuuriin alustoille. Serial viikoittain kohdat kelluvat solut uusiin kasvatusastiat sallittu eristäminen vahinkojen talteen solujen eri toipumisaika. Koko tämän paperin, me kutsumme näitä soluja vahinko-talteen (DR) soluja osoitetun palautumisaika yhden (DR
W1), kaksi (DR
W2) tai kolmen viikon aikana (DR
W3) päässä vahinkoja, kun puhumme lapsilukon solujen Pc-solut (kuvio 2A). Tämä menetelmä mahdollisti erottaa kolmen populaation soluja, jotka heijastavat tarvittava aika hyödynnettäväksi. Sen arvioimiseksi, onko eristetty DR solut talteen vaurioita, tutkimme ilmaus proapoptoottisten molekyyli, Bax. DR soluja väheni Bax ilmentymistä toipumisaika riippuvaisella tavalla merkkinä kunnossa, kun taas ennustetusti, Pc soluja altistetaan H
2O
2 3 h (akuutti vaurio) ilmaisivat korkeaa Bax (kuvio 2B). Lisäksi syöpäsolut toipunut vahinkoa myös näytteillä lisääntynyt tuotanto H
2S verrattuna vahingoittumaton Pc solujen toipumisaika riippuvaisella tavalla (kuvio 2C, D). Koska endogeeninen rikkivety syntyy kolme entsyymiä, CBS, CTH ja MST, tutkimme mRNA ja proteiini tasoilla näiden entsyymien Pc ja DR soluja. Kuten kuviossa 2E, mRNA tasot CBS ja CTH kasvoi DR soluissa myös on toipumisaika riippuvaisella tavalla. Kuitenkin MST oli poissa Pc tai DR soluja. Verrattuna vanhempien ehjä Pc solut, syöpäsolut toipunut vahinkoa oli lisääntynyt CBS ja CTH proteiinien suorassa suhteessa toipumisaika. Niistä DR soluja, näiden solujen pidemmän palautumisaika vaurioilta osoittavat korkeimman säätely ylöspäin CBS ja CTH (kuvio 2F). CBS oli säädelty enintään 2-kertaiseksi toipumisen jälkeen aiheuttaman vaurion glukoosin poisto, hypoksia ja vetyperoksidia (kuvio 2G). Verrattuna Pc soluihin, DR solut tuottavat suurempia H
2S oli korkeampi proliferaationopeus ja osoitti korkeampaa toleranssin aiheuttaman vaurion bleomysiini (kuvio 2 H, I). Nämä havainnot osoittavat, että soluissa toipunut vahinkoa, H
2S tuotanto saattaa olla merkitystä niiden lisääntynyt sietokyky vaurioita.
(a) järjestelmän eristämiseksi Damage-Keräyspaperi (DR) soluja. (B) Bax ilmentyminen H
2O
2 käsitellään Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 ja DR
H2O2 W3 HepG2-soluissa. (C) määrä H
2S vapauttaa DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 ja DR
H2O2 W3 HepG2-soluissa. Merkitys välillä Pc ja kolme DR soluissa oli
p
0,0005 in ANOVA tilastollinen analyysi. (D) H
2S värjäys Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 ja DR
H2O2 W3 HepG2-soluissa 5 uM H
2S fluoresoiva koetin, HSN2. Mittaviivat 50 pm. (E) PCR-analyysi
CBS
,
CTH
ja
MTS
geenien Pc, DR
H2O2 W1 ja DR
H2O2 W3 HepG2-soluissa. (F) Western blot-analyysi CBS ja CTH Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 ja DR
H2O2 W3 HepG2-soluissa. (G) Western blot-analyysi CBS Pc ja DR
H2O2 W1, DR
H W1 ja DR
G W1 HepG2-soluissa. (H) leviämisen HepG2 talteen H
2O
2, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 soluja prosentteina että Pc soluissa. (I) elinkelpoisuus Pc, DR
H2O2 W1 ja DR
H2O2 W2 HepG2-soluissa ja ilman hoitoa bleomysiinin. *;
p
0,05, **;
p
0,005, ***;
p
0,0005.
DR soluilla lisääntynyt Glykolyysivaiheen ja parannettu solu bioenergetiikan
Koska nopeasti jakautuvat solut toteuttaa aerobinen Glykolyysivaiheen edistää lisääntynyt biomassa seuraa solun jako, tutkimme taso keskeisten glykolyyttisiä välituotteiden ja entsyymien solujen talteen vaurioita. DR solut osoittivat kohonnut solunulkoisen happamoitumista rate (ECAR), joka on osoitus tasosta Glykolyysivaiheen (kuvio 3A). DR-solut tuottavat korkeita H
2S oli parempi bioenergetic profiili osoituksena kohonnut taso solujen ATP: tä (kuvio 3B).
(A) ECAR Pc HepG2-soluissa on käsitelty tai ei ole 800 uM H
2O
2 ja DR
H2O2 W2 HepG2-soluissa. (B) ATP tasot Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 ja DR
H2O2 W3 HepG2-soluissa. Merkitys välillä Pc ja kolme DR soluissa oli
p
0,005 ANOVA tilastollinen analyysi. (C) NAD
+ tasoilla Pc HepG2 (tai ilman H
2O
2), DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 ja DR
H2O2 W3 HepG2-soluissa. NAD
+ normalisoitiin tasoa kokonaisproteiinista. Merkitys välillä Pc ja siellä DR soluissa oli
p
0,005 ANOVA tilastollinen analyysi. (D) NAD
+ tasoilla Pc ja DR
H W1 HepG2-soluissa. (E) Western blot analyysi solunsisäisten Nampt ja CBS Pc ja DR
H2O2 MDA-MB-231-soluja. (F) Nampt tasot määritettiin ELISA Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 ja DR
H2O2 W3 HepG2-soluissa. Merkitys välillä Pc ja kolme DR soluissa oli
p
0,05 ANOVA tilastollinen analyysi. (G) välinen korrelaatio Nampt ilmaisun ja tuotanto H
2S ja taso ATP Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 ja DR
H2O2 W3 HepG2-soluissa. Merkitys H
2S ja Nampt oli
p
0,05, ja merkitys ATP ja Nampt oli
p
0,05 ANOVA tilastollinen analyysi. *;
p
0,05, **;
p
0,005, ***;
p
0,0005.
Jotta voitaisiin käsitellä onko tukahduttaminen Glykolyysivaiheen vaimentaa H
2S tuotantoa, mittasimme H
2S tasolla DR käsitellyissä soluissa HK1 estäjä, 100 uM bromipalorypälehapolla tai LDH-A-inhibiittori, 1 mM natrium-oksamaattia, 15 tunnin ajan. Kuten kuviossa S2, ei ollut tilastollisesti merkittävää eroa taso H
2S hoidon jälkeen joko bromipalorypälehapolla tai natrium oksamaattia, kun taas, kuten odotettua, glykolyyttisissä aktiivisuus merkittävästi vähentynyt molemmissa estäjiä. Nämä tiedot osoittavat, että glykolyyttiset entsyymit eivät säännellä H
2S-Nampt piiri.
Solut toipunut vahinkoa voimakkaasti vedonnut Glykolyysivaiheen että lisääntynyt kysyntä NADH /NAD
+. Siksi mittana bioenergetic valtio, arvioimme tasot NAD
+ ja NADH. Vaikka akuutti vaurio alensi tason NAD
+, NAD
+ lisääntyi merkitsevästi syöpäsolut talteen aiheuttaman vaurion H
2O
2 ja hypoksia (kuvio 3C, D Kuvio S3). Pelkistetty muoto NAD
+, NADH, lisääntyi merkitsevästi DR soluissa (kuvio S4).
Nampt, joka vaaditaan NAD
+ synteettinen pelastus-reitin [24], oli merkittävästi lisääntynyt upon elpyminen DR soluissa ja tämä kasvu samaan aikaan säätely ylöspäin H
2S tuottaville CBS (kuvio 3E). DR solut pidempi toipumisaika vaurioilta osoitti Suurinta kasvu Nampt (kuvio 3F). Lisäksi olemme havainneet, että Nampt tasot korreloivat sekä tasoon H
2S vapautuu soluista (R
2 = 0,9,
p
0,05) ja solunsisäinen taso ATP (R
2 = 0,94,
p
0,05) (kuvio 3G).
Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että syöpäsolujen toipunut vahinkoa tuottavat korkean H
2S ja Nampt, ja että ne ovat erittäin riippuvaisia tuotannosta H
2S ja aerobinen Glykolyysivaiheen niiden tehokkaan aineenvaihdunnan.
H
2S, annoksesta riippuvalla tavalla, up-regulation Nampt, kasvaa aerobinen Glykolyysivaiheen ja tarjoaa solusuojaus
lisäarvioimiseksi tärkeyden H
2S hankkimiseen uusien metabolisen ominaisuuksien, Pc soluja käsiteltiin H
2S luovuttajan, NaHS. Samanlainen kuin meidän havaintoja DR soluissa (kuvio 3A), hoito NaHS parannettu ECAR annoksesta riippuvaisella tavalla, lisää ATP ja NAD
+ tuotos ja johti merkittävää nousua tason Nampt (kuva 4A-F). Yhdenmukaisia aiempien raporttien osoittavat, että H
2S tarjoaa solusuojaus [8], [26], Pc solut esikäsiteltiin NaHS osoitti suurempi vastustuskyky aiheuttaman vaurion joko vetyperoksidia tai bleomysiini (Kuva 4G).
(A) ECAR Pc HepG2-soluissa hoidettiin 48 tunnin 0, 1, ja 100 uM NaHS ja DR
H W1 HepG2-soluissa. (B) vertailu ATP tasojen Pc HepG2-soluissa hoidettiin 48 tunnin 0, 10 ja 100 uM NaHS, DR
H2O2 W1 HepG2-soluissa ja Pc MDA-MB-231-solujen hoidettiin 48 tunnin 0, 10 ja 100 uM NaHS. Tiedot on ilmaistu prosentteina tason ATP käsittelemättömissä soluissa. (C) tasot NAD
+ HepG2 ja MDA-MB-231 Pc soluja käsiteltiin 0, 10, ja 100 uM NaHS 48 tuntia. (D) Western blot analyysi solunsisäisen Nampt MDA-MB-231 PC-soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 0 ja 100 uM NaHS. (E) qPCR analyysi
NAMPT
ilmentymistä Pc HepG2-soluissa hoidettiin 48 tuntia ja 0 ja 100 uM NaHS. (F) kvantitointi solunsisäisen Nampt ELISA Pc HepG2-soluissa hoidettiin 48 tunnin 0, 10 ja 100 uM NaHS. (G) Elinkelpoisuus HepG2-soluissa esikäsitellyt kanssa 24 tuntia 0, 1, ja 10 mM NaHS ja alistetaan sitten H
2O
2 (800 uM) tai bleomysiini (35 nM, 18 h). Elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinieksluusiolla. *;
p
0,05, **;
p
0,005, ***;
p
0,0005.
Yhdessä meidän havainnot osoittavat, että säätely ylöspäin H
2S ja Nampt johtavat glykolyysistä ja bioenergetic muutokset ovat tärkeitä mekanismeja kehitettäessä lääkeresistenssin ja selviytymistä syöpäsoluja.
H
2S-Nampt reitin säätelee bioenergetiikan vuonna DR soluissa
lähemmin käsitellä suhde Nampt ja H
2S tuotanto, DR solut käsiteltiin estäjä Nampt, FK866. Solujen käsittely 200 nM FK866 ei vaikuttanut solujen elinkelpoisuuteen osoittaa puuttuessa FK866 sytotoksisuuden tällä annoksella HepG2 (kuva S5). Suppressio Nampt sen estäjä, FK866, sekä inhibition CTH D, L-propargylglycine (PAG), vähensivät H
2S tuotannon (kuvio 5A). Vastaavat tällaista muutosta H
2S tuotanto, ilmaus sekä CBS ja CTH lievitti solujen käsittely FK866 (kuvio 5B, C). Taso ATP väheni myös merkittävästi käsittelemällä DR solujen PAG ja FK866 (kuvio 5D, E). Tämä vähennys ATP oli yhdenmukainen edellisessä tutkimuksessa osoittavat, että inhibitio Nampt jonka FK866 tukahdutti tuotantoa ATP munasarjasyöpäsoluja [27]. Mielenkiintoista, hoito DR solujen estäjä CBS (CHH) ja estäjä CTH (PAG) vähensi Nampt (kuvio 5F). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Nampt voivat toimia kiihotusaineena H
2S-Producting entsyymejä ja näin tuotanto H
2S, kun taas H
2S aiheuttaa säätely ylöspäin Nampt.
(A ) määrä H
2S vapautuu DR
H W1 HepG2 solut käsiteltiin CTH estäjä, PAG (100 uM, 18 h), ja Nampt estäjä, FK866 (200 nM, 24 h). (B) Western blot-analyysi CBS DR soluissa puuttuessa ja läsnä FK866 (200 nM, 24 h). (C) Western blot-analyysi CTH vuonna DR soluissa puuttuessa ja läsnä FK866 (200 nM, 24 h). (D) ATP tasot DR
H2O2 W3 HepG2 soluista, kun (-) ja läsnäolo (+) ja PAG (100 uM, 18 h). (E) ATP tasot Pc, DR
H2O2 W2 ja DR
H2O2 W3 HepG2-soluissa puuttuessa ja läsnä FK866 (200 nM, 24 h). (F) Western blot-analyysi Nampt vuonna DR
H2O2 W2 ja DR
H2O2 W3 HepG2 solut käsiteltiin CBS estäjä, CHH (500 uM, 18 h) tai CTH estäjä, PAG (100 uM, 18 h). *;
p
0,05, **;
p
0,005, ***;
p
0,0005.
Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että säätely ylöspäin H
2S ja Nampt ja niiden ylikuulumisen parantaa bioenergetic tehokkuutta ja helpottaa toipumista vaurioita.
kasaantuminen H
2S johtaa suurempaan glykolyysin, parempi bioenergetiikan ja lisääntyvän leviämisen vaurioitumiseen talteen syöpäsolujen eristettyjä
in vivo
kasvanut kasvaimia
selville onko soluissa samanlainen
in vitro
syntyy DR solujen olemassa tai voidaan tuottaa kasvaimia, epiteelisyöpäsolujen inokuloitiin kateenkorvattomiin nude-hiiriin. Me eristetty elinkelpoisia syöpäsoluja (T
V) ja vaurioita talteen (T
DR) soluja, kuten kuvattu edellisessä tutkimuksessa [23]. T
DR-solut eristettiin
in vivo
syntyy kasvaimia osoitti kertyminen H
2S sekä lisääntynyt ilmentymä CBS ja CTH (kuvio 6A, B). Samanlainen
in vitro
tietojen tasot NAD
+ ja Nampt korotettiin T
DR soluja verrattuna tasot havaittiin Pc ja T
V-solut (kuvio 6C, D). ECAR lisääntyi T
DR soluja ja nämä solut osoittivat parempaa bioenergetic profiilin osoituksena kohonnut taso ATP ja korkeampi leviämisen nopeudella (Kuva 6E-G).
(A) H
2S tasot T
V ja T
DR-solut eristettiin HepG2 kasvaimista kasvanut
in vivo
. (B) ilmentäminen CBS ja CTH T
V ja T
DR soluja. (C) NAD
+ tasot T
V ja T
DR-solut eristettiin HepG2 kasvaimista kasvanut
in vivo
. (D) Nampt tasot T
V ja T
DR-solut eristettiin HepG2 kasvaimista kasvanut
in vivo
. (E) ECAR T
V ja T
DR-solut eristettiin HepG2 kasvaimista kasvanut
in vivo
ilmaistuna prosenttia ECAR tason Pc. (F) ATP tasolla elinkelpoisten kasvainsoluissa (T
V) eristettiin HepG2 kasvaimista kasvanut
in vivo
ilmaistuna prosenttia ATP tason Pc. (G) proliferaatio T
V ja T
DR-solut eristettiin HepG2 kasvaimista kasvanut
in vivo
ilmaistuna prosenttia leviämisen Pc. Solut ympättiin konsentraatiolla 2 x 10
4 ja kokonaismäärä solujen arvioitiin sen jälkeen, kun 24 ja 48 tunnin viljelyn. (H) Järjestelmä, H
2S-Nampt riippuvainen bioenergisesti piiri. Soluvaurioita johtaa suurempiin H
2S ja Nampt että coordinately johtavat aineenvaihdunnan muutoksiin. Nämä solut osoittavat räjähdysmäinen kasvu ja sietokykyä vaurioita. *;
p
0,05, **;
p
0,005, ***;
p
0,0005.
Näiden havaintojen perusteella ehdotamme järjestelmää, jossa syöpäsoluja toipunut vahinkoa muuttaa metabolointiprofiilista kautta säätely ylöspäin H
2S- Nampt reitti (kuvio 6H). Siten H
2S-Nampt riippuvainen energinen piiri on kriittinen säätelijä stressinsietokyky, lisääntynyt Glykolyysivaiheen, parannettu bioenergetiikan ja lisääntynyt solujen lisääntymistä.
Keskustelu
endogeeninen tuotanto H
2S on erittäin ylössäädelty epiteeli- peräsuolen ja eturauhasen syöpäsolujen ja tuumorista peräisin endoteelisolujen [28], [29]. Tämän mukaisesti todisteet, osoitamme, että epiteelisyöpäsolujen (maksa, rinta, iho) synnynnäisesti tuottaa suuria määriä rikkivetyä riippumatta niiden alkuperästä. H
2S lisääntyy entisestään syöpäsoluissa upon akuutti aiheuttaman vaurion hypoksia, vetyperoksidia ja bleomysiini, tai seuraava toipuminen vahinkoa seurauksena lisääntyneen ilmentymisen H
2S tuottavat entsyymejä,
CBS
ja
CTH
.