Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on yksi johtavista syistä syövän liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti yli miljoona kuolemantapausta vuodessa. Köyhä ennuste on, koska sen korkea aggressiivisuus ja sen varhainen etäpesäke. Vaikka tarkkaa mekanismia ei vielä tunneta, prosessia epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) näyttää olevan osallisena näitä kasvainmuutoksia prosesseissa. Olemme jo osoittaneet, että seerumitasot CCL18, kädellinen erityinen kemokiinin, ovat erittäin koholla potilailla, joilla on keuhkosyöpä ja korreloi niiden elinaika potilailla, joilla on adenokarsinooma keuhkojen. Siksi me arveltu, että CCL18 voidaan suoraan mukana patologisia keuhkosyöpään, esim. EMT. Olemme tutkineet vaikutus CCL18 A549, adenokarsinoomasolulinja keuhkojen, EMT ja muiden solujen toimintoja, kuten proliferaatiota, kemotaksista, invaasio, chemoresistance ja leviämisen. Altistuminen A549 keuhkosyövän soluja CCL18 eri pitoisuuksina vähentää epiteelisolujen markkeri E-kadheriinin, kun taas FSP-1, joka on markkerin mesenkymaalisten fenotyypin kasvaa. Näin ollen, CCL18 indusoi transkriptionaalisen EMT säädin SNAIL1 annoksesta riippuvaisella tavalla. Sitä vastoin yhä CCL18 pitoisuus liittyi lasku soluproliferaation määrä. Lisäksi, CCL18 indusoimaa kemotaksista näiden solujen ja kasvatti chemoresistance. Näin ollen, CCL18 voi olla mielenkiintoinen terapeuttinen kohde NSCLC.

Citation: Ploenes T, Scholtes B, Krohn A, Burger M, Passlick B, Muller-Quernheim J, et al. (2013) CC-kemokiinin ligandimallin 18 indusoi epiteelisolujen ja mesenkymaalitransitioon Lung Cancer A549 Cells ja nostaa Invasiivinen Potential. PLoS ONE 8 (1): e53068. doi: 10,1371 /journal.pone.0053068

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 28 marraskuu 2012; Julkaistu: 18 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Ploenes et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: On ei nykyiset rahoitusmahdollisuudet tätä tutkimusta varten. T.P. on vastaanottaja avustuksen, jonka Albert-Ludwig-yliopiston Freiburg (Stiftung Mattern). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut. J.M.Q. ja G.Z. ovat hakeneet patenttia CCL18 ja CCL18R biomarkkerina ja hoito tavoite (patenttihakemus). G.Z. on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

tuumorietäpesäke on monimutkainen tapahtuma, johon liittyy monenlaisia ​​vaiheita kuten erottaminen syöpäsolujen kompakti primaarikasvaimen, kulkeutuminen alukset, invaasio kudosten ja muodostuminen toissijaisen kasvain kyhmy. Vaikka vielä keskustelua, epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) näyttää olevan yksi keskeisistä tapahtumista paikallisten edistymistä ja etäpesäkkeiden epiteelin pahanlaatuinen kasvain [1], [2]. EMT on monimutkainen monivaiheinen tapahtuma, joka muuttaa paitsi solumorfologiaan vaan mahdollistaa myös soluja saamaan tärkeitä uusia toimintoja, kuten ilmaus uusien molekyylien tai muuttoliike ja hyökkäystä. Lisäksi morfologisia muutoksia, prosessi EMT on tunnusomaista erot transkriptio ja ilmentäminen epiteeli- ja mesenkymaalisten geenejä. Yksi tärkeimmistä molekyylimarkkereiden epiteelisolujen on epiteelin adheesiomolekyyli E-kadheriinin, joka välittää solu-solu-vuorovaikutuksia [3]. Prosessi EMT liittyy menetys E-kadheriinin, joka korreloi positiivisesti kasvaimen vaiheen ja huono selviytyminen monilla epiteelituumori [4] – [6]. Rinnalla menetys epiteelin merkkiaineiden ilmentymisen mesenkymaalisten merkkiaineiden, kuten FSP-1 on myös tärkeä askel prosessissa, EMT [7]. FSP-1, jota kutsutaan myös S100A4 korreloi metastaattista potentiaalia kasvaimet ja jotkut kirjoittajat osoittivat, että korkean tason FSP-1 on yhteydessä huonoon ennusteeseen eri syöpätyyppejä [8] – [10]. EMT säätelevät useat transkriptiotekijät [11]. Yksi tärkeimmistä on SNAIL1, joka toimii myös E-kadheriinin repressori. On osoitettu, että korkea SNAIL1 ilmentyminen liittyy huonon ennusteen keuhkosyövän [12]. EMT voidaan indusoida useat kasvutekijöiden ja sytokiinien, mikä tärkeintä, jonka TGF-beetaa mutta myös EGF, FGF, HGF ja muut [13]. Useimmat näistä tekijöistä ovat läsnä tuumorin ympäristöön ja tuotetaan tuumorisolut itse tai ympäröivän solun komponentteja. Mikroympäristössä kiinteiden kasvainten on monimutkainen seos solujen ja muiden solujen tekijöitä, jossa kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) edustaa jopa 50% kasvaimen massa [14]. TAM vaihtoehtoisesti aktivoidaan makrofagit erittävät tiettyä mallia useista kasvain edistämällä sytokiinien ja kasvutekijöiden. Yksi näistä sytokiinien on ihmisen tietyn CC-kemokiinin ligandin 18 (CCL18), joka on erittäin läsnä keuhkokudoksessa ja mukana monissa patologisissa prosesseissa pahanlaatuisten sairauksien tai fibroosi [15] – [20]. Olemme jo osoittaneet, että CCL18 on erittäin koholla potilaiden seerumeista ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja korreloi kasvaimen vaiheen ja eloonjäämiseen alaryhmässä adenokarsinooma [21], [22]. Mean CCL18 seerumin taso joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä oli 150 (857) ng /ml vs. 32 (61) ng /ml terveillä kontrolliryhmässä [22]. Me siis arveltu, että CCL18 on indusoi EMT ihmisen adenokarsinoomasolua keuhkojen ja parantaa metastaattista potentiaalia.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Rekombinantti ihmisen TGFbeta1 ostettiin R https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/). Liittymistä koodinumerot nukleotidisekvenssejä käytetään tuottamaan vastaavia alukkeita ja alukkeen sekvenssit on lueteltu taulukossa 1.

Kaikki alukkeet introni-ulottuu ja syntetisoitiin Biomers (Biomers.net, Ulm, FRG ). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen iQ SYBR Green SuperMix-, iCycler thermocycler, ja iCycler iQ 3.0 ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, FRG) mukaan valmistajan protokollaa. Sulamiskäyräanalyysillä käytettiin ohjaamaan spesifisyyden monistuksen tuotteita. Mitään monistusta epäspesifisten tuotteiden havaittiin tahansa reaktioista. Raja-cycle-arvo (Ct) laskettiin ja käytetään laskemaan suhteellinen taso spesifisten mRNA meidän näytteet seuraavan kaavan:

Western Blot

Solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä ja raaputettiin pohjasta. Solut lyysattiin lyysipuskurilla (50 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,1% Trition-X), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä kit (Thermo Scientific, Waltham, MA), naudan seerumin albumiinia standardina. Kokosolulysaateille keitettiin 93 ° C: ssa 5 minuutin ajan yhtä suuret tilavuudet latauspuskuria (0,5 M Tris-HCI, pH 6,8, 2% SDS: ää, 0, 05% bromifenoli-sinistä, 20% 2-merkaptoetanolia, 10% glyserolia ).

Kaikki näytteet tehtiin 12% natriumdodekyylisulfaattia-PAGE, erotettiin elektroforeesilla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo (PVDF). Blokkauksen jälkeen 2 tuntia Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa, kalvoja inkuboitiin ensisijaisen vasta-ainetta laimennettuna 1:200 (FSP-1), 1:500 (E-cadherine) tai 1: 3000 (SNAIL1) ja TBS, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa 4 ° C: ssa yön yli. Visualisointi suoritettiin käyttäen sopivia sekundäärisiä vasta-aineita on leimattu IRDye 800CW tai IRDye 700CW (Li-COR Bioscience, Bad Homburg, FRG) laimennettuna 1:10 000-1:20000 2 tuntia ja skannata Odyssey järjestelmä (Li-COR Bioscience, Bad Homburg , FRG) mukaan valmistajan ohjeiden.

Kemotaksismääritvs

Kemotaksisanalyysit suoritettiin käyttäen 10-kuoppaisen kemotaksis-kammion (NeuroProbe, Gaithersburg, USA). Pohja kuopat täytettiin 400 ui DMEM, joka sisälsi CCL18 pitoisuus on 100 pg /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, ja 100 ng /ml (kontrolli: TGF-beetaa 2 ng /ml). A12 um huokosia halkaisijaltaan polyvinyylipyrrolidoni-vapaa polykarbonaatti suodatin (NeuroProbe, Gaithersburg, USA) asetettiin pohjalevyn. Silikonitiiviste ja ylälevy 12 reikää sitten asennettu, joka muodostaa alkuun kuoppiin. 2 x 10

4 solut lisättiin tilavuuteen 285 ui. Rinnakkaisissa kokeissa, DMEM ilman kemokiini ladattiin pohjaan kuoppiin negatiivisena kontrollina. Toinen negatiivinen kontrolli kanssa kemokiinin saman pitoisuuden ylä- ja alempi hyvin suoritettiin myös. 24 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa ja 5% CO 2, suodatin levy poistettiin, ja ei-siirretyn solut pyyhkiä pois yläpuolelta suodattimen. Sitten suodatin värjätään kristalliviolettia (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ja kiinnitetty kirkas lakka. Tämän jälkeen 9 korkean tehon kenttää per suodatin laskettiin 200-kertainen suurennus käyttäen Zeiss mikroskoopilla.

Invasion Pitoisuus

solujen kyky kulkeutua läpi Matrigel tyvikalvon matriisin mitattiin käyttäen Cell Invasion Assay Kit (Chemicon International, Temecula CA), jossa on 8 mm: n huokoskoon polykarbonaattikalvon. Uudelleenhydratoinnin jälkeen geelit 2 tunnin ajan, 1 x 10

5-solut seerumivapaassa DMEM levitettiin ylempään kammioon, kun taas alempi kammio sisälsi seerumitonta DMEM tai seerumittomassa DMEM CCL18 eri pitoisuuksina tai TGF-beetaa kontrollina. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan, kaikkien solujen ylemmän kammion puolella poistettiin pumpulipuikolla ja kalvo poistettiin ja invasiivisia solut värjättiin käyttäen kideviolettia. Analyysi tehtiin laskemalla 9 suuritehoisia kenttää per suodatin 200-kertainen suurennus käyttäen Olympus mikroskooppi (Olympus, Tokio, JPN).

Chemoresistance Pitoisuus

mittaamiseksi vaikutuksen CCL18 on chemoresistance kasvaimen solut, A549-soluja viljeltiin 6-kuoppaisen levyn ja kasvatettiin 80% konfluenssiin. Soluja viljeltiin 24 ja 72 tuntia tai ilman CCL18 pitoisuuksina, kuten on ilmoitettu. Tämän jälkeen laimennussarja Sisplatiinin vaihtelevat 0,4-25 ug /ml lisättiin vielä 72 tunnin ajan. Lopussa määrityksen aikana elävät solut mitattiin käyttäen MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli-liumbromidi] määrityksessä. Väliaine vaihdettiin ja MTT-liuosta (5 mg /ml fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa /kuoppa) lisättiin 4 h ja tuotettu formatsaanikiteet liuotettiin isopropanoliin ja mitataan spektrofotometrisesti 563 nm: ssä. Optinen tiheys talteen ei-käsitellyissä soluissa oli asetettu 100% ja käytetään laskettaessa prosenttiosuudet elinkelpoisten solujen käsitellyissä viljelmissä.

BrdU leviämisen valossa määrityksen

DNA-synteesi mitattiin käyttäen bromideoksiuridiinia (BrdU) Cell Proliferation Kit (Calbiochem, Darmstadt, FRG). BrdU-merkinnät liuos lisättiin soluihin yhdessä erilaisia ​​hoitoja ja inkuboitiin 24 tuntia. Poistamisen jälkeen viljelyalustan, solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja DNA denaturoitiin kautta mikroaaltouuni. Anti-BrdU-vasta-ainetta lisättiin yhden tunnin ajan ennen kuin lisättiin hiiren IgG-peroksidaasikonjugaatin 20 minuuttia. Signaali kehitettiin tetrametyylibentsidiinin ratkaisu pimeydessä. Absorbanssi mitattiin käyttämällä spektrofotometrisellä levynlukijalla 450 nm: ssä, jossa on viittaus aallonpituudella 595 nm.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen StatView (SAS Institute, Cary, NC). Arvot esitetään keskiarvona ± SD ainakin vähintään kolme itsenäisesti kokeita. Annos-riippuvuudet laskettiin Friedman Test seuraa pariksi vertailuja käyttäen Wilcoxonin testi.

Tulokset

muutos Solumorfologia

Aluksi A549 paljastaa tyypillinen cuboid epiteelin morfologia kanssa tiukka solu-solu kontakteja (Fig. 1A). Hoito solut CCL18 24 tunnin ajan indusoi merkittäviä muutoksia solun morfologiassa (kuvio. 1C ja D). Solut muutti morfologia peräisin kuution tai kolmion muotoisia karan-muotoinen; kehittyneillä pitkittynyt solu puristeet ja solu-solu kosketuksiin olivat vähemmän voimakkaita. Nämä muutokset voidaan havaita annosvälillä 1-100 ng /ml (kuvio. 1C). Kuten odotettua, stimulaatio 2 ng /ml TGF-beetaa 24 tuntia aiheuttama myös kara-muotoinen, fibroblastien kaltainen fenotyyppi (Fig. 1 B). Siten CCL18 ja TGF-beetaa aiheuttaa morfologisia muutoksia yhteensopiva EMT.

morfologiset muutokset soluissa käsitelty CCL18 ja TGF-beetaa: käsittelemätön A549-solut osoittavat tyypillisiä epiteelin morfologia läheisessä solu-solu-yhteydet, jotka on merkitty valkoisilla nuolilla ( A). Hoidon jälkeen 2 ng /ml -β-solujen muuttunut fenotyyppi entistä mesenkymaaliset morfologia pitkittyneen solujen puristeet ja löysätä solu-solu-kontaktien merkitty nuolenpäin. (B) CCL18 muuttaa myös solun morfologian annoksesta riippuvaisella tavalla (C [1 ng /ml] ja D [10 ng /ml]) ja fibroblastin kaltaisia ​​mesenkymaalisten fenotyypin ja irrottaa solu-solu-kontaktien merkitty nuolenpäillä.

Expression of EMT liittyvien geenien

Käyttämällä RT-PCR, emme voineet havaita mitään selkeää vaikutusta CCL18 E-kadheriinin ilmentymisen jossakin käytettyinä pitoisuuksina jälkeen stimulaation ajan 72 tunnin (Fig. 2A). Sitä vastoin stimulaatio A549 kanssa CCL18 72 tuntia lisää SNAIL1 (Fig. 2B) ja FSP-1 ilmentymisen (Fig. 2C). Kasvu FSP-1 ilmentyminen oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,03). Mielenkiintoista on, että vaikutus oli suurimmillaan 1 ng /ml CCL18 ja laski hieman kasvavilla pitoisuuksilla (Kuva. 2C.). Verrattuna hallita CCL18 stimulaation lähes kaksinkertaistui keskimääräistä SNAIL1 ilme. Tämä kasvu ei pääse merkitystä ja selvää annos-suhde voitiin havaita (Fig. 2B). Mielenkiintoista on, että vaikka TGF-beetaa indusoi kasvua SNAIL1 ja FSP1 ilmentymisen vaikutukset olivat pienemmät kuin mitä havaitaan vertailukelpoinen CCL18 pitoisuus (1 ng /ml). Jälleen, ei ole vaikutusta E-kadheriinin ilmentymisen löytynyt.

mRNA-tasoja (A) E-kadheriinin, (B) SNAIL1, (C) FSP-1 stimulaation jälkeen -β tai erilaisia ​​CCL18 pitoisuuksina 72 h verrattuna ei-Ärsykekontrollin. Jokainen pylväs edustaa keskiarvoja ± SD neljästä itsenäisestä kokeesta. GAPDH käytettiin taloudenhoito geeni normalisoimaan erojen määrän kokonais-RNA.

Muutokset Expression of EMT liittyvien PROTEINES

Vahvista meidän PCR havaintojen analysoimme proteiini ilmentymisen Western Blot. Rinnakkain PCR-tuloksiin, E-kadheriinin ilmentymisen esitetty hieman, mutta ei-merkittävä lasku, kun soluja stimuloitiin CCL18 72 tuntia (Fig. 3A). Sen sijaan löysimme huomattavasti SNAIL1 (p 0,005; Fig. 3B) ja FSP-1 ilmaisuja (p 0,05; Fig. 3C) neljäkymmentä ja viisikymmentä prosenttia, vastaavasti. TGF-beetaa (2 ng /ml) indusoi joko ei (snail1) tai vain vähäisiä ja merkityksettömiä muutoksia (E-kadheriinin, FSP1, Fig. 3).

Kaikki tulokset normalisoitiin käsittelemättömään kontrolliin. Bars yhteenveto tuloksista kolmen itsenäisen western blot analyysit, oikeassa paneelissa yksi edustaja blot on esitetty.

CCL18 liittyviä Kemotaksia ja Invasion

Boyden kammion kokeet paljastivat, että CCL18 indusoi kemotaksista A549-soluja annoksesta riippuvaisella tavalla. Havaitsimme annoksesta riippuvainen ja merkittävää (p 0,0001) lisäys kemotaksista aiheuttama CCL18, joka saavutti suurimman (50% kontrolliin verrattuna) annoksena 100 ng /ml CCL18 (Fig. 4). TGF-beetaa (2 ng /ml) lisää kemotaksista 40%, mikä oli myös tilastollisesti merkittävä (p 0,0001). Voitto valmiudet invaasion kudoksen tai matriisi on uusi tärkeä ominaisuus EMT vaativat proteolyyttisen aktiivisuuden lisäksi kemotaksista. Siksi olemme analysoineet vaikutus CCL18 kykyyn hyökkäystä. Olemme havainneet, että CCL18 (1 ng /ml) lisää invaasio yli kaksinkertaiseksi verrattuna kontrolli (p 0,0001, Fig. 5). TGF-beetaa (2 ng /ml) kasvaa invasiivisia samaa luokkaa, mutta vähäisempää (p 0,0001).

merkitykset laskettiin parivertailu (Wilcoxonin testi), ohjaus: käsittelemättömät solut (n = 4) .

merkitykset laskettiin parivertailu (Wilcoxonin testi), ohjaus: käsittelemättömät solut (n = 3).

leviämisen

vaikutuksen määrittämiseksi CCL18 soluproliferaatioon, A549-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan joko 2 ng /ml TGF-beetaa tai 0,1 ng /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, tai 100 ng /ml CCL18, vastaavasti, ja sen jälkeen BrdU-määritys suoritettiin. Inkubointi CCL18 vähentynyt leviämisen korko annosriippuvaisesti saavuttaa merkittävä vähennys 50% verrattuna kontrolleihin 1000 ng /ml (p 0,001; Fig. 6). TGF-beetaa (2 ng /ml) vähensi lisääntymistä korkoa 55% verrattuna kontrolleihin (p 0,001).

Chemoresistance

Tutkimme lisäksi CCL18 moduloi herkkyyttä A549 että sisplatiinihoitoon. Siksi me inkuboitiin solujen kanssa CCL18 ja joita käsitellään myöhemmin solut sarjalaimennoksia Cisplatin. Jälkeen CCL18 stimulaation 72 tuntia, ei ole toksisia vaikutuksia CCL18 tai TGF-beetaa voitiin havaita (tuloksia ei ole esitetty). LD

50 käsittelemättömien A549-solut oli 6 ug /ml sisplatiinia. Jälkeen CCL18 stimulaation (0,1 ng /ml) solujen 72 tunnin ajan, LD

50 nousi 9 ug /ml sisplatiinia. Samoin LD50 stimuloitujen solujen nousi 10 ug /ml silloin, kun soluja esikäsiteltiin 1 ng /ml CCL18 (Fig. 7). Suurempia pitoisuuksia CCL18 testattiin, mutta mitään ylimääräistä vaikutusta ei havaittu (tuloksia ei ole esitetty).

Soluja viljeltiin läsnä ollessa tai ilman -TGFbeta tai CCL18 ilmoitetuissa konsentraatioissa 72 tuntia. Viljelyjakson jälkeen, väliaine vaihdettiin ja soluja inkuboitiin sisplatiinin kanssa vielä 72 tunnin ajan pitoisuuksina 0,4-25 ug /ml. Solujen eloonjääminen mitattiin MTT-määrityksellä. Vaakasuora viiva osoittaa LD

50, pystyviivat osoittavat LD

50 vastaaville preinkubointi ehto (n = 4).

Keskustelu

Lung syöpä on yksi syöpäsairauksia korkein esiintyvyys länsimaissa, ja siitä huolimatta edistysaskeleet diagnosoinnissa ja hoidossa yksi johtavista syövän syiden liittyvän kuoleman [23]. Lähes 85% näistä potilaista kärsii ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka on jaettu levyepiteelikarsinooma, adenokarsinooma, iso solukarsinoomat ja muiden harvinaisten alatyyppeihin [24]. Adenocarinoma edustaa korkeinta osuudet NSCLC ja 1970-luvulta lähtien sen osuus on kasvussa [25]. Hetkellä diagnoosi suurimmalla osalla potilaista NSCLC kärsii kuitenkin edennyt tai etäpesäkkeitä, joka liittyy huonoon ennusteeseen [26]. Mekanismi etäpesäkkeiden keuhkosyövän ei täysin tunneta, mutta epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) näyttää olevan yksi keskeinen tapahtuma prosessissa etäpesäke. Jotkut kirjoittajat jo osoittanut, että eri välittäjien julkaistiin mikroympäristössä kiinteiden kasvainten kykenevät indusoimaan EMT ja siksi edistää taudin etenemiseen [14]. CCL18 on kemokiini tuotetaan ja vapautuu kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) mikroympäristössä syöpäsolujen ja keuhkofibroosia [16], [17]. Voisimme osoittamaan, että CCL18 on erittäin kohonnut potilailla, joilla on NSCLC ja korreloi T-vaiheen ja keskimääräinen elinaika on adenokarsinooma alaryhmä [21]. Tämä johtaa kysymykseen, jos CCL18 on suoraan mukana patogeenisia prosesseja syöpäsairaudet. Koska CCL18 havaittiin indusoivan kollageenin keuhkojen fibroblasteja ja toimimaan samalla tavalla kuin TGF-beetaa [17], [27], [28], me arveltu, että CCL18 voi edistää prosessia etäpesäkkeiden kautta EMT. A549-solut ovat hyvin tunnettu ihmisen solulinja eristettiin adenokarsinooma keuhkojen, joka on jo käytetty useissa tutkimuksissa, tutkimalla induktion EMT TGF-β [29], [30]. Kanssa muita, me osoittavat, että A549-soluja käsiteltiin myös pienellä annoksella TGF-β tehtiin morfologisia muutoksia kuution epiteelisolujen karan muotoinen fibroblastin kaltaisia ​​soluja, ja hankkinut mesenkymaaliset fenotyyppi 24 tunnin kuluttua hoidosta. Samoin pystyimme myös osoittamaan, että CCL18 indusoi saman morfologiset muutokset, kuten TGF-β. Tämä tukee edelleen analysoimalla ekspressiokuviota epiteeli- ja mesenkymaalisten geenien mRNA: n ja proteiinin tasolla. Ylös-säätely mesenkymaalisten geenien kuten FSP-1 tai SNAIL1 on tunnusmerkki parhaillaan EMT. Havaitut muutokset ominaisuuden ilmaisua kuvio ovat melko samankaltaisia ​​TGF-β ja CCL18 ärsykkeet. Tässä yhteydessä on huomattava, että Miyazaki et al. julkaistiin vuonna 2006, että potilailla, joilla keuhkojen adenokarsinooma osoittavat matalan E-kadheriinin ilmentymisen yhdessä korkean FSP-1 ilmentymisen joutuvat kohtaamaan merkittävä huonompi ennuste johtuu hematogenous etäpesäkkeiden [9]. Havaitsimme myös, että SNAIL1, transkriptiotekijä kutsuttava varhaisessa tapahtumien EMT, was up-säännellään CCL18 käsittely samalla tavoin kuin TGF-beetaa. Tässä prosessissa etäpesäke, syöpäsolujen hankkia uusia ominaisuuksia, kuten hyökkäyksen, lisätä maastamuuttoa ja alas-säätely leviämisen. Me siis tutkittu myös vaikutus CCL18 näihin solujen toimintaa ja noudatetaan tehostettua vaeltavia ja invasiivisia mahdollisten 24 tunnin kuluttua CCL18 hoidon. Lisäksi leviämisen nopeus A549 laski 24 tunnin kuluttua CCL18 hoidon, mikä saattaa johtua aloittamisen erottaa prosesseja. Yhteensä nämä laajat muutokset solun toimintojen edellä mainittu osoittamaan vahvaa vaikutus CCL18 prosessissa etäpesäke. Siten perustuvat Tässä esitetyt tiedot, meidän aiemmin julkaistu tietoja, seerumin CCL18 korreloi vähentynyt selviytymisen aikaa adenokarsinooma keuhkoissa [22] ja siihen havaintoon Chen et al. osoittavat, että CCL18 edistää etäpesäke rintasyövän [5] me arveltu, että CCL18 voi olla yksi tärkeimmistä tekijöistä EMT kasvain ympäristössä.

Pitäen mielessä, että suurin osa potilaista tarvitsee kemoterapiaa joko adjuvanttia tai neoadjuvant osa multimodaalisen lähestymistavan tai yhtä hoitoa, chemoresistance on edelleen yksi suurimmista esteistä riittävän hoidossa NSCLC ja syy kasvaimen edistymistä, uusiutumisen ja kasvaimen kuolemaan. Kemoterapia NSCLC nojaa edelleen platina on johdettu huumeita, vaikka tiedetään, että useat mekanismit ovat olemassa, miten keuhkosyöpäsoluissa paeta sisplatiinin sytotoksisuuden ja CCL18 saattaa olla keskeinen välittäjänä näissä prosesseissa. Nämä mekanismit näyttävät olevan yhteydessä EMT koska transkriptiotekijät säätelevät EMT myös säädellä kuljettaja proteiineja liittyvä lisääntynyt kestävyys platinaa aineita [31], [32]. Siksi tutkimme roolia CCL18 in chemoresistance. Havaitsimme todellakin kasvanut chemoresistance aiheuttama CCL18. Kiinnostavaa kyllä, tämä lisäys chemoresistance korkeimmillaan samaa luokkaa kuin merkkiaineiden EMT (esim FSP1). Tämä antaa näyttöä rooli CCL18 induktioon chemoresistance. Koska CCL18 on kemokiini, joka saattaa myös olla mukana itseohjautuva syöpäsolujen, myös tutki chemotacic ominaisuuksia CCL18 A549-soluissa. Havaitsimme, että CCL18 kykenee annosriippuvainen lisääntyminen kemotaksista keuhkosyövän soluista osoittaa, että CCL18 houkuttelee keuhkosyöpään solujen sivustoja CCL18 vapautumisen. Koska keuhkojen on elin, jolla on korkein taso CCL18 tuotannon, tämä vaikutus saattaa vaikuttaa ohjautumisen CCL18 kasvainsolujen keuhkoihin.

Mielenkiintoista, useimmissa kokeissa emme voineet havaita selkeä annoksesta riippuvainen vaikutus CCL18. Sen sijaan lisäämällä pitoisuudet CCL18 johtaa usein pienentävä vaikutus CCL18. Tämä on yhteensopiva ilmaisun eri agonistinen ja antagonistinen reseptorit CCL18. Äskettäin Catusse et ai. julkaistu että CCL18, liipaisu kautta GPR30 toimii agonistista ja vähentää CXCR4-välittämiä vaikutuksia CXCL12 [15]. Chen et ai. osoittivat, että PITPNM3, joka on kalvoon liittyvä fosfatidyyli siirto domain sisältävä proteiini, voi toimia CCL18-reseptori [5]. Olemme tunnistaneet jo tiedossa kemokiinireseptoria CCR6 kuin CCL18 reseptorin teho aloittaa kuvatun toiminnan fibroblasteissa [33]. Tämä osoittaa, että CCL18 voi käyttää useita reseptorit ja tasapaino-reseptorin ilmentymisen voisi säädellä agonistinen ja antagonistiset vaikutukset CCL18.

Yhteenvetona tietomme osoittavat, että CCL18 indusoi EMT A549-soluissa, parantaa metastasoituneeseen potentiaalia ja tukee kemoterapian resistenssin. Näin ollen, CCL18 ei ole vain välittäjänä vapauttaa kasvaimeen liittyvien makrofagien ja mahdollisesti heijastaa kasvaimen koon, mutta se vaikuttaa myös neoplastisiin prosesseihin adenokarsinooma. Tässä esitetyt tulokset osoittavat, että CCL18 voi käynnistää tapahtumia mukana tuumorimetastaasissa kuten muutos ensisijaisesti epiteelikasvainsolut osaksi vaeltavien mesenkyymisolujen, kemotaksista, ja invaasio. Lisäksi, CCL18 suojaa myös kasvainsolujen kemoterapian lisäämällä chemoresistance. Näin ollen päättelemme, että CCL18 on tulevaisuuden tavoite hoitoon keuhkosyöpään.