Krooninen sairaus

tiivistelmä

Perinteiset keuhkosyövän hoitojen liittyy kemiallisia tai sädehoitoa jälkeen kirurginen kasvaimen poisto; kuitenkin, nämä menettelyt ovat usein tappaa normaalit solut samoin. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että chemotherapies, yhdistettynä perinteinen kiinalainen lääkintä, voi tarjota uuden tavan syövän hoitoon.

In vitro

mittaavia testejä induktion autophagy ja /tai apoptoosin käytettiin tutkimaan sytotoksisuuden SBPE, jota käytetään yleisesti keuhkojen tulehduksen A549-solulinja. Tulokset osoittivat, että solujen välinen tasot P62 ja Atg12 lisättiin, LC3-I katkaistiin osaksi LC3-II, ja autophagy indusoitiin SBPE vain. 24 tunnin jälkeen, apoptoottisten mekanismi indusoitiin. Jos Sisplatiini lisättiin sen jälkeen, kun solut saavuttanut autophagy tilassa, havaitsimme synergistisiä vaikutuksia kahden voisi saavuttaa riittävä kuoleman keuhkosyövän soluja. Siksi sisplatiini käytetty annostus apoptoosin voitaisiin vähentää puoleen, ja aikaa saavuttamiseksi tarvitaan inhiboiva konsentraatio 50% oli myös puolet alkuperäisestä. Lisäksi asiakkuutta autophagy kuluessa lyhyemmästä aikaan SBPE ja kemoterapia lääkeyhdistelmäterapiaan pystyi tavoitteen saavuttamiseksi nopean alhaisen annoksen syöpäsolun poistamista. Sitä paitsi, SBPE levitettiin gemsitabiini tai Paclitaxel, ja totesi, että yhdistelmähoito todellakin saavuttaa parempia keuhkosyövän soluja tappava vaikutus. Kuitenkin SBPE voi myös olla vähemmän myrkyllisiä normaaleille soluille.

Citation: Tseng C-Y, Lin C-H, Wu L-Y, Wang J-S, Chung M-C, Chang J-F, et ai. (2016) Mahdolliset Combinational Anti-Cancer Therapy in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, jossa perinteisen kiinalaisen lääketieteen su-Bai-Pi Pura ja sisplatiinia. PLoS ONE 11 (5): e0155469. doi: 10,1371 /journal.pone.0155469

Editor: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung yliopisto, Taiwan

vastaanotettu: 29 helmikuu 2016; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2016; Julkaistu: toukokuu 12, 2016

Copyright: © 2016 Tseng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksen Ministry of Science and Technology (NSC-102-2320-B-033-001-MY3) Taiwanissa.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Taiwanissa, noin 10.000 uutta keuhkosyöpää esiintyy vuosittain, ja 7000 ihmistä kuolee keuhko syöpä vuosittain [1], joka on suurempi kuin ne, joilla on peräsuolen, kohdunkaulan, rinta-, eturauhas-, ja mahasyöpä yhdistettynä. Nämä numerot edelleen kasvaa nopeasti vuosittain. On olemassa lukuisia syitä keuhkosyöpä, ja varhainen oireet eivät aina ole ilmeisiä. Keuhkosyöpä potilaat eivät useinkaan ole tietoisia ensimmäisiä oireita ja epäonnistui mahdollisuuksia varhainen diagnoosi ja hoito [2]. Mukaan Department of Health tilastojen tupakansavu, kuuma terva höyryjä, säteilyä, asbesti, tehdas savu, noki, hieno keskeytetty hiukkaset, ja pöly myrskyt ovat ensisijainen syy keuhkosyöpään [3-14]. Keuhkosyövästä luokitellaan pienisoluinen tai ei-pienisoluinen karsinoomien mukaan, ovatko ne ei-epiteelin tai epiteelin johdetun vastaavasti [15]. Pienisoluinen karsinoomat ovat erittäin pahanlaatuisten ja voi helposti etäispesäkkeitä, varsinkin jos solu-koko on erittäin pieni [16]. Siksi kemiallinen käsittely on edullinen hoitokuuri pienisoluisen karsinooman [17-19]. Sivusuunnassa tapauksissa voidaan jakaa okasolusyöpä, adenokarsinooma (mukaan lukien bronchioloalveolar karsinooma, jota kutsutaan myös alveolaarinen karsinooma), suuri karsinooma, rauhasten okasolusyöpä, karsinoidituumorit, keuhkoputken adenokarsinooman (mukaan lukien rauhasmainen kystinen karsinooma tai mucinous epiteelikarsinooma), jne [15, 20, 21]. Hoidot tämäntyyppisten syöpien liittyvät pääosin kirurginen täydennetään säteilyn ja kemoterapiaa [22, 23].

hoitoon tavanomaisten ei-pienisoluinen keuhkosyöpä jälkeen kirurgisen poiston, kemoterapian tappaa normaalit solut yhdessä syöpä niistä . Mitä pidempi kemoterapiaa jatkuu, sitä vahvempi vastus, joka on kehittänyt syöpäsolut [24, 25]. Vaikka tämä hoito menetelmä voi tarjota haluttuun lopputulokseen, se myös lisää riskiä samanaikaisten sairauksien [25]. Suuremmat annokset kemoterapiaa huumeita tarvitaan aikana terminaalin vaiheissa syöpien, jotta saavutetaan sama vaikutus pienempien annosten aikana aiemman sairauden vaiheet [20]. Sivuvaikutuksia perinteisen käsittelymenetelmät tehdä niistä vaikeampaa ja vähemmän sopivia potilaille, joilla on myöhemmissä vaiheissa syövän tai huonompi terveys [26-29]. Perustuen sivuvaikutuksia ja aiheutuvia haittoja näiden hoitojen, viimeaikaiset tutkimukset keskittyivät kasvainsoluihin ja kiinnitettävä enemmän huomiota solun immunoterapia, geeniterapian kohde lääkehoito jne [30-34]. Jotkut tutkimukset yrittivät hakea kasviperäisten lääkkeiden syövän hoitoon [35-38]. Nämä tutkimukset osoittivat, että lukuisat kasviperäisten lääkkeiden, kuten Kiinan marjakuusi, ängelmät onni, Plumbagin tai Ganoderma lucidum [39-42], todettiin vähentää epänormaalia tulehdusta [43-45] ja nopeasti indusoida tuumorisolujen apoptoosin [46-48] .

Sun-Bai-Pi (SBP) on juuri kuori valkomulperi L. mukaan Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine ”Yhteenveto materia Medica” SBP on keskeinen lääke, jota käytetään poistamaan vesihöyryn keuhkot ja hoitoon sylki verta, lämmitetty jano, turvotus, täyteläisyys ja vatsan turvotus, virtsan raita ongelmia, asteeniset päänsärky, sisäinen energia puutos, yskä, tulehdus, diabetes, syöpä, hepatiitti, ja sydänsairaudet [49]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että keskeiset ainesosat Sun-Bai Pi Extract (SBPE) mukana Morusin, Prenylflavonoid, ja bentsofuran [50-53]. Nämä ovat antioksidantteja, jotka voivat vähentää NF-KB-aktiivisuutta syöpäsoluissa, aiheuttaa sytotoksisuus, ja estävät syöpäsolujen leviämiseen, mutta niiden vaikutusmekanismi on vielä epäselvä [54-57]. Siksi lisäksi tutkimiseen mekanismeihin SBPE aiheuttama syöpä solukuoleman, meidän on myös luoda asianmukaiset synergististä syöpähoidon, joka yhdistää kasviperäisten lääkkeiden ja kemoterapiaa huumeita. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että lisäksi pitkän aikavälin apoptoosin, SBPE myös indusoi autophagy A549 keuhkosyövän soluja. Kun kemoterapiaa huumeiden, sisplatiinia, lisättiin autophagic A549-soluja, tulokset osoittivat, että SBPE paransi syöpäsolun tappaminen tehokkuuden kemoterapiaa huumeita jopa pienentää tasolle.

Materiaalit ja menetelmät

Chemical

SBP kerätään Di Lian Sheng Pharmaceuticals (DLSP, Taiwan), joka uutettiin kuumalla vedellä 30 minuutin ajan sen jälkeen sentrifugoimalla, varanto dialyysi ja proteiini ehtyminen. Pelletti heitettiin pois, supernatantti otettiin talteen ja säilytettiin 4 ° C: ssa. Sisplatiini, gemsitabiini, paklitakseli ostettiin Sigma-Aldrich.

Soluviljely

Ihmisen keuhkosyöpä keuhkorakkuloiden A549-soluja ja normaali keuhkojen fibroblastien WI 38VA13 Osio 2RA solut saatiin Bioresource Collection ja tutkimuskeskus (BCRC, Taiwan). Soluja viljeltiin Hamin F-12K-alustassa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Kokeita varten solut käsiteltiin SBPE useita ajankohtina tai käsitelty SBPE 6 h, jonka jälkeen ylimääräinen kemoterapialääkkeet altistus lisäaikaa pistettä.

MTS sytotoksisuusmäärityksissä

Elävyys havaitaan käyttämällä kaupallista MTS-määritys ostettiin Promega (Madison, WI), mittaamalla mitokondrioiden sukkinaattidehydrogenaasi aktiivisuuden kautta muuntaminen MTS ja phenazinemethosulfate on formatsaaniksi. Käsittelyn jälkeen, seos 10 ul vesiliukoisten kit reagenssia plus 190 ui tuoretta väliainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja 1 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa pimeässä. Supernatantit (100 pl /kuoppa) kerättiin ja absorbanssi syntyy formatsaanin mitattiin 490 nm: ssä, jossa on microreader.

Autophagy immunofluoresenssilla

Kiinnityksen jälkeen ja läpäiseväksi, epäspesifinen reaktiivisuus on estetty lisäksi 2% normaalia vuohen seerumia 0,02% NaN

3. A549-soluja inkuboitiin sitten ensisijaisesti anti-LC3 (Abcam) ja anti-LAMP-1 (Abcam) monoklonaalisia vasta-aineita 1: 200 laimennos 24 h, 4 ° C: ssa. Toissijainen vasta-aine on leimattu Alexa Fluor 488 (Invitrogen) tai Alexa Fluor 594 (Invitrogen) käytettiin ja objektilasit peitettiin Prolong Gold (Invitrogen) antihäipyminen kiinnitysväliaineet ennen käyttöä. Kaikki kuvat havaittiin Olympus IX51 mikroskoopilla.

mittaus kaspaasi 3 aktiviteetti

kaspaasiaktiivisuus arvioitiin kanssa käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 iinianalyysikitissä (Promega). Jälkeen SBPE hoidon viljelmän levyt poistettiin inkubaattorista ja annettiin tasapainottua huoneenlämpötilassa noin 30 minuuttia, ja sitten kaspaasi-Glo 3/7 reagenssilla (200 ul /kuoppa) pantiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Suhteellinen Luminanssi Unit (RLU) synnyttämä tuote mitattiin käyttäen microreader.

Western blot

Proteiinit (40 ug /kuoppa /näyte) erotettiin electrophorectically SDS-geeleissä siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Epäspesifinen reaktiivisuus kalvot estettiin, ja ensisijainen anti-p62 (Abcam), anti-Atg-12 (Cell signalointi), anti-p53 (Abcam), anti-LC3 (Abcam), anti-Bcl-2 (Soluviestintä) , anti-Bax (Cell signalointi), anti-Bad (Cell signalointi), anti- α-tubuliinin (Abcam) koettimena sopivia laimennoksia. Toissijainen vuohen anti-hiiri-IgG- tai anti-kaniini-IgG: llä konjugoituna HRP käytettiin, ja blotit tehtiin näkyviksi tehostetulla kemiluminesenssilla (Promega ™ ECL Western-blottaus Substrate) ja analysoitiin Odyssey Infrapuna kuvantamisjärjestelmä (LI-COR Biosciences) (Lincoln, NE).

Solusyklianalyysiä

käsittelyjen jälkeen solut kerätään ja kiinnitetään jääkylmällä 75% etanolilla yön yli -20 ° C: ssa. Solut sen jälkeen sentrifugoitiin 300 x g 5 minuutin ajan ja inkuboitiin propidiumjodidilla (PI) käyttöliuos (100 ug /ml PI: n ja 100 ug /ml RNaasiA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solusyklin jakautuminen analysoitiin käyttäen FACScan-virtaussytometrillä, ja analysoitiin käyttäen ModFit ohjelmistoa (Becton Dickinson, CA).

Tilastot

tilastollinen analyysi, jokainen koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa . Tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta ja erot ryhmien välillä analysoitiin käyttäen Studentin t-testit GraphPad tilasto-ohjelma. *, ** Ja *** osoittaa p 0,05, p 0,01 ja p 0,001 merkittävä ero, vastaavasti, verrattuna negatiiviseen kontrolliin. # Ja ## esittävät p 0,05 ja p 0,01, vastaavasti, verrattuna näytteiden kanssa tai ilman SBPE-hoitoa.

Tulokset

elinkykyyn

Käytimme MTS toteamiseksi vaikutuksia SBPE oli elinkelpoisuudesta WI 38VA13 Osio 2RA solujen normaalin keuhkokudoksen fibroblastisolut, ja A549 keuhkosyövän soluja. Kuten on esitetty kuviossa 1a, olemme huomanneet, että 24 tuntia antamisen jälkeen SBPE, elinvoimaisuutta A549-solut laskettiin, kun SBPE annos kasvoi. Solujen elävyys antamisen jälkeen 5 mg /ml oli 85%, IC50 saavutettiin antamisen jälkeen 9 mg /ml, ja solujen elinkyky antamisen jälkeen 10 mg /ml, oli 23%. Päinvastoin, SBPE ei todettu merkitsevää toksisuutta kohti normaaleja WI38- solut pienimmällä testatulla annoksella, mutta merkittävä solukuolemaa tapahtunut 24 tunnin kuluessa hoidon SBPE 5 ja 10 mg /ml. Jos SBPE 5 mg /ml ja 10 mg /ml, käytettiin eri ajankohtina, olemme huomanneet, että SBPE aiheutti merkittävän solukuoleman 24 tunnin kuluessa.

(a) Tehdään solujen elinkykyä testejä antamalla eri konsentraatioita SBPE on WI38- ja A549-soluja. (B) hallinnoima 5 mg /ml ja 10 mg /ml SBPE A549 ja inkuboitiin soluja eri ajankohtina. Sitten käytimme MTS-reagenssia testata elinkyvyt.

SBPE aiheuttama Cancer Cell Autophagy Effect

arvioimiseksi mekanismi, oletamme, että ennen solukuolemaa, SBPE indusoi syöpäsoluja tulla autophagic. Kuten on esitetty kuviossa 2a ja 2b, fluoresenssimikroskopiaa havainnot osoittivat, että riippumatta SBPE annostus. Kun kaksi fluoresoivaa väriä asetettiin päällekkäin ja määrällisesti, The autolysosome sisältö vähitellen kasvanut ajan myötä. Näin ollen suhde autolysosome muodostumista solujen annettiin SBPE 10 mg /ml huomattavasti funktiona SBPE annos (kuvio 2b). Sen jälkeen suhde monistuksen autophagosome ja lysosomin overlaped, mikä osoittaa, että SBPE voi todellakin simuloida A549-solut tulla autophagic (kuvio 2c). Tilastollinen kaavio Kuvion 2d osoitti, että 8 tunnin kuluessa SBPE (10 mg /ml) käsittely, 70% A549-solut syntyy lysosomaalisen autophagy, ja että nousi 90% 12 tunnissa. Western blotit (kuvio 2e) osoitti, että p62-proteiini huomattavasti neljä kertaa suurempi kuin kontrolliryhmän (kuvio 2f) yli 8 tuntia, ja LC3-I katkaistiin osaksi LC3-II tänä aikana. Nämä tulokset tarkoittavat, että SBPE indusoi syöpäsolujen tulla autophagic, joka oli huipussaan kahdeksan tunnin kuluessa. Lisäksi, käyttäen autophagy estäjä, klorokiinin (CQ) plus SBPE (10 mg /ml), löydettiin solujen elinkelpoisuus oli huomattavasti palautettiin 6 tuntia ja 24 tuntia käsittelyn jälkeen (S1 kuvio).

SBPE 5 mg /ml (a) ja 10 mg /ml (b) lisättiin vastaavasti soluja ja inkuboitiin 2, 4, 6, 12, ja 24 tuntia. Immunovärjäys leimaamiseen käytetty autophagy proteiini LC3 (vihreä), LAMP-1 (punainen), ja DAPI (sininen) syöpäsoluja. Suurennus oli 400X. (C) Suurennettu soluja inkuboidaan kuusi tuntia 630X tarkkailla autophagy jakeluun. (D) Overlay vihreän fluoresenssin (LC3) ja punainen fluoresenssi (LAMP-1), ja lasketaan solujen lukumäärä kanssa autophagic lysosomeihin. Pystyakselilla solujen kokonaismäärästä pinta-alayksikköä kohti jaettuna solujen autophagic lysosomeihin. (E) Western-blotit käytettiin tarkkailla vaikutuksia SBPE ollut säätelyyn A549 autophagy liittyviä proteiineja, ja totesi, että SBPE indusoi solun autophagy, joka kasvoi ajan ja saavutti kahdeksan tuntia. Kaikki geelit on ajettu samoissa koeolosuhteissa. (F) Tilastolliset analyysit proteiineille esityksiä.

SBPE aiheuttaman apoptoosin

SBPE oli sytotoksinen ja prosentuaaliset autophagy induktion vahvistui annostus ja hallinnon lisääntyi. On kuitenkin vielä tiedetä anto SBPE yli 12 tuntia voi aiheuttaa kasvainsolujen tulla apoptoottisia. Siksi apoptoottinen markkeriproteiinina Caspase3 /7 havaittiin onko se syntyy ajan mittaan. Kuvio 3a osoittaa, että suorituskyky on Caspase3 /7 sisällä A549-solut eivät täydentää kuin SBPE hallinnon lisääntyi. Kuitenkin vahvistus alkoi 12 tuntia ja saavutti huippunsa suorituskykyä 24 tuntia. Perusteella luopuminen tuloksiin, SBPE voi todellakin aloittaa apoptoosin mekanismi 12 tunnin kuluttua ja voi edistää kasvainsolujen autophagy kahdeksan tunnin kuluessa. Western blot (kuvio 3b) osoitti, että ilmenemismuotoja pro-apoptoottisten proteiinien p53, Bax ja Bad kasvoi ajan myötä, kun taas anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2 merkittävästi vähentynyt. Kuvion 3d, kun A549 keuhkosyövän soluja käsiteltiin SBPE (10 mg /ml), eri aikoja, virtaussytometriä käytettiin tarkkailla solun jakautuminen tilan solusyklin aikana. Tulokset osoittivat, että valotusaikaa lisääntynyt, solujen määrä jäljellä G1 vaiheessa ollut nousussa, ja suhde S vaiheessa olevien solujen lisääntynyt ajan edetessä, mutta laskussa saavutettuaan huippunsa 12 tuntia.

(a) antamisen jälkeen on SBPE 10 mg /ml; Caspase3 /7 reagenssia käytettiin havaitsemaan niiden esityksiä. (B) vaikutuksista, joita SBPE on proteiinin valvontaa liittyvien tekijöiden A549 apoptoosia ja anti-apoptoosin. Kaikki geelit on ajettu samoissa koeolosuhteissa. (C) Tilastollinen kaavio proteiinin suorituskykyä. (D) FACS-analyysit solusyklin jakelua ja käyttöä ModFit LT ohjelmisto analysoida solusyklin jakelu.

Sisplatiini ja SBPE Yhdistelmähoito voi vähentää syövän elinkykyyn

mukaan kuvio 4, välillä 24 ja 48 tuntia sen jälkeen, kun sisplatiinia annettiin A549-keuhkosyövän soluja, sen sytotoksisia vaikutuksia vahvistunut Cisplatin pitoisuus kasvoi. Kuitenkin vaikutukset voivat nousta vain IC50 48 tuntia 25 uM sisplatiinia annettiin, ja hoito voi aiheuttaa vain 33% solukuolemaa klo 24 tuntia merkki. Siksi olemme ottaneet yhdistelmähoito menetelmä, jolla SBPE annettiin kuusi tuntia ja sisplatiinia annettiin 24 tuntia. Tavoitteena oli käyttää sisplatiinihoitoon tappaa syöpäsolut, kun solu autophagy on kannustanut toivoo, että tämä yhdistelmä menetelmä voi merkittävästi vahvistaa sytotoksista vaikutusta ja vähentää Cisplatin annosta. Kuten on esitetty kuviossa 4a, antamalla 10 uM ja 25 uM sisplatiinia 48 tunnin jälkeen, kun solut esikäsiteltiin SBPE (5 mg /ml) kuuden tunnin ajan, syövän solujen elinkelpoisuus voidaan vähentää 52% ja 37%, vastaavasti . Verrataan tuloksiin, olemme havainneet, että solut esikäsiteltiin SBPE tarvitaan vain Sisplatiini 10 uM 48 tuntia saavuttaa IC50, joka on sama suorituskyky, joka voidaan saavuttaa Sisplatiini 25 uM yksin samana ajankohtana. Jos Sisplatiini-konsentraatio on lisääntynyt 25 uM, kasvaimen soluja tappava vaikutus on parantunut. Kuten on esitetty kuviossa 4b, jos SBPE 10 mg /ml, lisättiin ennen sisplatiini hoidon 24 tunnin ajan, olemme huomanneet, että syöpä elinvoimaisten solujen jälkeen 5 uM, 10 uM, ja 25 uM sisplatiinia hoitoja voidaan vähentää 58%, 50%, ja 36%, vastaavasti. Sisplatiinia 25 uM yksin voi saavuttaa vain IC50 pitoisuus 48 tuntia ilman SBPE. Sytotoksiset vaikutukset sisplatiinin 10 uM voidaan saavuttaa IC50 hoidon jälkeen 48 tuntia. Todisteet osoittivat, että esikäsitelty SBPE voi todellakin vahvistaa merkittävästi syöpäsolun sytotoksisia vaikutuksia sisplatiinia ja vähentää Sisplatiini annosta tai käsittelyaikaa.

A549 tuumorisolun eloonjäämisaste analyysien jälkeen 1 uM, 5 uM, 10 uM ja 25 uM sisplatiinia annettiin ja inkuboitiin 24 ja 48 tuntia. MTS-reagenssia käytettiin havaitsemaan eloonjäämisaste. Esikäsittely käyttäen SBPE 5 mg /ml (a) ja SBPE 10 mg /ml (b) annosta Sisplatiini lisättiin ja inkuboitiin 24 ja 48 tuntia. MTS-reagenssia käytettiin havaitsemaan eloonjäämisluvuissa.

Apoptoosi indusoitiin Sisplatiini ja SBPE Yhdistelmähoito

Western blotit käytettiin tarkkailla kuinka yhdistelmähoito muutti apoptoosin säätelyyn proteiinit (kuvio 5a); ja tulokset osoittivat, että pro-apoptoottinen proteiinien p53 (kuvio 5b), Bax (kuvio 5d), ja Bad (kuvio 5e) kasvoi ajan edennyt 24 tunnin kuluessa. Tämä oli erityisen totta p53, joka lisäsi merkittävästi jälkeen vain 12 tuntia. Anti-apoptoottinen proteiini, Bcl-2, laski merkittävästi ajan edetessä (kuvio 5c), ja väheni 32% 24 tunnin kuluttua, joka saavutti vaikutukset päivää aikaisemmin kuin 37%: n vähennys määrä saavutettiin 48 tunnin kuluttua, kun vain sisplatiini oli annettuna.

Apopthsis aiheuttama SBPE ja sisplatiiniyhdistelmähoidon (a) 6 tuntia käsittelyn jälkeen käyttäen 10 mg /ml SBPE ja 25 uM sisplatiinia lisättiin ja inkuboitiin 24 ja 48 tuntia. Western blotit käytettiin tarkkailla vaikutuksia solujen apoptoosiin liittyvä ilmiö proteiineja (p53, Bcl-2, Bax ja Bad). Kaikki geelit on ajettu samoissa koeolosuhteissa. Kvantifiointi kaavion p53 (b); BCL-2 (c); Bax (d); Bad (e).

perustaminen optimaalinen SBPE pitoisuus indusoi Cancer Cell Sytotoksisuus ja paras aika hallinnoida ylimääräisiä Kemoterapia huumeet

sytotoksisuuden analyysit osoittivat, että kun SBPE pitoisuudet ja hoitoajat kasvoivat niin tekivät heidän solumyrkkyvaikutuksessa. Siksi olemme perustaneet suhde A549 syöpäsoluja, SBPE pitoisuuksia, ja altistus kertaan optimaaliseen induktioon A549 autophagy (Kuva 6). Matlab 2015a, teimme kolmiulotteisen kvantifioida olemassa (a) solujen elävyyden arvoja; (B) SBPE pitoisuudet; ja (c) SBPE valotusaikoja jotta paljastaa mitään suhteita. Kuvion 2, olemme havainneet, että kun solujen elävyys oli 70%, noin 70% soluista indusoitiin tulla autophagic. Tässä vaiheessa, sisplatiinia voitaisiin sitten lisätä nopeuttaa sytotoksisen hoidon vaikutuksia. Tällä solun elinkelpoisuutta 70%, me sitten poimi kymmenen ajankohtina tällä annostus ja määritellään relaatiolauseketta käytetään arvioitaessa korrelaatio aika ja SBPE annostus. Relaatio lauseke ajan ja annostus SBPE A549 keuhkosyöpäsolua koinkubaation oli seuraava: Kun

y

edustaa agentti pitoisuus annetaan soluihin,

x

edustaa toteutusaika ja 5,7665 on laskennan vakio.

MTS sytotoksisuuskoetta havaitseminen arvo merkittiin MATLAB matemaattinen analyysi ohjelmistoja tilastollinen ohjelmisto luo kolmiulotteisessa koordinaatistossa kaavio suhteesta pitoisuus, aika, ja kannattavuus . XYZ olivat muuttujat. X-akseli edustaa SBPE pitoisuus X = [X, x1]; matriisit X ja x1 edustavat SBPE pitoisuuksia 0 mg /ml, 1 mg /ml, 5 mg /ml, 10 mg /ml, 25 mg /ml, ja 50 mg /ml; Y-akseli kuvaa SBPE palautusaika Y = [Y, y1]; matriisit Y ja y1 edustaa 24 ja 48 tuntia; Z-akseli solujen elävyyden Z = [Z, z1]; ja matriisit Z ja z1 edustavat elinkykyisyyksiä jälkeen SBPE annon 24 ja 48 tuntia. Tiedot matriiseja syötetyn käyttäen surffailla komentoja ja kolmiulotteinen pinta kaavio piirrettiin. Värit ovat toiminnan välisiä suhteita kolme.

tarkistaminen optimaalinen annostus ja keskittyminen varten SBPE aiheuttaa syöpää Cell Autophagy

Kuvion 2, huomasimme, että kun solujen elävyys oli 70%, noin 70% soluista indusoitiin tulla autophagic. Sisplatiini voitaisiin lisätä tällä kertaa nopeuttaa sytotoksisia vaikutuksia. Kuvion 6 ja esitetty kaava, solujen saavuttaa autophagic tilassa, solut on annettava SBPE tietyn ajanjakson ajan, jotta ne voivat saavuttaa 70% eloonjääneitä. Teimme MTS testejä SBPE 5 mg /ml (32 h), 6,25 mg /ml (30 h), 7,5 mg /ml (16 h), ja 10 mg /ml (6 h) sen varmistamiseksi, että tämän aikataulun mukaisesti optimaalisen annostus ja pitoisuus SBPE aiheuttavan syöpäsolun autophagy. Tulokset osoittivat, että solujen elinkelpoisuus voidaan säilyttää 70%, kuten on esitetty kuviossa 7a. Suoritimme fluoresenssimikroskopia ja totesi, että LC3 päällekkäin LAMP-1, kun SBPE annettiin nämä 4 pitoisuuksina. Tämä havainto edusti limitys autophagosome ja lysosomissa. Siksi annetaan SBPE tietyn aikaa voi todellakin stimuloida A549 autophagy (kuvio 7b).

(a) Pitoisuus ja aika todentaminen vastaan ​​elinkelpoisuus suoritettiin mukaan matemaattisen analyysin arvot syntyvät tilasto-ohjelmalla MATLAB kuin kuviossa 6. SBPE-pitoisuus on 5 mg /ml, 6,25 mg /ml, 7,5 mg /ml, ja 10 mg /ml; aikataulut ovat 32, 30, 16, ja 6 tuntia; ja MTS-reagenssia käytettiin havaitsemaan toimintaansa. (B) Immunovärjäys leimaamiseen käytetty autophagy proteiini, LC3; lysosomaalisissa merkki, LAMP-1; ja ydinvoiman merkki, DAPI. Soluja inkuboitiin kahdeksan tuntia ja oli suurennettu klo 630X tarkkailla autophagy jakeluun. Nuolet osoittavat autophagosomes (päällekkäin vihreä ja punainen).

vaikutukset että yhdistäminen SBPE kemoterapia huumausaineiden gemsitabiini ja paklitakseli on syövän elinkykyyn Hinta

Kuvion 8, sytotoksista vaikutukset Gemsitabiini ja paklitakselin 72 tunnin kuluessa voidaan parantaa, kun SBPE-konsentraatio on lisääntynyt. Kuitenkin gemsitabiini vaaditaan hallinnon 100gM enintään 72 tuntia ja paklitakselin vaaditaan hallinnon 100gM jopa 48 tuntia saavuttaakseen IC50. Samanlaisia ​​sisplatiini, me esikäsitelty solut SBPE kuusi tuntia ja sitten lisätään Gemsitabiinin tai Paklitakseli yhdistelmä sen toteamiseksi, onko SBPE voi merkittävästi lisätä sytotoksisia vaikutuksia Gemsitabiini tai paklitakselin samalla vähentää niiden annosta. Tulokset osoittivat, että käsittelyn jälkeen käyttäen 50 uM Gemsitabiini ja Paklitakseli 48 tuntia, eloonjäämisluvut olivat vähentää tehokkaasti 78%: sta 44% ja 65%: sta 45%: iin. Verrattaessa hoitamattomiin tuloksia (kuvio 8a ja 8e), The SBPE esikäsitellyt solut tarvitaan vain puolet määrästä Gemsitabiini tai Paklitakselin 48 tuntia saavuttaa IC50.

(a) A549 kasvain solujen elävyyden analyysi antamisen jälkeen Gemsitabiini. Sen jälkeen 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM ja 100 uM Gemsitabiini annettiin 24 ja 48 tuntia, MTS-reagenssia käytettiin havaitsemaan niiden toimintaa. Toiseksi, sen jälkeen 6 tuntia hoidon 10 mg /ml SBPE; Gemsitabiini lisättiin 24 tunnin ajan (b), 48 tunnin (c) ja 72 tuntia (d). (E) A549 kasvainsolujen elinkelpoisuuden analyysi hoidon jälkeen 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM ja 100 uM paklitakselin ja inkuboitiin 24 ja 48 tuntia. MTS-reagenssia käytettiin havaitsemaan toimintaansa. Toiseksi, sen jälkeen 6 tuntia hoidon 10 mg /ml SBPE; Paklitakselihoidon lisättiin 24 tunnin ajan (f), 48 tunnin (g) ja 72 tunnin (h).

Keskustelu

On olemassa lukuisia haittavaikutuksia, jotka liittyvät olemassa oleviin perinteisiin kemoterapialääkkeet [26-29]. Esimerkiksi sisplatiini, kemoterapia lääke yleisesti käytetään keuhkosyöpä on pitkä vasteaika, on altis lääkeresistenssin, ja pitkän aikavälin sovellus voi inhiboida apoptoosia tai tuottaa sivuvaikutuksia potilaille [58]. Toinen kemoterapiaa huumeiden, gemsitabiini, voi aiheuttaa epämiellyttäviä oireita, kuten huimausta, oksentelua, leukopenia, trombosytopenia, ja munuaistoksisuutta [59]. Perinteinen kiinalainen kasviperäisten lääkkeiden ovat alkaneet nousta syöpälääkkeet [35-38]. Tällä hetkellä noin kaksi kolmasosaa syöpäpotilaille ovat keskipitkän ja myöhäisvaiheen niiden diagnoosi, koska diagnostisten tekniikka rajoitusten ja vähentää kirurgisten mahdollisuuksia [2, 15-23]. Potilaat näissä vaiheissa ovat liian fyysisesti heikkoja kestämään trauma leikkauksen ja myrkyllisiä haittavaikutuksia kemoterapiaa. Tavanomaisten syövän leikkaus, säteily ja kemoterapia käsittelymenetelmät kaikilla on rajoituksia, kuten laajuus potilaan patologian hoidon ajan, ikä, fyysinen kunto, että on olemassa komplikaatioiden, ja huumeiden allergiat. Jotkut potilaat saattavat olla haluttomia hyväksymään nämä käsittelymenetelmät tai lopettaisi vuoksi hoidon sivuvaikutukset [2, 15-23]. Kasviperäisten lääkkeiden puuttuvat nämä rajoitukset ja voidaan käyttää vastaavasti [60, 61]. Edut Kiinan kasviperäisten lääkkeiden ovat enemmän kuin pelkästään sytotoksinen vaikutus syöpäsoluja, ne myös parantavat hyötyy fyysinen kunto, aiheuttaa immuunijärjestelmän sytokiinien, ja vahvistaa soluvälitteisen immuniteetin; siten, suojaavat syöpää. On kuitenkin olemassa mitään laajoja kliinisiä kokeita perinteistä kiinalaista lääkkeitä, jotka toistuvasti osoittavat ”näyttöön perustuvan lääketieteen” tehon. Siksi kasviperäisten lääkkeiden ovat edelleen luokitellaan toissijaisiksi ja vaihtoehtoisia lääkkeitä syövän hoitoon.

Tässä tutkimuksessa tutkimme onko perinteinen kasviperäisten lääkeaineiden, SBPE, voi aiheuttaa kasvainsolun autophagy. Olemme edelleen antaa Cisplatin tarkkailla, onko SBPE voi tappaa keuhkosyövän solujen vähentää samalla Cisplatin annoksia. Lopuksi verrattiin tuottaa muilla kemoterapiaa huumeiden toivoo perustaa Kiinan ja Länsi-yhdistelmähoito hoito. Tuloksemme osoittivat, että SBPE ei tuota merkittävää sytotoksisuutta normaaleihin keuhkojen epiteelisolujen mutta aiheuttaisi keuhkosyöpää solukuoleman samoissa pitoisuuksissa. Olemme myös havainneet, että keuhkosyövän solut saavuttavat IC50 hoidon jälkeen 10 mg /ml SBPE 24 tuntia. Vaikka mekanismi SBPE alemman sytotoksisuutta kohti normaaleja soluja edelleen tuntematon, nämä tulokset tarkoittavat, että SBPE voi tehokkaasti tappaa keuhko- syöpäsoluja vahingoittamatta normaalit solut.

Kun autophagy tapahtuu, LC3-leimattu autophagosomes muodostavat autophagic lysosomeihin LAMP-1 leimattua lysosomeihin. Huomasimme, että SBPE voivat aiheuttaa autophagy A549-solujen ja tämä tuli enemmän selvää ajan edetessä. Autophagic lysosomeista käsitellyissä soluissa saavutti Maksimiäänenvoimakkuuden kahdeksan tuntia lääkkeen. Expression of leimatun, lysosomaalisen proteiinin, P62, ja leimattu, autophagosomal proteiini, Atg12, todennettujen meidän loisteputki tiedot. Kahdeksan tunnin kuluttua lääkkeen antamisesta, LC3-I katkaistiin enimmäismäärä LC3-II. 12 tunnin kuluttua, keuhkosyöpä solut alkoivat apoptoosin, osoituksena lisääntynyt proteiinin ilmentymistä apoptoottisten ja pro-apoptoottisten markkereita ja vähentää ilmentymistä anti-apoptoottisen markkeri. Tulosten perusteella edellä, SBPE voi aiheuttaa keuhkosyöpää-solujen apoptoosin jälkeen autophagy. Vaikka solujen määrä G1 vaiheessa on taipumus lisätä sen jälkeen, kun 24 tunnin aikana solusyklin analyysi, solujen määrä G2 /M-vaiheessa ei muuttunut ja ei ollut merkki osoittaa, että SBPE voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen syöpäsoluja . Mielenkiintoista on, että solujen määrä S-vaiheessa kasvoi 31%: sta 38%, kun SPBE hoidon ajan edetessä, mutta laski takaisin 30% 24 tunnin kuluttua. Syynä tämä vaikutus on tuntematon, mutta se on arvioitu, että suurin osa soluista siirretään kohti apoptoosin ja pieni osa soluista siirretään kohti G1 vaiheen pysähtymisen 24 tunnin kuluttua.

Kuvion 4, kesti 48 tunnin päästä IC50 seuraavien hoidossa A549-solujen kanssa kemoterapiaa huumeiden, sisplatiinia. Lisäksi tutkimus havaitsi, että esikäsittelemällä keuhkosyövän soluja 10 mg /ml SBPE kuusi tuntia aiheutti 30%: lla hoidetuista solut kuolevat ja indusoitiin autophagy 50% näistä soluista. Syöpäsolun eloonjäämisaste oli taipumus vähentyä soluissa, jotka on esikäsitelty SBPE verrattuna ryhmiin, joita ei ole esikäsitelty. Lisäksi sisplatiini pitoisuus ja hoidon saavuttamiseen vaadittu aika IC50 oli merkittävästi vähentynyt. Suuntaus kaavio kuvassa 6 osoitti, että mitä suurempi SBPE keskittyminen ja käsittelyaika, sitä vahvempi sytotoksisia vaikutuksia 24 tunnin kuluessa. Mukaan meidän Matlab analyysi kaavio, huomasimme, että kun pitoisuudet saavutettiin sininen alue kaavion, sytotoksisuus oli lähes 80%. Käsittelemällä 5 mg /ml SBPE 24 tuntia vähennetään solujen elinkelpoisuus jopa 80%.