Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ruokatorven okasolusyöpää (ESCC) on huono ennuste. Vaikka yhdistetyn liikennemuotojen kemoterapiaa ja sädehoitoa kasvaa selviytymisen, useimmat potilaat kuolevat viiden vuoden kuluessa. Kehittäminen aineita, jotka antavat syöpä soluspesifisestä kemo- ja radioherkkyyttä voi parantaa terapiaan ESCC. Me täällä raportoitu löytö Berberiini tehokkaana sädeherkistävä agentti ESCC soluissa.

Keskeiset havainnot

Berberiini pieninä pitoisuuksina (alle 15 uM) olennaisesti radiosensitized ESCC soluja. X-ray aiheuttama DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t) pysyvät pitempään ESCC soluissa esikäsitelty berberine. Berberiini esikäsittely johti merkittävään downregulation RAD51, keskeinen toimija homologisen rekombinaation korjaus, vuonna ESCC soluissa, mutta ei ei-pahanlaatuiset ihmissoluja. Downregulation

RAD51

RNA interferenssin samalla radiosensitized syöpäsoluja, ja päinvastoin, eksogeenisten RAD51 pystyi merkittävästi torjumaan sädeherkistävä vaikutus berberiini, jolloin syntyy RAD51 tärkein tekijä säteilyn herkkyys. Havaitsimme myös, että RAD51 oli yleisesti yli-ilmentyy ihmisen ESCC kudoksissa, mikä viittaa siihen, että on tarpeen säädellä vähentä- västi RAD51 saavuttaa korkea radio- tai kemoterapeuttisen tehoa ESCC klinikalla, koska yliekspressio RAD51 tiedetään antaa radio- ja chemoresistance.

Johtopäätökset /merkitys

Berberiini voi tehokkaasti downregulate RAD51 vuonna annetaan radioherkkyyttä on ruokatorven syöpäsoluja. Sen kliininen sovellus adjuvanttina kemoterapiaa ja sädehoitoa ruokatorven syöpien olisi tutkittava.

Citation: Liu Q, Jiang H, Liu Z, Wang Y, Zhao M, Hao C, et al. (2011) Berberiini herkistää säteilylle Human Ruokatorven syöpäsolujen downregulating homologisella rekombinaatiolla korjaus Protein RAD51. PLoS ONE 6 (8): e23427. doi: 10,1371 /journal.pone.0023427

Editor: Qian Tao, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 21 joulukuu 2010; Hyväksytty: 17 heinäkuu 2011; Julkaistu: 08 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoittivat National Natural Science Foundation of China; Ministry of Science and Technology of China. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven okasolusyöpää (ESCC), joilla on erityisen suuri esiintymistiheys Itä-Aasian maissa, on yleensä huono ennuste. Vain 4% 5 vuoden pysyvyys tallennettiin kirurginen hoito [1]. Sädehoito oli samanlainen tulos [2]. Eloonjäämisaste potilaalla on ESCC voidaan merkittävästi parantaa yhdistetyn kemoterapiaa ja sädehoitoa [3], [4]. Kuitenkin lisäämällä säteilyannos ei tuota enemmän tyydyttäviä tuloksia [5]. Jäljelle jää tarvetta kehittää aineita, jotka antavat kemo- ja radioherkkyyttä valikoivasti syöpäsoluihin samalla ottaa minimaalinen säteilyn myrkyllisyys normaaleille soluille. Vaikka eri säteily herkistävät aineet on testattu, mukaan lukien aineet, jotka kohdistuvat DNA: ta tai ei-DNA-kohteisiin, erinomainen säteily herkistävä vielä löytäjäänsä [6].

Berberiini, pääasiallinen alkaloidi komponentti Huang Lian ja muiden lääkkeiden yrttejä , on yleisimmin käytetty lääke ruoansulatuskanavan epämukavuus Kiinassa. Rinnalla yhteisen käytettäväksi päivittäin lääkettä, useita laboratorio- tutkimukset ovat osoittaneet, että berberiini on tuumorin vastaista aktiivisuutta erilaisia ​​syöpäsoluja, mukaan lukien glioblastooma [7], suusyöpä [8], hepatooma [9], mahasyöpä [10 ], eturauhassyöpä [11], leukemia [12] ja osteosarkooma [13]. Useimmissa tapauksissa, berberiini havaittiin solusyklin etenemisen ja apoptoosin indusoimiseksi. Tuore tutkimus osoitti, että Berberiini kykeni tukahduttamaan konstitutiivisen NF-KB joissakin syöpäsoluissa [14], jossa todettiin suoraan estävän IKB kinaasia (IKK) aktivointi, mikä tukahduttaminen fosforylaation ja tumaansiirtymiseen p65 . Berberiini on myös raportoitu olevan sädeherkistävä vaikutus keuhkosyöpään indusoi- autophagy [15]. Lisäksi berberiini voi heikentää kasvaimen kasvua estämällä angiogeneesiä [16].

Osoitimme aikaisemmin, että Berberiini voi estää syöpäsolujen lisääntymistä indusoimalla DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t). Berberiini, joka lähettää kellertävä fluoresenssi, havaittiin olevan tehokkaammin kertynyt ytimet luusarkoomasoluissa kuin ne, normaalin osteoblastien, ja tämä ero kertyminen berberiini korreloi sen kasvua estävä vaikutus, induktioon DNA-vaurioita, ja myöhemmin aktivoinnin p53 ja solukierron pysähtymisen [13]. Näin ollen, signaalinvälitysreitin taustalla antituumorivaikutusta berberine on todennäköisesti samanlainen kuin alulle muiden DNA: ta vaurioittavien aineiden, kuten sisplatiinin. Tuore raportti osoitti, että berberiini voi säätää ylös p53 häiritsemällä MDM2-Daxx-HAUSP vuorovaikutusta ja edistää MDM2 itsensä ubikinaation ja hajoaminen [17].

Me täällä ilmoittaa, että Berberiini pieninä pitoisuuksina voi merkittävästi radiosensitize ESCC solut. Olemme osoittaneet, että säteilylle herkistävän vaikutuksen berberiini välittyy downregulation

RAD51

, joka koodaa kriittisen proteiinin homologisen rekombinaation korjaus. Lisäksi havaitsimme, että

RAD51

oli yleisesti yli-ilmentynyt ihmisen ESCC kudoksissa, mikä osoittaa, että on tarpeen säädellä vähentä- västi RAD51 saavuttaa korkea radio- tai kemoterapeuttisen tehoa ESCC klinikalla, koska yliekspressio

RAD51

tiedetään antaa radio- ja chemoresistance.

tulokset

berberine herkistää ruokatorven syöpä soluja ionisoivalle säteilylle

Kuten aikaisemmin raportoitu muiden syöpäsolujen, Berberiini hoito yksinään oli kasvua estävä vaikutus ruokatorven syöpä solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 1A). Verrattuna ihmisen normaalien fibroblastien (HNF), ESCC solut ovat herkempiä berberine. 72 h, IC50 ESCC soluja KYSE450 (12,58 uM), oli noin neljännes että HNF (51,28 uM) (Fig. 1 B). Pieninä pitoisuuksina (alle 15 uM), berberiini oli suhteellisen alhainen myrkyllisyys ESCC soluja ja indusoi havaittavaa apoptoosia (Fig. 1 C). Kuitenkin ESCC soluja, jotka oli esikäsitelty pieninä pitoisuuksina Berberiini osoitti merkittävästi lisääntynyt herkkyys ionisoivaa säteilyä, kuten heijastuu merkittävä väheneminen niiden kyky muodostaa pesäkkeitä (Fig. 2). Berberiini esikäsittely (15 uM, 24 h) pienensi SF2 (eloonjääntifraktion 2 Gy) on KYSE30 solujen 48,1 ± 0,6%, 77,2 ± 1,2% soluissa, joita ei ole esikäsitelty berberine. Toinen ESCC linja KYSE450 oli samanlainen vaste, jossa SF2 alennetaan 50,2 ± 2,1%, kun soluja esikäsiteltiin berberine 15 uM 48 tuntia, verrattuna 81,2 ± 2,6% soluista ei esikäsitelty berberine. Sen sijaan, berberiini ollut sädeherkistävä vaikutusta ihmisten normaalien fibroblastien (Fig. 2).

(A), vaikutus berberiini elinkelpoisuudesta KYSE30, KYSE450 ja HNF soluja. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai ilmoitetut pitoisuudet berberiini 24 h, 48 h ja 72 h. Tulokset olivat edustettuina keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B), Sytotoksisuus Berberiini vastaan ​​KYSE30, KYSE450 ja HNF solujen edustaa estävät pitoisuudet IC50. (C), mittaus apoptoosin Western blot -analyysillä kaspaasi-3. KYSE30 ja KYSE450 soluja käsiteltiin berberiini 24 h ja 48 h, vastaavasti. Paklitakseli-käsitelty HL-60 ja HeLa-soluissa positiivisena kontrollina.

(A), säteilylle herkäksi mukaan berberiini mukaan klonogeenisten solujen eloonjääminen määrityksessä. KYSE30 ja KYSE450 solut altistettiin berberiini (15 uM) tai ajoneuvon ohjaus (DMSO) ja 24 ja 48 tuntia, vastaavasti, ennen kuin ne oli säteilytetty ja maljattiin. Ihmisen normaali fibroblastisoluja käsiteltiin berberiini 24 h ja 48 h ennen kuin ne altistettiin X-säteitä. Datapisteet keskiarvoja kaksi erillistä koetta kukin päällystetty kolmena kappaleena; baareja, SE. (B), SF2 arvot hoidon jälkeen berberine. Lasku SF2 arvojen ilmaisee sädeherkistävä vaikutuksia Berberiini.

Berberiini esikäsittely pidentää pysyvyys säteilyn aiheuttaman DSB

Ionisoiva säteily tappaa soluja aiheuttamalla erilaisia ​​vaurioita genomin . Me arveltu, että sädeherkistävä vaikutus berberiini syöpäsoluihin voi johtua heikentynyt korjaus DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t). Siksi määritettiin tasot DSB mukaan immunof- värjäytymisen γ-H2AX pesäkkeitä ESCCs eri ajankohtina altistumisen jälkeen röntgenkuvat. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, vuonna KYSE30 soluissa ei esikäsitelty berberiini, suurin osa γ-H2AX pesäkkeitä raivattiin 12 tuntia altistuksen jälkeen 0,5 Gy röntgensäteiden, ja keskimäärin γ-H2AX pesäkkeitä laantui lähes perustasolle 24 tuntia. Sen sijaan enemmän γ-H2AX pesäkkeitä säilyivät näiden kahden ajankohtina KYSE30 soluissa, jotka oli esikäsitelty Berberiini (15 uM). Keskimäärin γ-H2AX pesäkkeitä solua kohden soluissa vastaanottaa yhdistetyn berberiinin /sädehoitoa oli merkitsevästi suurempi verrattuna säteilyä ainoa ryhmä 12 ja 24 tunnin ajankohtina (Fig. 3B) (

P

= 0,002, ja

P

0,001, tässä järjestyksessä). Berberiini hoito yksinään ei havaittu aiheuttavan ilmeisiä DNA vaurioita suhteen γ-H2AX pesäkkeitä induktio yli käsittelemättömiin kontrolleihin (

P

= 0,081).

(A), immunofluoresenssi γ-H2AX in KYSE30 soluissa. (B), Yhteenveto γ-H2AX pesäkkeitä KYSE30 solut eri aikapisteissä seuraavat erilaisia ​​hoitoja. (C), Yhteenveto γ-H2AX pesäkkeitä KYSE450 solut eri aikapisteissä seuraavat erilaisia ​​hoitoja. Sarakkeet, välineet kolmen riippumattoman kokeen. Solut kasvavat coverslip 6-kuoppalevyillä altistettiin Berberiini (15 uM) 24, säteilytettyä (0,5 Gy), ja lukkoon määrättyinä ajankohtina varten immunofluoresenssianalyysin avulla.

KYSE450 solut osoittivat myös viivästynyt puhdistuma X-ray-induced γ-H2AX pesäkkeitä, kun ne esikäsiteltiin berberiini. Vaikka suurin osa γ-H2AX pesäkkeet selvitetty kontrollisoluissa 24 tunnin altistuksen jälkeen röntgenkuvat, enemmän kuin puolet γ-H2AX pesäkkeitä säilyi soluissa, jotka oli esikäsitelty berberiini (Fig. 3C). Nämä tulokset osoittavat, että berberiini esikäsittely heikentynyt korjaukseen röntgenkuva aiheuttama DSB.

Berberiini downregulates RAD51 syöpäsoluissa mutta ei pahanlaatuisissa soluissa

DSB ensisijaisesti korjataan kahdella väyliä, eli ei-homologisen end liittymällä ja homologinen rekombinaatio [18], [19], [20]. Ku70 ja Ku86 ovat välttämättömiä entisen, jossa sillä RAD51 on keskeinen pelaaja jälkimmäisessä. Me seuraavaksi määrittää, ovatko tasot näiden kolmen proteiinin vaihdettiin ruokatorven syöpäsoluissa esikäsitelty berberine. Havaitsimme, että vaikka ei ollut ilmeisiä muutoksia tasojen Ku70 ja Ku86 taso RAD51 proteiinin huomattavasti vähentynyt ESCCs, joita oli käsitelty berberiini 24 h tai 48 h 7,5 uM tai 15 uM (Fig. 4A). Taso

RAD51

mRNA osoittivat merkittävää vähenemistä molemmissa syöpäsolulinjoissa käsittelyn jälkeen Berberiini (Fig. 4B), mikä viittaa siihen, että downregulation RAD51 johtui todennäköisesti vähentynyt transkriptio

RAD51

mRNA.

(A), tasot DNA korjaukseen proteiinien ruokatorven syöpäsolujen käsitelty berberine. Soluja käsiteltiin berberiini ilmoitettuina pitoisuuksina ja osoitetut ajan, ennen kuin solut valmistettiin solu-uutteiden. (B), vähennys

RAD51

mRNA jälkeen berberine altistuksen. Solut altistettiin berberiini (15 uM) 24 h KYSE30 solut (48 h KYSE450 solut), ja kerätään kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR analyysi RAD51 /GAPDH-mRNA: n suhde. (C),

RAD51

promoottorin aktiivisuutta tukahdutettiin berberine KYSE30 ja KYSE450 soluja. PGL3-RAD51p lusiferaasi (tulikärpäsen) toimittaja plasmidit transfektoitiin ohimenevästi ihmisen ruokatorven syöpäsoluja. Neljä tuntia myöhemmin solut käsiteltiin berberiini 24 tuntia, ja sitten lusiferaasiaktiivisuus. Tulikärpäsen lusiferaasi-arvot normalisoitiin Renilla lusiferaasin aktiviteetin kotransfektoitiin PRL-SV40 kontrollivektorilla. Kukin arvo edustaa keskiarvoa SE kolmen erillisen kokeen. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen paritonta Studentin

t-testiä. *

, P 0,05 verrattuna kontrolliarvoihin. (D), puute RAD51 downregulation in-pahanlaatuisissa soluissa. Solut altistettiin Berberiini (15 uM) ja määrätyn ajan ja kerätään immunoblottausanalyysillä. (E), alassäätely RAD51 muiden syöpäsolujen. Solut altistettiin nimetty berberiinin pitoisuus 48 tuntia ja kerätään immunoblottausanalyysillä. Immunoblot esitetty A, D ja E edustavat vähintään kaksi erillistä koetta, joissa GAPDH toimii proteiinimäärän ohjaus. C osoittaa altistetuissa viljelmissä ajoneuvon ohjaus DMSO.

ilmentyminen RAD51 tiedetään olevan solusyklin riippuvainen ja on korkeampi S ja G2 /M-vaihetta kuin G0 /G1-vaiheessa [21] , [22]. Sen määrittämiseksi, onko alennettu ilmentyminen RAD51 johtui muuttaa solusyklin jakautumisen berberiini-käsitellyissä soluissa, me altistettiin berberiini-käsiteltyjen solujen virtaussytometria-analyysiä. Vaikka berberiini hoito (15 uM 24 h) vähensi prosenttiosuus KYSE30 solujen S ja G2 /M 49%: iin 60%: in ohjaus (tuloksia ei ole esitetty), tällainen muutos ei riitä selittämään moninkertaisesti väheneminen taso RAD51 ilmaisua. Vielä tärkeämpää on, berberiini hoito (15 uM 24 h) ei merkittävästi muuttanut jakautumista solusyklin jakautumisen KYSE450 soluja (44% ja 45%, että solujen prosenttiosuus S-G2 /M-vaihetta ohjaus ja käsitellyssä ryhmässä, vastaavasti ), mikä osoittaa, että väheneminen RAD51 ilmentymistä vasteena berberiini ei alentuneen populaation koko solujen S ja G2 /M-vaiheessa. Siten downregulation RAD51 vastauksena berberiini on luultavasti riippumaton ilmentyminen muuttuu, jotka liittyvät solusyklin etenemisen.

yli-ilmentyminen

RAD51

liittyy usein lisääntyminen sen promoottorin aktiivisuus [23]. Me seuraavaksi kloonata promoottorin ja 5′-päähän alueelle

RAD51

(-1693-487 bp) otetaan lusiferaasireportteriplasmidi, pGL3-perusvektoriin, transfektoitiin ne ruokatorven syöpä soluja, ja testataan

RAD51

promoottorin aktiivisuutta vasteena berberine hoitoon. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, promoottorin aktiivisuus

RAD51

väheni merkittävästi soluissa, joita oli käsitelty berberiini verrattuna kontrolliin. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että Berberiini kykeni downregulate ilmaus

RAD5

1 ruokatorven syövän solujen transkriptio tasolla.

Koska RAD51 on keskeinen toimija homologisen rekombinaation korjaus, sen downregulation voisi edistää radioherkkyyttä on ESCC solujen esikäsitelty berberine. Koska Berberiini ollut sädeherkistävä vaikutusta HNF, me arveltu, että RAD51 taso ei ehkä vaikuta berberine hoitoa HNF. Ensin selvitettiin pohjapinta tasoilla RAD51 useissa pahanlaatuisissa solulinjojen HNF. Kuten on esitetty kuviossa. 4D, tasot RAD51 oli paljon pienempi HNF, hMSC (ihmisen mesenkymaaliset kantasolut ovat peräisin napanuoran) ja XWXL (saaduissa fibroblasteissa hyvänlaatuinen fibroadenoma) kuin ESCC soluissa. Mielenkiintoista, ihmisen napanuoran verisuonten endoteelisolut (HUVEC) ja HEK-293-soluissa ilmaisivat myös korkeita RAD51. Kuitenkin toisin kuin ESCC soluihin yksikään neljän tyyppisiä ei-pahanlaatuisten solujen osoitti downregulation in RAD51 ilmaisun upon berberine hoitoon (Fig. 4D).

onko downregulation RAD51 mukaan berberiini koskee myös muita syöpäsolujen, myös alttiina ihmisen rintasyöpäsoluja MCF7, ihmisen osteosarkooma-soluja U2OS, hiiren eturauhasen syöpäsoluja RM-1 ja hiiren keuhkosyöpään solujen LLC pieninä pitoisuuksina berberiini 48 h ja mitataan proteiinin taso RAD51. Kuten on esitetty kuviossa. 4E, RAD51 säädeltiin vähentävästi kaikissa näissä neljässä syövän tutkituissa solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että downregulation RAD51 mukaan berberiini ei ole ainutlaatuinen ESCC soluihin. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että erityyppiset solut voivat reagoivat eri berberine hoitoon kannalta sääntelyn RAD51 ilmaisun.

lisääntymisen merkkejä RAD51 IR voidaan vaimentaa berberine

Havaitsimme, että ionisoiva säteilyn aiheuttaman ylös-säätely RAD51 vuonna ESCC soluissa (Kuva. 5A). Johdonmukaisesti lisäämisen kanssa RAD51 on proteiinin tasolla, taso

RAD51

mRNA lisääntyi ESCC soluissa, jotka oli altistettu IR (tietoja ei esitetty). Tämä havainto on sopusoinnussa aiemman raportin RAD51 induktion IR glioomasoluihin [24]. Koska IR voi upregulate ilmaus

RAD51

, me seuraavaksi testataan onko berberine esikäsittely voitaisiin torjua tätä vaikutusta IR. ESCC soluja käsiteltiin ensin berberiini, sitten IR- ja taso RAD51 ilmentyminen mitattiin. Toisin kuin korkeus RAD51 soluissa, joita oli käsitelty IR yksinään, berberiini esikäsittely tehokkaasti vaimennettu ylös-säätely RAD51 indusoiman IR (Fig. 5B), mikä osoittaa, että berberiini pystyi voittamaan säätelyä RAD51 aiheuttama IR. Ei vain ollut siellä väheneminen kokonaisproteiinin tasolla, muodostumista RAD51 pesäkkeitä vastauksena IR suuresti inhiboitui Berberiini (Fig. 5C). Vaimennussäätely RAD51 mukaan berberiini oli jälleen heijastuu transkriptio tasolla (Kuva. 5D).

(A), Säteily parantaa RAD51 ilmentymistä kasvainsoluissa. Solut altistettiin osoitettuun säteilyannoksen ja kerättiin 24 tuntia myöhemmin immunoblot-analyysillä. (B), muutos RAD51-proteiinin tasot vastauksena berberiini ja säteily. Soluja esikäsiteltiin berberiini (15 uM) 24 tunnin ajan, ennen kuin sitä säteilytettiin 6 Gy röntgensäteilyä. Solut kerättiin immunoblot-analyysi 24 tunnin säteilytyksen jälkeen. (C), Inhibition säteilyn aiheuttaman RAD51 pesäkkeitä muodostumisen berberiini. On esitetty immunofluoresenssimenetelmällä kuvia KYSE30 ja KYSE450 solut värjättiin anti-RAD51-vasta-ainetta sen jälkeen, kun 24 tunnin esikäsittely berberiini ja 24 tunnin säteilytyksen jälkeen 6 Gy röntgensäteilyä. DAPI counterstaining osoitti ytimet. (D),

RAD51

mRNA-tasot esikäsittelyn jälkeen berberiini (15 uM) 24 tunnin ajan (KYSE30) tai 48 h (KYSE450) ennen säteilytystä 6 Gy. Solut kerättiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR analyysi RAD51 /GAPDH-mRNA: n suhde on 24 tuntia altistuksen jälkeen 6 Gy röntgensäteilyä. Immunoblotit ja mRNA: n ilmentymisen arvot ovat edustavia vähintään kahden itsenäisen kokeen.

RAD51 downregulation RNAi herkistää säteilylle syöpäsolut

Koska Berberiini voi vaikuttaa moniin solureiteillä jotka ovat mukana solujen lisääntymisen ja selviytyminen, ei voida sulkea pois, että reittejä kuin downregulation RAD51 vastasivat sädeherkistävä vaikutusta berbeirne. Sen osoittamiseksi, että se on downregulation RAD51 joka on vastuussa tästä vaikutus berberiini, me seuraavaksi köyhdytettyä RAD51 ruokatorven syövän soluissa RNAi ja testataan niiden radioherkkyyttä. Kuten on esitetty kuviossa. 6A,

RAD51

ilmaisua voitaisiin tehokkaasti vaiennetaan siRNA erityisesti suunnattu

RAD51

molemmissa solulinjoissa. Lisäksi, spontaani muodostuminen RAD51 pesäkkeitä oli vähentynyt huomattavasti (Fig. 6B). Kuten odotettua, ehtyminen RAD51 johti huomattavaan vähenemiseen klonogeeniset solusäilyvyyden sekä ruokatorven syöpään solulinjoissa (Fig. 6C). SF2 aleni 33,3 ± 0,4% RAD51-RNAi KYSE30 solut 78,4 ± 1,2% hallinnassa. KYSE450 solut oli samanlainen vaste RAD51 ehtyminen. Siten sädeherkistävä vaikutus berberiini on ruokatorven soluihin välittyy pääasiassa vaimennussäätely RAD51.

(A), alassäätely RAD51 siRNA. RAD51-proteiinin tasot mitattiin Western blot. KYSE30 ja KYSE450-solut transfektoitiin siRNA-dupleksit (200 nM) spesifinen

RAD51

tai negatiivinen oligo seerumittomassa väliaineessa 4 tunnin ajan, sitten korvattiin täydellistä elatusainetta 24 tunnin ajan. Koko solu-uutteet kerättiin Western blot -analyysillä käyttäen RAD51 vasta-aineita. (B). Vähentynyt muodostuminen säteilyn aiheuttamista RAD51 pesäkkeitä ruokatorven syöpäsoluissa, joissa

RAD51

hiljennettiin RNAi. Solut altistettiin 6 Gy röntgensäteiden 28 h transfektion jälkeen siRNA-dupleksit. (C), vaikutus RAD51 pudotus on radioherkkyyttä ruokatorven syöpään solujen määritettynä klonogeenisten -eloonjäämiskoe. (D), Western blot-analyysi RAD51 proteiinin syöpäsoluissa, jotka transfektoitiin pcDNA3.1 tai pcDNA3.1B-mRAD51. Immunoblot Esitetyt tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta, joissa GAPDH toimii proteiinimäärän ohjaus (KYSE30 /KYSE450 emosolulinjan, KYSE30 /KYSE450 (pcDNA3.1) soluja, jotka on transfektoitu stabiilisti pcDNA3.1, KYSE30 /KYSE450 (mRAD51), jotka on vakaasti transfektoitu jossa pcDNA3.1B-mRAD51). (E), vaikutus RAD51 ilmentymisen vaikutus radioherkkyyttä ruokatorven syöpään solujen määritettynä klonogeenisten -eloonjäämiskoe. Tulokset, jotka koskevat transfektoitu mRAD51 tai pcDNA3.1-vektori käsitelty berberine verrattiin (* P 0,01).

eksogeenisten RAD51 ehkäisee sädeherkistävä vaikutus berberiini

edelleen vahvistaa asemaa RAD51 keskeisenä toimijana välittämisessä sädeherkistävä vaikutus berberiini, teimme rakenteen, joka ilmentää hiiren RAD51 alle CMV promoottori, pcDNA3.1B-mRAD51, ja oli ESCC pysyvästi transfektoitujen solujen. Ulkosyntyisen RAD51 näkyi transfektoiduissa soluissa mRAD51, kuten on esitetty Western blot (kuvio. 6D). Tärkeää on, että säteilylle herkistävän vaikutuksen berberiini oli merkittävästi heikennetty niin KYSE30 ja KYSE450 solulinjoja, jotka transfektoitiin mRAD51 (Fig. 6E). Nämä tulokset yhdessä, jotka saatiin RAD51-RNAi, osoitti, että RAD51 on kriittinen tekijä radioresistance in ESCC soluissa.

RAD51 yliekspressio on yleistä ruokatorven syöpä kudoksiin

lisääntymisen merkkejä

RAD51

ilmentyminen on yhteinen kasvainsolulinjoissa [25], ja useissa ihmisten maligniteettien [26], [27], [28]. Seuraavaksi me arvioitiin

RAD51

ekspressiotaso paneelin 86 ihmisen ensisijainen ruokatorven okasolusyöpä kudosten immunohistokemiallisella värjäyksellä. Ydin- ja /tai sytoplasmista värjäytymistä RAD51 havaittiin 81 86 yksilöitä. Yksilöiden näytteille positiivinen värjäytyminen RAD51, subsellulaarinen jakelu ja voimakkuus vaihtelivat. Intensiteetti pisteytettiin 1 29, 2 43, ja 3 9. kuusi näytettä osoitti hallitseva tumavärjäystä, 30 näytteet osoittivat hallitseva sytoplasminen värjäys, ja 45 näytteet osoittivat sekä soluliman ja tuman värjäytymisen (kuvio. 7A-E). Sen sijaan

RAD51

ilmentyminen oli vähän tai ei ollenkaan normaaleissa kudoksissa ympäröivä karsinooma (Fig.7F). Emme kuitenkaan löytäneet mitään korrelaatiota RAD51 ekspressiotasot ja kliinis parametrit ESCCs (taulukko 1). Kuitenkin meidän tulokset osoittivat, että RAD51 yleisesti yliekspressoituu ESCC yksilöitä. Koska yli-ilmentyminen RAD51 yleensä antaa vastustuskyvyn aineet, jotka vaurioittavat DNA: ta [29], [30], [31], tuloksemme edellyttävät toimenpiteitä, downregulate RAD51 saavuttaakseen korkean radio- tai kemoterapeuttisen tehoa ESCCs kliinisissä puitteissa. Mielenkiintoista on, berberiini hoito myös alas-säädellä RAD51 kolme ylimääräistä ruokatorven syöpä solulinjoja (KYSE410, EC109, ja TE-1), kuten KYSE30 ja KYSE450 soluja (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että berberiini voi tehdä sädeherkistävä vaikutus laajaa joukko ruokatorven syöpä soluja.

Kuvia näyttää erilaisia ​​ekspressiotason ja solun jakautuminen on esitetty. (A), ei ole RAD51-spesifistä värjäytymistä (sininen ytimet vuoksi Mayerin Hemalum counterstaining). (B), alhainen RAD51 sytoplasmassa, mutta ei ytimet, invasiivisen karsinooman solut. (C), väliportaan RAD51 sekä sytoplasmassa ja ytimet invasiivisen karsinooman solut. (D), korkea RAD51 sytoplasmassa, mutta ei ytimet, invasiivisen karsinooman solut. (E), korkea ydinvoiman RAD51 ytimet invasiivisen karsinooman soluja. Ei sytoplasmassa värjäytyminen on ilmeinen. (F), ei ole RAD51 värjäytyminen normaalissa ruokatorven kudoksessa. Immunohistokemia suoritettiin kuten materiaalit ja menetelmät. Kaikki alkuperäiset kuvat tallennettiin × 400 suurennus.

Keskustelu

osoitettu ensimmäistä kertaa, että berberiini voi tehokkaasti downregulate RAD51 ilmentyminen syöpäsoluja antavat radioherkkyyttä. Berberiini hoito johti vähenemiseen

RAD51

transkription ja inhibitiota

RAD51

promoottorin aktiivisuutta. Se voi myös voittaa säätelyä RAD51, joka indusoi ionisoiva säteily (IR). Sädeherkistävä vaikutus berberiini heikennettiin syöpäsoluissa yli-ilmentävät eksogeenisiä RAD51. Downregulation RAD51, joka on olennaista homologista rekombinaatiota korjaus, suuresti heikentynyt korjaus DSB aiheuttama IR ja johti huonoon selviytyminen IR-käsiteltyjen solujen. Mikä tärkeintä, havaitsimme, että RAD51 oli yleisesti yläreguloituja ihmisen ESCC kudoksissa, jotka saattavat tehdä vastustuskyky hoitoja, jotka kohdistuvat DNA. Siksi anto Berberiini kuin radio- ja chemosensitizer voi toimia strategian hoidossa ESCC potilaista.

lisääntymisen merkkejä RAD51 syöpäsoluissa oli osoitettu liittyvän lisääntyneeseen chemoresistance [29], [30] . Useat aiemmat tutkimukset osoittivat myös, että jotkut syöpälääkkeet tehdä syöpäsolut säteilylle ja chemosensitive mukaan vähen- tämisessä RAD51 ja heikentäen homologista rekombinaatiota korjaus syöpäsoluissa. Esimerkiksi imatinibi (Gleevec), joka estää c-Abl-tyrosiinikinaasin, voidaan tehokkaasti vähentää ilmentymistä RAD51 syöpäsoluissa ja antaa radioherkkyyttä [24], [32]. Gefitinibi, valikoiva epidermaalisen kasvutekijän reseptorin tyrosiinikinaasin estäjä, havaittiin säätelevät vaimentaen RAD51 keuhkosyövän soluja ja herkistää ne mitomysiini C [33] ja gemsitabiinin [34]. Fenyyli hydroksaamihappo- PCI-24781, histonideasetylaasi- inhibiittorin, joka on säteilylle herkistävän vaikutus syöpäsoluihin, myös toimii mukaan vähen- tämisessä RAD51 [35]. Lisäksi ottaa joukko sivuvaikutuksia, nämä lääkkeet ovat yleensä hyvin kalliita.

Monet luonnon tuotteilla on merkittävä lääkkeiden arvoja. Sen lisäksi, että edullisempia, kasviperäisten lääkkeiden on yleensä alhainen myrkyllisyys. Useat luonnolliset yhdisteet on todettu antavan säteilyherkkyyttä ja kemosensitiivisyys syöpäsoluihin. Yksi tutkimus osoitti, että curcumin, komponentti kurkuma (

Curcuma longa

), voisi radiosensitize syöpäsolujen kautta NFkB: n toiminto, joka johti downregulation anti-apoptoottisen geenin

Bcl-2

[36]. Kohdunkaulan syövän hoitoon solujen curcumin johti parantaa tuotannon IR-indusoidun reaktiivisen hapen (ROS), joka aiheuttaa jatkuvaa ERK1 /2-MAPK aktivointi [37]. Sen sijaan, emodiini, aine esiintyy joissakin kasveja kuten raparperi, on raportoitu estävän aktivaation ERK1 /2 keuhkosyövän soluja, jotka vuorostaan ​​johtaa downregulation RAD51 ja antaa kemosensitiivisyys [38], [39].

Huang Lian on yksi yleisimmin käytetty lääkekasvien Kiinassa. Se on yksi 12 yleisimmin käytetty lääkekasvien Yhdysvalloissa [40]. Sen lisäksi yhteinen käyttö lääkkeenä ruoansulatuskanavan epämukavuus, berberiini on testattu kliinisissä tutkimuksissa tyypin 2 diabetes [41], [42] ja hyperkolesterolemia [43]. Tärkeää on, potilailla berberine kokemus suhteellisen lieviä sivuvaikutuksia. Vaikka aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että berberiini on välittömiä antituumorivaikutuksia indusoimalla reaktiivisten hapen lajien syöpäsoluissa, mikä oletettavasti antaa säteilylle herkäksi [44], [45], [46], [47], meidän tutkimus on ensimmäinen osoittaa, että berberiini voi antaa radioherkkyyttä jonka vähen- tämisessä avainasemassa korjauksessa DSB. On huomattava, että teho berberiini vähen- tämisessä RAD51 in ESCC soluissa on verrattavissa Gleevec glioomassa soluihin [24]. Suuremmilla pitoisuuksilla, berberiini odotetaan pelata kaksoisrooli edistämisessä solujen kuolemaan, jossa se säilyy, samanaikaisesti aiheuttamalla DNA-vaurioita ja haittaavaa koulutusjakson, joka on vastuussa kärsimien vahinkojen korjaamisen. Tärkeää on, pitoisuuksina, jotka antavat radioherkkyyttä ruokatorven syöpäsoluja, berberiini ollut sädeherkistävä vaikutusta normaaleihin ihmisen fibroblasteissa. Vastaavasti Berberiini ei havaittu downregulate RAD51 sisään pahanlaatuisissa soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sädeherkistävä vaikutus berberiini voi olla ominaisia ​​syöpäsoluja.

Yhteenvetona osoitimme, että Berberiini pieninä pitoisuuksina merkittävästi radiosensitized ruokatorven okasolusyöpä soluja. Se vaikuttaa vähen- tämisessä RAD51, keskeinen toimija homologisen rekombinaation korjaus, joka johtaa heikentynyt korjaamiseen kaksinkertaisen säikeen katkoksia. Meidän havainnot näin paljastanut toistaiseksi tunnistamaton biologinen aktiivisuus yleisesti käytetty ja edullinen lääke ja ilmoitti, että berberiini, jossa on suhteellisen alhainen myrkyllisyys, voidaan käyttää adjuvanttina syövän sädehoidon.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki toimenpiteet, joissa kliiniset näytteet hyväksynyt eettinen komitea Shandong University School of Medicine.

Solulinjat

Kaikki soluja kasvatettiin 37 ° C kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2. Ihmisen ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) linjat KYSE30, KYSE450, KYSE410, EC109 ja TE-1 saatiin Cancer Institute Hospital, Kiina Academy of Medical Sciences (Beijing) ja viljeltiin RPMI 1640 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. KYSE30, KYSE450 ja KYSE410 alun perin tuotettu Dr. Yutaka Shimada, Normaali ihmisen fibroblasti (NHF) solut saatiin Institute of Basic Medical Sciences, Kiinan Academy of Medical Sciences (Peking), ja pidettiin DMEM täydennetty 10% sikiön naudan seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä-streptomysiiniä ja 4 ug /ml bFGF: ää. HUVEC-solut saatiin ATCC: ltä. Mesenkymaaliset kantasolut ovat peräisin ihmisen napanuoran olivat lahja tri Dong Li, Qilu sairaala, Shandong University. Fibroblastit (XWXL) perustettiin kirurgisesti poistettu fibroadenoma, jossa tietoisella suostumuksella potilaan ja hyväksynyt eettinen komitea Shandong University School of Medicine.