Krooninen sairaus

tiivistelmä

Human ABCG2, jäsen ATP-sitova kasetti kuljettaja superperheen, on keskeisessä asemassa monilääkeaineresistenssin ja suojella syövän kantasoluja . ABCG2-tyrmäys ollut selvää haitallinen vaikutus kehitykseen, biokemia, ja elämän hiirillä. Siten ABCG2 on mielenkiintoinen ja lupaava kohde kehittämiseksi kemiallis-herkistäjiä parempaan hoitoon lääkkeille vastustuskykyiset syöpien ja poistamiseksi syövän kantasoluja. Aiemmin olemme raportoitu uusi kahden tilassa toimiva ABCG2 estäjä, PZ-39, joka indusoi ABCG2 huononemisen estämisen lisäksi sen toimintaan. Tässä käsikirjoitus, raportoimme viime etenee tunnistaa kaksi eri ryhmää ABCG2 estäjien yhdellä estämällä vain ABCG2 toiminto (staattinen) ja toinen aiheuttaa ABCG2 hajoaminen lysosomissa lisäksi estämällä sen toiminta (dynaaminen). Siten estäjän aiheuttama ABCG2 hajoaminen voi olla yleisempää kuin aiemmin arvioitua ja lisätutkimuksia dynaamisen inhibiittorit indusoivat ABCG2 hajoamista voi tarjota tehokkaampi tapa herkistävän ABCG2 välittämän MDR syövän kemoterapiassa.

Citation : Peng H, Qi J, Dong Z, Zhang JT (2010) Dynamic

vs

Staattinen ABCG2 inhibiittorit herkistää lääkkeille vastustuskykyiset syöpäsoluja. PLoS ONE 5 (12): e15276. doi: 10,1371 /journal.pone.0015276

Editor: Wenqing Xu, University of Washington, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 syyskuu 2010; Hyväksytty: 03 marraskuu 2010; Julkaistu: 7. joulukuuta 2010

Copyright: © 2010 Peng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health myöntää CA113384 ja CA120221 (JTZ) ja jonka Showalter Foundation avustus (ZD). Jing Qi on vastaanottaja puolustusministeriön Breast Cancer Research Program Postdoctoral Fellowship. Hui Peng tuetaan tällä hetkellä, osittain NNSF Kiinan avustuksen nro 30873083. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut : kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ABCG2 kuuluu ATP-sitova kasetti (ABC) transporter superperheen ja yli-ilmentyminen ABCG2 on osoitettu syy moniresistenssin (MDR) mallissa syöpäsolulinjoilla ja korreloivan huonon ennusteen sekä aikuisten ja lasten leukemian ja rintasyöpäpotilaiden (for tarkastele [1], [2], [3]). Toisin kuin useimmat muut jäsenet ABC transporter superperheen, kuten P-glykoproteiini (MDR1 /ABCB1), ABCG2 pidetään puoli kuljettaja, joka koostuu yhden nukleotidin sitovan domeenin (NBD) on aminopäässä ja toinen kalvo-ulottuva domeeni (MSD) on karboksyyliterminuksesta. Se on siten ajateltu olevan olemassa ja toimivat homo-dimeeri. Kuitenkin viime aikoina näyttö osoittaa, että ABCG2 voivat esiintyä ja toimivat korkeamman asteen oligomeeriä, joka koostuu 8-12 identtisistä [4], [5] ja oligomerisaatioon sivustot ovat todennäköisesti sijaitsevat MSD [6].

Tässä prosessissa, jonka tarkoituksena on herkistävät MDR välittämä ABCG2, useita ABCG2 inhibiittoreita on äskettäin löydetty [7], [8], [9], [10], [11], [12], sen lisäksi, että aiemmin tunnistettu mekanismeja, kuten Fumitremorgin C (FTC) (katsaus katso [2]). Yksi näistä ABCG2 inhibiittorit, PZ-39, oli hyvin tehokas ja erottuva muut, kuten FTC: n, jolla on kyky aiheuttaa lysosomiin riippuvan hajoamisen ABCG2 proteiini [7].

edelleen määrittää, onko estäjän aiheuttama ABCG2 hajoaminen on ainutlaatuinen PZ-39, testasimme muita ABCG2 estäjiä syntyy järjestetyssä alustavassa seulonnassa joka johti tunnistamiseen PZ-39. Löydettiin kahdenlaisia ​​ABCG2 estäjien yhden estävä ABCG2 aktiivisuutta vain (staattinen) ja toinen estävää ABCG2 toiminnan sekä indusoivan ABCG2 hajoamisen kautta lysosomiin (dynaaminen). Nämä havainnot viittaavat siihen, että estäjän aiheuttama ABCG2 hajoamista lysosomissa voivat olla yleisempiä kuin se on aikaisemmin odotettu ja edelleen tutkii dynaamisen estäjiä, jotka aiheuttavat ABCG2 heikkenemistä lysosomissa voi tarjota tehokkaampi tapa herkistävän ABCG2 välittämän MDR syövän kemoterapiassa.

tulokset

kahdentyyppisiä ABCG2 estäjien

Aikaisemmin on raportoitu, että järkevä seulonta edustajista erilaisia ​​yhdisteen kirjaston tiedot (www.specs.net) johti tunnistaminen kahden tilassa toimiva ABCG2 estäjä PZ-39 [7]. Aikana alustava seulonta, useita muita ABCG2 estäjät, jotka ovat rakenteellisesti erilaisia ​​kuin PZ-39 ja sen johdannaiset (Fig. 1), on havaittu myös, ja niiden aktiivisuus estää ABCG2-välitteistä lääkevuoto- on vahvistettu käyttäen HEK293-solut yli-ilmentyminen Kohdunulkoisten ABCG2 (HEK293 /ABCG2) (Fig. 2A). Sen määrittämiseksi, jos nämä inhibiittorit myös omaavansa kahden tilassa toimiva ominaisuus, ensin vaikutus testattiin näiden estäjien ABCG2 ilmentymisen käyttäen Western-blot-analyysi. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, kolme neljästä uusia estäjiä (PZ-8, 34, ja 38) yhdessä PZ-39 estävät ABCG2 ilmaisu kun PZ-16 ei. Yhdessä aiempaan toteamukseen FTC estää vain ABCG2 aktiivisuus [7], voimme päätellä, että on todennäköisesti kahdenlaisia ​​ABCG2 estäjien yhdellä estävä vain ABCG2 aktiivisuutta, kun taas toinen estämällä sekä aktiivisuuden ja ilmentymisen ABCG2.

kemialliset rakenteet on esitetty PZ-8, (12E)-N’-((5-(3,4-dihydro-4-oxo-3-phenylquinazolin-2-ylthio)furan-2-yl)methylene)-2-(4-ethylphenoxy)acetohydrazide; PZ-16, 2- (4- (4-nitrofenoksi) fenyyli) -2-oxoethyl2- (2- (4- kloori bentsamido) asetamido) asetaatti; PZ-34, (E) -2- (4-etoksifenyyli) -N ’- (1- (4- (furaani-2-karboksiamido) fenyyli) etylideeni) kinoliini-4-karbohydratsidi; PZ-38, (N-(2,5-dimethoxyphenyl)-2-({4-[4-(dimethylamino)benzylidene]-5-oxo-1-phenyl-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl}sulfanyl)acetamide); ja PZ-39 (N- (4-kloorifenyyli) -2 – [(6 – {[4,6-di (4-morfolinyyli) -1,3,5- triatsin-2-yyli] amino} -1,3 bentsotiatsol-2-yyli) sulfanyyli] asetamidi).

, mitoksantronia kertymistä. HEK293 /ABCG2 soluja inkuboitiin mitoksantroni 30 min: n läsnä ollessa DMSO: ssa (ohut viiva) tai 10 uM PZ yhdisteiden (paksu viiva) ja sen jälkeen FACS-analyysi mitoksantronin tasolla. B, ABCG2 ilme. HEK293 /ABCG2 soluja inkuboitiin 3,3 uM PZ yhdisteitä tai DMSO-kontrollin eri aikoina ja sen jälkeen keräämällä solut ja Western blot-analyysi ABCG2 tutkittiin monoklonaalisella vasta-aineella BXP-21.

Suppression of ABCG2 ilmentymisen tunnetut ja nykyisten ABCG2 estäjät

edellä olevat tulokset viittaavat siihen, että estäjän aiheuttama suppressio ABCG2 ilmentyminen voi olla yleisempää kuin odotettiin. Edelleen tämän mahdollisuuden testaamiseksi, tutkimme vaikutus kahden muun julkaistu ABCG2 estäjät (NSC-168201 ja NSC-120668) [12] ABCG2 ilmentymisen käyttäen Western-blot-analyysi. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, sekä NSC-168201 ja NSC-120668 tehokkaasti estää ABCG2 ilme. Kuitenkin ohjaus ABCG2 estäjä FTC ei vaikka kaikkia kolmea estäjät tehokkaasti parantaa mitoksantronilla kertymistä HEK293 /ABCG2 solulinjoissa (Fig. 3B). Täten voimme päätellä, että estäjän aiheuttama suppressio ABCG2 ilmentyminen voi olla yleisempää kuin se on ennakoitu ja siellä on mahdollisesti kaksi ryhmää ABCG2 estäjien.

, ABCG2 ilme. HEK293 /ABCG2-soluja käsiteltiin 10 uM kutakin tunnetun ABCG2 inhibiittorit NSC-168201, NSC-120668, tai FTC eri aikoina ja sen jälkeen Western blot-analyysi ABCG2 ilmaisun tutkittiin monoklonaalisella vasta-aineella BXP-21. B, mitoksantronia kertymistä. HEK293 /ABCG2 soluja inkuboitiin mitoksantroni 30 min: n läsnä ollessa DMSO: ssa (ohut viiva) tai 10 uM NSC-168201, NSC-120668, tai FTC (paksu viiva) ja sen jälkeen FACS-analyysi solunsisäisen mitoksantronin tasolla.

Erityinen vaikutus PZ-34 ja PZ-38 ABCG2 välittämän mitoksantronilla ulosvirtaus

tutkimiseksi edelleen, jos nämä uudet inhibiittorit tukahduttaa ABCG2 ilmaisun indusoimalla ABCG2 hajoamista lysosomissa, päätimme keskittyä PZ -34 ja PZ-38 ja ensimmäinen suoritetaan yksityiskohtainen analyysi niiden vaikutuksista huumeiden kertymistä. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, molemmat PZ-34 ja PZ-38 ~ 4 uM kasvattaa mitoksantronilla kertyminen samassa määrin kuin vakiintunut ABCG2 estäjä FTC HEK293 /ABCG2 soluja. Nämä yhdisteet kuitenkaan ole merkittävää vaikutusta mitoksantronilla kertymiseen kontrollisoluissa-transfektoitu vektorilla (HEK293 /Vec), mikä osoittaa, että vaikutus PZ-34 ja PZ-38 mitoksantronilla kertyminen on todennäköistä kautta estämällä ABCG2. Sitten testattiin annosvastetta PZ-34 ja PZ-38 inhiboimaan ABCG2-välitteisen mitoksantroni ulosvirtaus HEK293 /ABCG2 soluihin käyttäen virtaussytometriaa. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, solunsisäinen mitoksantronia taso on paljon vähemmän HEK293 /ABCG2 soluja verrattuna HEK293 /Vec solujen takia ABCG2 välittämää ulosvirtausta. Lisääminen PZ-34 ja PZ-38 lisää kertymiseen solun mitoksantronia annoksesta riippuvaisella tavalla samanlainen kuin FTC.

, mitoksantronia kertymistä. HEK293 /Vec tai HEK293 /ABCG2 soluja inkuboitiin mitoksantroni 30 minuutin läsnä ollessa DMSO-kontrollin, tai 3 uM PZ-34, PZ-38 tai FTC: n ohjaus. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. B, annosvaste PZ-34, PZ-38, ja FTC ohjaus palauttamisessa mitoksantronilla kertymistä HEK293 /ABCG2 soluja. Paksu viiva näyttää tason mitoksantronia kertymistä HEK293 /Vec soluja, joka toimii enimmäiskertymä ohjaus. C, vaikutus ABCB1 ja ABCC1 välittämän adriamysiinin ulosvirtausta. HEK293 solujen ABCC1 yli-ilmentyminen (HEK293 /ABCC1) ja BC19 solujen ABCB1 yli-ilmentyminen inkuboitiin adriamysiinin puuttuessa (harmaa alue) tai läsnä ollessa (katkoviiva) 3,8 uM PZ-34 tai PZ-38 seuraa FACS analyysi. Paksu viiva osoittaa enimmäismäärä kertymistä transfektoiduissa soluissa vektorisäätötilassa. D, vaikutus ABCB1 ja ABCC1 ilme. HEK293 /ABCC1 ja BC19 solujen ABCB1 yli-ilmentyminen oli käsitelty 10 uM PZ-34 tai PZ-38 3 päivää ja sen jälkeen Western blot-analyysi ABCB1 käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta C219 ja ABCC1 käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta MRPr1. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

spesifisyyden määrittämiseksi PZ-34 ja PZ-38, testasimme niiden vaikutuksen lääkevuoto- välittyy kahden muun ABC kuljettajat, joiden tiedetään aiheuttavan MDR, ABCB1 ja ABCC1, käyttämällä MCF7-solut transfektoitiin samalla ABCB1 (BC19) [13] ja HEK293-solut transfektoitiin samalla ABCC1 (HEK293 /ABCC1) [14], [15]. Havaitsimme kuitenkin, ei ole vaikutusta näiden yhdisteiden aktiivisuutta ABCB1 ja ABCC1 laskeva Adriamycin kertymistä (Fig. 4C). Sekä PZ-34 ja PZ-38 ei myöskään vaikuta ilmaus ABCB1 ja ABCC1 (Fig. 4D). Siten PZ-34 ja PZ-38 voi olla ominaisia ​​ABCG2 eivätkä vaikuta lääkevuoto- välittävät kaksi muuta merkittävää ABC kuljettajat.

vaikutus PZ-34 ja PZ-38 ABCG2 välittämän monilääkeresistenssin

sen määrittämiseksi, jos molemmat PZ-34 ja PZ-38 on kyky herkistää ABCG2-välitteisen lääkeresistenssi, teimme analyysit vaikutuksia näiden yhdisteiden eloonjäämiseen HEK293 /ABCG2 solujen läsnä ollessa tai ilman mitoksantronin . Kuten on esitetty kuviossa. 5A, sekä PZ-34 ja PZ-38 yksin ei ole mitään vaikutusta eloonjäämisen HEK293 /ABCG2 solujen pitoisuuksina alle 10 ug /ml. Heidän IC

50 arvioitiin olevan ~12.9 ja 20 uM, tässä järjestyksessä (taulukko 1). Siten sekä PZ-34 ja PZ-38 on vähän sytotoksisuus HEK293 /ABCG2 soluja pitoisuuksina alle 10 uM, mikä viittaa siihen, että ne eivät voi toimia muita olennaisia ​​molekyylejä, joilla on suuri affiniteetti solujen eloonjäämistä.

A, teho PZ-34 ja PZ-38 kääntämään mitoksantronia vastarintaa. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin ilman tai 0,1 uM (IC

10) mitoksantroni puuttuessa tai läsnä ollessa eri pitoisuuksina PZ-34 tai PZ-38 ja sen jälkeen SRB-määrityksellä. B, herkistyminen indeksi PZ-34 ja PZ-38 HEK293 /ABCG2 soluja. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla mitoksantronin puuttuessa tai läsnä ollessa eri pitoisuuksina PZ-34 tai PZ-38 ja sen jälkeen SRB-määrityksellä. C ja D, herkistyminen indeksi PZ-34 ja PZ-38 huumeisiin valittujen MCF7 /AdVp3000 soluja. MCF7 /AdVp3000-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla mitoksantronin (C), tai adriamysiinin (D) läsnä ollessa DMSO: ssa (vehikkeli) tai 500 nM PZ-34 ja PZ-38 ja sen jälkeen MTT-määrityksellä. Herkistyminen indeksi laskettiin IC

50 syöpälääkkeitä puuttuessa tai läsnä PZ-34, PZ-38, tai FTC. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

vieressä määritti PZ-34 ja PZ-38 herkistävä soluvastetta 0,1 uM mitoksantroni, joka yksin tuottaa alle 10% kasvun esto HEK293 /ABCG2 soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, sekä PZ-34 ja PZ-38 alhaisella pitoisuusalueella herkistää näiden solujen mitoksantronia. Noin 1,2 uM, sekä PZ-34 ja PZ-38 avustaa 0,1 uM mitoksantronilla kokonaan estävät solujen kasvua. IC

50 PZ-34 ja PZ-38 herkistävä mitoksantronilla vastustuskyky laskettiin olevan 71 ja 45 nM (taulukko 1). Testasimme myös PZ-8 ja PZ-16 ja totesi, että IC

50 näistä yhdisteistä yksinään -20 uM ja niiden IC

50 herkistettäessä mitoksantronilla vastus MCF7 /AdVp3000 solut ovat -80 ja -70 nM vastaavasti. IC

50 FTC herkistettäessä mitoksantroni vastus, toisaalta, on paljon suurempi 326 nM (taulukko 1).

Seuraavaksi tutkimme annosvaste PZ-34 ja PZ-38 herkistettäessä ABCG2 välittämän mitoksantronilla vastus käyttäen HEK293 /ABCG2 soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, IC

50 mitoksantronin vähenee dramaattisesti läsnäollessa PZ-34 ja PZ-38. 50 nM, PZ-34 ja PZ-38 vähentää merkittävästi IC

50 mitoksantronin kanssa herkistyminen indeksi 1,6 ja 2,2, vastaavasti (taulukko 2). 500 nm: ssä, herkistymisestä indeksi PZ-34 ja PZ-38 ovat 8,7 ja 14,3, vastaavasti (taulukko 2). Toisaalta, herkistymisestä indeksi FTC 500 nM on vain 3,9 (taulukko 2). Nämä tulokset osoittavat, että PZ-34 ja PZ-38 ovat hyvin voimakkaita uusia ABCG2 estäjiä.

Jotta voitaisiin edelleen tutkia, PZ-34 ja PZ-38 voi kääntää ABCG2 välittämää MDR on lääkkeille vastustuskykyisten syöpäsolu linja, käytimme lääke valittu rintasyövän MCF7 /AdVp3000 joka yli-ilmentää ABCG2 ja testattiin lisäksi syöpälääkkeen substraatti ABCG2, adriamysiinin. Kuten on esitetty kuviossa. 5C, sekä PZ-34 ja PZ-38 500 nm: ssä vähentää huomattavasti vastus MCF7 /AdVp3000 sekä Adriamycin ja mitoksantronilla.

PZ-34 ja PZ-38 eivät vaikuta ABCG2 oligomerisaatioon

Aiemmin on osoitettu, että ABCG2 voivat esiintyä ja toimivat homo-oligomeeriä [4], [6]. Sen tutkimiseksi, mikäli PZ-34 ja PZ-38 mahdollisesti estävät ABCG2 oligomeroinnin, samanaikainen immunosaostus kaksi differentiaalisesti koodattu ABCG2 suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [4] jälkeen 6 tunnin hoidon PZ-34 ja PZ-38 3,3 uM. Ei kuitenkaan vaikutusta PZ-34 ja PZ-38 ABCG2 samanaikainen immunosaostus todettiin (katso täydentävää Fig. S1), mikä viittaa siihen, että PZ-34 ja PZ-38, samanlainen PZ-39 [7], ei saa vaikuttaa ABCG2 oligomeroinnin. Kuitenkin, johtuen rajoittamisesta samanaikainen immunosaostus, nämä inhibiittorit voivat vaikuttaa dimerisaatio, joita ei voida paljastaa samanaikainen immunosaostus että olemassa on ainakin 3 erilaista vuorovaikutusta sivustoja oligomeerisen ABCG2 [4], [6].

vaikutus PZ-34 ja PZ-38 on puoliintumisaika ABCG2

Kuten edellä on esitetty, sekä PZ-34 ja PZ-38 tukahdutetaan ABCG2 ilmentymistä (Fig. 2). Sulkea pois mahdollisuutta, että tämä tukahduttaminen on estämällä geenin ilmentymisen, suoritimme reaaliaikainen RT-PCR-analyysillä. Kuten on esitetty kuviossa. S2, vakaan tilan tasot ABCG2 mRNA ovat samat ja ohjaimen välillä yhdisteen hoitoryhmään, ja siten poistaa sen mahdollisuuden, että nämä yhdisteet vaikuttavat transkriptio- tai vakautta ABCG2 mRNA: iden.

Sen määrittämiseksi, tukahdutetaan ilmaus ABCG2 johtuu estäjän aiheuttama hajoaminen kuten aikaisemmin havaittiin PZ-39 [7], tutkimme vaikutus PZ-34 ja PZ-38 on puoliintumisaika ABCG2 HEK293 /ABCG2 solut esikäsittelemällä soluja sykloheksimidi, joka estää venymä proteiinisynteesin aikana, ja sen jälkeen käsittelemällä PZ-34 ja PZ-38 eri aikoina. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, menetys ABCG2 käsitellyissä soluissa yhdistelmä sykloheksimidi ja PZ-34 tai PZ-38 on paljon nopeampi kuin ohjaus hoidon DMSO ajoneuvon tai FTC: n ohjaus. Puoliintumisaika on ABCG2 läsnäollessa PZ-34 ja PZ-38 arvioidaan olevan ~8 tuntia katsoo, että on vakaa joiden arvioitu puoliintumisaika on yli 60 tuntia kontrolliryhmässä hoidon FTC tai DMSO (Fig. 6B ). Näin ollen, PZ-34 ja PZ-38 todennäköisesti nopeuttaa hajoamista ABCG2 proteiinin samoin kuin PZ-39 [7].

A, Western blot-analyysi. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin ensin 5 ug /ml sykloheksimidiä (CHX), jonka jälkeen lisättiin 3 uM PZ-34, PZ-38, FTC, tai DMSO-kontrollin eri aikoja. Solut kerättiin sitten Western blot-analyysi ABCG2 tutkittiin monoklonaalisella vasta-aineella BXP-21. Aktiini käytettiin latauskontrollina. B, puoliintumisaika ABCG2. ABCG2 tasot Western blot kuten esitetään A-kuvassa määritettiin käyttämällä Scion Image ja ajan funktiona hoidon. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta.

PZ-34 ja PZ-38 indusoi ABCG2 hajoamista lysosomissa

On raportoitu aiemmin, että villin tyypin ja oikein-taitettu ABCG2 proteiinit hajoavat lysosomissa taas mutantti ja väärin laskostuneen proteiinit ovat osallisena ubikitiinistä välittämää hajoamista proteasomin [16]. Lisäksi huomasimme aikaisemmin, että PZ-39 aiheuttaa ABCG2 hajoamisen kautta lysosomifuusio-välitteisen hajoaminen [7]. Sen määrittämiseksi, PZ-34 ja PZ-38 syy ABCG2 hajoamisen kautta lysosomifuusio tai proteasomin, käytimme bafilomysiini

1, estäjä proteiinien hajoaminen lysosomissa, ja MG-132, proteasomin estäjä kuten aikaisemmin on kuvattu [7]. Kuten on esitetty kuviossa. 7A, esikäsittely solujen bafilomysiini

1 estää PZ-34 ja PZ-38 aiheuttama ABCG2 hajoamista kun taas esikäsittely MG-132 ei. Siten todennäköisesti PZ-34 ja PZ-38 aiheuttaa myös ABCG2 hajoamista lysosomissa, sama kuin PZ-39 [7].

, ABCG2 hajoaminen lysosomeihin. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin 3 uM PZ-34 tai PZ-38 puuttuessa tai läsnä 10 nM bafilomysiini

1 (BMA1) tai 2 uM MG-132 eri aikoina. Solut kerättiin sitten Western blot-analyysi ABCG2 ilmaisun tutkittiin monoklonaalisella vasta-aineella BXP-21. Aktiini käytettiin latauskontrollina. B, ABCG2 konformaatiomuutoksia. HEK293 /ABCG2 ja MCF7 /AdVp3000-soluja käsiteltiin 10 uM PZ-34, PZ-38, tai DMSO: vehikkelikontrolli seurasi värjäys monoklonaalisella vasta-aineella 5D3 ja FACS-analyysiä. Nuolenkärki osoittavat PZ-34 ja PZ-38 käsiteltyjen ryhmien.

PZ-34 ja PZ-38 sitoutuvat ABCG2

Aiemmin on raportoitu, että monoklonaalinen vasta-aine 5D3 sitoutuu ABCG2 solun pinnalla helpommin sitoutumisen inhibiittorien ABCG2 johtuen mahdollisesti estäjän aiheuttama konformationaalisia muutoksia ABCG2 [7], [12], [17]. Sen määrittämiseksi, onko PZ-34 ja PZ-38 mahdollisesti sitoutuvat ABCG2, teimme värjäys analyysit ABCG2 käyttämällä 5D3: n läsnä tai poissa ollessa PZ-34 ja PZ-38. Kuten on esitetty kuviossa. 7B, sekä PZ-34 ja PZ-38 aiheuttaa kasvua 5D3 värjäystä sekä MCF7 /AdVp3000 ja HEK293 /ABCG2 solut, mikä osoittaa, että molemmat PZ-34 ja PZ-38 voi sitoutua ABCG2 ja sitovat johtaa konformationaalista muutosta ABCG2.

keskustelu

Tässä tutkimuksessa, osoitamme, että on olemassa mahdollisesti kaksi ryhmää ABCG2 estäjien ja estäjien aiheuttaman ABCG2 hajoamista lysosomissa voivat olla yleisempiä kuin aiemmin oletettiin. Samalla osoitetaan, että PZ-34 ja PZ-38 ovat voimakkaita ABCG2 estäjiä. Vaikka PZ-34 ja PZ-38 ovat rakenteellisesti erilaisia ​​kuin aiemmin tunnistettu ABCG2 estäjä, PZ-39, ne näyttävät olevan samanlainen vaikutusmekanismi estämällä ABCG2 toiminto ja nopeuttamalla ABCG2 hajoamista lysosomissa.

Monien ABCG2 inhibiittorit aiemmin tunnistettu, harvat tiedetään olevan ominaisia ​​ABCG2 ja mitään ei ole tutkittu osoittamaan, jos he voisivat nopeuttaa ABCG2 hajoamista lysosomissa. Tässä ja edellisessä tutkimuksessa [7], huomasimme, että FTC eivät vaikuttaneet ABCG2 ilmaisua taas sekä NSC-168201 ja NSC-120668 teki. Kun neljä uutta ABCG2 estäjät (PZ-8, 16, 34, ja 38) testattiin tässä tutkimuksessa, kolme vaimentaa ABCG2 ilmaisu, kun taas toinen ei. Yhdessä uskomme, että on olemassa kaksi ryhmää ABCG2 estäjien yhdellä estävä vain ABCG2 aktiivisuus ja muut myös tukahduttamalla ABCG2 huononemisen estämisen lisäksi ABCG2 toiminto. Nimeämme nämä inhibiittorit kuten staattista ja dynaamista estäjät, vastaavasti.

Toistaiseksi ei tiedetä, mitä perustavanlaatuisia eroja näiden kahden ryhmän estäjät aiheuttavat eroa niiden toimintamekanismi. Se on, kuitenkin, houkuttelevaa spekuloida, että ne sitoutuvat kahteen eri kohtaan ABCG2. Sitoutuminen joko päällä aiheuttaa konformaatiomuutoksiin of ABCG2 jotka johtavat esto ABCG2 aktiivisuuden. Kuitenkin sitoutuminen yksi sivustot myös helpottaa ABCG2 endosytoosin ja hajoamista lysosomissa. Muutos ABCG2 konformaatioon PZ-34 ja PZ-38 havaittiin käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta 5D3 viittaa siihen, että PZ-34 ja PZ-38 sitoudu suoraan ABCG2 vaikka niiden sitoutumiskohdat ovat tällä hetkellä tuntemattomia. Koska FTC aiheuttaa myös konformaation muutoksen, mutta ei kiihdytä ABCG2 hajoamista, PZ-34 ja PZ-38 todennäköisesti eivät sitoudu samanlaisia ​​sivuston FTC. Aikaisemmin on osoitettu, että agonistin sitoutumisen nopeutetun endosytoosin ja hajoamisen β

2-adrenergisen reseptorin lysosomissa [18], joka tukee edellä esitetty hypoteesi. Vaikka epätodennäköistä, on myös mahdollista, että dynaaminen ABCG2 inhibiittorit saattavat olla off-tavoite vaikutus, joka aktivoi alkupään reittejä mukana ABCG2 hajoamista. Riippumatta, nämä mahdollisuudet on testattava tulevaisuudessa perusteellisia tutkimuksia.

Aikaisemmin on osoitettu, että ABCG2 hajoaminen tapahtuu pääasiassa kahdella eri mekanismeja. Vaikka oikeinlaskostunutta villityypin ABCG2 pääasiassa hajoavat kautta lysosomifuusio [16], mutantti proteiinit hajotetaan proteasomin välityksellä laadunvalvontamekanismi [16], [19], [20]. Näyttää siltä, ​​että laadun valvonta mekanismi tapahtuu ER heti synteesin ABCG2 ja normaali hajoaminen villityypin proteiinit voivat tapahtua endosytoosin ABCG2 plasmasta kalvoja. Tällä hetkellä se ei vielä tiedetä, dynaaminen estäjän aiheuttama hajoaminen ABCG2 tapahtuu kaupan lysosomaalisten alkaen solukalvojen kautta endosytoosin ja /tai ER kalvot heti niiden synteesi.

Vaikka tällä hetkellä tiedetä, PZ -34 ja PZ-38 ovat ominaisia ​​ABCG2, tuloksemme osoittavat, että ne eivät vaikuta ABCB1 ja ABCC1 toiminta ja ilme. Näin ollen, PZ-34 ja PZ-38 ovat ominaisia ​​ABCG2 kuin jotkut aikaisemmin tunnistetut ABCG2 inhibiittorit, kuten tunnettua ABCG2 estäjä GF120918, joka näyttää estävän ABCB1 ja /tai ABCC1 yhtä hyvin [2], [21]. Olemme myös havainneet, että sekä PZ-34 ja PZ-38 ei ole sytotoksinen, jonka pitoisuus on korkeintaan 10 ug /ml, mikä viittaa siihen, että nämä ABCG2 inhibiittorit todennäköisesti eivät sitoudu ja estää muiden solun proteiinien kanssa, joilla on korkea affiniteetti, jotka ovat välttämättömiä solujen selviytymistä. Kuitenkin lisää tutkimuksia tarvitaan selvittämään spesifisyyttä PZ-34 ja PZ-38 ja onko ne sitoutuvat ja estävät muiden jäsenten ihmisen ABC transporter perhe.

Se, että PZ-34 ja PZ -38 ole sytotoksisuus HEK293-solut pitoisuuksina alle 10 uM ja voi tehokkaasti kääntää MDR viittaa siihen, että ikkuna terapeuttinen indeksi näistä yhdisteistä ovat suuria. Ihanteellinen kemiallis-herkistävä on se, että sen ei pitäisi olla toksinen itsessään. On selvää, PZ-34 ja PZ-38 täyttää tämän vaatimuksen in-vitro -tutkimuksissa. Kuitenkin, se ei ole tiedossa, jos nämä yhdisteet ovat myrkyllisiä ja tehokkaita kääntää MDR in vivo, joka on arvioitava tulevissa tutkimuksissa, joissa käytettiin eläinmalleja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Monoklonaalinen vasta-aine BXP-21 vastaan ​​ABCG2, anti-Myc ja anti-HA vasta-aineet olivat peräisin ID Labs, Cell Signaling, ja Roche, vastaavasti. Monoklonaalinen vasta-aine C219 ja MRPr1 ostettiin Kamiya Biomedical Company. Biotiini-konjugoitu 5D3-vasta-aine ja fykoerytriini-streptavidiinia konjugaatit olivat eBiosciences. Kaikki elektroforeesi reagenssit, proteiinipitoisuus määritys kit, ja polyvinylidiinidifluoridiin kalvot ostettiin Bio-Rad. FTC, adriamysiinin, mitoksantroni, kamptotesiini, ditiotreitoli, sulforodamiini B (SRB), ja Triton X-100 olivat peräisin Sigmalta. Yhdisteet PZ-8, PZ-16, PZ-34, PZ-38, ja PZ-39 hankittiin silmälasit. NSC-168201 ja NSC-120668 olivat lahjoja National Cancer Institute. Proteiini-G PLUS-agaroosi ja SYBR Green PCR Master Mix olivat Santa Cruz Biotechnology and Applied Biosystems, vastaavasti. LipofectAMINEa Plus ja G418 olivat Invitrogen. Soluviljelyelatusainetta IMEMiin ja DMEM olivat BioSource International ja Media Tech, vastaavasti. Kaikki muut kemikaalit olivat molekyylibiologian laadut Sigma tai Fisher Scientific.

Soluviljely, hoidot ja lysaatti valmisteet

Ihmisen rintasyöpä MCF7 ja sen johdannainen linjat BC19 (lahja Julie Horton National Institute of Environmental Health Sciences) ja MCF7 /AdVp3000 (lahja Susan Bates National Cancer Institute), HEK293 /ABCC1 [14], HEK293 /vektori [14], HEK293 /ABCG2 [4] viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],4], [13], [14], [22]. Analysointiin ABCG2 hajoamisen, HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin ensin 10 nM bafilomysiini

1 tai 2 uM MG132 24 tunnin ajan, jota seuraa käsittely 3 uM PZ-34 tai PZ-38 eri aikoina ja kokoelma solulysaateista . Määrittämiseksi ABCG2 puoliintumisaika, HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin 5 ug /ml sykloheksimidiä, 3 uM PZ-34 tai PZ-38 eri aikoina ja sen jälkeen keräämällä solut. Lysaattia valmistelu suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [22].

Western blot, immunosaostus ja FACS-analyysit

Western blot, immunosaostus ja FACS-analyysit lääkeaineen kertymistä suoritettiin täsmälleen kuten aikaisemmin on kuvattu [ ,,,0],4], [6]. Määrittää konformaation muutoksen ja ABCG2 hoidon jälkeen ABCG2 estäjien, HEK293 /ABCG2 soluja inkuboitiin 10 uM PZ-34 tai PZ-38 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ennen kuin inkuboitiin biotiini-konjugoidun 5D3-vasta-aineen (1:100 laimennus) 2 tuntia. Sitten solut pestiin 3 kertaa ja niitä inkuboitiin fykoerytriini-streptavidiini 30 minuuttia, mitä seurasi pesu ja analyysi käyttäen FACS: llä.

Sytotoksisuusmääritvs

Sytotoksisuus määritettiin käyttäen SRB ja MTT-määrityksiä, kuten aikaisemmin on kuvattu [ ,,,0],6], [22], [23]. Vaikutus ABCG2 estäjien lääkeresistenssin määritettiin altistamalla solut konsentraatioalueella syöpälääkkeiden puuttuessa tai läsnä ollessa eri pitoisuuksina ABCG2 estäjiä. Teho ja herkistymistä indeksi ABCG2 estäjien laskettiin seuraavasti:

Reaaliaikainen RT-PCR

RNA ja reaaliaikaisen RT-PCR suoritettiin, kuten olemme aiemmin on kuvattu [22]. Sekvenssit ABCG2-alukkeet ovat 5′-GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-ATGGCGTTGAGACCAG-3′ (taaksepäin). Sekvenssit GAPDH-alukkeet ovat 5’-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3’ (taaksepäin). Suhteellinen ABCG2 RNA taso (2

ACt) käsiteltiin estäjillä ilmaistiin prosentteina ohjaus (läsnä ollessa 0,1% DMSO), jossa ACt (kynnys sykli) = (CT

ABCG2-CT

GAPDH ).

tukeminen Information

Kuva S1.

vaikutus PZ-34 ja PZ-38 ABCG2 dimeroitumisen /oligomerisaatiota. HEK293-solut kotransfektoitiin Myc- ja HA-merkitty ABCG2 altistettiin 3,3 uM PZ-34, PZ-38, tai DMSO-kontrollin 6 tuntia ja solulysaatit altistettiin immunosaostukselle anti-Myc tai anti-HA-monoklonaalinen vasta-aine ja sen jälkeen western blot-analyysi koettimella käyttäen anti-HA ja anti-Myc-vasta-aineita.

doi: 10,1371 /journal.pone.0015276.s001

(JPG)

Kuva S2.

vaikutus PZ-34 ja PZ-38 ABCG2 mRNA tasolla. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin DMSO ajoneuvon, PZ-34, tai PZ-38 eri aikoina ja korjataan RNA: n valmistaminen ja reaaliaikaisen RT-PCR-analyysillä. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0015276.s002

(JPG) B

Kiitokset

Kiitämme Developmental Therapeutics Program at NCI että NSC yhdisteitä käytetään tässä tutkimuksessa.