Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä RNA: ita, jotka tunnistavat ja säätelevät mRNA kohdegeenien. Monirivisille todisteet osoittavat, että ne ovat keskeisiä säätelijöitä lukuisten tärkeimpien toimintojen kehittämiseen ja sairauksien, kuten syövän. Kuitenkin määritellään paikka ja toiminta miRNA monimutkaisissa säätelyverkkojen ei ole yksinkertaista. Systems lähestymistavat, kuten päättelyn moduulin verkon ekspressiotietojen, voi auttaa saavuttamaan tämän tavoitteen.

Menetelmät /Principal Havainnot

Viimeisen vuosikymmenen aikana, paljon edistystä on tapahtunut kehitystä kestäviä ja tehokkaita moduuli verkko päättely algoritmeja. Tässä tutkimuksessa analysoidaan ja arvioida kokeellisesti moduuli verkko päätellä sekä miRNA ja mRNA: n ilmentymisen tietoja käyttämällä äskettäin kehitetty moduuli verkko päättely algoritmi perustuu todennäköisyyspohjaisiin optimoinnilla. Osoitamme, että useat miRNA ennustetaan tilastollisesti merkitsevä säätimet eri moduuleja tiukasti koekspressoi geenejä. Yksityiskohtainen analyysi kolme näistä moduuleista osoittaa, että erityinen osoittaminen miRNA on toiminnallisesti yhtenäinen ja tukevat kirjallisuudesta. Olemme lisäksi suunnitelleet sarjan kokeita testata osoittamiseksi miR-200a kuin alkuun säätelijänä pienen moduulin yhdeksän geenejä. Tulokset viittaavat vahvasti siihen, että miR-200a säätelemällä moduuli geenien kautta transkriptiotekijä ZEB1. Kiinnostavaa kyllä, tämä moduuli on todennäköisesti mukana epiteelin homeostaasin ja sen säätelyhäiriö saattaisi edistää pahanlaatuinen prosessi syöpäsoluissa.

Johtopäätökset /merkitys

Tuloksemme osoittavat, että vankka moduuli verkosto analyysi ilmaisun data voi tarjota uusia oivalluksia miRNA funktion tärkeisiin solun prosesseissa. Tällainen laskennallinen lähestymistapa, alkaen ekspressiotietojen yksin, voi olla hyödyllistä kartoittaa toiminnan miRNA ehdottamalla moduulit koekspressoidusta geenejä, joissa niillä on säätelevä rooli. Kuten tässä tutkimuksessa, nämä moduulit voidaan sitten testata kokeellisesti tutkia tarkemmin ja tarkentaa toiminta miRNA sääntelyn verkossa.

Citation: Bonnet E, Tatari M, Joshi A, Michoel T, Marchal K , Berx G, et ai. (2010) moduuli Verkko päättely siitä Cancer Gene Expression Data identifioi MicroRNA Säännellyt moduulit. PLoS ONE 5 (4): e10162. doi: 10,1371 /journal.pone.0010162

Editor: Simon Rogers, University of Glasgow, Iso-Britannia

vastaanotettu 15 joulukuuta 2009; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2010; Julkaistu: 14 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Bonnet et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukena on Innovatie ovi Wetenschap en Technologie (sisävesiliikenteen) avustuksen Strategisch BasisOnderzoek (SBO) Bioframe hanke ja jota Interuniversity Attraction Pole (IUAP) avustuksen BioMaGNet hankkeen (bioinformatiikan ja Modelling: alkaen Genomit Verkostot, viite. p6 /25). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojenkeruuohjelmat ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä endogeenisen sääntely-RNA: t, esiintyy monenlaisia ​​eukaryoottisia organismeja. Ne sisällytetään RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (RISC), joka sitoutuu sivustoja vaihtelevien täydentävät kohde RNA: iden, liipaisu niiden hajoamisen ja /tai tukahduttaa niiden käännös [1]. Todisteet, jotka koskevat miRNA solukasvun, solujen erilaistumista ja syöpä on parhaillaan kasaantuu. Lähes puolet selityksin ihmisen miRNA kartta sisällä hauras kromosomialueita, jotka ovat alueilla, joilla erilaisten ihmisen syöpien. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että miRNA sekä tekijät, jotka osallistuvat miRNA biogeneesissä voi toimia tuumorisuppressoreilla ja /tai oncogenes [2]. Uusimpien miRBase arkiston julkaisu [3], on 700 ihmisen kypsän miRNA tunnistetun kokeellisen tuen, kun taas jotkut laskennallisia tutkimuksia laajentaa luetteloa yli 1000 [3], karkeasti vastaten määrä transkriptiotekijöiden [4] . Laskennallinen ja kokeelliset tutkimukset ovat myös ennustettu, että välillä 30% ja 100% ihmisen proteiinia koodaavan geenien voisi olla alle transkription jälkeisen sääntelyn miRNA [5], [6]. Ei ole vaikea nähdä, että jopa ottamalla kaikkein konservatiivisia arvoja, sääntely verkon aiheuttama niin suuri määrä sääntelyviranomaisten ja tavoitteista on potentiaalisesti erittäin suuri. Lisäksi miRNA eivät toimi eristyksissä, vaan ovat osa monimutkaista sääntelyverkon, joissa transkriptiotekijät, signaalimuunta- ja muita säätelymolekyyleja [7]. Jälleenrakennetaan ja analysoimalla tällainen säätelyverkkoja on siis monimutkainen mutta tärkeä haaste puuttumaan.

Various algoritmeja olemassa päätellä sääntelyn verkkoja ekspressiotietojen [8], [9], [10]. Yksi tehokkaimmista menetelmistä, erityisesti eukaryoottiorganismeja, oletetaan modulaarinen rakenne taustalla sääntelyverkon, jossa ryhmä koekspressoi geenien säätelee yhteisiä sääntelyviranomaisten (tunnetaan myös sääntelyn ohjelma) [10]. Sääntely Ohjelma käyttää ekspressiotasot joukko sääntelyviranomaisten ennustaa ehto riippuva keskimääräinen ilmentymä koekspressoi geenejä. Siten moduulit koostuvat klustereita koekspressoitiin geenejä ja niihin liittyviä sääntelyviranomaisten. Säätelijänä voi liittyä useampi kuin yksi moduuli, ensemble muodostaa moduulin verkkoon. Olemme viime aikoina kehitetty uusi algoritmi, joka ulottuu alkuperäisen moduulin verkosto käsite Segal ja työtoverit [10] käyttämällä todennäköisyyspohjaista optimoinnilla, joiden avulla priorisointi tilastollisesti merkittävin klustereita koekspressoi geenejä ja niiden ehdokas sääntelyviranomaiset [11], [12]. Suurin etu tässä algoritmi on, että se purkaa edustavampi Guldinin kaltaisia ​​ratkaisuja kokonaisuus mahdollista tilastollisten mallien, jotta vältetään optimaalinen ratkaisuja. Kokeilemalla sitä eri biologisia aineistoja, olemme osoittaneet, että tämä lähestymistapa tuottaa enemmän johdonmukaisia ​​moduuleja, ja että sääntelyviranomaiset ovat jatkuvasti valittu moduulin useammin tukevat ulkoiset tietolähteet [11], [12].

tässä tutkimuksessa olemme mukautettu meidän moduuli verkko algoritmi ottaa syötteenä heterogeeninen aineisto sekä miRNA ja lähetti-RNA (mRNA) ilmentyminen tiedot mitattava samalla näytteistä. Useita miRNA osoitetaan korkean Tilanne ehdokas säätimiä useita moduuleja yhdessä tunnettujen transkriptiotekijöiden tai signaalimuuntajia. Yksityiskohtainen analyysi kolmesta moduulista, joissa miRNA valitaan korkean pisteytys sääntelyviranomaisten osoittaa, että tämä tehtävä on erittäin johdonmukainen moduulin toiminta ja tukevat myös erilaisten ulkoisten tietolähteitä. Olemme myös validoitu yksi niistä moduuleista kokeellisesti, mikä osoittaa, että yli-ilmentyminen tai inhibition miRNA osoitettu säätelijänä muuttuu merkittävästi ekspressiota valikoima moduulin geenien, mikä vahvistaa päättelyn algoritmin. Nämä tulokset tukevat moduuli verkko johtopäätöksen vankan ja käyttökelpoinen tapa saada tarkempaa tietoa siitä, miRNA toiminto.

Tulokset

päättely mikroRNA moduulin verkkoa ekspressiotietojen

LeMoNe algoritmi alkaen ilmaisu data matriisi ja luettelo ehdokkaan sääntelyviranomaisten tuottaa moduuli verkosto, joka koostuu moduulien koekspressoi geenejä ja niihin liittyviä sääntelyviranomaisten. Algoritmi myös kokosi ehdot (sarakkeet) kunkin lajin koekspressoi geenejä, luoden kunnossa klustereita. Luettelo sääntelyviranomaisten tietylle moduuli tilataan mukaan yksittäisten pisteet. Tämä tilanne vain otetaan huomioon ero ilmaus regulaattorin sekä eri eri olosuhteissa klustereita, eikä niiden itseisarvo. Näin voimme samanaikaisesti arvioida ja vertailla mRNA ja miRNA ehdokas sääntelyviranomaisten, käyttäen ekspressiotasoja kunkin luokan sääntelyviranomaisten. Syötteenä algoritmimme käytimme aineisto koostuu ekspressiotietojen mitattiin 89 kasvain ja normaali kudosnäytteistä (edustaa 11 kasvain luokat) sekä 11833 RNA: iden ja 124 miRNA [13]. Toisin kuin aikaisemmat yritykset [14], [15], [16], meidän lähestymistapamme integroimiseksi miRNA verkossa ei perustu miRNA tavoite ennustus, tai sekoitus kohde ennustaminen ja ilmaisun tietoja, mutta perustuu yksinomaan ekspressiotietojen. Algoritmi tuotti joukon 76 tiukasti koekspressoi geeniklustereina vastaa yhteensä 2987 geenejä. Laskimme GO rikastamiseen kaikkien moduulien [17] ja löysi yhteensä 44 klustereita on ainakin yksi GO luokan rikastunut (p 0,05), yhteensä 589 rikastettua luokkiin (täydellinen lista moduuleista ja niiden GO luokat on saatavana taulukko S2). Varattaessa sääntelyviranomaisten, olemme koonneet listan 1841 ehdokasta sääntelyviranomaisten perustuu niiden GO merkintä (joko transkriptiotekijöiden tai signaalimuuntajia), sekä luettelon 124 miRNA. Luovutuksen jälkeen sääntelyviranomaisten otimme tiukat raja vastaa top 2% merkittävin ennustettu sääntelyn yhteisvaikutuksia (kuva 1), saadaan lopulliset 294 ainutlaatuisia sääntelyviranomaisten (täydellinen lista moduulin geenien ja sääntelyviranomaisten on saatavana taulukko S1). Tässä asetettu kymmenen miRNA valittiin sääntelyviranomaisten yhteensä seitsemän moduulia (taulukko 1). Sen arvioimiseksi pätevyyttä ja merkitys päätelty moduulin verkko, me täällä esittämään yksityiskohtaisen analyysin kolme moduulia, jossa korostetaan tyypilliset ominaisuudet miRNA-välitteisen sääntelyn moduuleja. Kyseisiä moduuleja valittiin niiden sisäisten edun toiminnallinen yhtenäisyys ja suuri määrä kirjallisuusviitteistä keskustella heidän otaksuttu toiminto.

histogrammit esittävät jakelua satunnaistettiin (vihreä) ja tosi (keltainen) sääntelyviranomaisten pistemäärät moduuli verkko. Nuoli että satunnainen sääntelyviranomaisten edustaa Maksimipisteet satunnaistetusti sääntelyviranomaisten kanssa arvo sulkeissa. Nuoli tosi sääntelyviranomaisten edustaa raja pisteet arvo, jossa raaka-arvon sulkeissa.

MiR-133 ja miR-145 osoitetaan säätelijöinä sileän lihaksen actomyosin moduuli

module 29 on pieni moduuli, joka koostuu neljästä geenistä ja viisi osoitettu sääntelyviranomaisten (kuva 2a). GO yliedustettuina luokkaa Tämän moduulin liittyvät sileän lihaksen kehittämiseen ja actomyosin rakenne (kuvio 2a ja taulukko S2). MYH11 koodaa sileän lihaksen myosiinin raskasketjun perheenjäsen. ACTG2 on gamma 2 aktiinin proteiinia esiintyy enteerinen kudoksissa. Kaksi muuta geeniä moduulin (MYLK ja CNN1) tunnetaan hyvin säätelijöitä aktiini-myosiinin vuorovaikutusta. MYLK on myosiinikevytketjun kinaasi, oma kalsiumista riippuvaisen kinaasin joka fosforyloi tietyn sivuston sääntelyn kevytketjun myosiinin, parantaa sen toimintaa. MYLK on läsnä kaikissa aikuisen kudoksiin suurimpien määrien löytyy sileän lihaskudoksen [18]. CNN1 (calponin) on kalsiumia sitova proteiini, joka estää ATP toiminnan myosiinin sileän lihaksen. Top säädin (PPP1R12B) valittiin tähän moduuli on myosiinifosfataasin alayksikköä. Myosiinin fosfataasi on myös tunnettu ydin säätelijänä actomyosin reitin, estämällä myosiinin aktiivisuus [18]. Toinen paljon pisteitä ehdokas säädin on miRNA, miR-133, kun taas kolmas säädin on TGF-beeta stimuloi klooni-22 jäsen 1 (TSC22D1) geeni, joka koodaa Leusiinivetoketjudomeenin proteiini, jäsen TGF-beeta1-reitin joka on mukana transkription säätelyyn. Viimeiset sääntelyviranomaiset ovat ANGPTL2, joka on endoteelikasvutekijä, ja toinen miRNA, miR-145.

Geenien ilmentyminen arvot on värikoodattu, vaihtelee tummansininen (matala ilmentymisen tasoa) kirkkaan keltainen (korkea ekspressiotasot) . Kussakin kuvassa, pylväät edustavat eri näytettä. Värikoodatut alareunassa kaavion edustaa kudosalkuperää (katso legenda), kun taas harmaat neliöt alapuolella osoittaa, onko näytteessä kudos oli normaali (vaaleanharmaa) tai kasvain (tummanharmaa). Ehdokas sääntelyviranomaiset tilataan pienentämällä pistemäärä (ylhäältä alas). Näytteet on ryhmitelty lehtiä homogeeninen ilmaisun arvojen mukaan hierarkkisia puita merkitty päällekkäin kuvion. Oranssi laatikoita oikealla kuvion osoittavat yliedustettuna GO luokat (p≤0.05).

Kaksi miRNA valittu säätimet Tämän moduulin osoittavat selvästi tiukasti korreloi positiivisesti ekspressiokuviota moduulin kanssa geenien ( kuva 2a). Koska useimmat miRNA on tunnettu siitä, sikäli kuin alipaineensäätöventtiileillä geenin ilmentymisen, tämä viittaa siihen epäsuora asetuksen välillä miRNA ja moduulin 29 geenit. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat joitakin todennäköisiä kandidaattigeenejä, joka voisi toimia väli- sääntelyviranomaisten välillä miRNA ja moduulin 29 geenit. MiR-133, valitaan toiseksi paras sääntelijä Tämän moduulin (kuva 2a), on äskettäin osoitettu olevan keskeinen säädin luustolihasten kehitykseen ja sydänlihaksen liikakasvu [19], [20]. Näissä tutkimuksissa, miR-133: n on osoitettu suoraan säädellä SRF transkriptiotekijä. SRF on tunnustettu keskeinen tekijä normaalin solun tukirangan ja supistuvien solujen toimintaa ja kaikki moduulin 29 geenit (

MYH11

,

CNN1

,

ACTG2

,

MYLK

) tiedetään olevan kohdistu suoraa SRF [21]. Nuo kirjallisuuden tulokset tukevat hypoteesia epäsuoran sääntelyn välinen yhteys miR-133a ja moduuli 29 geenien kautta SRF. Useimmat tutkimukset SRF toimintaa on tähän asti tunnettu tämä tekijä transkriptioaktivaattorina [21], mutta jotkut tulokset viittaavat myös siihen, että SRF saattaa toimia transkription repressori sen tavoitteiden geenien [22], [23], [24]. SRF välittämä geenin tukahduttaminen ei ole selvä, mutta se saattaa liittyä rekrytointi SRF transkription äänenvaimentimien [23], [24]. Jos oletamme, että SRF on tukahduttaa transkriptio moduulin 29 geenien, sitten osa sääntelyä miR-133 – SRF – moduuli 29 geenit voivat selittää positiivisen geeniekspressiota korrelaatio, joka havaitaan kuviossa 2a. Toinen miRNA valittu säätelijänä, miR-145 oli hiljattain osoitettu olevan tärkeä säädin sileälihassolujen kohtalo [25]. Tässä tutkimuksessa [25] osoittaa myös, että miR-145 aktivoi yhden suoran tavoitteet, mutta myocardin (Myocd), joka on transkriptiotekijä hyvin tiedetään aktivoivan sileän lihaksen geenin ilmentymisen vuorovaikutuksessa SRF [26]. Näin meillä on myös sääntelyn ketju miR-145 – Myocd – moduuli 29 geenejä, jotka voivat selittää ekspressiokuvion havaittu kuvassa 2a. Kumpikaan SRF eikä Myocd määrittyvät sääntelyviranomaisten tai ryhmitelty yhteen muiden moduulin 29 geenejä. Valitettavasti myocardin geeni ei ollut läsnä mikrosiruissa käytetään tuottamaan aineistoja [13]. Profiilia SRF transkriptiotekijän näyttää korreloivan huonosti ilmentymisen moduulin 29 geenien meidän aineisto (Tiedoston S1), miksi tämä geeni ei valita säätelijänä. Useat syyt voivat selittää, miksi profiili on eriävät, kuten translaation jälkeiset modifikaatiot tai se, että miRNA toimittava transkription jälkeisellä tasolla, mahdollisesti estää sääntelyn vaikutus voidaan havaita (by tukahduttaa käännös).

MiR -142s annetaan säätelijöinä immuunivasteen moduulin

moduuli 18 koostuu kuudesta geenistä (kuvio 2b), joista viisi koodaavat immunoglobuliineja, joka vastaa joko raskaan ketjun (IGHG4, IGHA2, IGHA1) tai kevyen ketjun (IGKV1-5, IGLV3-21), kun taas IGLL1 on korvike kevyt ketju, joka on kriittinen osa esi-B-solureseptorin kompleksin. Ei ole yllättävää, löysimme GO luokka immuunivastetta yliedustettuna Tämän moduulin (kuva 2b ja taulukko S2). Kaikki moduulin geenit tiedetään enimmäkseen ilmaistaan ​​kehittämisessä ja kypsien B-solujen, paljastaen yhtenäinen moduuli [27]. Yhdeksän korkea pisteytys sääntelyviranomaisten valittiin tässä moduulissa. Top säädin on homeobox geeni, HOXC5. HMGA1 geeni valitaan toiseksi paras sääntelijä Tämän moduulin. Suuren liikkuvuuden ryhmä proteiineja (HMGA) säätelevät erilaisia ​​geenien muuttamalla DNA konformaatio niiden kohdegeenien. HMGA1 tiedetään co-transkription aktivoimiseksi B-soluissa ja on tärkeää, että B-solujen kehittämiseen [28]. Kolmas ja neljäs ehdokas sääntelyviranomaiset ovat kahden miRNA jalostettu samasta esiaste, miR-142-5p ja miR-142-3p. HLA-DRB1 geeni kuuluu HLA luokka II beta ketjun paralogues. On tunnettua keskeinen rooli immuunijärjestelmässä esittämällä johdetuilla peptideillä solunulkoisia proteiineja, [29]. CCL5- on kemotaktinen sytokiini aktiivisesti rekrytoimaan valkosolujen tulehduskohtiin [30]. AXL on reseptori tyrosiinikinaasin, joka on muuttamassa fibroblastien ja hematopoieettisten solujen, ja on mukana mesenkymaalisten kehittämiseen [31]. CXCL14 on pieni sytokiini kuuluvat CXC kemokiiniperhe. Tämä geeni on kemotaktinen monosyyteille ja voivat aktivoida näiden solujen läsnä ollessa tulehdusvälittäjäaineen [32]. CXCL14 ilmentyminen vähenee tai poissa useimpien syöpäsolujen [33]. Tämä moduuli on todennäköisesti liittyy immuunivaste laukaisee eri kasvaimen todetaan. Tällainen jatkuva pro-kasvaimen immuunivasteita tiedetään vahvistavan ensisijaisen kasvaimen kehittymisen ja maligni kehittyminen.

MiR-142s on ilmentyy hematopoieettisissa kudoksissa ja niiden ilmentymistä säädellään aikana hematopoieesia, viitaten rooliin immuunijärjestelmän solujen erilaistumista [34 ]. Transkriptiotekijän TCF12 on ennustettu kohteena miR-142-3p [35]. Aikaisemmassa tutkimuksessa, joka on yhdistetty annoksen tekijöistä E2A, E2-2 ja TCF12 osoitettiin vaaditaan normaalia B-solujen kehittymisessä. Tarkemmin sanottuna, TCF12 on tärkeää sukupolven normaali määrä pro-B-solujen [36]. Koska moduuli 18 geenit ilmentyvät kehitettäessä B-solujen säätelyssä TCF12 by miR-142-3p voi olla tärkeää tässä prosessissa. Lisäksi löysimme konservoituneet sitovat motiivit TCF12 useimmille moduulin 18 geenejä (Tiedoston S1), mikä osoittaa, että tämä transkriptiotekijä voisi olla tärkeitä niiden sääntelyä. Kuten moduulin 29 ja SRF, ilmaisu profiili TCF12 on erittäin poikkeavat ilmentymisen profiilit moduulin 18 geenien, miksi tämä geeni ei ole valittu moduuli geenin tai säädin (tuloksia ei ole esitetty).

asennuspalveli- 200a on keskeinen säätelijä moduulin mukana epiteelin homeostaasin

moduuli 25 koostuu yhdeksästä geenien (kuvio 2c). SCNN1A (tunnetaan myös nimellä ENaC) on alayksikön alfa on amiloridi herkkien epiteelin natrium- kanava, ilmaistuna monissa epiteelikudoksissa [37]. PRSS8 (prostasiinia) on trypsinogeeni, joka säätelee aktiivisuus epiteelisolujen natrium- kanavan [38]. FDXY3 on pieni membraaniproteiini, joka on erittäin transkriboidaan kudoksiin, kuten kohtuun, vatsan ja paksusuolen, ja se voi toimia Na /K-kanavan säädin [39]. TACSTD1, kasvaimeen liittyvää kalsium- signaalin anturin 1, toimii kalsium-riippumaton soluadheesiomolekyyli [40]. Muita geenejä kuten ATAD4 tai TMEM63A ovat transmembraaninen proteiinien toimintaa ei tunneta. RAB25 on pieni GTP: tä sitova proteiini. RAB proteiinit ovat osallistuneet säätelyyn rakkula kaupan [41]. Moduuli Top säädin on miR-200a. Mitä tulee muihin säätölaitteet, PPP1R1B on fosfoproteiini säännelty dopamiinin ja cAMP, ja on inhibiittori Proteiinifosfataasiin 1. Sen lisäksi tunnettu rooli keskushermostossa, se on erittäin ilmaistaan ​​eri epiteelikudosten, jossa se voisi osansa epiteelin signalointi ja kasvaimen kehittymisen [42]. GPR30 on transmembraaninen G-proteiiniin kytketty estrogeenireseptorin [43], kun taas PTGER3 on G-proteiiniin kytkeytynyt prostaglandiini E2-reseptorin, joka on mukana erilaisissa fysiologisissa prosesseissa, ja sen osoitettiin vaikuttavan solunsisäisen pitoisuuksia Ca ++ ja cAMP [43]. ZNF157 on sinkkisormen proteiinin toimintaa ei tunneta, kun taas GNB3 ja GNG5 ovat G-proteiinit alayksiköt osallistuvat signaalinvälitykseen. Vuodesta toimintoja näiden geenien, voimme päätellä, että suurin osa moduulin 25 geenit ja sääntelyviranomaiset todennäköisesti mukana epiteelin homeostaasiin, vaikka emme löytäneet mitään erityistä GO luokka rikastettu Tämän moduulin. On myös syytä huomata, että useat näistä geeneistä liittyy kasvaimen etenemistä [40], [41], [44].

MiR-200a, joka valittiin paras ehdokas säätimen moduuli 25, on jäsenenä miRNA perheen viisi läheistä sukua miRNA (miR-200a miR-200b, miR-200c, miR-141 ja miR-429). Viimeaikaiset julkaisut osoittavat epiteelin-erityinen ilmaisu miR-200a ja miR-200B [45], [46]. Olemme suunnitelleet sarjan kokeita vahvistaa roolia miR-200a säätelijänä geenien moduulissa 25. MiR-200a tuotiin ihmisen de erilaistunut epiteelin rintasyöpä MDA-MB-231, tiedetään ilmentävät poikkeavasti alhainen miR-200a. Ilmaisu kuuden geenin (

RAB25

,

IRF6, SCNN1A, PRSS8, ATAD4

,

TACSTD1

) yhdeksästä kuuluvien moduuli 25 seurattiin käyttäen RT-qPCR ( kuvio 3). Poikkeuksetta kuutta seurataan geenit osoittavat selvän ylössäätöä kun eksogeeninen ilmentymisen miR-200a (kuvio 3a). Päinvastainen kokeilu, estyminen joidenkin jäsenten miR-200 perhe (miR-200a, b, c) MDA-MB-231-soluihin käyttäen antagomirs, johti merkittävien alas-säätely neljä viidestä testattujen geenien, (

SCNN1A

ei ole merkittävästi alassäädetty,

ATAD4

ei ilmenny normaaleissa olosuhteissa tässä solulinjassa) (kuva 3b). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että miR-200A on keskeinen säätelijä moduulin 25, ja mitä todennäköisimmin muiden jäsenten miR-200 perhe.

(a) Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (RT qPCR) analyysi ilmaus moduuli 25 geenit

RAB25

,

IRF6, SCNN1A

,

PRSS8

,

ATAD4 ja TACSTD1

ja kun yli-ilmentyminen miR-200a MDA- MD-231-solut (keskiarvo ± keskihajonta). Y-akseli edustaa suhteellista mRNA: n ekspression arvo. miR-1 käytettiin kontrollina (Ctrl), koska se ei tiedetä kohdistamista valvotaan geenien (b) RT qPCR analyysi suhteellisen lauseke geenien

RAB25

,

IRF6

,

SCNN1A

,

PRSS8

ja

TACSTD1

MDA-MB-231-solujen soluttautunut miR-200a, b, c antagomirs. Y-akseli edustaa suhteellista mRNA: n ekspression arvo (keskiarvo ± keskihajonta). miR-1 käytettiin kontrollina (Ctrl) (c) RT qPCR analyysi suhteellisten ekspressiotasojen moduulin 25 geenien

RAB25, IRF6, SCNN1A, PRSS8, ATAD4, TACSTD1, TMEM63A

ja

FXYD3

MDA-MB-231-solujen, joissa

ZEB1

on tippuu alas. Ensimmäinen barplot (musta) osoittaa tehokas tukahduttaminen

ZEB1

tasoilla transfektoitaessa kanssa

ZEB1

erityisiä siRNA. Par = vanhempien soluviljelmässä, Mock = mock transfektion si-ZEB1 = transfektion kanssa ZEB1 erityisiä siRNA.

Tässä moduulissa havaitsemme jälleen selkeä positiivinen korrelaatio kuvio välillä miR-200a ja moduuli geenien ilmentymistä, mikä viittaa siihen, epäsuora sääntely piirin välillä miR-200a ja moduuli 25-geenien (kuvio 2c ja kuvio 3a ja 3b). Viimeaikaiset kokeellinen työ osoitti, että miR-200 perheenjäsenet suoraan kohdistaa transkriptiofaktoreiden ZEB1 ja ZEB2 [47], [48], [49]. Nämä transkriptiotekijät tunnetaan suuri transkriptiorepresso- epiteelisolujen erilaistumisen orchestrating epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) [50]. EMT on prosessi, joka ajaa epiteelisolujen polarisoidun fenotyyppi erittäin liikkuvia, ei polarisoitu mesenkymaalisten fenotyyppi, ja tiedetään esiintyvän epiteelikasvaimissa synnyttää erittäin pahanlaatuisten syöpäsolujen. ZEB transkriptiotekijät ovat olleet liittyvät toiminnallisesti jäsenille miR-200 perheen kautta kaksinkertainen negatiivinen kierre, mikä edistää EMT ja syövän invaasio [47], [51], [52]. Löysimme konservoituneet ZEB sidosmotiivien usean moduulin 25 geenejä (Tiedoston S1), mikä viittaa siihen, että ZEB tekijät voisivat olla väli- sääntelyviranomaisten välillä miR-200 ja moduulin 25 geenit. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me alas-säännelty ZEB1 transkriptiotekijä MDA-MD-231-soluissa tietyllä siRNA valvoessaan ilmaus kahdeksan moduulin 25 geenejä (kuvio 3c). Kaikki geenit osoittavat vahvaa ylössäätöä kuvio, lukuun ottamatta geenin RAB25 (kuvio 3c). Nämä tulokset osoittavat, että ZEB1 tekijä on olennaista sääntelyn moduulin 25 geenejä. Yhdessä meidän kokeellisia tuloksia (kuva 3) viittaavat vahvasti siihen, että kyseessä on sääntely ketjun välillä miR-200 ja moduulin 25 geenien kautta ZEB1 transkriptiotekijä (kuva 4). Koska molemmat miR-200 ja ZEB1 tärkeitä rooleja EMT [47], [48], [49], [51], [52] oletamme, että moduuli 25 tukahduttaminen voi edistää pahanlaatuinen EMT prosessi syöpäsoluissa.

MiR-200-geenien tukahduttaa ZEB tekijöitä, jotka puolestaan ​​tukahduttaa ilmaisun moduulin 25 geenejä. Vaaleankeltainen osoittaa geenien määrätty valvojat, vaaleanvihreä osoittaa moduulin geenejä, kun valo oranssi osoittaa geenejä ole määritetty sääntelijöinä, vaan tukevat kirjallisuudesta (epäsuora asetus). Tämä sääntelymallin tukevat positiivisen korrelaation ilmaisun kuviot välillä mir-200a ja moduuli 25 geenit.

Keskustelu

miRNA ovat nousseet aivan äskettäin uusi ja tärkeä kerroksen sääntelyä. Useimmat tutkimukset ovat tähän mennessä keskittyneet niiden tunnistamisen ja havaitsemiseen tavoitteensa. Useat kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että ainakin osa niistä on merkittävä osa erilaisissa kehitys- ja solureiteillä. Integrointi miRNA sääntelyyn verkoissa on tästä syystä erittäin tärkeää ja olisi parasta tehdä ottaen huomioon muuntyyppisten sääntelyyn molekyylejä. Toistaiseksi muutamat tutkimukset ovat ehdottaneet laskennallinen strategiaa päätellä miRNA välittämää moduuli verkkojen [14], [15], [16]. Nämä perustuivat pääasiassa miRNA tavoite ennustus, tai yhdistelmä kohde ennustaminen ja ilme datan. Olemme hakeneet vankan ja puolueeton moduuli verkko päättely algoritmi on syöpään liittyvien ekspressiotietojen joukko molempien mRNA: iden ja miRNA. Meidän lähestymistapa, miRNA pidettiin ehdokkaana sääntelyviranomaiset yhdessä muuntyyppisten sääntelyviranomaisten, kuten transkriptiotekijät ja signaalimuuntajia. Senkin jälkeen soveltamalla tiukkoja sulku, useita miRNA jäivät niin paljon pisteitä, tilastollisesti merkitsevä ehdokas säätimet eri moduuleja. Kautta perusteellisen analyysin niistä kolme moduulia, osoitimme, että osoitetaan tietty miRNA sääntelijöinä tukee eri ulkoisista lähteistä ja on toiminnallisesti yhtenäinen. Lisäksi voisimme osoittaa kokeellisesti, että miRNA, määritetty parhaana säädin, on todellakin avainsäätelijänä moduulin geenien ilmentymisen. Määrä miRNA antanut tässä tutkimuksessa (10) voi tuntua melko vaatimaton, mutta tämä määrä on arvioitava suhteessa kokonaismäärään miRNA jolle ilmentyminen mitattiin näytteistä (124). Suhde osoitetaan kohden kokonaismäärä miRNA on yhtä suuri kuin 8%, kun taas sama suhde arvo on 15% ensemble transkriptiotekijöiden sekä signaalin muuntimet (284/1841). Kaksi suhde arvot ovat vertailukelpoisia ja näin ollen voimme kohtuudella odottaa suurempi määrä miRNA määritetään, kun lisääntynyt kattavuus miRNome ilmaisun maisema on saatavilla.

Kuitenkin aivan kuten muilla vastaavilla menetelmillä, hoito on oltava otetaan tulkinnassa johdettua sääntelymallin. Erityisesti korrelaatio geenien ilmentymisen ei välttämättä aina tarkoita suoraa vuorovaikutusta. Todellakin, kolmen moduulia olemme tutkineet yksityiskohtaisesti, olemme löytäneet välillistä sääntelyä polku välillä säädin ja moduuli geenit. Lisäksi mikään näistä välillisten säätelygeenien määrättiin algoritmilla asetuksessa ohjelmaan tai jopa ryhmittyneet yhdessä moduulin geenejä. Kuten voisimme osoittaa moduulin 29 ja SRF transkriptiotekijä, syy on, koska nämä epäsuora sääntelyviranomaisten mentymisprofiili eroavat merkittävästi moduulin geenejä. Eri syistä voi selittää tätä poikkeama, esimerkiksi sääntely saattaa tapahtua transkription jälkeisellä tasolla, tai saattaa olla seurausta translaation jälkeisiä modifikaatioita. Epäsuora sääntelyviranomaisten voisi tietysti mutkistaa tulosten tulkintaa, mutta ne on odotettavissa, erityisesti korkeampi eukaryoottiorganismeja jossa säätelyverkkojen odotetaan olevan monimutkaisempi [53].

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että uusi oivalluksia voidaan saada vankka moduuli verkosto analyysi miRNA ja mRNA: n ilmentymisen tiedot ja tukevat näkemystä, että ainakin jotkut miRNA on keskeinen sääntelyn rooli tärkeä solun prosesseissa. Lähestymistapamme on myös se etu, että suora näköyhteys posttranskriptionaalisella muutoksia integroimalla miRNA, jossa mRNA ilmaisu ei välttämättä yksin riitä paljastaa olemassaolon sääntelyn vuorovaikutusta. Kaikki kolme moduulia, jolle teimme yksityiskohtaisen analyysin tässä tutkimuksessa ovat kukin yhtenäisen joukon geenejä, mukana samassa prosessissa ja toiminta. Lisäksi kytkemällä miRNA johdonmukaista moduulit, uskomme, että tämä lähestymistapa voi auttaa selvittämään miRNA funktio ja voi tehokkaasti ajaa kokeellista työtä kohti tunnistaminen keskeisten sääntelyn komponenttien eri prosesseissa. Nopean leviämisen eri tekniikoita mitata suurella tarkkuudella ekspressiotasot satoja miRNA, ja samanaikainen saatavuus mRNA ekspressiotietojen, se on erittäin houkutteleva soveltaa laskennallisia strategioita jollainen kuvaamme tässä laajentaa tietämystä maailmanlaajuisissa säätelyverkkojen.

Materiaalit ja menetelmät

Expression aineistoja

Käytimme normalisoitu syöpä ekspressiotietojen asetettu aiemmin julkaistu [13]. Suoritimme Lisäsuodatusta toimiin laadun parantamiseksi lähtötietojen asetettu. Probesets ilman tunnettua Ensembl geenin tunnisteet hylättiin, samoin kuin miRNA sekvenssit, joita ei selityksin kuin ihmisen miRNA viimeisimmässä miRBase julkaisu [3]. Lopulliset tiedot alusta sisälsi 11833 geenejä ja 124 miRNA, jolle ilmentyminen mitattiin yli 89 näytettä, jotka kattavat 11 eri kasvain luokissa.

Module verkko päättely

Käytimme LeMoNe algoritmia päätellä moduulin verkko [11], [12], [54]. Ensimmäisessä vaiheessa, algoritmi etsii osio geenien klustereita koekspressoi geenejä. Toisessa vaiheessa, algoritmi määrittelee sääntelyn ohjelma (joukko säätelygeenien) kunkin klusterin.