Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä molekyylejä, jotka säätelevät geeniekspressiota posttranscriptionally. Aikaisemmassa tutkimuksessa, tunnistimme miR-96 voimistuvan eturauhassyövässä yksilöitä verrattuna normaaliin viereiseen kudokseen ja olla riippumaton markkeri biokemiallisten uusiutumisen Monimuuttuja ennustemalli. Siksi olemme tutkineet toiminnallista roolia miR-96 eturauhasessa karsinogeneesissä. LNCaP ja DU145 eturauhassyövän solut transfektoitiin väliaikaisesti miR-96 esiasteiden ja fenotyyppisiä muutoksia, jotka analysoitiin. MIR-96 lisäsi proliferaatiota ja heikentynyt indusoiman apoptoosin camptothecine näissä soluissa. In silico tavoite ennusteanalyysiyksiköihin tunnistettu FOXO1 mahdollisia pro-apoptoottisten miR-96 kohde. miR-96 kykeni sitoutumaan sekä siteet sivustoja FOXO1 3 ’UTR on lusiferaasireportterigeenin määritys. Yli-ilmentymisen miR-96 LNCaP-soluissa, pienensi FOXO1 ilme. Yliekspressio FOXO1 indusoi voimakkaan apoptoottisen fenotyyppi, joka oli osittain pelasti -parin miR-96. RT-qPCR ja immunohistokemia 69 eturauhassyövän yksilöitä paljasti downregulation FOXO1 ja käänteinen korrelaatio miR-96 ja FOXO1 proteiinin ilmentymiseen. Lopuksi osoitamme, että miR-96 voi säädellä apoptoosin eturauhassyöpä, estämällä FOXO1 transkriptiotekijä.

Citation: Fendler A, Jung M, Stephan C, Erbersdobler A, Jung K, Yousef GM (2013 ) antiapoptoottisten toiminta miR-96 Eturauhassyöpä mukaan esto FOXO1. PLoS ONE 8 (11): e80807. doi: 10,1371 /journal.pone.0080807

Editor: Kin Mang Lau, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 21. 2013 Hyväksytty 16. lokakuuta 2013 Julkaistu: 19 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Fendler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ AF ja KJ rahoittivat Foundation for Urologiset Research, Berliinin ja Sonnenfeld Stiftung, Berlin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat uuden luokan pienet ei-koodaavat RNA: t ja säädellä geeniekspressiota posttranscriptionally estämällä translaation mutta myös hajoamista vastaavan mRNA: n. Noin 30% kaikista mRNA: iden ennustetaan voidaan kohdistaa miRNA [1]. Riippuen niiden tavoitteista, miRNA toimivat tumorsupressors tai onkogeenien ohjaamalla merkittäviä väyliä Karsinogeneesin myös solujen jakautumista, apoptoosia ja soluliikkuvuus [2].

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin pahanlaatuinen syöpä miehillä ja toiseksi yleisin syy syövän länsimaissa [3]. Mekanismit PCa tumorigeneesin vielä ole täysin selvitetty ja on puute diagnostisia ja prognostisia markkereita.

vapautuminen miRNA PCA on osoitettu lukuisissa tutkimuksissa [4-9]. Heidän ilmaisun korreloi kasvaimen vaiheen ja aggressiivisuus [10]. Olemme aikaisemmin tunnistettu miR-96 joukko vapautettiin miRNA PCA. Sen ilmentyminen korreloi Gleason pisteet ja se on riippumaton markkeri biokemiallisten uusiutumisen [6].

silico tavoite ennustus käyttämällä miRecords tunnistettu FOXO1 mm otaksutuksi kohteena miR-96. FOXO1 on jäsenenä forkhead -transkriptiotekijät. Orlistaatin tumorsuppressive toiminnon kautta säädellään transkription tärkeitä säätelijöitä solukierron ja apoptoosin [11,12]. FOXO1 transkriptionaalinen aktiivisuus säädellään kautta PI3K /AKT-reitin [13]. Rintasyövän ja kohdun limakalvon syöpiä, samoin kuin Hodgkinin lymfooman FOXO1 on aiemmin osoitettu säätelevän miR-96 [14-16].

Oletimme, että miR-96 voi olla myös kasvaimia synnyttävää toimintoa PCA. Todistaakseen tämän oletuksen, me (a) tutki vaikutusta miR-96 ilme olennainen solun ominaisuudet, kuten proliferaatiota, apoptoosin ja maahanmuuttoa PCa solulinjoissa, (b) suoritetaan silico tavoite ennustus, (c) tutkitulla sitoutumisen asennuspalveli- 96 ennustettu sitoutumiskohdat FOXO1 3 ’UTR ja myöhemmät muutokset mRNA ja proteiini tasolla, (d) tutkitaan pelastamista FOXO1 indusoiman apoptoosin miR-96 ja (e) korreloidaan miR-96-ilmentymisen FOXO1 transkriptio ja proteiini ilmentyminen ihmisen PCa ja vastaaviin normaaleihin viereiseen kudokseen. Osoitamme, että miR-96 inhiboi kamptotesiini-indusoitua apoptoosia ja säätelee FOXO1 ilmentymistä sitoutumalla 3’-UTR. PCA yksilöitä, tunnistimme negatiivinen korrelaatio FOXO1 proteiinin tasot ja miR-96 ilme.

Materiaalit ja menetelmät

Kudokset ja solulinjoissa

Pariksi normaalia ja pahanlaatuista kudosnäytteiden 69 PCa potilaista kerättiin sen jälkeen eturauhasen vuosien 2001 ja 2005 Charité yliopistollisessa sairaalassa. Kunkin potilaan kliinis-patologisten kerättiin (taulukko 1). Tutkimuksessa kutsutaan ”MikroRNA niin ja ennustavia allekirjoitukset urologiset kasvaimet” (EA1 /153/07) hyväksyi eettiset hallitus Charité yliopistollisen sairaalan ja kirjallinen suostumus on saatu.

Potilaat RT-qPCR (N = 69) B Potilaat TMA-analyysi (N = 64)

N (%)

N (%)

ikä, vuotta Median6363Range50-7246-74Pre leikkauksen PSA

a, ng /mlMedian7.076.24Range1.71-41.92.00-26.0T vaihe

apT2a2 (3) 1 (2) pT2b11 (16) 3 (5) pT2c30 (43) 39 (61) pT3a20 (29) 18 (28) pT3b6 (9) 3 (5) N-vaiheessa

apN0 /pNx67 (97) pN12 (3) M vaihe

AM0 /Mx69 (100) M10 (0) Kirurginen marginsR041 (60) R127 (39) R x1 (1) Gleason score53 (4) 1 (2) 620 (29) 24 (37) 728 (41 ) 27 (42) 811 (16) 8 (12) 97 (10) 3 (5) 100 (0) 1 (2) seuranta, monthMedian50.0035.63Range1-930-86Biochemical toistuminen

a10 ( 15) 12 (19) Taulukko 1. Kasvaimen ominaisuuksista ja kliinis-patologisten tietojen potilasaineistoihin.

aBiochemical uusiutumisen määriteltiin ensimmäisen postoperatiivisen PSA yli 0,1 ng /ml, joka on vahvistettu vähintään 1 myöhemmin kasvaa arvo ( pysyviä PSA lisäys) saavuttamisen jälkeen havaita PSA postoperatively, määritellään määritysrajan alle 0,04 ng /ml.RT-qPCR, reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR, TMA, kudos microarray, PSA, eturauhasen antigeeni, T vaiheessa kasvain vaiheessa N vaiheessa imusolmukemetastaaseja vaiheessa M vaiheessa metastaasit vaiheessa. CSV Lataa CSV

Kudokset jäädytettiin välittömästi leikkauksen jälkeen ja näytteitä kuten aikaisemmin on kuvattu [6]. Lyhyesti, alueet kasvaimen ja normaalin kudoksen tunnistettiin haematoxilin-eosiinivärjäykset patologi ja booli-koepala, jossa kudoksen-mikro array neula. Vain ytimet, joilla on vähintään 90% tuumorin sisältöä pidettiin lisäanalyysiä.

LNCaP, DU-145, PC3 ja 22rv-1-soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen, Carlsbad, CA,) täydentää 10% vasikan sikiön seerumia ja penisilliiniä /streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO2-ilmakehässä. BPH-1-soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä, jota oli täydennetty 20% vasikan sikiön seerumia, 20 ng /ml DHT, 5 ug /ml transferriiniä, 5 ng /ul natriumseleniittiä ja 5 ng /ul insuliinia. Solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) tai saksalaiseen mikro-organismien ja solujen Cultures (DSMZ). Solulinjat ajoittain seurataan mykoplasmisia saastumisen RT-qPCR mukaan van Kuppeveld et ai [17]. Lisäksi identiteetti eturauhassyöpäsolujen varmennettiin saksalainen Eturauhassyöpä Consortium.

Tissue Microarray

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut kudoksessa 64 potilasta, rakentamiseen kudoksen microarray kuten aiemmin on kuvattu [18]. Haematoxilin-eosiini värjäys suoritettiin tunnistaa pahanlaatuinen ja hyvänlaatuisia alueilla. Kiinnostuksen olivat punch-koepala kanssa 1,5 mm kudos microarray neulan ja siirretään vastaanottajan lohko. Jokainen kasvain edusti yksi ydin. Normaali kudos paksusuoli-, haima-, munuais- ja 2 prostates ja sidekudos käytettiin kontrollina.

RNA: n eristämistä

Kokonais-RNA tuore kudosten ja solujen viljelmistä eristettiin käyttäen miRNeasy Minikit (Qiagen , Hilden, Saksa) mukaan valmistajan ohjeen kuten aikaisemmin on kuvattu yksityiskohtaisesti [6].

uuttamalla RNA: n soluviljelmä, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille lopulliseen pitoisuuteen 3 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja transfektoitiin kuten on kuvattu alla. 24 tunnin kuluttua, 1 x 10

6 solut kerättiin Qiazol (Qiagen).

RNA tuotto ja A260 /280-suhde oli seurattiin Nano Drop ND-100 spektrometri (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) ja RNA Integrity Numbers (RIN) on arvioitu 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara , CA). Vain RNA näytteitä RIN 6 sisällytettiin analyyseihin.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

mRNA-tasot analysoitiin RT-qPCR. Solujen RNA käänteiskopioitiin käyttäen Omniscript Käänteistranskriptaasilla ja Oligo-dT-alukkeita (Qiagen) mukaisesti valmistajan suosituksia. Reaktiot suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui, käyttäen 1 ug kokonais-RNA: ta. Reaktioita inkuboitiin Vaihe yksi lämpösyklilaitetta (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kvantifiointi FOXO1 solulinjoista suoritettiin käyttäen 2 x Fast SYBRgreen Mastermix (Applied Biosystems) käyttäen 1 ui cDNA: ta 20 ul: n kokonaistilavuudessa. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1. Alukkeet suunniteltiin tuottamaan amplikoni, joka kattaa ainakin 1 intronin. Spesifisyys monistamisen varmistettiin alukkeen puhallus ja sulamisen käyrä analyysit.

mRNA kudosnäytteistä käänteiskopioitiin käyttäen Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Saksa) 1 ug: RNA: ta 20 ul: n kokonaistilavuudessa . Kvantifiointi FOXO1 suoritettiin käyttämällä UPL anturi # 11 (Roche) ja Universal Probes Master Mastermix (Roche) 10 ul: n kokonaistilavuudessa.

miRNA havaittiin RT-qPCR käyttäen TaqMan miRNA Pitoisuus kuten aikaisemmin on kuvattu [6 ].

Kaikki näytteet ajettiin kolmena kappaleena ja keskiarvo ja SD laskettiin. FOXO1 ilmentyminen normalisoitiin TUBA1B [19], kun taas miR-96 normalisoitiin miR-130b [6]. Standard käyrät mitattiin kunkin geenin korjaamaan tehokkuus (FOXO1: E = 1,95; TUBA1B: E = 1,96, miR-96: E = 1,83, miR-130b: E = 1,83). Normalisointi tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [6].

rakentaminen lusiferaasin vektorit

kohdegeenin 3 ’UTR-sekvenssit kloonattiin pMiR raportin vektori (Ambion Austin TX, USA). Target sekvenssit FOXO1 3 ’UTR monistettiin BPH1 ksi käyttäen AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja geenispesifisiä alukkeita (taulukko S1), kloonattiin pCR 2.1-TOPO-vektoriin (Invitrogen) ja monistettiin TOP10 kemiallisesti kompetentteja soluja (Invitrogen). Plasmidi-DNA positiivisista klooneista uutettiin QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) ja lähetetään sekvensointi käyttäen M13 uni (-21) ja M13-rev (-29) alukkeet (Eurofinsille MWG GmbH, Ebersberg, Saksa). Restriktiohyd- positiivisia pCR2.1 vektoreita ja pMiR raportin vektorit tehtiin Sacl ja Spel (New England Biolabs, Ipswich, MA). Rajoitettu insertit ja pMiR raportti vektori ligoitiin käyttäen 1 U T4 DNA-ligaasia (Invitrogen) ja monistettiin kemiallisesti toimivaltainen DH5a-soluja (Invitrogen). Positiiviset kloonit tunnistetaan pesäke-PCR: llä. Plasmidi-DNA eristettiin käyttäen QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).

transfektio PCa solulinjojen ennalta miRNA miRNA-inhibiittorit ja plasmidi-DNA:

LNCaP ja DU145-solut transfektoitiin pre- miRNA esiasteita, anti-miRNA-inhibiittorit tai pre-miR-NC # 1 (Applied Biosystems) lopullisessa konsentraatiossa 10 nM tai 500 ng FOXO1 täyspitkä klooni (Origene, Rockville MD, USA) käyttäen SIPORT NeoFX transfektion aine (Applied Biosystems) . Kutakin määritystä varten, joka on ei transfektio ohjaus tehtiin pitkin. Sillä lusiferaasireportterigeenianalyysissä solut transfektoitiin lisäksi 500 ng pMiR raportti vektorin ja β-galaktosidaasi kontrollivektorilla.

Luciferase reportterigeenimäärityksessä

LNCaP-soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin ja ympättiin 6 kuoppaiset levyille lopulliseen tiheyteen 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut irrotettiin, jossa on kaavin, ja kokonaisproteiinin uutettiin 80 ui lyysipuskuria (Applied Biosystems). Lusiferaasi ja β-galaktosidaasin aktiivisuus uutteet havaittiin käyttäen Dual-Light yhdistetyn Reporter Gene Assay System (Applied Biosystems) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lusiferaasiekspressiota normalisoidaan P-galaktosidaasin ekspression. Jokainen reaktio suoritettiin kahtena kappaleena, ja tulokset on esitetty keskiarvona kolmesta itsenäisestä määrityksissä.

Western Blot

uuttamalla koko proteiinin soluviljelmästä, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille on lopullinen pitoisuus 3 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja transfektoitiin kuten edellä on kuvattu. Proteiini uutettiin 72 tunnin kuluttua 100 ui NENT- puskuria (20 mM TRIS-HCI, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2% NP40, 0,2% SDS, pH 7,5) tai RIPA-puskuria (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5 % natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 50 mM tris-emästä, 100 uM PMSF, 1 ug /ml aprotiniinia, 10 ug /ml soijapavun trypsiini-inhibiittori, 2 mM EDTA). Kokonaisproteiinia erotettiin 10% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin 0,45 um polyvinyylifluoridista kalvon. Membran blokattiin 2% rasvatonta maitoa ja koetettiin seuraavilla vasta-aineilla: kanin FOXO1 pAb, hiiren anti-ACTB mAB (Sigma Aldrich, Munich, Saksa), kanin anti-Akt pAb, kanin anti-Pakt Pab (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA), ja vuohen anti-kani-HRP-konjugoitu tai kanin anti-hiiri-HRP-konjugoidun sekundaarisen Ab: n (DAKO, Hampuri, Saksa). Kalvoja värjättiin ECL (Pierce, Bonn, Saksa) tai edistyneen ECL liuosta (GE Healthcare, Munchen, Saksa) 5 minuuttia ja kehitetään fluori-S multiimager (BioRad, Munich, Saksa). Määrittämään suhteellinen proteiinipitoisuus, bändi intensiteetti laskettiin ImageJ 1.43r (https://rsb.info.nih.gov/ij) ja normalisoidaan p-aktiini.

Proliferaatiomääritys ja analyysi solusyklin

leviämisen ennalta miR-96 transfektoitiin LNCaP-soluja arvioitiin metabolisen konversion 3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi bromid (MTT) (Sigma Aldrich). Soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin ja ympättiin 96-kuoppaisille levyille lopulliseen pitoisuuteen 6 x 10

3 solua kuoppaa kohti ja transfektoitiin kuten edellä on kuvattu. Solujen annettiin levätä 24 tuntia, ja sittemmin seerumia. Viljelmiä inkuboitiin 5 mg /ml MTT: ssa 4 tuntia, ja hajotettiin 10% SDS: ää 0,01 M HCl: ää. Lysaatit inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli ja absorbanssi formatsaanin mitattiin 550 nm: ssä. Jokainen reaktio suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tulokset on esitetty keskiarvona kolmesta riippumattomasta määrityksissä. Solusyklin analyysi-soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin ja ympättiin 6-kuoppaisille levyille lopulliseen pitoisuuteen 1,5 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja transfektoitiin kuten edellä on kuvattu. Solujen annettiin levätä 24 tuntia, ja olivat sen jälkeen ilman seerumia 24 tunnin ajan. Solut värjättiin 20 ug /ml propidiumjodidia täydennetty 200 ug /ml RNaasi 0,1% Triton X-100, ja analysoitiin käyttäen FacsScan virtaussytometriä ja CellQuest Software (BD Biosciences, Mississauga, ON, Kanada). Jokainen näyte mitattiin kahtena kappaleena ja tulokset esitetään keskiarvona kolmesta itsenäisestä määrityksiä.

haavanparantumis- määritys

aasit migrative phenotyp DU-145-solujen upon miR-96 transfektio suoritimme haavan paranemista määrityksessä. Soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin, ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja transfektoitiin kuten edellä on kuvattu. Solujen annettiin kasvaa konfluenssiin ja yksikerroksinen oli naarmuuntunut 100 ul: n pipetin kärjellä. Paluumuuttoa solujen haava arvioitiin elämä solukuvauksessa 24 tuntia alle seerumistarvaatio. Prosenttiosuus avoin alue mitattiin ohjelmiston TScratch ohjelmisto [20] määrätyin ajankohtina (0,5,10,15,20 h). Kaikki arvot normalisoitiin prosenttiosuuden avoimen alue 0 h. Kaksi satunnaisesti valituilla alueilla kunkin tyhjästä analysoitiin. Tiedot esitetään keskiarvona kolmesta itsenäisestä määrityksissä.

apoptoosimäärityksessä

LNCaP ja DU145-soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin ja ympättiin 6-kuoppaisille levyille lopulliseen konsentraatioon 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja transfektoitiin kuten edellä on kuvattu. Apoptoosi indusoitiin 10 uM kamptotesiinin (CPT) (Sigma Aldrich) seerumivapaassa 24 tuntia. Solut värjättiin anneksiini V-FITC: tä (Invitrogen) ja propidiumjodidia (PI) (Invitrogen) Viljelmät analysoitiin käyttäen FacsScan virtaussytometriä ja CellQuest Software (BD Biosciences, Mississauga, ON, Kanada). Kukin näyte mitattiin kahtena kappaleena, ja tulokset on esitetty keskiarvona kolmesta itsenäisestä määrityksissä.

immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin 2 um dioja kudoksen microarray kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, kudosta parafiini ksyloliin ja antigeenejä demasked on pressur liesi. Objektilasit koetettiin kanin anti-FOXO1 mAb (Cell Signaling Technologies), biotinyloitua linkkeri-Ab ja streptavidiini-konjugoitua sekundaarista Ab (DAKO) ja värjättiin Fast Red haluttuun intensiteettiä. Tumat vastavärjättiin haemalaun. Objektilasit peitettiin käyttämällä Aquatex kiinnitysväliaine (Merck Kgh, Darmstadt, Saksa). Värjäys FOXO1 analysoitiin kasvaimen rauhaset ja normaali vieruskudos kullekin potilaalle tarvittaessa. Koska yleinen värjäys FOXO1 oli vain heikko, se teki läsnäolevaksi (1) tai poissa (0) vain.

In silico tavoite tutkimus

silico tavoite etsiä miR-96 tavoitteita oli suoritettiin käyttäen miRecords (https://mirecords.biolead.org/). Käytimme kriteeri että otaksuttu tavoite oli havaita TargetScan, Miranda PicTar ja kaksi muuta ennustaminen algoritmeja. Sijainti miR-96 sitoutumiskohdat 3 ’UTR: FOXO1 analysoitiin käyttäen TargetScan 5.1.

Tilastolliset analyysit

Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism versio 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA), MedCalc versio 10.3.2 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgia) tai SPSS 19,0 (IBM, Somers, NY). Studentin t-testi, yksisuuntainen tai kaksisuuntainen ANOVA, Kolmogorov-Smirnof normaaliuden testi, Wilcoxonin testi, McNemar testi, Kaplan-Meier-analyysi ja Coxin suhteellinen vaara regressio suoritettiin. Kaikki testit suoritettiin kaksisuuntainen ja P-arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

toiminnallinen luonnehdinta miR-96

Olemme aiemmin raportoitu, että asennuspalveli- 96 ylössäädellään ja ennustaa biokemiallisia uusiutumisen eturauhassyövän ad siis hypoteesi onkogeenisessä funktio miR-96 eturauhasessa. Korkeampi ilmentyminen miR-96 ilmentyminen eturauhassyövässä solulinjoja verrattuna hyvänlaatuinen eturauhasen solulinja BPH-1 (kuvio S1A) lisäksi on tultu siihen kasvaimia synnyttävää toimintaa. Perustaa toiminnallista roolia miR-96, LNCaP ja DU145-solut transfektoitiin synteettisellä miR-96 prekursorimolekyylit tai antisense-estäjä. Ensin arvioitiin rooli miR-96 soluproliferaatioon. LNCaP ja DU145-soluja transfektoitiin miR-96 osoitti suurempaa lisääntymisnopeus verrattuna transfektion kontrolleihin (kuvio 1A + B). Tämä pro-proliferatiivinen vaikutus kumottiin osittain transfektoimalla sen antisense-estäjä.

LNCaP ja DU145-solut transfektoitiin 10 nM esi-miR-96, anti-miR-96, pre-miR-NC # 1 tai yhdistelmä ennalta miR-96 ja anti-miR-96. Vaikutus (A) LNCaP ja (B) DU145 soluproliferaatioon alle seerumistarvaatio mitattiin MTT: llä yli kolme päivää. Kaikki tiedot normalisoitiin proliferaatioon kontrolliviljelmien päivänä 1 ja esitetään keskiarvo (± SD) kolmesta riippumattomasta määrityksissä. * P 0,05, kaksisuuntainen ANOVA. Solusyklin siirtyminen mitattiin PI värjäytymistä transfektoiduissa (C) LNCaP ja (D) DU145 soluja. Solut seerumia yhden päivän kuluttua transfektion vielä 24 tuntia ja sen jälkeen kiinnitettiin ja värjättiin. Musta, G1-vaiheessa; vaaleanharmaa, S-vaihe; tummanharmaa, G2 /M-vaiheessa. Data näytetään keskimääräisenä kolmen riippumattoman määrityksissä. Apoptoosin CPT-käsiteltyjen (E) LNCaP ja (F) DU145 soluja. 24 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin 10 uM CPT 24 tuntia. Solut värjättiin anneksiini V-FITC ja PI. Osa alussa (mustat palkit) ja myöhäiset (valkoiset pylväät) apoptoottisten solujen mitattiin virtaussytometrialla. Data näytetään keskimääräisenä (+ SD) kolmesta riippumattomasta määrityksissä. * P 0,05; Bonferroni testin jälkeen (P 0,001, kaksisuuntainen ANOVA).

Seuraavaksi käsitteli kysymystä siitä tehostetun leviämisen saattaa johtua vapauttaa solusyklikontrollin tai vähentynyt apoptoosin. Määrittämään vaikutuksen miR-96 solusyklin sääntelyn määrä LNCaP ja DU145 soluja G1, S tai G2 /M vaiheessa arvioitiin virtaussytometrialla upon transfektoimalla miR-96 seerumin puutteessa solujen. Valtaosa LNCaP olivat G1 alle seerumistarvaatio (71,0-76,7%) ja pienempinä osina olivat S-vaiheessa (4,8-5,3%) tai G2 /M (18,6-23,7%, kuvio 1C). Ei ollut merkittäviä eroja (Toisen Way ANOVA; P = 0,12) solusyklin siirtymävaiheessa transfektoiduissa soluissa miR-96 esiasteiden ja inhibiittorit verrattuna kontrolleihin. DU145 olivat vaihtamassa nopeammin läpi solusyklin, jolloin suurempi määrä soluja G2 /M (30,1-34,4%) ja S-vaiheen (19,2-22,7%) ja vähemmän soluja G1 (43,9-50,7, kuvio 1 D). Mitään merkittäviä eroja solusyklin siirtymävaiheessa havaittiin transfektoitaessa siten vahvistavat havainnot LNCaP (toinen tapa ANOVA, p = 0,2).

Koska tehostetun lisääntymistä ei voida selittää lisääntynyt solusyklin siirtyminen, tutkimme vaikutus miR-96 transfektion apoptoosiin. LNCaP ja DU145-solut transfektoitiin ennalta miR-96, miR-96-estäjien tai sekoitetun ohjaus ja apoptoosia indusoitiin 10 uM kamptotesiinin (CPT). CPT aiheuttaman apoptoosin LNCaP kontrolliviljelmien 13,2% varhain apoptoottisia soluja ja 5,6% myöhään apoptoottisia soluja ja DU145 soluissa (24,2% aikaisin ja 5,9% myöhään apoptoottisia soluja) (kuvio 1 E + F). Ohimenevä transfektio miR-96 esiasteiden vähensi osa varhaisen apoptoottisten ja myöhäisten apoptoottisten solujen 28% (LNCaP) ja 25% (DU145) (toinen tapa ANOVA, P 0,001). Spesifisyys havaittu vaikutus miR-96 vahvistettiin miR-21, joka toimi positiivisena kontrollina [22], ja osoittivat samanlaisen apoptoosin estämiseen ja miR-16, joka toimi negatiivisena kontrollina ja ei vaikuttanut apoptoosia syöpäsolujen.

Tutkimme lisäksi migraation DU-145-solujen upon transfektoimalla miR-96. DU-145 osoitti migrative fenotyypin ja pystyivät remigrate 60% alueen alkuperäisen haavan 20 h (kuvio S2). Transfektion miR-96 esiaste tai miR-96-estäjä ei ollut vaikutusta solujen vaeltamiseen verrattuna transfektio salattu ohjaus tai ei-transfek- ohjaus (Toisen Way ANOVA; P = 0,71).

tunnistetiedot asennuspalveli- 96 kohdegeenien

tunnistaa säänneltyjen tavoitteita, mikä mahdollisesti selittää apoptoottisia vaikutuksia, suoritimme in silico kohde toimialalla miRecords ja pitää ennusteen voimassa vain, jos kohde tunnistettiin Miranda TargetScan ja PicTar, ja kaksi lisäksi Ennustusalgoritmien. Siten tunnistimme 209 tavoitteet miR-96 (taulukko S2). Joukko ennustettu kohdegeenien analysoitiin edelleen koskevat heidän geeni ontologian (GO) ehdot tunnistamiseksi apoptoosiin liittyviä geenejä. 21 ulos 209 ennustetun miR-96 tavoitteet oli apoptoosin liittyvän GO aikavälin osoitettu (taulukko S2). Tutkimme myös sitoutumiskohtien lukumäärä ja niiden evoluution suojelun TargetScan 5.1. ja suoritetaan kirjallisuudesta kohteiden tunnistamiseen, joiden tiedetään tumorsuppressive toiminto PCA. Yksi ennustettu tavoitteiden FOXO1 valittiin lisävalidointia koska sen tiedetään tumorsuppressive toiminto eturauhassyövässä. Korrelaatio miR-96 ja FOXO1 transkriptioekspressiokuvio LNCaP ja DU145 solujen näyttää käänteinen korrelaatio ilmaisun (kuva S1A + B). FOXO1 3 ’UTR satamat kaksi 8-mer miR-96 sitoutumiskohtien asemassa 264-270 ja asema 2138-2145. Vaikka ensimmäinen sitoutumiskohta on erittäin hyvin säilynyt, toinen miRNA sitoutumiskohtaan ei ole. Olemme rakennettu lusiferaasi-reportterit sisältävien 200-300 emäsparin sekvenssit sulkee ennakoi maalin sivustoja. Kotransfektio sekä FOXO1 3 ’UTR lusiferaasin toimittajat ennalta miR-96 LNCaP-solut osoittivat 40%: n vähennys lusiferaasiaktiivisuuden verrattuna transfektion ohjaus (Yksisuuntainen ANOVA, P 0,01), kun taas transfektio luki- 96 estäjän tai salattu ohjaus ei merkittävästi vaikuttanut lusiferaasiaktiivisuutta (kuvio 2A). Lisäämisen miR-96 antisense-sekvenssit julkaisi esto vain hieman. Vaikka toinen miR-96 sitoutumiskohta FOXO 3 ’UTR on vain osittain konservoitunut, samanlainen sitoutumisaktiivisuus 42%: n vähennys lusiferaasiaktiivisuuden (ANOVA, P 0,05) havaittiin verrattuna kontrolliin (kuvio 2B). Lisäksi on miR-96-antisense-sekvenssin osittain vähentynyt tätä vaikutusta, kun taas antisense-sekvenssin yksinään ei vaikuta lusiferaasi-aktiivisuutta. Salattu miRNA sekvenssi johti pieneen, mutta ei merkittävää estoa lusiferaasin aktiivisuuden.

LNCaP-solut transfektoitiin 10 nM esi-miR-96, anti-miR-96, pre-miR-NC # 1 tai yhdistelmä ennalta miR-96 ja anti-miR-96 sekä 500 ng pMiR raportti β-galaktosidaasi ohjaus plasmidia ja 500 ng pMiR raportti plasmidin FOXO1 3 ’UTR A) sitoutumiskohtaan 1 asemassa 264-270 ja B) sitovat site 2 asemassa 2138-2145. * P 0,05, ** P 0,01, Yksisuuntainen ANOVA ja Tukeyn monivertailu kokeen.

vähentäminen miR-96 kohdegeenin ilmentymistä in vitro

miRNA ehdotetaan pääasiassa estää proteiinin translaation, mutta jotkut miRNA on myös osoitettu johtavan ainakin osittaisen hajoamisen vastaavan mRNA: n [23]. Luoda tärkein mekanismi, jonka miR-96 estää FOXO1 PCA ja todistaa, että mekanistinen sitoutumisen miR-96 on 3-UTR voi johtaa vähentynyt ilmentyminen FOXO1, me transfektoitu LNCaP ja DU145 solujen miR-96 esiaste ja /tai estäjä. miR-96 tasolla molemmissa solulinjoissa oli 400-kertaa suurempi miR-96 transfektoituja soluja ja kotransfektoitiin soluissa verrattuna kontrolliviljelmiin (ANOVA, P 0,001; kuvio 3A + B). Vastaavasti, FOXO1 mRNA väheni enemmän kuin kaksi-kertaisesti miR-96 transfektoiduissa soluissa (ANOVA, P 0,01, kuvio 3C + D), kun taas transfektio miR-96-antisense-sekvenssin ja salattu miRNA ei ollut vaikutusta FOXO1 ekspressiotasot (kuvio 3C + D). Lisäksi alentamista FOXO1 transkriptin, havaitsimme 1,6-kertaiseksi ja 2,6-kertainen väheneminen FOXO1 proteiinin LNCaP ja DU145-soluja, kun ektooppinen yliekspressio miR-96 esiaste, kun taas proteiinin tasot eivät muuttuneet merkittävästi soluissa, jotka oli transfektoitu miR -96 estäjän tai salattu ohjaus (kuvio 3E + F, kuva S3A + B). Yhdessä nämä tiedot tukevat hypoteesia, että miR-96 inhiboi FOXO1 ilmentymistä.

Eturauhassyöpä-solut transfektoitiin 10 nM pre-miR-96, anti-miR-96, pre-miR-NC # 1 tai yhdistelmä ennalta miR-96 ja anti-miR-96. miR-96 ilmentyminen (A) LNCaP ja (B) DU145-solut ja FOXO1 ilmentymisen (C) LNCaP ja (D) DU145-solut. Data näytetään keskimääräisenä (+ SD) kolmesta riippumattomasta määrityksissä. ** P 0,01, *** P 0,001, yksisuuntainen ANOVA. FOXO1, AKT, ja Pakt proteiinin ilmentymistä (E) LNCaP ja (F) DU145 soluihin tehtiin näkyväksi western blottauksella. p-Actin käytettiin latauskontrollina.

FOXO1 toiminto suoraan säätelee fosforylaatio Akt kun ulkoinen kasvu signaaleja, jolloin translocalization tumasta. Voit tarkistaa, onko miR-96 yliekspressio muuttaa merkittävästi ylävirtaan Akt signalointi, arvioimme Akt ja fosforyloituu Akt ilmaisun miR-96 yliekspressoivia soluja. Kumpikaan Akt eikä fosforyloidun Akt tasot olivat merkitsevästi muuttunut heti transfektion miR-96 esiasteita tai inhibiittorit (kuvio 3E + F), jotka osoittavat, että aktiivisuus FOXO1 eivät vaikuttaneet muutokset Akt ilmentymistä tai aktiivisuutta.

tukevat edelleen hypoteesia, että miR-96 valvonnan FOXO1 eturauhassyövässä ja siten suojaa soluja apoptoosin, transfektoimme LNCaP ja DU145-soluja, joissa on täyspitkä FOXO1 cDNA. Ektooppinen ilmentyminen FOXO1 seurasi voimakas ylösajon FOXO1 kuin validoitu RT-PCR: llä ja westernblotting sekä LNCaP ja DU145-soluja (kuvio 4A-D). Vahvan värjäytymisen intensiteetti FOXO1 transfektoiduissa soluissa, FOXO1 valvonta soluissa ei vielä näy blot ja vasta tuli näkyviin jälkeen enää käsikirjassa kertaa. Kotransfektio kanssa miR-96 vähensi FOXO1-mRNA-tasojen 2.5- ja 1.7-kertaisesti LNCaP ja DU145 soluja (Yksisuuntainen ANOVA, p 0,001), kun taas proteiinin tasot alenivat 2.8- ja 2.1- kertaiseksi (kuvio 4C + D, Kuvio S3C + D).

LNCaP ja DU145-solut transfektoitiin 500 ng FOXO1 täyspitkän kloonin tai tyhjän vektorin, 10 nM esi-miR-96 tai pre-miR-NC # 1. FOXO1 ilmentymistä (A) LNCaP ja (B) DU145 soluja. Data näytetään keskimääräisenä (+ SD) kolmesta riippumattomasta määrityksissä. *** P 0,001, yksisuuntainen ANOVA. FOXO1 proteiinin ilmentymistä (C) LNCaP ja (D) DU145-solut visualisoitiin Western blot. p-Actin käytettiin latauskontrollina. Apoptoosin CPT-käsiteltyjen (E) LNCaP ja (H) DU145 soluja. 24 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin 10 uM CPT 24 tuntia. Solut värjättiin anneksiini V-FITC ja PI. Osa alussa (mustat palkit) ja myöhäiset (valkoiset pylväät) apoptoottisten solujen mitattiin virtaussytometrialla. Data näytetään keskimääräisenä (+ SD) kolmesta riippumattomasta määrityksissä. ns, P 0,05, * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, kaksisuuntainen ANOVA, Bonferronin post testi). Solusyklin siirtyminen mitattiin PI värjäytymistä transfektoiduissa (F) LNCaP ja (I) DU145 soluja. Solut seerumia yhden päivän kuluttua transfektion vielä 24 tuntia ja sen jälkeen kiinnitettiin ja värjättiin. Musta, G1-vaiheessa; vaaleanharmaa, S-vaihe; tummanharmaa, G2 /M-vaiheessa. Data näytetään keskimääräisenä kolmen riippumattoman määrityksissä. *** P 0,001, yksisuuntainen ANOVA. Analyysi subG1 huippu (G) LNCaP ja (J) DU145 soluja. Data näytetään keskimääräisenä kolmen riippumattoman määrityksissä. *** P 0,001, yksisuuntainen ANOVA.

Seuraavassa vaiheessa, arvioimme, onko FOXO1 on vastakkaisen rooli miR-96 syöpäsolujen ja onko vaikutus voidaan pelastaa keratransfektiolla kanssa miR-96. FOXO1 indusoituu voimakkaasti apoptoosia sekä solulinjoissa (Kaksisuuntainen ANOVA, p 0,001, kuvio 4E + H). Hoidon CPT oli vain lievä ylimääräinen vaikutus soluihin. Samanaikainen yli-ilmentymisen miR-96 osittain pelasti FOXO1 aiheuttaman apoptoosin hoitamattomien sekä CPT-käsiteltyjä soluja, vaikka vaikutus oli pieni ja ei ollut merkittävä kaikissa käsittelyissä (kuvio 4E + H).

Lisääntyminen myös voimakkaasti vähennetty FOXO1 transfektoiduissa LNCaP ja DU145 soluja, mutta miR-96 ei merkittävästi kääntää päinvastaiseksi (Kuva S4A + B).