Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Claudins ovat tiiviin liitoksen proteiineja, jotka ovat osallisina tiiviin liitoksen muodostumista ja toimintaa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että klaudiini-7 on usein yliaktiivista epiteelin munasarjasyöpä (EOC) yhdessä klaudiini-3 ja klaudiini-4. Täällä me tutkimme yksityiskohtaisesti ilmaisua malleja klaudiini-7, sekä sen mahdolliset toiminnot EOC.

Menetelmät /Principal Havainnot

Yhteensä 95 munasarjojen kudosnäytteistä (7 normaali munasarjojen kudokset, 65 vakavasta karsinoomat, 11 kirkas solukarsinoomat, 8 endomet- karsinoomat ja 4 mucinous karsinoomia) tutkittiin klaudiini-7 ilme. Reaaliajassa RT-PCR-analyysi, geeni klaudiini-7,

CLDN7

, havaittiin voimistuvan kaikki kasvain kudosnäytteitä tutkittu. Vastaavasti, immunohistokemiallinen analyysi ja western-blottauksella osoitti, että klaudiini-7-proteiinia oli merkittävästi yli-ilmentyy suurimmassa osassa EOCs. Sirna välittämää knockdovvn klaudiini-7 munasarjasyöpäsoluja johtanut merkittäviin muutoksiin geenien ilmentyminen mitattuna mikrosiruja ja vahvistanut RT-PCR ja immunoblottauksella. Analyysit geenien differentiaalisesti ilmaisi paljasti, että geenit muuttunut vastauksena klaudiini-7 Knockdown liittyi reittejä sekaantunut eri molekyyli- ja solutason toimintoihin, kuten solusykliä, solujen kasvun ja lisääntymisen, solukuoleman, kehitys, ja solujen liikkumista. Toimintonumerojen kokeissa in vitro, huomasimme, että muuttoliikkeen ja invaasion muutettiin soluissa, joissa

CLDN7

oli tippuu alas tai yli-ilmentyy. Mielenkiintoista, klaudiini-7 ilmentyminen liittyi nettolisäystä hyökkäyksen, mutta myös laskua muuttoliikettä.

Päätelmä /merkitys

Työmme osoittaa, että klaudiini-7 on merkittävästi yliaktiivista EOC ja että se voi olla toiminnallisesti mukana munasarjasyöpäpotilailla hyökkäystä.

CLDN7

voivat siten muodostaa mahdollisia merkkiaine munasarjasyövän havaitsemiseksi ja tavoite hoitoa.

Citation: Dahiya N, Becker KG, Wood, WH III, Zhang Y, Morin PJ (2011) Claudin -7 usein yli-ilmennetään Munasarjasyöpä ja Edistää Invasion. PLoS ONE 6 (7): e22119. doi: 10,1371 /journal.pone.0022119

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 15 joulukuuta 2010 Hyväksytty: 16 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 15 heinäkuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuki kokonaan Intramural tutkimusohjelma National Institutes of Health, National Institute on Aging. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on kuudenneksi yleisin syy syöpäkuolemista naisten maailmanlaajuisesti [1]. Munasarjasyöpä on tyypillisesti diagnosoitu kehittyneitä sairauden hoitovaihtoehtojen ovat rajalliset ja ennusteen erittäin huono. Viimeisten vuosien aikana nähneet useita edistysaskeleita ymmärrystämme molekyylitason mekanismeja munasarjasyövän etenemisessä [2], [3], vaikka suuri osa yksityiskohdat ovat tiedossa. Niistä geenit, joiden ekspressio on usein muutettu munasarjasyöpä ovat ne, jotka koodaavat klaudiini perheen tiiviin liitoksen proteiinien [4] – [7]. Claudins muodostavat selkärangan TJs ja ovat siksi välttämättömiä epiteelin kompartmentalisaatio ja valvontaan liuenneen aineen siirto poikki yksisolukerrokset [8] – [10].

syöpä, normaali TJ toiminta ja rakenne ovat tyypillisesti muuttunut eikä TJs itse usein puretaan [11], [12]. Viimeaikaiset geenien ilmentyminen profilointi tutkimuksissa on raportoitu muuttuneen ilmentymisen määrä TJ proteiinien useita syöpiä, mukaan lukien useita klaudiini proteiinit [4], [6]. Esimerkiksi klaudiini-3 ja klaudiini-4 ovat koholla munasarja-, eturauhas-, kohtu- ja rintasyöpiä, kun taas klaudiini-1 pienenee rinta- ja eturauhasen syöpiä.

Claudin-7 on löydetty vaimentua useissa syövissä mukaan lukien ruokatorven [13], [14], pään ja kaulan [15] ja eturauhassyövän [16]. Menetys klaudiini-7 korreloi erilaistamattomuuden useissa eri syövissä [16] – [19]. Rintasyövässä klaudiini-7 ilmentyminen havaittiin myös vähennettävä ja korreloi käänteisesti kasvaimen ja etäpesäkkeitä [17], [18], vaikka on näyttöä siitä, että klaudiini-7 voi tulla uudelleen ilmaistaan ​​etäpesäkkeitä [20], [21]. Sen vuoksi on ehdotettu, että menetys klaudiini-7 liittyy menetys solun tarttumista ja lisätä etäpesäkkeiden [14], [17]. Kuitenkin klaudiini-7 on myös osoitettu olevan koholla useita syöpiä. Esimerkiksi, klaudiini-7 tiedetään olevan koholla munasarjasyöpä [22] – [27] sekä muiden maligniteettien [28], [29]. Syynä eri malleja havaittujen muutosten syöpätyypin ei tällä hetkellä tiedetä, mutta se voi liittyä tarkka roolit klaudiini-7 eri pahanlaatuisia kasvaimia, joten selvittäminen näistä rooleista tärkeä tavoite.

Tässä raportissa , ensin arvioida klaudiini-7 ekspressiotasot munasarjojen kudosnäytteistä ja solulinjoissa käyttämällä western blotting, RT-PCR, ja immunohistokemia ja huomaavat klaudiini-7 ilmentyy laajalti munasarjojen kasvaimia. Käyttäen mikrosiruja, huomaamme, että monet geenit ilmentyvät differentiaalisesti seuraavan

CLDN7

pudotus ja analyysi näiden geenien ehdotetaan useita reittejä, joiden kautta

CLDN7

voivat toimia munasarjasyöpä. Osoitamme, että

CLDN7

knockdown johtaa lasku fosfo-Erk ja kasvu Raf-1 tasot, mikä viittaa mahdolliseen koulutusjakson klaudiini-7 signalointi munasarjasyöpä. Lisäksi olemme huomanneet, että

CLDN7

ilmentyminen liittyy lisääntynyt invaasio, mutta väheni muuttoliikkeen useita solulinjoissa tarjoaa toiminnallisen linkin

CLDN7

ilmaisun munasarjasyöpäpotilailla.

tulokset

CLDN7

transkriptio ja proteiini tasot ovat koholla munasarjasyövän kudoksissa

Viimeaikaiset työ osoittaa, että sen lisäksi, että

CLDN3

ja

CLDN4

geenit,

CLDN7

usein koholla munasarjasyöpä [22] – [26], [30]. Jotta voidaan selkeästi määrittää

CLDN7

ilmaisun muotoja munasarjasyöpä, microdissected munasarjakasvaimia eri alatyypeistä sekä solulinjat analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR.

CLDN7

mRNA havaittiin olevan erittäin säädelty kaikissa neljä suurta munasarjasyöpä alatyyppejä (eli vakavien, mucinous, kirkas solu, ja endomet-) verrattuna normaaliin munasarjojen kudoksiin (kuvio 1A). Tason yli-ilmentymisen vaihteli valtavasti ja sen havaittiin olevan missä tahansa 2-kertaiseksi 50000-kertainen. Todellakin, 2-kertainen nousu yli HOSE-B havaittiin 2 normaalin munasarjan valvonta taas 50000-kertainen yliekspressio nähtiin 3 serous munasarjasyövän kudoksiin.

CLDN7

jakautuu laajalle normaaleissa ihmisen kudoksissa ja sen transkripti havaittiin suhteellisen korkea munuaisissa, paksusuolessa, keuhkossa, ohutsuolessa, kiveksissä, istukka, sylkirauhasen, kilpirauhasen, lisämunuaisen, haiman, eturauhasen, maksan , vatsa, munasarjojen ja ihon (kuvio 1 B). Toisaalta, lihas, aivot, sydän, perna, kohtu, veren leukosyytit, luuytimen, sikiön aivojen, ja sikiön maksassa ilmaistuna alhaisempi

CLDN7

mRNA.

. Ilmoitettu munasarjakarsinooma alatyyppejä, testattiin

CLDN7

ilmentymisen RT-PCR: llä ja tasot on esitetty suhteessa HOSE-B-solujen (munasarjojen pinnan epiteelisolujen mukaisesti kuolemattomiksi E6 ja E7 [52]). B.

CLDN7

ilmentymistä normaaleissa kudoksissa. Seuraavat kudokset analysoitiin: 1, Lihas; 2, Brain; 3, sydän; 4, Munuainen; 5, Perna; 6, maksan; 7, Colon; 8, Lung; 9, ohutsuoli; 10, Vatsa; 11, Kives; 12, Istukka; 13, Syljen; 14, Kilpirauhasen; 15, lisämunuainen; 16, haima; 17, Kohtu; 18, Munasarja; 19, eturauhasen; 20, iho; 21, Plasma leukosyyteissä; 22, Bone Marrow; 23, sikiön aivot; 24, Fetaalimaksasolujen. Tasot näytetään suhteessa lihasten ja kudosten kanssa arvoja suurempia 4-kertainen on merkitty kuvaajassa. C. immunoblot-analyysi klaudiini-7 ilmentymistä 2 normaalissa munasarjakudoksessa (N1 ja N2), 7 vakavien (S1, S2, S3, S4, S5, S6, ja S7), joka on yksi selkeä solun (C1) ja yksi endomet- (E1 ) munasarjojen karsinoomat. Yhteensä 29 näytettä testattiin immunoblottauksella ja edustavia esimerkkejä esitetään. D. immunohistokemia of vakavasta munasarjakarsinoomissa. Valitut munasarjojen karsinoomat (S3, S4, S5, S6), ja normaali munasarjojen näyte (N) on esitetty. Munasarjasyöpä näytteet värjättiin klaudiini-7-vasta-ainetta (CI-7) on voimakas värjäytyminen verrattuna negatiivisiin kontrolleihin värjäystä puuttui primaarinen vasta-aine (-).

Tutkiakseen klaudiini-7-proteiinin tasot munasarjasyöpä , paneeli 29 ensisijaisen munasarjasyövän näytteitä sekä 4 normaali munasarjan kudoksissa tutkittiin immunoblottauksella (kuvio 1 C, taulukko S1). Claudin-7 puuttui kaikista normaalin munasarjan kudoksissa, mutta löydettiin korkealla /kohtalainen tasoja 66% (19/29) syöpä näytteitä. Claudin-7 havaittiin ilmaistiin vähäisinä määrinä 24% (7/29) tapauksista, ja ei ollut havaittavissa 10% (3/29).

immunohistokemia (IHC) vahvistivat, että klaudiini-7 ilmentyi suurina määrinä munasarjasyöpä (kuvio 1 D). IHC Tutkimus osoitti, että klaudiini-7 yliekspressio rajoitettiin syöpäsoluihin ja ei liity strooman. Lisäksi vaikka tietyt kasvaimet osoittivat merkittävää kalvon värjäytymistä (S3 ja S4), toiset oli vähentynyt värjäytymisen kalvon ja korkea sytoplasmista värjäytymistä.

CLDN7

on kohonnut munasarjasyövän solulinjoissa ja voidaan sijoittaa kalvon tai sytoplasmassa

jotta voitaisiin arvioida

CLDN7

ilmentyminen solulinjoissa, 7 solulinjoja arvioitiin RT-PCR: llä ja immunoblottauksella (kuvio 2A, B) .

CLDN7

transkripti ei havaittu ei-pahanlaatuinen pintaepiteelin runkoputken-B, mutta havaittiin kaikissa munasarjasyövän solulinjoissa, paitsi UCI101 ja OVCA432 (kuvio 2A). Samoin, klaudiini-7-proteiinia ei havaittu HOSE-B, mutta oli läsnä useimmissa munasarjasyövän solulinjoissa (mutta ei HEI ja UCI101) (kuvio 2B). Mielenkiintoista, HEY solut osoittivat korkean

CLDN7

mRNA, mutta vähän proteiinia tasolla, kun taas OVCA432 näytteillä hyvin alhainen

CLDN7

transkriptipitoisuuksissa, mutta korkea klaudiini-7-proteiinin ilmentymisen. Nämä tiedot osoittavat, että vaikka klaudiini-7 transkriptio säilytetään solulinjoissa, klaudiini-7-proteiinin tasoja voidaan säännellä transkription jälkeisen mekanismeja.

. Klaudiini-7 immunoblottauksella paljastaa ilmentymisen korkeita tasoja, on ilmoitettu munasarjasyövän solulinjoissa. B. RT-PCR-analyysi

CLDN7

mRNA solulinjoissa. C. immunofluoresenssi valittujen syöpäsolulinjojen osoittaa vahvaa klaudiini-7-ilmentymisen solun liitos BG-1, OVCA433, OVCA420 ja OVCA432, sekä pistemäinen sytoplasmista värjäytymistä BG-1 ja OVCA420. Klaudiini-7 havaittiin anti-klaudiini-7-vasta-aineen ja visualisoitiin sekundäärinen vasta-aine on konjugoitu Alexa fluor. Tumat soluista vasta- värjättiin DAPI. Kuvat yhdistettiin määrittämään oikean lokalisointi.

Käyttäen immunofluoresenssimenetelmällä, klaudiini-7 värjäys löydettiin lokalisoitu pääasiassa at solukalvon, jossa pistemäinen värjäytymistä sytoplasmassa munasarjasyövän solulinjoissa BG-1, OVCA420 ja OVCA433 (kuvio 2C). Vuonna OVCA432, myös havaittu solukalvojen värjäytymistä, mutta vähän ilmentymistä sytoplasmassa.

Geenien ilmentyminen muuttuu seuraavien

CLDN7

Knockdown munasarjan syöpäsolujen

Tutkitaan mahdollisia rooleja

CLDN7

munasarjasyövän, tutkimme geenien ilmentymisen muutoksia seuraaviin

CLDN7

knockdown. Nämä pudotus kokeet suoritettiin solulinjoissa OVCAR-2 ja OVCA420, jotka molemmat osoittavat kohtalaista endogeenisten tasojen klaudiini-7 ilmentymistä (kuvio 3A).

CLDN7

siRNA käsittely johti huomattavaan vähenemiseen klaudiini-7-proteiinin 72 tuntia transfektion (kuvio 3A) ja tällä kertaa pisteen valittiin mikrosiruanalyysillä. In OVCAR-2-solut, jotka muodostavat TJs viljelmässä,

CLDN7

pudotus johtaa vähenemiseen epiteelin vastus (TER, mitta TJ tiukkuus) ja samanaikainen läpäisevyyden lisääntyminen yli yksikerroksista (kuvio 3B). Tämä osoittaa, että

CLDN7

knockdown on toiminnallinen vaikutus TJ näissä soluissa. Vuonna OVCA420 soluissa, jotka eivät muodosta TJ kulttuurin, TER oli erittäin alhainen ja pysyi vaikuta

CLDN7

taintumisen (kuvio 3B). Tämän mukaisesti havainnon, läpäisevyys oli myös vaikuttanut

CLDN7

knockdown.

. Immunoblottianalyysi OVCAR-2 ja OVCA420 soluissa

CLDN7

Knockdown 72 tuntia. B. Vaikutukset

CLDN7

Knockdown TJ ja läpäisevyys. Epiteelin vastus (TER) mitattiin useilla aikapisteissä seuraavat

CLDN7

knockdown. Läpäisevyys mitattiin arvioimalla kykyä fluoreseiini-isotiosyanaatti-dekstraania (40 kDa) ylittää yksikerroksista. Fluoresenssimääritykset heijastavat yksikerroksisen läpäisevyys ja tulokset peilaavat TER mittauksia. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja tulokset esitetään keskiarvona +/- SEM Tähti (*) tarkoittaa p-arvo 0,05, ja kaksinkertainen tähdellä (**), p-arvo 0,01. C. hierarkinen ryhmittely analyysi geenien ilmentyminen seuraavien

CLDN7

Knockdown molemmissa solulinjoissa. Vihreä väri edustaa alassäätöä, kun taas punainen edustaa säätelyä ylöspäin. Yhteensä 20 klustereita geenien, joilla erilliset kuvioita havaittu.

Microarray-analyysiä käytettiin vaikutusten tutkiminen

CLDN7

pudotus geenien ilmentymisen sekä OVCAR-2 ja OVCA420 solu linjat. Klusterointi analyysi osoitti useita malleja muutoksista seuraavien

CLDN7

Knockdown ja nämä kuviot edustivat 20 eri klustereita geenejä tunnistaa valvomatta kuvio klustereiden avulla JMP-ohjelmiston (kuvio 3C).

CLDN7

oli ainoa geenin klusterin 3 ja odotetusti, oli erittäin vaimentua molemmissa solulinjoissa. Ja 1327-geenit ilmentyvät differentiaalisesti kaksi riviä (taulukko S2), 297 (200 voimistunut ja 97 vaimentua) on yhteinen OVCAR-2 ja OVCA420 (kuvio 4). Tämä edustaa 23% limityksellä kaikkien differentiaalisesti ilmentyvien geenien, luku paljon suurempi kuin sattumalta odotettua yksinään (p 0,001). In OVCAR-2, yhteensä 553 geenien ilmentyminen lisääntyy ja 415 olivat vaimentua ja OVCA420, 404 geenejä voimistunut ja 252 olivat vaimentua. Top 20 geenit säädellään ylöspäin ja alassäädetty kussakin solulinjassa (sekä molemmissa yhtä aikaa), luetellaan kuviossa 4.

Venn-kaavio, numerot punaisella edustavat geenejä sääteli ja numerot vihreä edustaa geenejä vaimentua. Top 20 geenejä kussakin luokassa on esitetty alla olevassa taulukossa Venn kaavio.

vahvistaa ja laajentaa microarray data, 15 geenejä, joita on huomattavasti muuttunut

CLDN7

knockdown vuonna toinen tai molemmat solulinjat, valittiin validointi RT-PCR-analyysi (kuvio 5). Vaikka kertainen ilmaisun näytti aliarvioida mikrosiruanalyysillä, reaaliaikainen PCR vahvisti trendejä kaikkien geenien testattu (kuvio 5A, B). Lisäksi, proteiini-tasot useita näistä geeneistä (

CA12

,

RRAS2

,

PRSS8

,

APOE

,

AGT

,

SPRR3

, ja

CLDN7

) testattiin eri aikapisteissä seuraavat

CLDN7

pudotus (kuvio 5C). Tulokset näistä kokeista olivat yhtäpitäviä havaitut muutokset RT-PCR: llä. Kaiken meidän tiedot osoittavat erinomaisen korrelaation muutokset havaitaan mikrosiruja ja vastaavan proteiinin ilmentymisen tasot.

. Kertamuutoksia eri osoitetusta geenien OVCA420 ja OVCAR-2 soluissa

CLDN7

knockdown. B. RT-PCR validointi geenien esitetty (A). C. immunoblottaus analyysi valituista ehdokkaista eri ajankohtina seuraavien

CLDN7

knockdown. GAPDH kontrolli otettiin mukaan vahvistamaan vastaavia lastaus kaikissa kaistoilla.

Pathway analyysi

Käyttämällä Ingenuity Pathway Analysis (IPA), olemme analysoineet reittejä ja mahdolliset toiminnot liittyvät geenin ilmentymisen muutoksia seuraavat

CLDN7

knockdown. Monet alkuun verkkojen tunnistettu mukana syövän, solujen kasvun ja lisääntymisen, mutta niitä ei selvästi konservoituneet solulinjoja (taulukko S3). Mielenkiintoista, ”integriini signalointi” löydettiin molemmissa solulinjoissa merkittävimpiä kanoninen väyliä tunnistetaan (taulukko S3). Top biologisiin toimintoihin sisältyi erilaisia ​​toimintoja kuten solujen kasvun ja solukuolemaa, ja mielenkiintoisesti, solujen liikkumista. Fysiologisten järjestelmien tunnistaa mukana hematologisten ja immuunivasteen, sekä sidekudoksen kehittämistä (taulukko S3). Gene ontologia analyysi muuttaa geenien merkitykselliset luokkiin, kuten ”rakenteellinen molekyyli toimintaa”, ”signaali anturin toiminta”, ”transkription säädin toiminta”, ”käännös säädin toiminta” ja ”transporter aktiivisuus” (taulukko S4).

mahdolliset toiminnalliset suhteet eri differentiaalisesti ilmentyvien geenien määritettiin sitten käyttäen erilaisia ​​lähestymistapoja. 5 Merkittävin yhteinen Kegg reitit (määritettynä Webgestalt) olivat ”sääntely aktiinitukirangan”, ”fokaalisen adheesion”, ”MAPK-signalointireitin aktivaatio”, ja ”insuliinin signalointireitin”. Taulukko S5 lista kaikista reittejä tunnistettu. Alkuun geenit 5 merkittävimmät reitit edellä luetelluista käytettiin hakemaan Pathway Studio tietokannan tunnettuja proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia (kuvio 6A). Taulukko S6 luettelee proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen yksityiskohtia ja niitä vastaavat viitteet. Kiinnostavaa yksi merkittävimmistä polkuja tunnistettu tämä lähestymistapa oli RAS-RAF-MAPK-reitin (kuvio 6A). Sitten tutkittiin tämän reitin in OVCA420 soluissa tutkimalla Erk ja Raf-1 ilmentymisen ja fosforylaatiota näissä soluissa (kuvio 6B). Claudin-7 Knockdown johti kasvuun fosforyloitu Raf-1 (Ser-338), joka heijastui kokonaismäärän lisääntymiseen Raf-1 jokaisessa aikapisteessä, mikä viittaa siihen, että todellakin tämän reitin voi vaikuttaa klaudiini-7. ERK1 /2 tasoa ei vaikuttanut klaudiini-7 knockdovvn, mutta fosforyloidun Erk osoitti lievää laskua, varsinkin myöhempinä ajankohtina.

. Pathway Studio analyysi. Suora yhteisvaikutuksia 33 merkittävästi voimistunut (punainen ylöspäin nuoli) tai vaimentua (vihreä alaspäin nuolet) geenit näkyvät. Legenda erityyppisille vuorovaikutusten alla näkyy kartalla. B. immunoblottianalyysi Erk1 /2, fosfori-Erk1 /2 (p-Erk) ja Raf-1 ja fosfo-Raf (Ser-338) in OVCA420 klo ilmoitettuina ajankohtina seuraavien

CLDN7

knockdown.

Claudin-7-proteiinin ilmentyminen liittyy solujen invaasiota, mutta käänteisesti verrannollisia maahanmuuttoon

koska meidän geenin analyysi edellä paljastaa soluun liikkeen funktiona mahdollisesti vaikuttaa

CLDN7

, päätimme testata mahdollisia rooleja

CLDN7

munasarjasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Ensin suoritetaan ohimeneviä siRNA-välitteisen knockdovvn

CLDN7

ilmentymistä kahdessa munasarjasyövän solulinjoissa (OVCAR-2 ja OVCA420) ja testattiin muuttoliike käyttäen Oris solujen vaeltamiseen määrityksessä.

CLDN7

knockdown johti toistettavissa kasvuun solumigraatio molemmissa solulinjoissa jokaisessa aikapisteessä testattu (kuvio 7A). Soluinvaasion arvioitiin sitten käyttämällä Boyden kammion määrityksessä, ja kuten on esitetty kuviossa 7B, inhibitio klaudiini-7 ilmentymisen OVCAR-2 ja OVCA420 solujen vähentänyt merkittävästi invasiivisen potentiaalin näiden solujen. Edelleen vahvistaa roolia klaudiini-7 invaasio, klaudiini-7 yliekspressoitiin OV-90-solut (joista puuttuu endogeeninen klaudiini-7 lauseke) ja totesi, että vakaa yliekspressio tämän proteiinin lisännyt invaasio verrattuna mock-transfektoituja soluja tai vanhempien OV-90-solut (kuvio 7C).

. Muuttoliike määrityksissä OVCAR-2 ja OVCA420 soluja. Muuttoa solujen

CLDN7

pudotettiin (tumma palkit) tai kontrolli solut (valkoiset pylväät) mitattiin eri ajankohtana alettua määritystä. B. Boyden chamber invaasiomääritys of OVCAR-2 ja OVCA420 solujen kanssa ja ilman

CLDN7

knockdown. Määrä tunkeutumaan solujen mitattiin tunnin välein 6 tunnin ajan. C. Invasion määrityksissä mallissa

CLDN7

yli-ilmentymisen. Kaksi stabiilia linjat, OV90-CLDN7 ja OV90-CiNeo, sekä transfektoimattomista vanhempien OV90 soluja käytettiin testaamaan muutoksia hyökkäyksen jälkeen,

CLDN7

yliekspressio. Kaikki tulokset on esitetty tässä kuviossa, kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tulokset on esitetty keskiarvona +/- SEM Tähdellä (*) osoitti p-arvo 0,05, ja kaksinkertainen tähdellä (**), p-arvo 0,01.

Keskustelu

Tuloksemme osoittavat, että

CLDN7

on kohonnut sekä mRNA: ta ja proteiinia tasolle useimmissa munasarjasyövän kudoksissa ja solulinjoissa. Western-analyysillä, primääri munasarjojen kasvain kudosten näytteillä vaihteleva ilmentyminen klaudiini-7 vaihtelevat kohtalaisesta voimakasta ilmentymistä 66%, alhainen 24%, ja huomaamaton 10% kasvain kudosnäytteitä. Syynä tähän vaihtelu on epäselvä, koska transkription säätely

CLDN7

vielä tunneta laajalti. Mielenkiintoista, hypermetylaation on oltava sekaantunut downregulation on

CLDN7

ilmentyminen rintasyövässä [17] ja kaksi transkriptiotekijöitä, Tcf-4 ja Sox9, on osoitettu yhteistyötä

CLDN7

sorto paksusuolen soluihin [31]. Ei tiedetä, ovatko nämä mekanismit ovat mukana

CLDN7

sääntelyn munasarjasyöpä, mutta nämä mahdollisuudet ovat parhaillaan tutkittavana.

Huomaamme, että

CLDN7

on kohonnut kaikissa keskeisissä alatyyppejä munasarjasyöpä: vakavien, endomet-, kirkas solu ja mucinous. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien microarray data [22], [26] ja IHC kokeiluja [27], [30] osoittaa, että CLDN7 tyypillisesti yliekspressoituu epiteelin munasarjasyöpä. Todellakin, varhainen tutkimus osoitti, että klaudiini-7 on yli-ilmentynyt kaikissa munasarjan epiteelin syövän alatyyppien, mutta ei overexpresssed seksi johto ja stroomakasvaimet [23]. Lisäksi yksityiskohtainen analyysi Tassi et al. [24] on osoittanut, että

CLDN7

on yleisesti säädellään ylöspäin epiteelin munasarjasyöpä sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Tutkimuksemme osoittaa myös yli-ilmentymisen yleisin epiteelin munasarjasyöpä alatyyppejä (vakavien, kirkas solu, endomet-, ja mucinous) sekä mRNA ja proteiini tasot käyttäen qRT-PCR, IHC, ja immunoblottauksella. Käyttö immunoblottauksen ja qRT-PCR avulla voimme osoittaa, että mRNA-tasot ja proteiinin tasot eivät aina korreloi, mikä viittaa siihen, translaation jälkeisen sääntely klaudiini-7 munasarjasyöpä.

Mielenkiintoista on, kun olemme huomanneet, että useimmat klaudiini -7 värjäys paikallistettiin kalvo, useita munasarjasyöpä näytteitä osoitti vahvaa sytoplasmista värjäytymistä (kuvio 1 D). Se, että klaudiini proteiinit löytyvät sytoplasmassa on raportoitu, ja erityisesti, pistemäinen sytoplasminen värjäys klaudiini-7 on havaittu munasarjasyöpä [24]. Mekanismeja ja syitä klaudiini sytoplasman lokalisointi jää epäselväksi, mutta useat tekijät osoittavat, että fosforylaatio claudins saattaa vaikuttaa lokalisointi. Esimerkiksi mutaatio on PKA fosforylaation sivuston klaudiini-3 on osoitettu johtavan lisääntyneeseen sytoplasman lokalisointiin munasarjasyöpä [32]. Samoin, klaudiini-4 havaittiin fosforyloida proteiinikinaasi C, ja tämä fosforylaatio on todettu johtavan translokaatio klaudiini-4 kalvosta sytoplasmaan ja lasku TJ-toiminto [32]. Klaudiini proteiineja tiedetään myös säänneltävä palmitoylation, kuten klaudiini-14 palmitoylation on osoitettu olevan ratkaiseva sen moitteettoman lokalisoinnin [33]. Tällä hetkellä on epäselvää, onko klaudiini-7 voidaan muokata ja onko muutoksia voi vaikuttaa sen lokalisoinnin.

yli-ilmentyminen claudins syövässä viittaa siihen, että claudins saattaa olla toiminnallisten roolien kasvainten synnyssä. Useat ryhmät ovat tutkineet mahdollisia rooleja klaudiini-7 syövässä. Claudin-7 on ehdotettu olevan osallisena säätelyssä prostataspesifisen antigeenin (PSA) [34], mahdollisesti vuorovaikutuksessa liitosadheesiomolekyyliin molekyyli A (JAM-A) [35]. Klaudiini-7 on myös raportoitu muodostaa kompleksin EpCAM-tetraspanin joka häiritsee EpCAM-välitteisen soluadheesion ominaisuuksia ja lisää vastustuskykyä apoptoosin [36] – [38]. Itse asiassa kolorektaalikarsinoomasta, EpCAM ja klaudiini-7 löytyy yhdessä tetraspanins CD9 ja /tai CO-029 ja edistää etäpesäkkeiden muodostumista [37]. Lisäksi EpCAM-

CLDN7

kompleksi ehdotettiin olevan rooli muuttoliikkeen, leviämisen, apoptoosin vastus, etäpesäke, ja tuumorigeenisyystesti [37], [39].

yrittää kerätä lisää vihjeitä

CLDN7

toiminto munasarjasyövän, tutkimme geenien ilmentymisen muutoksia seuraaviin

CLDN7

knockdown. Oletimme, että downregulation

CLDN7

voivat vaikuttaa loppupään reittejä joita tämä proteiini ja lopulta johtaa ilmaisun muutoksia geenien säätelevät näiden reittien. Välillä kaksi munasarjasyövän solulinjoissa tutkittu tunnistimme yhteensä 1296 geenejä, jotka olivat merkittävästi muuttunut annettaessa

CLDN7

knockdown. Näistä geeneistä, 297 oli samanaikaisesti löytyi differentiaalisesti ilmaistut molemmat linjat. Analyysi näistä geeneistä käyttää kekseliäisyyttä Pathway Analysis, johti esille useita geenin verkkojen sisältävän geenejä, jotka liittyvät toiminnalliset luokat ”syöpä”, ”solukuolema”, ”solusyklin”, ”RNA kaupan”, ”solujen kehitystä”, ”solu signalointi ”,” solujen kasvua ja lisääntymistä ”, ja” solu liike ”. Kioton Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) koulutusjakson analyysi, valitsimme top 5 polkuja, jotka muutettiin sekä OVCAR-2 ja OVCA420 solulinjojen ja tuotti proteiini-proteiini vuorovaikutukseen verkon kartan näitä reittejä. Käyttämällä polku Studio, löysimme suoraan vuorovaikutukset 33 merkittävästi voimistunut tai vaimentua geenejä (taulukko S6). Vuorovaikutus verkko oli useita geenejä, jotka ovat onkogeenisiä tai kasvaimia estävä rooleja. Esimerkiksi, RRAS2, jotka koodaavat Ras liittyvä GTPaasi kanssa muuttamassa potentiaalia samanlainen H-, K- ja N-Ras, on tunnettu onkogeenin ja on patogeneesiin ihmisen syövän. Polut, jotka välittävät RRAS2 aiheuttama tuumorigeneesiä eivät ole vakiintunut, vaan fosfoinositidi 3-kinaasin, p38 MAPK, ja mTOR polkuja ovat sekaantuneet [40]. Erityisen kiinnostavia, RRAS2 ja RRAS on osoitettu edistävän hyökkäyksen kautta integriinin signalointi rintojen epiteelisolujen [41].

Olemme aiemmin osoittaneet, että munasarjojen epiteelin soluja, jotka ilmentävät klaudiini-3 ja -4 osoittavat lisääntynyt invasiivisuus

in vitro

[42], joka oli välittyvät MMP-2 yli-ilmentymisen. Samoin maksasolukarsinoomassa soluissa, klaudiini-10 ilmentyminen edistää solujen eloonjäämistä, liikkuvuuteen ja invasiivisuus, vaikka matriksimetalloproteinaasi 2 (MMP2) oli säädelty [43]. Kuitenkin claudins on myös osoitettu vähentävän Invasion klaudiini-4-ekspressio liittyy väheneminen invasiivisuutta haiman syöpäsoluissa [44]. Vähentynyt ilmentyminen klaudiini-7 on korreloinut kasvaimen invaasion ja etäpesäkkeiden levyepiteelisyövän ruokatorven ja peräsuolen syöpä [13], [45]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että

CLDN7

Knockdown johtanut muutoksiin geenien liittyy erilaisia ​​toimintoja, kuten muuttoliike /hyökkäystä. Erityisesti seurannassa polulla analyysitulokset, osoitimme että Raf-1, geeni aiemmin osallisena solujen vaeltamiseen [46], [47], oli säädelty seuraavat

CLDN7

taintumisen (kuva 6) . Erk-1 ei löytynyt merkittävästi kohonnut näissä olosuhteissa, mikä viittaa siihen, että Raf-1 voi merkitä muilla loppupään väyliä vastauksena

CLDN7

knockdown.

Perustuu ekspressiotietojen, me sitten tutkitaan mahdolliset roolit

CLDN7

ja todettu vaikutuksia invaasio ja maahanmuuttoa

in vitro

. Todellakin, invaasio kapasiteetti väheni merkitsevästi jälkeen

CLDN7

pudotus ja päinvastoin, havaittiin lisääntynyt jälkeen yliekspressio

CLDN7

. Mielenkiintoista, muuttoliike todettiin lisättävä seuraava

CLDN7

taintumisen (mahdollisesti koska kasvu Raf-1), ja nämä näennäisesti ristiriitaista havainnot (hyökkäys vs. siirtymä) voi selittää aikaisemmat havainnot alalla. Todellakin, tarkka roolit klaudiini on invaasio ovat pysyneet kiistanalainen, koska jotkut tutkijat tarkkailla myönteisiä vaikutuksia claudins on hyökkäyksen ja toiset ovat löytäneet päinvastainen. Koska klaudiini proteiinien tiedetään aktivoida MMP [42], [48], mutta myös rooleja solu-adheesio [9] ja muuttoliike (kuten kuvassa), nettovaikutus havaittu voi edustaa tuloksesta nämä vastakkaiset vaikutukset invaasio. Tuloksemme viittaavat siihen, että vaikka

CLDN7

yliekspressio voi vähentää muuttoliikettä, kasvu hyökkäys johtuu muista tekijöistä (kuten lisääntynyt MMP aktivointi) on hallitseva ja johtaa positiivinen vaikutus solujen invaasiota järjestelmäämme. Tarkka mekanismit

CLDN7

rooleja solumigraatioon ja invaasiota tutkitaan, mutta meidän data voi selittää joitakin eroavaisuuksia kirjallisuudessa.

Yhteenvetona havaitsemme, että

CLDN7

on kohonnut useimmissa munasarjojen syöpien. Me tehdään mikrosiruanalyysi tunnistaa muutoksia geenien ilmentyminen liittyy

CLDN7

Knockdown munasarjasyövän. Kiinnostavaa kyllä, olemme huomanneet, että monet geenit ja polkuja vaikuttaa

CLDN7

ilmaisu ovat osallisina syövän solujen selviytymistä, kasvua ja invaasiota. Invasion ja muuttoliike analyysit osoittivat selkeitä vaikutuksia klaudiini-7 invasiivisen käyttäytymisen munasarjasyöpäsoluja. Meidän mikrosiruanalyysi tarjoaa useita mahdollisia mekanismeja, joilla klaudiini-7 voi vaikuttaa solujen vaeltamiseen ja invaasiota, ja nämä erilaiset mekanismit tutkitaan parhaillaan. Lisäksi niiden tiiviin liitoksen toiminto, klaudiini-7 voi olla tärkeä rooli useissa signalointireittien osallisina syövän, solujen kasvua, lisääntymistä ja solusyklin. Koska sen tärkeä rooli munasarjan Karsinogeneesin

CLDN7

voi olla merkittävää potentiaalia diagnostisissa ja terapeuttisissa sovelluksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki ihmisen kudokset kerättiin läpi IRB hyväksytty protokolla (MedStar tutkimuslaitos IRB # 2003-103). Kudokset kerätään anonyymisti ja tämä protokolla oli vapautettu suostumusvaatimuksen.

Solulinjat ja Kudosnäytteiden

Munasarjasyöpä rivit tässä tutkimuksessa käytetyt, BG-1, UCI-101, hei, OV90, OVCA420, OVCA432, OVCA433, OVCAR-2, OVCAR-3, ja OVCAR-5 on julkaistu [49] – [51]. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.