Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kiertävä kasvain DNA (ctDNA) kuljettaa tietoa kasvaintaakkaa. Kuitenkin mutaatio spektri on erilainen eri kasvaimia. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia hyödyllisyyttä ctDNA seurantaan kasvaintaakkaa perustuu yksilölliseen mutaatio profiilin.

Menetelmät

DNA uutettiin yhteensä 176 näytettä, kuten esi- ja post operatiivinen plasma, ensisijainen kasvaimia, ja ääreisverenkierron mononukleaariset solut (PBMC), 44 yksilöiden peräsuolen kasvain joille tehtiin parantava resektio Kolorektaalituumorien sekä yhdeksän terveillä henkilöillä. Paneelia käyttämällä 50 syöpään liittyvien geenien, kasvaimeen ainutlaatuinen mutaatiot tunnistettiin vertaamalla yhden nukleotidin variantit (SNVs) kasvaimia ja PBMC: t Ion PGM sekvensseri. Ryhmä kasvaimeen ainutlaatuinen mutaatioita yksittäisten kasvainten oli nimetty yksittäisiin merkki mutaatioita (MMS) jäljittää kasvaimen taakkaa ctDNA käyttäen pisaran digitaalisen PCR (ddPCR). Näistä kokeista kolme päätavoitetta arvioitiin: (a) Tumor-ainutlaatuinen mutaatioiden; (B) mutaatio spektri kasvain; ja (c) muutokset alleelin taajuus MMS ctDNA jälkeen parantava resektio kasvain.

Tulokset

Yhteensä 128 geenin pistemutaatioiden tunnistettiin 27 Kolorektaalituumorien. Kaksikymmentäkuusi geenit mutatoitiin vähintään 1 näytteen, kun taas 14-geenien havaittiin olevan mutatoitunut vain 1 näyte, vastaavasti. Keskimäärin 2,7 geenien mutatoitiin per kasvain. Myöhemmin, 24 MMS valittiin SNVs varten kasvaintaakkaa seurantaa. Niistä MMS saapuvat ddPCR kanssa 0,1% muunnos alleelifrekvensseiltään plasman DNA, 100% (8 out of 8) osoitti laskua jälkeisessä toiminnassa ctDNA, kun taas yksikään 16 MMS saapuvat ddPCR 0,1% variantin alleelin frekvenssi plasman DNA laskivat.

Päätelmät

Tämä paneeli 50 syöpään liittyvien geenien näytti olevan riittävä tunnistaa yksittäisiä, kasvaimen ainutlaatuinen, mutatoitu ctDNA markkereita syövän potilailla. MMS osoitti kliinisen hyödyn seurannassa curatively saaneilla peräsuolen kasvaintaakkaa jos alleelin taajuus MMS plasmassa DNA on yli 0,1%.

Citation: Sato KA, Hachiya T, Iwaya T, Kume K, Matsuo T Kawasaki K, et ai. (2016) Yksilöllistä Mutaatio Detection in Kiertävä kasvain DNA Monitoring peräsuolen kasvaintaakka käyttäminen syöpään liittyvän geenin sekvensointi Panel. PLoS ONE 11 (1): e0146275. doi: 10,1371 /journal.pone.0146275

Editor: Alvaro Galli, CNR, ITALIA

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2015; Hyväksytty 15 joulukuuta 2015 Julkaistu: 04 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Sato et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Keiryoukai Research Foundation No.125 of Iwate Medical University [KAS]; ja opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede ja teknologia, Japanissa MIAST (Medical Innovation Advanced Science and Technology) hanke avustuksen-in-Aid for Strategic Research Foundation Private yliopistojen [S1001001 että SSN]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

määrällistä arviointia verenkierrossa kasvaimen DNA: ta (ctDNA) on osoitettu olevan hyödyllisiä valvonnassa tuumoritaakka hoitovasteen [1, 2]. Kuitenkin mutatoituja geenejä monissa syöpien osuus on vain muutama prosentti koko määrä geenejä läsnä, mikä viittaa siihen, että vain rajallinen määrä geenejä, jotka liittyvät syövän kehittymisen ja etenemisen [3, 4]. Siksi joukko selektiivisiä geenejä, joiden tiedetään liittyvän syöpään on pohjimmiltaan tarvitaan valvomaan kasvaintaakkaa. Itse asiassa, hoidon seurantaan tehoa by ctDNA on suoritettu käyttämällä joukko hyvin tutkituissa kohdegeenien, kuten

KRAS

,

BRAF

,

HER2

, ja muut [5 -9]. Toisaalta tiedot seurannasta kasvaintaakkaa jälkeen kirurgisia toimenpiteitä on rajoitettu, koska se on edelleen tuntematon jotka kasvaimeen ainutlaatuinen mutatoitunut geenien tulee seurata jokaiselle potilaalle [10]. Itse asiassa, tiedot ovat antaneet ymmärtää, että rajoitettu määrä kasvaimeen ainutlaatuinen mutaatiot voivat riittävän edustaa määrä ja ominaisuudet (esim., Lääkeresistenssin) yksittäisten kasvainten [11]. Jos pieni määrä kasvaimeen ainutlaatuisia mutaatioita on tunnistettu primaarikasvaimista, niin niitä voitaisiin käyttää havaitsemaan mutaatioita ctDNA. Tämä merkitsee edullinen ja kustannustehokas lähestymistapa seurantaan kasvaintaakkaa jälkeen kirurgisia toimenpiteitä.

Ajatus käyttää ctDNA syöpään potilaita seuraamaan kasvaintaakkaa johti meidät suunnittelemaan nykyistä tutkimus keskittyi kolorektaalisyöpä potilailla, jotka olivat saaneet parantava poistamalla kasvain. Strategiamme oli koota yksittäisiä peräsuolen kasvain näytteet kautta endoskooppinen tai laparoskooppinen peräsuolen kasvaimen parantava resektion sekä verinäytteitä. Toisin kuin aiemmissa tutkimuksissa käyttäen erittäin kehittyneitä kasvaimia, mukaan lukien tapaukset, joissa puutteellisia resektio [1, 2, 7], tuloksemme osoittavat, että yksittäinen merkki mutaatioita (MMS) in ctDNA voi olla hyödyksi seurannassa leikkauksen jälkeen kokoisen peräsuolen kasvain taakka perusteella vähentynyt alleelin taajuus ctDNA postoperatiivisen plasma.

Potilaat ja menetelmät

Ihmisen näytteitä ja tutkimuksen suunnittelu

tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of Iwate Medical University noudattaen Helsingin julistuksen (HG H24-22). Yksittäinen kirjallinen suostumus saatiin kaikki osallistujat ja kaikki analyysit tehtiin anonyymisti. Periaatteessa potilaat olivat sopivia, jos niiden kirurgisiin tai endoskooppinen resektio oli tarkoitettu hyvän- tai vaiheen 0-III peräsuolen kasvaimia, ja ei ollut aiempi mitään hoitoa aikaan tietoisen suostumuksen. Kaikki analysoitavissa tapausta annettava seuraavat neljä tyyppisiä materiaaleja: esi- ja post-operatiivisen plasmaa (vähintään 24 tunnin kuluttua kasvaimen resektion), ensisijainen kasvain, ja ääreisverenkierron mononukleaariset solut (PBMC). Verinäytteet otettiin rutiini ennen ja jälkeen operatiivinen laboratoriotutkimusten. Joko kahdeksan tai 16 ml verta kerättiin BD Vacutainer CPT verinäytteen putki (Becton, Dickinson and Company, East Rutherford, NJ). Kahden tunnin kuluttua kokoelma, putkia sentrifugoitiin 1800

g

20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa erottamiseksi plasmaan ja PBMC-kerroksia. Ylempi faasi kahdeksan ml verta siirrettiin sitten viiden ml: n putkeen merkitty potilaan-yksilöllisen tunnistenumeron. Putkia välittömästi varastoitiin -80 ° C: ssa, kunnes DNA-eristys. Yhteensä genominen DNA eristettiin käyttäen QIAamp Kiertävä Nucleic Acid Kit plasman ja QIAamp DNA Mini Kit ensisijaisen kasvaimia ja PBMC (Qiagen, Venlo, Alankomaat). Määrä uutettua DNA: ta mitattiin käyttäen Qubit® 2,0 dsDNA suuren herkkyyden määritys (Life Technologies, Carlsbad, CA). Esillä olevassa tutkimuksessa, meidän alustavassa kokeessa vahvisti, että poistuva 5-7mm on ”puskurointi” kerroksen buffy coat jälkeen sentrifugin riittävästi estää plasman kerroksen saastumisen veren ja solujätteen, ja saannot hyväksyttävää DNA laatua [12, 13]. Suhteellinen kopioluku genomin plasman DNA arvioitiin myös kvantitatiivisen-PCR (qPCR) ja LINE-1-geenin avulla Alukesarjat aiemmin kuvattu [14].

DNA uutetaan ihmisen koolonisyöpäsolulinja

ihmisen koolonisyöpäsolulinja, HCT116, saatiin vuonna 2008 Division of Cancer Treatment and Diagnosis kasvain Repository, National Cancer Institute (NCI MTA # 1-2093-08). Solulinja viljeltiin RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, ja genominen DNA uutettiin käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Venlo, Alankomaat) kolmen kohtia sulatuksen jälkeen.

Multiplex PCR ja kirjasto rakentaminen käyttämällä CHPv2

CHPv2 on pooli PCR-alukkeiden että tavoite 207 amplikoneihin varten 2885 mutaatioita 50 syöpään liittyvien geenien [15] (Life Technologies, Carlsbad, CA). Koko lista geenien on saatavilla toimittajan verkkosivuilla (https://tools.invitrogen.com/downloads/cms_106003.csv). Noin 10 ng DNA: ta per näyte käytettiin amplikonin tuotantoon multiplex PCR: llä käyttäen Ion AmpliSeq CHPv2 ja Ion AmpliSeq Library Kit 2,0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Tuloksena multiplex PCR-reaktio-allas käytettiin kohdesekvenssin kirjaston valmistelua. Alukesekvenssit multiplex-PCR digestoitiin osittain ligatoida viivakoodi adapterit (Ion P1 sovitin ja Ion XpressTM Bacode X, Life Technologies, Carlsbad, CA) ja sen jälkeen helmi-pohjainen nukleiinihapon puhdistus järjestelmä (AMPure® XP Reagent, Life Technologies, Carlsbad , CA). Sen jälkeen vahvistuksen, että lopullinen kirjaston fragmenttikoko korkeimmillaan 130 emäsparin, kirjaston fragmentit kloonaamalla monistettiin emulsio PCR (Ion PGM Template OT2, Life Technologies, Carlsbad, CA). Emulsio sisältävät hiukkaset kloonaamalla monistetut PCR-fragmentit Sitten levitettiin puolijohde sekvensointi siru (Ion 316 Chip, Life Technologies, Carlsbad, CA) massiivinen rinnakkaissekvensointijärjestelmät koskevasta Ion PGM sekvensseri (Life Technologies, Carlsbad, CA).

Target syvä sekvensointi

sekvensointi tietoja tallennetaan BAM muodossa jatkoanalyysille. Sekvensointi linjaus arvioitiin torrentilla Suite V.3.6.2 Software (Life Technologies, Carlsbad, CA) jäsentää viivakoodilla lukee ja kohdista lukee vertailutasoon genomin (ihmisen genomi build19; hg19). Havaitsemiseksi vaihtelut suunnattu sekvenssin, laajuus kattaa kunkin amplikonin asetettiin saadaan ainakin keskimääräisen syvyyden 1400 x primaareja kasvaimia ja 700 x plasman DNA: ta, jossa Ion Torrent Variant Soittajan v3.6 asetettiin alleeli taajuus yli 0,1% muunnelmaa. Integroiva Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/) käytettiin myös visualisoida linjaus, joka mahdollisti meille tarkastaa väärin määritelty vaihtelut lohkon bias ja sekvensointivirheitä.

tunnistaminen ja havaitseminen geenien mahdollisten MMS

MMS primäärikasvaimissa nimettiin priorisoida yhden nukleotidin variantteja (SNVs), jotka olivat todennäköisesti havaita ctDNA. Kohdennetut sekvensointi päässä Cancer Panel tunnistetaan kasvaimen ainutlaatuinen SNVs (eli somaattiset mutaatiot) vertaamalla sekvensoinnin tulokset primaarikasvaimen ja vastaavat PBMC: t (ts ituradan polymorfismit). Lyhyesti, algoritmi tunnistamiseen kasvaimeen ainutlaatuisia mutaatioita on seuraava: (a) suodatin lyhyt lukee ( 50 nt) käyttäen fastaq tiedosto DNA kasvain, PBMC: t, ja plasma; (B) Kartta suodatetaan fragmentit hg19 käyttäen Burrows-Wheeler Aligner DNA kasvain, PBMC, ja plasma; (C) Tunnista SNVs käyttäen GATK Unified GENOTYPER DNA kasvain tai PBMC; (D) Lista kasvaimeen ainutlaatuinen SNVs vertaamalla SNVs kasvain ja PBMC; ja (e) tunnistaa kasvaimeen ainutlaatuisia mutaatioita kasvain-ainutlaatuinen SNVs että kartoitettiin kohde-sekvenssin CHPv2. Koko prosessi algoritmin toteutus tapahtuu kuusi tuntia tavallisella pöytätietokoneella (Intel Core 2 Duo-prosessorit kanssa 3 Gt random Muistia) 1,5 Gt sekvenointitulosten. Saatu kasvain-ainutlaatuinen mutaatioita voidaan käyttää ctDNA markkereita. Meidän talon algoritmi tunnistaa primaarikasvaimen SNV fragmentteja, jotka ovat differentiaalisesti havaitaan PBMC DNA. Se mahdollistaa valinnan fragmenttien korkean alleelin taajuus, jolla on suuri todennäköisyys havaitseminen ctDNA [11]. Saadun kasvaimeen ainutlaatuinen mutaatioiden tahansa variantti taajuuksilla SNVs, MMS kunkin kasvaimen priorisoitiin perustuvat seuraavat kriteerit: (a) yli 10 variantti kattavuus; (B) yli 5 variantti Jos lukumäärä ei mutaatioita oli yli 10 variantti kattavuus; ja (c) saatavuus validoitu QX200

TM pisaroiden Digital

TM PCR System (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) aluketta ja koetinsekvenssit (S1 taulukko). Alleeli taajuus MMS plasmassa seurattiin ddPCR käyttäen aluke ja koetin asetetaan.

ddPCR

Jokainen seos valmistettiin 20 ui reaktiopuskuria, 2 x ddPCP SuperMix- varten Probes (Bio -Rad Laboratories, Hercules, CA), ja 10 ng templaatti-DNA. PCR-reaktioseokset erotettiin tasaisesti kokoinen emulsiopisaroita. Pisarat jaettiin 96-kuoppaisen mikrolevyn käytettäväksi tavanomaisen -lämpösyklilaitteella. Standardi PCR-reaktiota käytettiin seuraavasti: 40 sykliä, joissa 94 ° C 30 s ja 55 ° C: ssa 60 s; ja lopullinen laajennus 98 ° C: ssa 10 minuutin ajan, jonka hehkutus lämpötila oli muuttua riippuen alukkeita. Tuote varastoitiin 4 ° C: ssa. PCR-tuote laitettiin sitten QX200 pisaran lukija (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), ja tulokset analysoitiin käyttäen QuantaSoft v1.6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Tilastollinen analyysi

Joko JMP 10,0 (SAS Institute, Cary, NC) tai Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA) käytettiin tilastolliseen analyysiin. Kliinis ja sekvensointi arvot ja taajuudet analysoitiin käyttämällä χ

2 testiä, Fisherin testiä, ja opiskelija

t

-testi, aiheesta riippuen ryhmiin.

Tulokset

potilaat

Toukokuun 2013 ja elokuu 2014, 37 joilla on pitkälle edennyt kolorektaalisyöpä ja 22 tähystyksessä-kokoisen peräsuolen kasvaimia suostunut tutkimukseen ennen lopullisen histopatologinen diagnoosi. Ilmoittautuminen potilaiden /terveillä yksilöillä ja katsaus tutkimuksen esitetään (kuvio 1). Vuonna leikkaus ryhmä, kuusi potilasta olivat tukikelpoisia: viisi potilasta todettiin Stage IV sairaus leikkauksen aikana ja yksi potilas oli useita ensisijainen syöpä vaurioita. Niistä sopivaa potilasta, näyte hankintaprosessi epäonnistui kolmessa tapauksessa. Siksi 28 koko näytejoukoille saatiin 31 sopivaa potilasta. Vuonna tähystys ryhmä, yksi potilas kieltäytyi osallistumasta tutkimukseen, ja yksi potilas oli munuaisten vajaatoiminta maahantulon jälkeen. Niistä sopivaa potilasta neljä potilasta oli kasvaimia, jotka olivat liian pieniä näytteenottoa. Siksi 16 koko näytejoukoille saatiin 20 sopivaa potilasta. Verta 10 terveiden yksilöiden (eli potilaat vuotiaista 22 ja 68 vuotta, kolme naista ja seitsemän miestä) kerättiin myös käyttämällä samaa kirjallinen suostumus. Yksi vapaaehtoinen havaittiin olevan raskaana kun verinäytteen ottamista ja siten sulkea pois. Kaiken ainakin yksi näytteen tyyppi saatiin 60 henkilöä ja yhteensä 176 näytettä asetettu neljä materiaalien 44 potilasta saatiin (kuvio 1). Kliinis ominaisuudet: lla potilaista (taulukko 1) ja kasvaimen markkerin (karsinoembryoninen antigeeni, CEA) on koottu (S1 kuvio). Vuonna leikkaus ryhmä, 30 ulos 31 (96,8%) voivat potilaita seurattiin vähintään yhden vuoden ajan. Neljä ulos 30 (13,3%) potilaista oli uusiutunut eikä potilasta kuoli tarkkailujakson aikana (mediaani: 14,3 kuukautta). Ei potilaiden sisätähystyksen ryhmässä ei ollut vielä käynyt meidän sairaalassa jälkeen kasvaimen resektion helmikuun 2015

Kaikki kerättiin prospektiivisesti. Näytteet kerättiin seuraavat kolme ryhmää; Leikkaus, tähystys, ja terveillä vapaaehtoisilla. Leikkaus ja Endoskopia ryhmät sisältävät Pre (ennen leikkausta plasma), PBMC, kasvain, ja Post (leikkauksen jälkeinen plasma) näytteitä. Näytteitä potilailta osoittaa Vaihe IV sairaus, riittämätön otoskoko, tai riittämätön uutettu DNA määrä jätettiin pois tutkimuksesta (yksityiskohtaiset tiedot tekstimuodossa). Väri jokaisen laatikon ilmoittaa menettelyjä käytettiin analyysiin kunkin näytteen.

laadun arviointi uutettu DNA

mediaani (alue) kokonaismäärä DNA primaaristen kasvainten, plasma-DNA, ja PBMC: t oli 9,4 ug (1,4-12,0), 58,1 ng (15,4-915), ja 4,7 ug (3,2-10,3), vastaavasti. Plasman DNA saanto olivat riittäviä loppupään määritykset, mukaan lukien sekvenssi kirjasto rakentamisen ja ddPCR. Määrä plasmaa DNA (alue; 83-5,435 ng /ml per plasma) osoitti erittäin korkea positiivinen korrelaatio (r = 0,9651, p 0,0001) kanssa kopioluku

LINE-1

(alue; 3050985 -232689225 kopiota /ml kohti plasmaa) (S2 Kuva). Kaiken kaikkiaan tuloksemme osoittavat, että 22,9 ng DNA keskimäärin saa 1 ml plasmaa.

laadun arviointi Ion PGM sekvensseri

Ennen sekvensointi potilaan materiaalin sekvensointi laatu Ion PGM on varmistettu käyttämällä laimennettiin sarjoittain genomista DNA: HCT116 ihmisen paksusuolen syövän solulinja, joka on lisätty liuokseen, genomisen DNA: n PBMC: istä terveen vapaaehtoisen (kuvio 2). Ensin vahvisti, että HCT116-solut kantavat 10 geenimutaatioita päässä 50 geeneistä CHPv2 (S2 taulukko), kun taas terveen ihmisen vapaaehtoinen DNA ei ollut merkittävää mutaatioita. Perustuu julkisesti saatavilla oleviin tietoihin, 1177 mutaatiot HCT116 on raportoitu (https://cansar.icr.ac.uk/cansar/cell-lines/HCT-116/mutations/#). Niistä 10 mutatoitua geenejä löydetty tässä tutkimuksessa, 4 on rekisteröity COSMIC tietokantaan HCT116, loput 6 olivat uusia. Erityisesti ei tiedetä mutaatiot jäänyt 50 geenien kattamien alukesarjoista että CHPv2. Käsitellä herkkyys, genomista DNA: ta, joka on saatu terveillä vapaaehtoisilla oli terästetty genomisen DNA: HCT116 koolonisyöpäsolulinja neljällä eri pitoisuuksilla (100, 1, 0,1, 0,01, ja 0,001% v /v) (kuvio 2). Keskimääräinen sekvenssi kattaa kaikki amplikonien varten lueteltujen pitoisuuksien oli 1287,7 (100%), 1456,7 (1%), 1412,5 (0,1%), 1708,2 (0,01%), ja 1464,3 (0,001%), vastaavasti. Lisäksi, kertoimet vaihtelut (CV) variantti taajuuksien mutatoidun fragmentit 33,4% (100%), 49,9% (1,0%), 125,6% (0,1%), 84,7% (0,01%), ja 115,6% (0,001 %), vastaavasti. Kaiken kaikkiaan kohtuullinen lineaarinen välillä asetetun pitoisuuksien ja havaita alleelin frekvenssi kanssa Ion PGM sekvensseri näytti olevan 0,1 100%. Näin ollen herkkyys sekvensoinnin menetelmä vaihtelun taajuuksilla käyttäen Ion PGM on suurempi kuin 0,1% riittävän sekvenssin lukee.

Vaaka-akseli ilmaisee pitoisuuden piikki DNA HCT116 koolonisyöpäsolulinja että DNA-liuokseen terveeltä ei-syöpä luovuttajan. HCT116 tiedetään olevan useita geenin mutaatioita ja siten konsentraatio mutaation fragmentti tehtiin laimennossarja. Pystyakseli on alleelin taajuus, joka on todella havaitaan kanssa Ion PGM. Jokainen väri piste ilmaisee havaitun alleelin frekvenssi syöpään liittyvää mutaatiota vastaavalla DNA pitoisuus johdettu HCT116 0,001 100%. Nimet mutatoidun geenit ilmoitetaan oikeanpuoleisen selitteen.

Mutaatiotutkimukset kirjo Kolorektaalituumorien tunnistaa CHPv2

Yhteensä 15354178 lukee ja 1636525575 emässekvenssi tiedot saatiin 27 ensisijainen kasvaimia ja vastaavat PBMC käyttäen Ion PGM sekvensserin. Kasvain-ainutlaatuinen mutatoitunut geenit tunnistetaan sitten käyttämällä itse kehitettyä algoritmia (ks potilasta ja menetelmät). Ensin asetetaan variantti alleelin taajuus 0,1% ja totesi, että 440 885 geenin muutokset olivat kasvaimen ainutlaatuinen mutaatiot perustuvat vertailuun PBMC ja ensisijaisen kasvaimia. Sekven- primaaristen kasvainten saatu IonPGM vahvistettiin ddPCR näytteitä, joita voitaisiin arvioida (S3 kuvassa). Saat tiukkaa analyysia, variantti kattavuus on yksi tärkeimmistä tekijöistä tietojen luotettavuus (S4 kuvio). Näin ollen analyysi suoritettiin geenejä, joiden muunnos kattavuus oli 10, jolloin yhteensä 128 geenin pistemutaatioiden (kuvio 3A). Koska joissakin tapauksissa hallussaan useita muutoksia yhden geenin, kokonaismäärä muuttunut geenejä tässä tutkimuksessa analyysi oli 73. Näin ollen, keskimääräinen mutaatio kohden kasvain oli 2,7 ulos 50 geenien (keskiarvo ± 2 standardipoikkeamaa: 2,7 ± 2,9) . Kaksikymmentäkuusi geenit mutatoitiin vähintään 1 näyte (26/50, 52%), kun taas 14-geenien (14/50, 28%) mutatoitiin vain 1 näyte, vastaavasti. Usein mutatoituja geenejä mukana

TP53

(19/27, 70%),

KRAS

(10/27, 37%), ja

APC

(6/27, 22 %). Kolme syöpä näytteet ovat kaikki näistä mutaatioista, mikä viittaa siihen, että muutokset geneettisen kertymisen tyypillisiä varten adenooma-karsinooma sekvenssi saattanut tapahtua näissä näytteissä [16, 17] (Kuva 3B). Nämä havainnot näyttävät tukevan aiempaa kertomusta exome sekvensointi Kolorektaalituumorien suhteen pyydystää mutaatiostatuksesta ominaisuuksien Kolorektaalituumorien [18], mikä viittaa siihen, että 50 syöpään liittyvän geenin asettaa kohtuullisen esitetään yhteenveto mutaatioprosessiin spektri kasvaimia. Mutaatio korko perustuu multiplex PCR pituus saatu CHPv2 ja määrä mutaatioita kattavuus 10 (73 mutatoitunut geenit) oli noin 2246 per 10

6 nukleotidin (eli 207 alukeparia keskimääräisten PCR-tuotteen pituus 157bp) , mikä viittaa siihen, että CHPv2 rikastui verrattuna mutaation detektioprosentti peräisin exome-sekvenssin, jossa suurin osa Kolorektaalituumorien osoitti 1-100 mutaatiot kohti 10

6 nukleotidin [18].

a, mutaatio tyyppejä. Kuusi eri mutaatioita tunnistettiin CHPv2. b, kasvain-ainutlaatuinen mutaatio profiilin mukaan alleelin taajuus. Kukin pylväs merkitsee kasvaimen ainutlaatuinen mutaation yksittäisen kasvaimen. Kukin rivi merkitsee syöpään liittyvien geenien CHPv2. Väri kertoo variantin alleelin taajuus ilmoitetaan väripalkkia.

Detection of MMS plasman DNA

mediaani (alue) plasman DNA tasot terveiden yksilöiden, endoskooppisesti-kokoisen kasvaimet , ja kehittynyt syövät olivat 4,2 (2,6-10,4), 6,8 (2,1-100,6), ja 9,2 (3,8-228,8) ng /ml plasmassa, vastaavasti (S5 kuvio). Mutaation havaitseminen plasman DNA, 66 MMS valittiin 320 kasvaimeen ainutlaatuinen SNVs kriteerien mukaisesti kuvattujen Potilaat ja menetelmät. Seuraavat mutaatiot, joita on raportoitu monissa eri syöpätyyppejä, esiintyi useammin kuin kerran useita kasvaimia:

KRAS

(G12C) x2;

KRAS

(G12D) x4;

KRAS

(G12V) x3;

TP53

(R273C) x2; ja

BRAF

(V600E) x3, jolloin yhteensä 57 ainutlaatuista MMS (S3 taulukko). MMS ensin tutkittiin käyttäen Ion PGM for Kotelot 1, 2, ja 3, mutta yksikään niistä kahdeksasta MMS plasman DNA osoitti riittävän korkea variantti kattavuutta (kuvio 4A ja S4 taulukko). Vaikka jotkut geenit osoittivat laski alleelin esiintymistiheys on tuumorikuorma riippuvaisella tavalla, laajuus kattavuus ei ollut luotettavasti riittävän korkea esillä olevissa asioissa (S6A kuvio).

a, MMS valvonnassa on mutaatio alleelin frekvenssi käyttämällä Ion PGM. Kolme, yksi ja kolme MMS käytettiin seurantaan tapauksissa 1, 2 ja 3, vastaavasti. Vastaava seerumin CEA on esitetty. b, MMS valvonnassa on mutaatio alleelin taajuus ddPCR. Yksi tai kaksi MMS käytettiin seurannan edustettuina tapauksissa. Vaakasuora katkoviiva osoittaa ylärajan normaalin CEA seerumissa (3,4 ng /ml). Jokainen numero vierekkäin datapiste on alleelin taajuus geenien; ja seerumin arvot CEA.

aStop kodoni,

bSplice päällä.

Koska Ion PGM ei näytä olevan riittävän herkkä havaitsemaan harvinaisia ​​alleelien, päätimme käyttää ddPCR havaita MMS sisään ennen ja jälkeen -operative plasman DNA: ta. Vaikka digitaalinen PCR edellyttää erityistä pohjamaali /koetin asettaa kullekin mutaation seuraa laadunvalvonta, jonka qPCR [10], digitaalinen PCR on vähintään 3 kertaa herkempi kuin syvä sekvensserit [19]. Tässä tutkimuksessa, pystyimme vahvistaa 19 ainutlaatuinen pohjamaali /koetin sarjoista qPCR käytettäväksi määrällisesti mutaatioita plasmasta ddPCR (S1 taulukko). Koska joissakin tapauksissa oli useita MMS, 19 validoitu ddPCR pohjamaali /koetin sarjat edustivat yhteensä 24 MMS 19 tapausta (S5 taulukko). Yksitoista mutaatioita (9 potilasta), joka täsmäsi primaarikasvaimia olivat ilmeisesti läsnä (minimi alleelin frekvenssi 0,032%) pre-operatiivinen plasma (kuvio 4B, S5 taulukko, ja S6b kuvassa). Postoperatiivisen plasma DNA, 8 24 (33,3%) MMS osoitti laskeva joka vastasi 6 19 potilasta (31,6%), mukaan lukien kaksi potilasta, joilla on useita MMS (kuvio 4B ja S6b kuvassa). Tärkeää on, 100% (8 8) MMS kanssa 0,1% alleelin esiintymistiheys valmisteluvaiheen plasma DNA näytteillä väheneminen leikkauksen jälkeen näytteissä (kuvio 4B), kun taas yksikään 16 MMS ja alle 0,1% alleelin esiintymistiheys valmisteluvaiheen plasma DNA näytteillä väheneminen postoperatiivisen plasma DNA (kuvio 4B ja S6b kuvassa). Vähentynyt suuntaus saadaan MMS kanssa 0,1% alleelin taajuus korreloi hyvin seerumin CEA tasoilla. Oli 2 potilaalla oli uusiutunut kuluessa yhden vuoden tarkkailujakson aikana (asia 5 ja 6). Molemmat tapaukset nähtiin selvää laskua MMS postoperatiivisen ctDNA (kuvio 4B), mutta mitään merkittäviä mutaatiostatuksesta profiili todettiin kummassakin tapauksessa.

Keskustelu

joukko geenimutaatioita kasvain on erittäin monipuolinen. Siksi yksilöllinen joukko kasvainperäinen mutatoitunut geenien pitää soveltua biomarkkereita yksittäisiä aineita. Koko genomin analyysi ja exome sekvenssi voi olla kustannustehokasta tähän tarkoitukseen, koska yli 99,99% genomin tai exome sekvenssin ensisijainen kasvaimia ei osoita mutaatioita [4, 18]. Täällä tunnistimme kasvaimeen ainutlaatuinen mutaatioiden kanssa CHPv2 Ion PGM ja myöhemmin seurataan kasvaintaakka MMS kanssa ddPCR alkaen erittäin pieni määrä plasmaa DNA: ta. Koska meidän lähestymistapa näyttää olevan riittävä saada laadukkaita mutaatiostatuksesta tietoa verrattuna koko genomin tai exome järjestyksessä tekniikoita, se voi olla välittömästi sovellettavissa kliinisessä käytössä.

hyödyllisyys mutaation havaitseminen ctDNA on raportoitu erittäin kehittynyt peräsuolen syövän potilaille, joista suurin osa koki toistuminen, eteneminen, tai kuolemaan yhden vuoden ajan hoidon aloittamisesta [1, 2, 5, 9, 20, 21]. Nämä erittäin kehittyneet kasvaimet (eli vaihe IV) katsotaan olevan suuri riski uusiutumisen tai etenemisen [22], joten rooli ylimääräisiä markkereita voidaan rajoittaa nykyisen käytännön. Itse asiassa suurin osa paksusuolen syövän potilaille voidaan hoitaa parantava tarkoitus (eli vaihe II-III), jonka 5-vuoden taudista vapaan hinnat on ilmoitettu olevan noin 70% [23, 24], mikä viittaa siihen, että noin 30 % potilaista yhä vaativat huolellista seurantaa varten uusiutumisen. Tällä hetkellä, CEA on yksi ainoa molekyylimarkkereiden rutiinikäyttöön seurannassa leikkauksen jälkeisen seurannan [25]. Kuitenkin on raportoitu, että selviytyminen etua CEA seuranta ja kirurginen hoito on todennäköisesti pieni [26]. Tämä havainto on todennäköisesti johtuu siitä, että lisääntynyt CEA tasot ovat: (i) heikko ennustaja paikallisen uusiutumisen; ja (ii) suhteellisen myöhään tapahtuma [27]. Toisin kuin CEA, ctDNA reagoi nopeasti, on spesifinen kasvaimen taakkaa, ja on havaittavissa riippumatta histologinen tyyppi [2]. On kuitenkin syytä huomata, että yksi tärkeimmistä asioista käyttäen ctDNA vaiheen II-III potilailla on herkkyys. Esiintyvyys primaarikasvaimen perustuva mutaatiot ctDNA on vain 0,1-10,0% variantin alleelin frekvenssi, jopa hyvin pitkälle kasvaimissa [10, 11, 28]. Siksi ctDNA voidaan käyttää biomarkkerina vaiheen II-III tai jopa Vaihe I peräsuolen syövän potilaille, mieluiten herkkyys on pienempi kuin 0,1% [19]. Viimeaikaiset edistysaskeleet digitaali- genomista sekvensointiteknologioihin, kuten helmiä, emulsio, vahvistus, ja magnetismi (säteilevä) [29], tagged-amplikoni syvä sekvensointi (Tam-Seq) [10], turvallinen-sekvensointijärjestelmällä (Safe-SeqS) [30] , error-tukahdutetaan multipleksoitu syvä sekvensointi [31], ja Duplex sekvensointi [32] ovat lähestyneet tätä herkkyyttä kysyntää. Nämä menetelmät ovat itse asiassa erittäin tarkkoja, mutta ei ole täysin sovellettavissa etsiä mutaatioiden useita amplikoneihin rajallisesta kopiomäärä malleja kuten ctDNA [30]. Esillä olevassa tutkimuksessa, ensin tunnistetaan kasvaimen ainutlaatuinen mutaatiot Ion PGM, ja sen jälkeen nämä mutaatiot analysoitiin käyttämällä ddPCR. DdPCR vaatii pohjamaali /koetin suunnittelu ja validointi aikaisempien tunnistamiseksi jokaisen mutaation primaarikasvaimen mutta se ei vaadi altaan tai syvä sekvensoinnilla. Olemme vahvisti, että ddPCR oli sopiva määrän mittaamiseen harvinaisia ​​muunnoksia mutantti alleeli osa 0.1% tai enemmän (yksi mutantti-molekyylin taustalla 1000 villityypin molekyylien) [1, 33, 34]. Käytännön käyttöä ctDNA kuin tuumorikuorma seuranta merkki, vain pieni joukko varmasti tunnistettu mutaatioiden primaarikasvaimista voisi olla luotettavia merkkejä. Nykyinen strategia on siis järkevää kliinisen kasvaintaakkaa seuranta etenkin leikkauksen jälkeinen potilaalla on parantava tarkoituksessa.

Gene muutoksia mukana alkuvaiheessa tumorigeneesin ilmeisesti edullisia, koska MMS koska niiden pitäisi olla mukana perustamiseen tuumorigeenistä kloonit [4]. Periaatteessa geneettinen heterogeenisyys kasvain on katsottu johtuvan heterogeenisten kertyminen geneettisten muutosten päälle precancerous tai aikaisin syöpä vaurioita [35, 36]. Itse asiassa, mutaatiot

TP53

,

KRAS

,

KIT

, ja

CDKN2A

havaittiin endoskoopin ryhmässä kasvaimia sekä kehittyneitä syöpiä, mikä viittaa siihen, että nämä mutaatiot siirretty prosessissa syövän kehittymisen ja levittää koko kasvain massa. Jos tietty mutaatio liittyy varhaisen syövän kehittymisen kasvain, niin mutaation havaitseminen harha ctDNA johtuen kasvaimen heterogeenisuus olisi minimoitava. Kuitenkin tunnistaminen geenit, jotka ovat erityisesti mukana varhaista kehitystä yksittäisten kasvaimet voivat olla haastavaa. Esillä olevassa tutkimuksessa, se voi olla vaikea käsitellä klonaalisen heterogeenisuus kasvaimen mutaation profiloinnin pieni syöpään liittyvän geenin sekvensointi paneelin yhdestä koepalasta per primaarikasvaimen. Ihannetapauksessa kaikki mutaatiot, mukaan lukien ne, joilla on alhainen alleeli taajuuksilla primaarikasvaimen yhdestä koepala, on tutkittava ctDNA. Kuitenkin havaitseminen erittäin alhainen alleelin taajuus ei ehkä ole mahdollista vielä johtuu puutteesta ddPCR pohjamaali /koetin vahvistaa kunkin yksittäisen nukleotidin muutoksen kaikkien koodaavat alueet. Mutaatiostatuksesta profilointi useita koepaloja kasvaimesta voi olla vaihtoehto kompensoida klonaalisia heterogeenisyys, mutta tämä lähestymistapa ei vielä ole mahdollista pieniä kasvaimia, kuten polyyppien ja kokoisen kasvaimia. Siksi arviointi klonaalisen heterogeenisuus kasvain ei voi olla täysin mahdollista alussa syöpiä. Tällä välin mutaatiot korkea levinneisyys primaarikasvaimia-MMS peräisin syöpään liittyvän geenin sekvensointi paneeli tässä tutkimuksessa-voi olla yksi parhaista korvikkeita tämän lähestymistavan [11].

Yhteenvetona