Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen mitokondrioiden ATP-riippuvaiset Lon proteaasin toimintojen säätelyssä aineenvaihduntaa ja laadunvalvonta proteiinien ja mitokondriaalisen DNA (mtDNA). Kuitenkin rooli Lon syövän ei ole hyvin ymmärretty. Siksi tämä tutkimus tarkoituksena oli selvittää, kuinka tärkeää on Lon kohdunkaulan syöpäsolujen potilailta ja vakiintuneet solulinjat. Mikrosiruanalyysi 30 syöpään ja 10 normaali kohdunkaulan kudoksissa analysoitiin immunohistokemiallisesti for Lon proteiinin tasot. Ilmaisu Lon tutkittiin myös immunoblottauksella 16 tuoretta kohdunkaulan syöpä kudoksiin ja niiden ei-kasvain kohdunkaulan kudoksissa. Kaikissa tapauksissa, Lon ilmentyminen oli merkittävästi kohonnut kohdunkaulan karsinoomat verrattuna normaaleihin kudoksiin. Augmented Lon ilmentyminen kudossiruina ei vaihtelevat iän, kasvaimen solmu-etäpesäke laadut, tai imusolmuke etäpesäke. Kaatamalla Lon HeLa kohdunkaulan syövän solujen lentivrial transduktion aiheutti huomattavaa laskua sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Tällainen säätely alaspäin Lon ilmentymisen merkittävästi estänyt HeLa-solujen lisääntymisen. Lisäksi kaatamalla Lon alensivat solujen bioenergetiikan määritettynä mittaamalla aerobinen hengitys ja Glykolyysivaiheen käyttäen Seahorse XF24 solunulkoisen vuon analysaattori. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että Lon näyttelee mahdollisen roolin synnyssä kohdunkaulan syöpä, ja se voi olla hyödyllinen biomarkkereiden ja tavoite hoidossa kohdunkaulan syövän. Lon; immunohistokemia; kohdunkaulansyöpä; solujen lisääntymistä; cellular bioenergetiikan.

Citation: Nie X, Li M, Lu B, Zhang Y, Lan L, Chen L, et al. (2013) alaspäin säätäminen yliekspressoituu Human Lon kohdunkaulan syövän vaimentaa Cell Proliferation ja Bioenergetics. PLoS ONE 8 (11): e81084. doi: 10,1371 /journal.pone.0081084

Editor: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Biotekniikan keskus, Intia

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 08 lokakuu 2013; Julkaistu: 19 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Nie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tuettiin Natural Science Foundation of China (lupanumeroon 31070710), National Basic Research Program of China (lupanumeroon 2013CB531702), Zhejiang maakuntien ylänäppäintä kuria laboratoriolääketieteessä, toinen aalto Zhejiang maakunta ohjelman viljelyyn korkean -tason innovatiivisia terveyttä kykyjä sekä keskeiset tieteelliset ja teknologiset innovaatiot joukkue kliinisen laboratoriodiagnostiikan Zhejiangin maakunnassa (604091155). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on kolmanneksi yleisin maligniteetti naisilla maailmanlaajuisesti yli 500000 uutta tapausta diagnosoidaan vuosittain. Ihmisen papilloomavirus (HPV) -infektio on yleisin riskitekijä kehittämiseen lähes kaikissa tapauksissa kohdunkaulan syövän [1,2]. Alkuvaiheessa, kohdunkaulan syöpä on mahdollisesti parannettavissa yhdistelmän kautta leikkaus, sädehoito tai kemoterapia. 5 vuoden pysyvyys on yli 90%. Rutiininomaista käyttöä Papa ja HPV testit on parantunut merkittävästi tuloksiin kohdunkaulasyövän kehittyneissä maissa [3]. Valitettavasti potilaat alemman tulotason maissa usein diagnosoitu pitkälle edenneessä vuoksi puutteellisen seulonta, varhaisen diagnoosin ja parantavia hoitoja [4]. Huolimatta siitä, että suurin osa molekyylitason tutkimustyötä ovat perustuneet välistä yhteyttä korkean riskin HPV-tyypit ja kohdunkaulan syöpää, tunnistaminen romaani molekyylimarkkereita ja mekanismeja, jotka auttavat parannetun diagnostisia ja kemoterapeuttisen hallintaan tämän taudin on mielekästä.

Lon on evoluutiossa konservoitunut ATP-riippuvainen proteaasi läsnä bakteerien ja nisäkkäiden mitokondrioita ja peroksisomeissa [5-8]. Mitokondrion matriisi, Lon paitsi toimintoja proteiinia laadunvalvonta poistamalla epänormaali proteiineja, mutta myös proteiinia asetuksessa valikoivasti hajottamalla avain nopeutta rajoittava proteiineja [9-13]. Lon ylössäädellään erilaisissa stressin olosuhteissa, kuten kertymistä kehitettyjen proteiinien Endoplasmakalvosto, hypoksia ja muut stressiolosuhteissa [10,14,15]. Kokeet viljellyissä soluissa ja eläinmalleissa osoittavat, että tehostettu ilmentyminen Lon laukaisee hypoksia tai ER stressiä, ja mahdollisesti vaikuttavaa proteolyyttisen liikevaihdon ja /tai kokoonpano Hengitysketjun kompleksit kuten sytokromi c oksidaasi [14]. Vuonna Friedreichin ataksia, harvinainen perinnöllinen neurodegeneratiivinen sairaus, asteittaiseen pienenemiseen mitokondrioiden Fe-S proteiinien mukana on liittynyt lisääntyminen Lon proteiinin tasot ja Lon välittämän proteolyysin [15]. Lisäksi, Lon on mtDNA-sitovaa proteiinia, joka edullisesti yhdistää ohjaus- genomin alueella, jossa replikaatio ja transkriptio aloitetaan [16]. Lon on läsnä proteiinin osa mitokondrioiden nukleoidien, ja on liitetty huolto- ja ilmentymistä mitokondriaalisen DNA (mtDNA) [13,16,17].

Perustuen ajatus, että Lon ylössäädellään stressiolosuhteissa lievittää metabolisen ja proteotoxic stressin syöpäsoluissa, tarkastelimme Lon ilmentymistä ihmisen kohdunkaulansyövän kudosten ja normaali kohdunkaulan kudoksissa käyttäen immunohistokemia ja immunoblottaus ja löysi positiivinen korrelaatio Lon yli-ilmentymisen ja kohdunkaulan syöpä. Vastatakseen mekanismi ja biologisia toimintoja Lon kohdunkaulan syövän kasvainten synnyssä, me alassäädetty Lon proteiinin tasot käyttäen lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) transdusoidut HeLa-soluissa, jotka ovat yleisesti käytetään kohdunkaulan syöpä solulinjassa. Olemme osoittaneet, että kaatamalla Lon HeLa kohdunkaulan syövän solujen pienentää solujen lisääntymistä, mitokondrion hengitystä ja aerobinen Glykolyysivaiheen. Tulosten perusteella näyttää, että Pit tukee kohdunkaulan syövän kasvainten synnyssä ja voi olla uusi biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde kohdunkaulan syövän.

Materiaalit ja menetelmät

2.1 Kohdunkaulan syövän kudosta mikrosiruanalyysi varten Lon immunohistokemiallisesti

Kohdun kohdunkaulansyöpä kudossiruina ostettiin Biomax (luettelonumero CR602). Tämä microarray sisälsi kohdunkaulan normaaleissa kudoksissa (n = 10) ja syöpä kudosten eri vaiheissa (n = 30). Immunohistokemia suoritettiin käyttäen seuraavaa protokollaa. Lyhyesti, kudossiruina inkuboitiin 60 ° C: ssa kammiossa 2 tunnin ajan, poistettiin parafiini ksyleenillä, ja rehydratoitiin läpi sarjan etanolia eri pitoisuuksina. Objektilasit keitettiin 10 mM natriumsitraattia (pH 6,0), 15 minuuttia antigeenin haku, ja sitten reaktio pysäytettiin upottamalla 3% vetyperoksidia tislatussa vedessä 20 minuuttia. Jälkeen estää epäspesifisen sitoutumisen kanssa 3%: lla lampaan seerumialbumiinia 20 minuuttia, levyt inkuboitiin kanin anti-Lon-vasta-ainetta (Beijing Biosynthesis Biotechnology, Kiina) (1: 100 laimennos 1% BSA PBS: ssä) yli yön 4 ° C: ssa . Sitten lasit huuhdottiin kolme kertaa PBS: ssä ja inkuboitiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa biotinyloidulla lampaan anti-kani-vasta-ainetta laimennoksena 1: 100 1% BSA PBS: ssä. Sekundaarinen vasta-aine imettiin sitten, ja levyjä pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla avidiinilla. Levyjä käsitellään myöhemmin 3’3-diaminobentsidiinillä tetra-hydrokloridi (DAB), vastavärjättiin hematoksyliinillä ja lopuksi asennettu neutraali balata. Negatiiviset kontrollit ilman primaarista vasta-ainetta inkubaatio suoritettiin myös.

Jaksot kudosta havaittiin alle Olympus mikroskoopin (Olympus, Japani) ja kuvia otettiin 200 x suurennus samalla valon voimakkuus ja valotusaikaa. Kaikki kuvat sitten muunnetaan 8-bittinen harmaa-asteikolla. Lon värjäytymisen intensiteetti kohdunkaulan kudosten oli puolittain määrällisesti verrattuna analysoimalla integroitu optinen tiheys (IOD) arvo kunkin kuvan, joka mitattiin Image-Pro Plus kuva-analyysi-ohjelmisto (Media Cybernetics, USA).

2.2 kokoelma kohdunkaulan kudosnäytteitä

Tutkimus hyväksynyt eettinen komitea ensimmäisen Affiliated sairaala Wenzhoun Medical University, Wenzhou, ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan. Ihmisen kohdunkaulan kerättiin osastolla Naistenklinikka leikkauksen aikana potilailla, joilla on kohdunkaulan syöpä, joka tehtiin täydellinen kirurginen resektio taudin ensimmäisessä Affiliated sairaala Wenzhoun Medical University (Wenzhou, Kiina) välillä elokuuta 2012 ja maaliskuussa 2013. potilaiden valittiin perustuen patologinen diagnoosi kohdunkaulan syövän. Ei ollut todisteita siitä muiden pahanlaatuisten kasvainten ja ei aikaisempaa preoperatiivisen syöpähoidon. Jokaisen kirurginen poisto, kudosnäytettä välittömästi pikajäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes myöhempää analyysiä.

2,3 Soluviljely

HeLa-solulinja hankittiin America Type Culture Collection (Rockville, MD). Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM) (Sigma), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Sigma) ja antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä), 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

2,4 Lon pudotus by lentiviral shRNA trasduction

HeLa-solut maljattiin 16 tuntia ennen transfektiota 6-kuoppalevylle tiheydellä 2 x 10

5 solua /kuoppa. Solut infektoitiin LONP1-shRNA lentivirus- partikkeleita (MOI 5) (Santa Cruz, sc-97290-V) tai kontrolli shRNA (Santa Cruz, sc-108080) viljelyväliaineessa, joka sisältää polybreeniä lopulliseen konsentraatioon 5 ug /ml. Elatusaine jälkeen aspiroitiin ja korvattiin tuoreella kasvualustalla, yön yli inkuboinnin jälkeen. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia myöhemmin, solut siirrostettiin 60 mm: n maljoille, joissa väliaineessa, joka sisältää puromysiiniä lopulliseen konsentraatioon 3 ug /ml. Tuoretta kasvualustaa puromysiini korvattiin päivittäin valinnan transdusoidut solut. Useita yhden solun klooneja siirretään valikoidusti käyttämällä steriiliä kloonauksen levyjen kuoppiin 24-kuoppalevyllä ja laajennettu. LONP1-shRNA kloonit osoittavat tehokkain pudotus verrattuna kontrollieläimiin shRNA kloonit tunnistettiin immunoblot-analyysillä ja käytetään edelleen analysointia

2,5 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (RT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantitoitiin käyttäen nanodrop lukija ja 2 ug RNA: ta käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen suuren kapasiteetin cDNA käänteistranskription Kit (Applied Biosystems) ja satunnaisia ​​alukkeita. CDNA laimennettiin ja 200 ng cDNA: ta käytettiin templaattina reaktiota kohden. Reaaliaikainen PCR (RT-PCR) analyysit suoritettiin TaqMan Gene Expression Assays (Hs00998404_m1 LONP1, Hs02800695_m1 HPRT1, Applied Biosystems) käyttäen seuraavia olosuhteita: denaturaatio 95 ° C: ssa 10 minuuttia, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 15 sekuntia ja hehkutus ja laajentaminen 60 ° C: ssa 1 min. Suhteellinen

LONP1

mRNA ekspressiotasoja normalisoitiin vastaan ​​taloudenhoito geeni hypoksantiinifosforibosyylitransferaasin 1 (HPRT1) käyttäen vertailevaa ΔΔCt menetelmällä. ΔΔCT laskettiin yhtälön [Ct1 (LONP1) -Ct1 (HPRT1)] – [CT2 (LONP1) -Ct2 (HPRT1)], Ct1 ja CT2 ovat Ct arvoja LONP1-shRNA ryhmä ja ohjaus shRNA vastaavasti ryhmä, ja suhteellinen kertainen muutos geenin laskettiin yhtälön 2

-ΔΔCt.

2,6 immunoblot-tunnistus Lon proteiinin

Jäädytetyt kudosnäytteet ja solut hajotettiin, kun läsnä on proteaasiestäjäseostabletit ja sentrifugoitiin 12000 x g 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa (BCA) menetelmällä. Yhtä suuret määrät proteiinia uutetta (20 ug kuoppaa kohti) erotettiin SDS poly akryyliamidia (SDS-PAGE). Erotetut proteiinit siirrettiin 0,2 um nitroselluloosakalvoa ja estetty 3% rasvatonta maitoa PBS: ssä. Blottia inkuboitiin kanin anti-humaani Lon (1: 300) 4 ° C: ssa yön yli ja sen jälkeen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (1: 5000, Santa Cruz). Vasta-aine β-aktiini käytettiin latauskontrollina kokeilua varten. Sitten membraania inkuboitiin kemiluminesenssisubstraatilla (Denville) 5 minuutin ajan ja altistettiin röntgenfilmille ja kehitetään pimeässä huoneessa. Signaalit havaittiin ja kvantitoitiin densitometrialla käyttäen Image-J ohjelmisto (National Institutes of Health, USA).

2,7 Soluproliferaatiomääritys

Ohjaus ja Lon pudotus solut ympättiin 6-kuoppaiselle kudosviljelylevylle tiheydellä 5 x 10

4 solua kuoppaa kohti ja inkuboitiin yön yli. Jälkeen trypsiinikäsittelyllä, solut suspendoitiin uudelleen yhtä suureen tilavuuteen elatusainetta ja trypaanisininen (0,05% liuos). Määrä elävien solujen kolmena rinnakkaisena, että ulkopuolelle trypaanisinistä laskettiin 6 päivää, jolloin saatiin solujen kasvukäyrän.

2,8 Seahorse XF-24 metabolisen flux analyysi

hapenkulutuksen (OCR) ja solunulkoisen happamoitumista rate (ECAR) mitattiin käyttämällä Seahorse XF24 solunulkoisen flux analysaattori (Seahorse Bioscience). Kaksikymmentäneljä tuntia ennen koetta, vakaa LONP1-shRNA HeLa-soluja (Lon ryhmä) ja valvonta-shRNA HeLa-soluja (CTR-ryhmä) viljeltiin Seahorse XF-24 levyille tiheydellä 5 x 10

4 solua kuoppaa kohti. Päivänä metabolisen flux analyysin, elatusaine korvattiin 675 ul: puskuroimattoman DMEM (DMEM, jota oli täydennetty 25 mM glukoosia, 1 mM natriumpyruvaattia, 31 mM NaCl, 2 mM Glutamax, fenolipunaista, pH 7,4) ja inkuboitiin 37 ° C ° C ei-CO

2 inkubaattoriin 1 tunnin ajan. Kaikki injektio reagenssit säädettiin pH-arvoon 7,4. Perustason mitattiin 37 ° C: ssa neljä kertaa ennen peräkkäin ruiskuttamalla seuraavat mitokondrio-inhibiittorit-oligomysiini (10 uM), carbonycyanide p- (trifluorimetoksi) fenyy- (FCCP, 1,50 uM), ja rotenoni (10 uM). Lisäyksen jälkeen kunkin inhibiittorin, neljä lukemaa on otettu myös. OCR ja ECAR oli lasketaan automaattisesti Seahorse XF-24 ohjelmisto. Jokainen piste edustaa keskimäärin 7 eri kuopissa.

2.9 Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen SPSS.11 ohjelmistoa. Yksisuuntainen ANOVA suoritettiin immunohistokemiallinen tulokset ja vertailu Lon ja CTR ryhmien

in vitro

kokeita. Virhepalkit kokeissa edustavat keskihajonta keskiarvosta (keskiarvo ± S.D.) kolmesta erillisestä kokeesta, ellei toisin mainita.

P

arvot ≤ 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

3.1 LONP1 on yli ilmaistaan ​​kohdunkaulan syövän kudoksissa

Selvitimme Lon proteiinin tasot 30 kohdunkaulan syöpä ja 10 ei-neoplastisia kohdunkaulan näytteiden suuren suoritustehon immunohistokemiallinen analyysit. Edustava osa Lon ekspression kaikissa kudoksissa on esitetty kuviossa 1. Kuitenkin, Lon ilmentyi oleellisesti korkeammalla tasolla syövän näytteiden toisin kuin heikko, mutta havaittava ilmentyminen normaaleissa kudoksissa, joissa on tilastollista merkitystä (

P

0,01) (taulukko 1). Täydennetty ilmentyminen Lon havaittiin poikki eri laatujen kohdunkaulan syövän ilman näkyviä eroja hyvin, kohtalaisen, ja huonosti eriytetty kudoksiin (kuvio 1 B-D). Samoin tuoreiden kohdunkaulan syövän kudoksissa, Lon havaittiin olevan enemmän erittäin ilmaistuna kuin vastaavilla ei-tuumorikudoksissa, kuten on esitetty immunoblottauksella (kuvio 2 A ja B). Myös tutki Lon yliekspressio liittyi riskitekijöitä, kuten ikä ja kliinis ominaisuudet kuten kasvaimen koko, kasvain vaiheessa paikallinen invaasio, ja imusolmuke etäpesäke. Lon ilme ei merkittävästi korreloi iän, kasvaimen, TNM (tuumori-solmu-etäpesäke) laatuja, tai imusolmuke etäpesäke jotka esitetään taulukossa 2. Yhdessä Lon on yliaktiivista kohdunkaulan syöpä.

(A) Normaali ihmisen kohdunkaulan kudoksissa. (B) Kohdunkaulan syöpä laatu 1. (C) Kohdunkaulan syöpä grade 2 (D) Kohdunkaulan syöpä arvosana 3. Bar asteikko: 50 um.

Luokka

asiat

Lon värjäystä IOD (x 10

4)

P

-arvo

*

Normal cervix104.47 ± 2.070.004Cervical cancer307.19 ± 2.52Table 1. Lon ilmentymistä normaaleissa kohdunkaulan kudoksissa ja kohdunkaulan syöpä kudoksiin.

a Lon värjäys integroitu optinen tiheys (IOD) mitattiin Image Pro Plus analyysin ohjelmisto. Aineisto semi-kvantitatiivisesti analysoitiin ja ilmaistiin keskiarvona ± S.D. *

P

≤ 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. CSV Lataa CSV

(A) edustaja immunoblottia Lon proteiinin ilmentymisen havaittiin useissa ihmisen kohdunkaulan syövän (parilliset juovat) ja vastaavat ei-kasvain (parittomat juovat) kohdunkaulan kudosten Western blot -analyysillä. (B) Kohdunkaulan syöpä ilmentää merkittävästi suuremman Lon verrattuna ei-kasvain kohdunkaulan kudokseen,

P

0,05. Tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. 16 ryhmää kohdunkaulan kudosten (normaali Cancer).

Luokka

Alaluokka

asiat

Lon värjäystä IOD (x 104)

Yhteensä

P-arvo

*

Ikä (v) 50196,72 ± 2.47300.186≥50118.00 ± 2.52Tumor GradeGrade 1107,00 ± 3.16300.522Grade 2107,93 ± 2.55Grade 3106,65 ± 1.74Invasion of tumorT1176 0,81 ± 2.82300.347T2137.70 ± 2.06Lymph solmu metastasisN0287.18 ± 2.59300.900N127.41 ± 1.80Table 2. suhde Lon ilmaisun ja kliinis ominaisuudet kohdunkaulan syövistä.

a Lon värjäys integroitu optinen tiheys (IOD) mitattiin Image Pro Plus analyysin ohjelmisto. Aineisto semi-kvantitatiivisesti analysoitiin ja ilmaistiin keskiarvona ± S.D. *

P

≤ 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. CSV Lataa CSV

3,2 Down sääntely Lon HeLa kohdunkaulan syöpäsolut

määrittämiseksi tärkeyden Lon selviytymisen kohdunkaulan syövän solujen, me käytti shRNA tekniikkaa. Arvioidaan spesifisyyden shRNA että

LONP1

geeni ja laajuus Lon alassäätöä sovelletaan HeLa-solujen, RT-PCR ja immunoblot-analyysi tehtiin. RT-PCR vahvisti, että LONP1 shRNA nimenomaan vähensi

LONP1

mRNA-tasolla 60% 10 vuorokauden kuluttua transfektion (

P

0,001; Kuva 3). Immunoblot-analyysi osoitti huomattavaa laskua ~ 100 kDa Lon proteiinin tasot verrattuna kontrolliryhmään (CTR

, P

0,001; Kuva 3 B ja C). Tehokkaimmin vaimentua solun klooni LONP1-shRNA valittiin lisätutkimuksia varten.

(A) edustaja RT-PCR-analyysi

LONP1

mRNA-tasolla HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu valvontaa tai LONP1 shRNA. (B) edustaja immunoblot osoittaa Lon proteiinin tasot otteita transfektoiduissa HeLa-soluissa valvontaa tai LONP1 shRNA. (C) Densitometria käytettiin määrittämään suhteellinen Pit-proteiinin tasot normalisoidaan P-aktiini on esitetty (B); ***

P

0,001. (D) Cell kasvun ohjaus ja LONP1 shRNA transdusoituja HeLa-solut,

P

0,05. Tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmesta erillisestä kokeesta.

3.3 Down-regulation of Lon vähentynyt proliferaatio ja pesäkkeiden muodostumista HeLa kohdunkaulan syöpäsolujen

Enhanced solukasvu on yksi tärkeimmistä ominaisuuksista kasvaimen kehitystä. Olemme ensi tutkinut vaikutusta kaatamalla Lon HeLa soluproliferaatioon

in vitro

. Solulisäkasvumääritykselle osoitti, että solujen kasvu Lon shRNA ryhmässä oli merkitsevästi alempi kuin CTR ryhmässä (

P

0,05; kuva 3 D). Mikroskooppinen analyysi osoitti, että koko solun pesäkkeen havaittiin olevan suhteellisen pienempi Lon ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (tuloksia ei ole esitetty).

3,4 Down-regulation of Lon ilmentymisen laskee energia-aineenvaihdunnan ja HeLa kohdunkaulan syöpäsolut

eteni määrittää vaikutus Lon knockdown solu- energetics mittaamalla hapenkulutus hinnat (OCR) ja solunulkoisen happamoitumista hinnat (ECAR), jotka ovat indikaattoreita mitokondrioiden hengityksen ja maitohapon tuotannon kautta aerobinen Glykolyysivaiheen soluissa vastaavasti. Basal OCR (lähtötilanteessa miinus oligomysiini), joka on mitta oksidatiivisen fosforylaation (OXPHOS), havaittiin olevan huomattavasti vähäisempää Lon ryhmään verrattiin kontrolliryhmään (

P

0,001; Kuva 4 B), mikä on alempi riippuvuus OXPHOS energiantuotantoon Lon-shRNA soluissa. Huomattava lohko Glykolyysivaiheen havaittiin myös Lon ryhmässä mikä näkyy merkittävä lasku ECAR suhteessa CTR ryhmään (kuva 4 D, lähtötilanteessa). Lisäämällä oligomysiini, joka estää F

0 ATP-syntaasi monimutkainen ja elektronin virtaus, laski jyrkästi OCR molemmissa ryhmissä samassa määrin (kuvio 4 A, oligomysiini). Lisääntyminen ECAR vastauksena oligomysiini havaittiin korreloivan lasku OCR (

P

0,05; kuva 4 D, oligomysiini), mikä viittaa laktaatin kautta Glykolyysivaiheen. FCCP injektio irrotetaan mitokondriaalisen hengityksen ATP synteesi ja kasvanut dramaattisesti OCR molemmissa solulinjoissa, antaa arvio varauksesta hengitysteiden kapasiteetti mitokondrioiden (kuva 4 A, FCCP). Lopuksi lisäys monimutkainen I -estäjä rotenone johti vastaavasti jyrkkä lasku OCR molemmissa solulinjoissa, ja jäljelle jäänyt OCR pidettiin ei-mitokondrioiden solujen hapenkulutus (kuvio 4 A, rotenone). Lon shRNA knockdown johti vähentynyt selvästi koko mitokondrioiden hengityskapasiteetti verrattuna kontrolliin soluihin (

P

0,001; Kuva 4 C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että alas-säätely Lon ilmentymisen HeLa-soluissa estää solujen energia-aineenvaihduntaa.

(A-C) Seahorse Bioscience XF24 solunulkoisen vuon analysaattorin käytettiin mittaamaan OCR (pmoolia /min), joka ilmaisee OXPHOS HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu valvontaa tai LONP1 shRNA. (A) Kun on todettu perustason, oligomysiini (10 uM), FCCP (1,50 uM), ja rotenone (10 uM) lisättiin peräkkäin. (B) pohjapinta OCR laskettiin erotus keskiarvon ajankohtina lähtötilanteessa (numerot 1-4), ja oligomysiini hoidossa (numerot 5-8) (lähtötilanteessa miinus oligomysiini OCR). (C) Maksimaalinen mitokondriaalisen hengityksen kyky käyrän alapuolinen alue (AUC) kahden ryhmän tajunnut käyttäen ero AUC OCR (pmoolia) summia ajankohtina FCCP hoidossa (numerot 9-12) ja rotenone hoidossa (numerot 13 16) (FCCP miinus rotenone AUC OCR). (D) profilointi ECAR (MPH /min) valvonta- ja Lon knockdown soluja mitattiin samalla kokeissa kuvatun (A). ***

P

0,001. Tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmesta erillisestä kokeesta.

Keskustelu

HPV-infektio on ensisijainen syy kohdunkaulan syövän. Laajimmin käytetty biomarkkereiden hallintaan kohdunkaulan ennalta syöpä on seulonta HPV-DNA [18]. Korkean riskin HPV-tyypille ominainen onkoproteiineja E6- ja E7 arveltiin olevan tärkeimpiä tekijöitä solutransformaatio ja syövän syntymistä [19,20]. Muita funktionaalisia biomarkkereita tutkittu kohdunkaulan syöpä ovat markkereita squamous erilaistumisen sytokeratiini (CK), solusyklin markkereita, kuten p21, p27, MCM5, sykliini A, sykliini E ja sykliini D, ja muut molekyylit, kuten telomeraasi, involukriini, ja surviviini. Samarzija äskettäin todennut, että Hedgehog (Hh) signalointireitin aktivoituu kohdunkaulan syövän peräisin olevia soluja käyttämällä Shh ligandin ja Hh-reitin estäjiä, mikä osoittaa estäminen tämä reitti voi olla terapeuttista vaihtoehto torjua kohdunkaulan syöpää [21].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että muutokset mitokondrion Lon proteiinin ilmentyminen liittyy erilaisia ​​ihmisen sairauksia, mukaan lukien familiaalinen amytrophic lateraaliskleroosi [22], syövät [23-25], sekä ikääntymiseen [26], ja Friedreich ataksia [15]. Nämä havainnot merkitsevät keskeinen rooli mitokondrion Lon proteaasi fysiologiseen solutoiminnoille. Kuitenkin kysymyksiä ekspressiokuviota ja roolia Lon syöpäsolun selviytymisen vielä ole täysin ymmärretty. Tässä tutkimuksessa valaista merkittävä rooli Lon ihmisen kohdunkaulan syövän. On hätkähdyttävää todeta, että Lon proteiini ylössäädellään kaikissa vaiheissa kohdunkaulan syövän mikrosiruja ja potilaiden näytteistä verrattuna hallita niitä.

Lon on stressiproteiinia samanlainen lämpösokille tekijät, jotka voimistunut stressiolosuhteissa [27]. Yleensä syöpäsolut ovat alle aineenvaihdunnan ja proteotoxic stressi, joissa on tarve kompensoivana lieventämään näitä rasituksia säilyttää tuumorigeenisyyteen ja solujen elinkykyä. Mitokondriot on tärkeä rooli aikana syövän leviämisen toimittamalla energiaa, ja kiertää apoptoosin. Lon on yksi tärkeimmistä mitokondriaalisen proteaasit, jotka tunnistavat ja hajottavat unfolded, väärin laskostuneet ja epänormaali proteiinien mitokondrioissa. Yli-ilmentyminen mitokondrioiden Lon Tässä esitetyt voimakkaasti tarkistanut, että se on yksi tärkeimmistä toimijoista kohdunkaulan syövän synnyn. Seurauksena rajallisesta saatavuudesta tuoreen kohdunkaulan syövän kudoksiin Tässä tutkimuksessa käytetyt, meillä ei ollut kykyä määrittää korrelaation proteiinin tasot Lon kanssa lavastus kohdunkaulan syöpä. Tuleva työ perustuu laajentuneen näytteistä määritetään, Lon transkriptipitoisuuksissa sekä proteiini liittyy kliinis kohdunkaulan syöpä.

mitokondrio Lon proteaasi erottuu useita toimii mitokondrion sitova proteiini, joka on kaperonia muistuttava proteiini kokoonpanon aikana mitokondrion sisemmän kalvon kompleksit ja selektiivinen epänormaalien proteiinien hajotukseen [14,28]. Tutkimukset hiiva osoittivat, että heikentävien Lon näyttää hengityksen vajaus johtuen kertymistä mitokondrioiden proteiineista ja eivät kykene kasvamaan fermentoitumatonta hiilen lähteitä [6,29]. Sekä hiiva- ja nisäkässoluissa pudotus Lon johtaa kertyminen elektronin tiheä sulkeumia, joiden oletetaan olevan epänormaali proteiinien mitokondrioiden [6,25,30]. Kaatamalla Lon käyttäen pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) aiheuttama alentunut kasvaimen solujen kasvua ja parantaa solujen herkkyys sisplatiinin ja ultraviolettivaloa että rintasyövän peräisin MCF-7 [31]. Vastaavasti alaspäin säätäminen Lon proteaasi WI-38 VA-13 ihmisen keuhkon fibroblastit antisense morpholinos heikentynyt mitokondrioiden rakenne ja toiminta ja aiheutti apoptoosin [32]. Lisäksi yksi viimeaikainen tutkimus on raportoitu, että Obtusilactone A ja (-) – sesamin indusoi apoptoosin ihmisen keuhkosyövän soluja aktivoimalla DNA-vaurioita tarkistuspisteitä ja estämällä mitokondrion Lon proteaasia [24]. Uudemmat työ osoittaa, että lentiviruksen välittämä kaataa Lon johtaa B-lymfaattisen solukuolemaa [25]. Nämä havainnot yhdessä viittaavat siihen osallistumista Lon kasvaimen synnyssä.

On tunnettua, että reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) syntyy pääasiassa nisäkkäiden mitokondrioiden elektroninsiirtoketju aikana OXPHOS myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn ohjauskeinoilla soluproliferaation, transformaatio fenotyyppejä, ja selviytyminen [33]. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen Lon useissa syöpäsolulinjoissa ilman HeLa-soluissa on äskettäin osoitettu aiheuttavan tuotannon ROS ja edelleen aktivoida-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) ja Ras-ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (Ras-ERK) signalointia, jotka ovat mukana tarjoamassa selviytymisen etuja syöpäsolut, stressin vastaus, ja sopeutuminen kasvaimen microenvironment [34]. Tutkia roolia Lon kohdunkaulan syövän, HeLa-solut transdusoitiin lentiviruksen kuljettavat shRNA varten erityinen knockdovvn Lon. Down-regulation endogeenisen Lon vaimenee leviämisen kapasiteettia HeLa-solujen viljelmässä, ja johti väheneminen yleisessä solujen energia-aineenvaihduntaan. Me spekuloida, että tämä ilmiö Lon puutteellinen HeLa-soluissa johtuu suhteellisesta puutos Lon toiminto. Vähentynyt kaperonitoiminta Lon heikentää kokoonpano ja /tai toiminta hengityselinten kompleksit ja siten voi estää mitokondrion ROS tuotanto, mikä on ratkaisevan tärkeää selviytymisen ja leviämisen syöpäsoluja. Kasvun estäminen HeLa-soluissa ja sen alhaisempi pohjapinta OCR ja OCRs lisäämisen jälkeen hengitysteiden komplekseja ”estäjien jälkeen Lon hiljentäminen ovat hyvässä sopusoinnussa tämän selityksen [35]. Lisäksi kasvun inhibitio voi osittain johtua menetys proteiinin laadun valvonta, jonka tuloksena haitallinen kertyminen väärin laskostuneen, irralliset ja /tai hapettumalla vahingoittuneiden proteiinien [36]. Mekanismi Tämän osan tulisi selvittää tarkempaa analyysiä.

Johtopäätös

lisääntymisen merkkejä Lon proteaasin kohdunkaulan syöpä on yksi sopeutumismekanismit solujen elinkelpoisuuden. Down säätämiseen tai estämällä Lon kohdunkaulan syöpäsoluja pysähtynyt cancer solujen lisääntymistä muuttamalla bioenergetic aineenvaihduntaa ja siten kohdistaminen Lon voi olla yksi mahdollisista menetelmistä syövän hoidossa. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään signaloinnin kanavat, joita Lon edistää tuumorigeenisyyteen kohdunkaulan syöpä. Yhdessä Lon voisi olla hyödyllinen biomarkkereiden kohdunkaulan syövän ja mahdollinen kohde kehitettäessä uusia lääkkeitä syövän hoitoon.

Kiitokset

Kiitämme tohtori C.K. Suzuki, Dr. V. Sundararajan ja Jae Lee hyödyllisiä keskusteluja ja katsaus tämän käsikirjoituksen.