Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lukuisat pitkäikäisyys geenit on löydetty malliorganismeja ja muuttaa niiden toiminta johtaa pitkäaikaiseen elinikä. Nisäkkäillä, jotkut ovat arvelleet, että mitään terveyshyötyjä johdettu manipuloimalla näitä samoja reittejä voidaan tasoittaa lisäämällä syöpäriskiä, ​​koska niillä taipumus lisätä solujen eloonjäämistä. SIR2 /SIRT1 perheen NAD

+ – riippuvaista deasetylaaseja ehdotetaan taustalla terveyshyötyjä kalori rajoitus (CR), ruokavalio, joka yleisesti estää syöpää nisäkkäillä. Tässä osoitamme, että CR indusoi kaksinkertaisen lisäyksen SIRT1 ekspressiota suolessa jyrsijöiden ja että ektooppinen induktio SIRT1 on β-kateniinin perustuva hiirimallissa paksusuolensyöpä vähentää merkittävästi kasvaimen muodostumisen, leviämisen, ja eläinten sairastuvuutta puuttuessa CR. Osoitamme, että SIRT1 deasetyloi β-kateniinin ja estää sen kykyä aktivoida transkriptiota ja ajaa solujen lisääntymistä. Lisäksi SIRT1 edistää sytoplasmisen lokalisoinnin muuten ydin–lokalisoitu onkogeenisiä muotoa β-kateniinin. Tämän mukaisesti, on merkittävä käänteinen korrelaatio löytyi läsnäolo ydin- SIRT1 ja kasvaimia synnyttävän muodon β-kateniinin 81 ihmisen paksusuolen kasvain näytteet analysoidaan. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että SIRT1 estää suolen kasvainten muodostumista

in vivo

ja nostaa mahdollisuus, että hoitoja kohdistaminen SIRT1 voi olla kliinistä käyttöä β-kateniinin perustuva syöpäsairauksia.

Citation: Firestein R, Blander G, Michan S, Oberdoerffer P, Ogino S, Campbell J, et al. (2008) Teollisuuden SIRT1 deasetylaasi vaimentaa Suoliston kasvaimen kehittymisen ja paksusuolen syövän kasvua. PLoS ONE 3 (4): E2020. doi: 10,1371 /journal.pone.0002020

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 5 maaliskuuta 2008; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2008; Julkaistu: 16 huhtikuu 2008

Copyright: © 2008 Firestein et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: RF oli tukee NIH T32 Grant. GB jota Estee Lauder tutkijatohtorin. PO jonka National Space Biomedical Research Institute Grant. DAS, SO, CSF ja LG avustuksilla NIH; RD osittain Intramural tutkimusohjelma NIH /NIA. DS tukee myös lahja Paul F. Glenn Foundation.

Kilpailevat edut: Leonard Guarente ja David Sinclair ovat konsultteja Sirtris Pharmaceuticals. William Hahn on konsulttina Novartis Pharmaceuticals.

Johdanto

Syöpä on toiseksi suurin syy ikääntymiseen liittyvää kuolleisuutta ihmisissä. Kalori rajoitus ulottuu elinikä Kaikkien organismien testattu ja nisäkkäillä kykenee vahva kasvaimen tukahduttava vaikutus [1]. Alemmilla eukaryooteissa,

SIR2

geeni ehdotetaan välittävän terveyshyötyjä CR [2], [3]. SIRT1, nisäkkään ortologi

SIR2

, indusoidaan CR useita Nisäkkäiden, ja sen on osoitettu lievittävän rappeuttavia sairauksia, jotka liittyvät ikääntymiseen, kuten hermoston rappeutumisen ja aineenvaihdunnan lasku [4]. Kun taas CR tiedetään estävän sekä spontaani ja indusoitu kasvainten muodostumista, rooli SIRT1 tässä prosessissa jää osoittaa, [5]. On ristiriitaisia ​​tietoja

in vitro

siitä SIRT1 löytyy toimimaan onkogeeni tai tuumorisuppressorina mutta toistaiseksi ei ole ollut

in vivo

tutkimuksissa, joissa käsitellään tätä kysymystä. Toisaalta, SIRT1 on yliaktiivista kasvaimia ja syövän soluja, joista puuttuu tuumorisuppressorigeenin, HIC1 [6], voi estää apoptoosia [7], [8], [9], [10] ja alas-säätelee ilmentymistä kasvaimen synnyssä [11], mikä on monissa päätellä, että SIRT1 osoittautuu onkogeeninä

in vivo

. Toisaalta, SIRT1 voi olla pro-apoptoottinen [12] ja anti-proliferatiivista [13], [14], ja näin ollen on ehdotettu käyttäytyä tuumorisuppressorina

in vivo

. Lisäksi jotkut ovat väittäneet, että nisäkkäiden pitkäikäisyys geenit, jotka viivästyttävät ikään liittyviä atrofinen taudit voivat päinvastoin altistaa ihmiset korkeampaan syövän johtuen niiden apoptoosin vastaisen toiminnan [15]. Tämä tutkimus käsittelee tätä kiistanalainen kysymys testaamalla vaikutuksia SIRT1 kasvainten muodostumiseen ja kasvuun.

Päätimme testata vaikutusta SIRT1 APC

min /+ mallin paksusuolensyöpä varten eri syistä : se fysiologisesti yhteenveto siitä aikaisin tapahtumien paksusuolen syöpää, mekanismi tumorigeneesin on hyvin tunnettu, ja CR on aiemmin osoitettu hidastavan kasvaimen tässä mallissa [16]. APC

min /+ hiiri on ituradan mutaatio adenomatoottisen polypoosin coli (APC) tuumorisuppressorigeenin [17]. Somaattiset menetys toisen alleelin johtaa konstitutiivista ydinvoiman lokalisointi β-kateniinin ja adenooma muodostumisen [18], [19].

β-kateniinin on keskeinen efektori on kanoninen Wnt-signalointireitin, joka ohjaa kantasolujen ylläpito , kehitys ja syövän syntymistä [20]. Konstitutiivinen aktivointi β-kateniinin reitin on havaittu 90%: ssa paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [21], [22]. Lisäksi tämä reitti on poikkeuksellisesti aktivoituu monien muiden syöpien, mukaan lukien eturauhas-, rinta-, munasarja- ja melanooma. Kiinnostavaa kyllä, kaksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että lisääntynyt Wnt signalointia liittyy vanhetessa, mikä viittaa siihen, että vaimennus Wnt signalointi voisi taustalla CR ja on hyödyksi syövän hoitoon vaan laajemmin vaimentamiseksi sairauksia ikääntymisen [23], [24] .

tässä raportoidaan että SIRT1 estää suoliston tuumorigeneesiä APC

min /+ hiirimallissa ja estää paksusuolen syövän kasvua. Tarjoamme merkittävää näyttöä siitä, että antituumorigeenistä vaikutuksia SIRT1 riippuvat sen deasetylaasia aktiivisuus ja välittyvät eston β-kateniinin. Nämä havainnot tunnistaa kasvaimen tukahduttava toiminto SIRT1, tarjoavat mekanistinen oivalluksia, ja ehdottaa terapeuttista roolia SIRT1 deasetylaasin aktivaattoreita paksusuolen syöpä.

Tulokset

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet dramaattinen kasvaimen tukahduttava vaikutus CR mutta molekyylitason mekanismi (t) ei toistaiseksi tunneta. Havaitsimme, että rotat on CR ruokavalio on ~ 2 kertaa korkeampi SIRT1 suolen epiteelissä suhteessa

ad lib

-fed valvontaa (Fig. 1A). Testata lisäävät SIRT1 ilmentymisen suolen epiteelisolujen, olemme tuottaneet Floxed SIRT1 siirtogeenisen hiiren (Fig. 1 B). SIRT1 siirtogeenisiä hiiriä risteytettiin APC

min /+ hiirillä seuraa jalostukseen on villiiniä-Cre-kantaa [25]. Niinpä syntyy kolminkertainen siirtogeenisiä hiiriä (SIRT1

ΔSTOP; Vil-Cre; APC

min /+), joka yli-ilmentää SIRT1 erityisesti suolistossa Villi (kutsutaan SIRT1

ΔSTOP). SIRT1 tasot suolistossa SIRT1

ΔSTOP hiiret olivat noin 7-kertainen (Fig. 1 E) ja morfologia Villi ilmestyi muuten normaali (Fig. 1 F).

(A) Western blot -analyysi osoittaa ekspressiotasot suolistossa epiteelin SIRT1 ad libitum ruokittujen (AL) tai kalori rajoitettu (CR) rottia. β-aktiini toimi latauskontrollina kaikissa kaistoilla. (B) Kaaviokuva strategiaa käytetään sukupolven floxed SIRT1 hiiren alkion kantasoluja (MES) soluja. SIRT1 kloonattiin alavirtaan konstitutiivisen CAGGS promoottorin, jota seuraa transkription loxP-STOP-loxP kasetti. Tämä rakenne on tarkoitettu erityisesti 3 ’UTR kollageenin A1-lokus (ColA1) hiiren alkion kantasoluja (MES) soluissa FLP rekombinaatiolla. Tavoiteltu MES Solut injektoitiin blastokysteihin. Punaiset nuolet osoittavat sijainnin SIRT1-Tg genotyypitys alukkeita. (C) Southern blot, joka osoittaa vahvistuksen SIRT1

STOP single integroitumista Col1A lokukseen MES soluja. (D) PCR vahvistetaan ituradan lähetyksen SIRT1

STOP siirtogeenin että sillikuningaskalat ”jälkeläisiä. (E) Western blot, joka osoittaa tasot SIRT1 triple siirtogeenisiä hiiriä yli-ilmentävät SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) ja valvonta (SIRT1

STOP). β-aktiini toimi latauskontrollina kaikissa kaistoilla. (F) Mucin tahra ja immunohistokemialla SIRT1 ohutsuolessa kokeellisen (SIRT1

ΔSTOP) ja valvonta (SIRT1

STOP) eläimet.

APC

min /+, SIRT1

STOP ohjaus hiirillä, jotka eivät yli-ilmentävät SIRT1 (kutsutaan SIRT1

STOP) osoitti tyypillisen kasvainmerkkien sairastavuuden 16 viikon iässä, on osoituksena avoin anemia ja kakeksia, kun taas APC

min /+ hiirillä yli-ilmentävät SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) ei ollut mitään selviä merkkejä kasvaimeen liittyvien sairastuvuuden (Fig. S1A, B). Tutkiminen suolen vuori neljän kuukauden iässä osoitti, että SIRT1

ΔSTOP siirtogeenisiä hiiriä oli huomattavasti pienempi ja vähemmän kasvaimia pitkin suolistossa (Fig. 2A). Kvantifiointi kasvaintaakka paljasti 3-4-kertainen väheneminen lukumäärän ja koon adenoomien sisällä ohutsuolen ja paksusuolen ja SIRT1

ΔSTOP hiirissä (Fig. 2B). Ki-67 on rakeinen osa nucleolus, joka on ilmaistu yksinomaan jakautuvat solut ja käytetään prognostinen markkeri ihmisen neoplasioiden. Adenoomia, että SIRT1

ΔSTOP hiirillä oli merkittävä väheneminen määrän mitoosien (per suuritehoisia kenttä) ja Ki-67 värjäys, joka osoittaa, että oli laskua adenooma leviämisen (Fig. 2C). Nämä tiedot osoittavat, että yli-ilmentyminen SIRT1 suolistossa samalla tasolla kuin aiheuttamien CR riittää matkimaan kasvain tukahduttava vaikutus CR APC

min /+ hiiri.

(A) Kuvia koko pohjukaissuolen ja sykkyräsuolileikkeissä näyttää brutto suoliston kasvaimet hiirissä yliekspressoivat SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) ja valvonta (SIRT1

STOP). Yhtenäinen viiva maha-pohjukaissuolen risteyksessä. Nuolet osoittavat adenoomia. Valkoinen palkki tarkoittaa 1 mm mittakaavassa. (B) keskimääräinen lukumäärä kasvaimia mukaan suoliston paikalla SIRT1

STOP ohjaus (n = 8) ja SIRT1

ΔSTOP kokeellinen hiirillä (n = 11). (C) Ki-67 värjäys adenoomien ja leviämisen hinnat. Kuvissa Ki-67 immunohistokemiallisella värjäyksellä adenoomien peräisin SIRT1

STOP ja SIRT1

ΔSTOP. Leviämisen-indeksi ilmaistaan ​​prosenttia Ki-67 värjätään adenooma soluja (keskimäärin vähintään 10 adenoomia per kohortti). Mitoosinopeudella lasketaan määrä histologisesti tunnistettavissa mitoottisia per 10 suuritehoisia kentät (400 x). Arvot B ja C ovat keskiarvoja ± S.D.

saada tietoa mekanismeista, joilla SIRT1 vähentää solujen lisääntymistä, tutkimme vaikutus SIRT1 kasvuvauhtiin useiden hyvin tunnettu syöpäsolun linjat. Leviämisen LNCaP eturauhassyövän soluissa huomattavasti vähentää yli-ilmentyminen SIRT1 ja vaikutus oli samanlainen tukahduttaa β-kateniinin itse (Fig. 3A). Tämä havainto viittasi siihen, että SIRT1 ja β-kateniinin toimivat samalla solujen yhteydessä. Tutkimaan edelleen tätä mahdollisuutta, olemme yli-ilmennetään SIRT1 ja katalyyttisesti aktiivinen SIRT1 mutantti (SIRT1

ΔHY) erilaisissa ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa joiden kasvua ohjaavat konstitutiivisesti aktiivinen β-kateniinin (HCT116 ja DLD1). Ihmisen paksusuolen syövän solulinja, jossa β-kateniinin on aktiivinen (RKO) toimi negatiivisena kontrollina. Lisääntynyt SIRT1 ilme vähentynyt huomattavasti lisääntymistä molemmissa koolonsyöpäsolulinjaa konstitutiivisesti aktiivisen β-kateniinin mutta ei β-kateniinin-aktiivinen solulinjassa (Fig. 3A-D). SIRT1

ΔHY katalyyttinen mutantti ei ollut merkittävää vaikutusta solujen lisääntymisen missä tahansa solulinjoista (Fig. 3B-D). Siten SIRT1 estää β-kateniinin perustuva leviämisen ja sen katalyyttinen aktiivisuus on ilmeisesti tarvitaan tätä vaikutusta.

(A-D) Vakaa LN-CAP, DLD1, HCT116 ja RKO, jotka ilmentävät osoitettuun tuotetta ympättiin ja solujen määrä tarkkailtiin eri aikapisteissä. Western blot suoritettiin SIRT1, aktiini tai β-kateniinin aineita. (E) DLD1 stabiilit solulinjat ilmentävät Topflash-LuciferasePEST infektoitiin osoitetuilla konstruktioita. Solut analysoitiin western blotilla vasta-aineiden SIRT1 ja β-kateniinin. Lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoitu koko näytteen proteiinien ja edustaa kolmen erillisen kokeen tehnyt neljänä kappaleena.

edelleen ymmärtää mekanismia, jolla SIRT1 vaimentaa β-kateniinin perustuva leviämisen, me suunnitelleet DLD1 solulinjaa sisältävän vakaasti integroitu reportteri β-kateniinin vaste-elementtien (Super8XTopflash-lusiferaasi

PEST). Knockdovvn β-kateniinin vähentänyt dramaattisesti reportteriaktiivisuutta, osoittaa riippuvuus reportteri endogeeniseen β-kateniinin aktiivisuutta (kuvio. 3E). Yliekspressio SIRT1 vähentää reportterin aktiivisuus ~ 2-kertaiseksi, kun taas SIRT1

ΔHY katalyyttinen mutantti ei ollut vaikutusta (kuvio. 3E), mikä viittaa siihen, että anti-proliferatiiviset vaikutukset SIRT1 välittyvät sen kyky tukahduttaa transkriptionaalista aktiivisuutta endogeeninen β-kateniinin ja että tämä edellyttää SIRT1 deasetylaasi aktiivisuutta.

asetylointi β-kateniinin by p300 /CBP voimistaa sen onkogeenisuustutkimuksessa lisäämällä β-kateniinin /TCF Sidosvoiman at kohdegeenin promoottorit [26]. Testata, onko SIRT1 muuttaa β-kateniinin, HEK293T-solut transfektoitiin mutantti muoto β-kateniinin, joka konstitutiivisesti paikantuu ytimeen (S33Y-β-kateniinin) [27]. Näissä soluissa SIRT1 co-immunosaostettiin β-kateniinin (Fig. 4A) ja päinvastoin (Fig. 4B). Välinen vuorovaikutus endogeenisen SIRT1 ja β-kateniinin oli myös ilmeistä (Fig. 4C).

(A) Ihmisen 293T-solut transfektoitiin ohimenevästi HA-S33Y-β-kateniinin yhdessä joko FLAG-merkitty SIRT1 tai vektorisäätö. Alikvootit koko proteiinia tehtiin immunosaostus anti-FLAG-vasta-ainetta (IP FLAG). Immunosaostettiin proteiinit immunoblotattiin anti-HA (ylempi paneeli) ja anti-FLAG (alempi paneeli). Vasen rataa, käsittelemätöntä otteet (input). (B) Ihmisen 293T-solut transfektoitiin kuten paneelissa A. Proteiinit immunosaostettiin anti-HA-vasta-aineen ja immunoblotattu anti-FLAG (ylempi paneeli), ja anti-HA (alempi paneeli). Vasen rataa, käsittelemätöntä otteet (input). (C) immunosaostus SIRT1 peräisin LN-CAP solu-uutteiden käyttäen anti-SIRT1 vasta-aine tai normaalia kanin IgG kontrollina (IgG). 10% immunosaostettiin proteiini sitten blotattiin anti-SIRT1 (ylempi paneeli), kun taas loput 90% oli blotattiin anti-β-kateniinin vasta-aineita. (D) 293T-solut transfektoitiin kuten on osoitettu, ja hajotettiin 48 tuntia myöhemmin. Vertailukelpoiset β-kateniinin immunosaostettiin ja blotattiin varten asetyloitu-lysiinijäännöksissä (IP: HA IB: Ac-K, yläpaneeli). Blotti uudelleenseulottiin HA osoittaa suunnilleen yhtäläinen HA-β-kateniinin (IP: HA IB: HA, alempi paneeli). (E-F) 293T-solut transfektoitiin kuten yhdessä TOP-FLASH lusiferaasi ja PRL-TK Renilla lusiferaasi-rakenne. Nikotiiniamidi (NAM) tai retroviruksen SIRT1 shRNA (RNAi) lisättiin esitetyllä. Aineisto on normalisoitu suhteessa Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. näytteistä suoritettiin kolmena kappaleena. (G) Epäsuora immunofluoresenssivärjäyksen of DLD-1 koolonsyöpäsoluihin tartunnan tyhjiä retrovirus- tai virus, joka sisältää SIRT1 shRNA (RNAi) tai SIRT1 cDNA (yliekspressio, O /E). Prosenttia solujen korkea, keskitaso tai alhainen ydinaseiden β-kateniinin värjäys käsittelemättömän: 6,5, 80,6, 12,9; SIRT1 O /E: 0, 29,4, 70,5; SIRT1 RNAi: 60,0, 32,0, 0,8. Kuvat otettiin 100 x suurennus.

Voit testata, onko SIRT1 estää β-kateniinin moduloimalla sen asetylointi, me 293T-solujen kanssa S33Y-β-kateniinin, asetyylitransferaasin p300, ja yhä suurempia määriä SIRT1 . Olemme havainneet, että p300 asetyloitu β-kateniinin (Fig. 4D) ja voimistaa sen transkriptionaalisen aktiivisuuden, kuten on aiemmin kuvattu [27] (Fig. 4E). Lisäämällä SIRT1 kuitenkin poisti asetyloitu muodossa β-kateniinin ja merkittävästi vähentynyt β-kateniinin aktiivisuus, kun se kotransfektoitiin p300 (Fig. 4D, E). Kääntäen, käsittelemällä solut SIRT1 estäjän nikotiiniamidi (NAM) [28] tai tukahduttaa SIRT1 retrovirus- shRNA vektorin (Fig. 4F) kasvoi lusiferaasireportterilla aktiivisuutta. Nämä tiedot osoittavat, että SIRT1 edistää deasetyloinnin β-kateniinin, mikä vähentää sen kykyä toimia trans-aktivaattori.

perustava läsnäolo β-kateniinin tumassa liittyy sen onkogeenisia toiminta ja kliinisesti huono potilaan ennusteeseen [29]. Sen testaamiseksi SIRT1 saattaisi tukahduttaa β-kateniinin muuttamalla sen lokalisoinnin, immunofluoresenssilla tehtiin transfektoitujen solujen shRNA tai yliekspressio konstruktioita varten SIRT1. Vastustamisesta SIRT1 että DLD1 koolonkarsinoomasoluissa korotti ydinvoiman β-kateniinin taas yliekspressio SIRT1 samassa solulinjassa johti dramaattiseen vähenemiseen ydinvoima β-kateniinin allas (Fig. 4G).

analysoida kliinistä merkitystä havaintomme, analysoimme SIRT1 ja β-kateniinin subsellulaarisista ilmentymistä kudoksessa microarray sisältävän 81 ihmisen paksusuolen syöpä näytteitä. Olemme havainneet, että osajoukko koolonsyöpien ilmaista SIRT1 tumassa (47/81 tapauksissa 58%). Kun β-kateniinin ilmentymistä teki näissä samoissa paksusuolensyövät, erittäin merkittävä käänteinen korrelaatio tason SIRT1 ilmaisun ja ydin- β-kateniinin lokalisointi kävi ilmeiseksi (p≤0.003, riskisuhde 0,24 95%: n luottamusväli 0,093-0,63) ( Fig. 5A, B). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että modulaatio β-kateniinin solunosasijaintia on tärkeä osa antituumorigeenistä vaikutukset SIRT1 mahdollisten diagnostisia ja terapeuttisia kliinistä merkitystä.

(A) Kuvat ovat havainnollistaa SIRT1 ja β-kateniinin subsellulaarisista ilmentyminen ihmisen paksusuolen kasvaimissa. Kutakin paksusuolensyöpä tapauksessa osoittaneet tekstikenttään insertti osoittaa havaitun proteiinin (kuva suurennos 200 x). (B) Korrelaatio SIRT1 ja β-kateniinin ilmentymistä ihmisen paksusuolen kasvaimissa. Pylväsdiagrammi esittää kumulatiiviset immuunivärjäysmenetelmällä dataa kudoksesta microarray 81 paksusuolen syöpätapausta. Nuclear ilmentyminen pisteytettiin joko ei ilmaisua, heikko ilme tai kohtalaista /strong ilme. Positiivisuus nucleus määriteltiin kohtalainen /strong ilme. Kaikki objektilasit tulkittiin kaksi hallituksen sertifioitu patologi sokaissut muista kliinisistä ja laboratoriotietoja.

Keskustelu

Ohessa kuvataan fysiologisesti relevantti kasvain tukahduttava rooli SIRT1 paksusuolen syövän muodostumisen ja kasvu. Havaitsimme, että SIRT1 ilmentymistä normaalissa suolistossa esiintyy erityisesti enterosyytteihin, esiaste solut, jotka käyvät läpi neoplastisen muutoksen paksusuolen syöpää ja että SIRT1 ylössäädellään jyrsijän suolistossa vastauksena CR. Osoitamme, että yliekspressio SIRT1 vähentää proliferaation koolonsyöpäsolulinjaa ja jotka yli-ilmentävät SIRT1 vuonna enterosyytteihin APC

min /+ eläimet jäljittelee kasvain tukahduttava vaikutus CR tästä paksusuolensyöpä mallia. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​hiljattain

in vitro

tutkimuksessa että syytöksiä SIRT1 ravinteena herkkä kasvu vaimentimella [30]. Vaikka SIRT1 ilmaistaan ​​meidän siirtogeenisiä hiiriä korkeammalla tasolla kuin nähty suolistossa CR käsiteltyjen jyrsijöiden (7-kertaiseksi (SIRT1) vs. 2 kertainen (CR)), tämän tason yli-ilmentymisen on silti sopusoinnussa havaintojen että SIRT1 voi olla fysiologisesti voimistunut 5-10 kertainen

in vivo

[31]. Koska kasvain tukahduttava vaikutus välittyy SIRT1 varjoonsa ne nähdään CR (70%: n vähennys (SIRT1) vs. 40%: n vähennys (CR)) [16] emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että SIRT1 myös estää kasvaimen kasvua CR-riippumaton mekanismi. Siitä huolimatta meidän data tarjoavat

in vivo

todisteita siitä, että yliekspressio SIRT1 fysiologisesti asianmukaisilla tasoilla, voi estää kasvaimen muodostumisen ja kasvun.

Tässä tutkimuksessa olemme myös läsnä todisteita siitä, että SIRT1 vuorovaikutuksessa ja estää β-kateniinin, transkriptiotekijä, joka ohjaa kasvaimia APC

min /+ malli ja erilaisia ​​ihmisen kasvaimissa. Huomaamme, että SIRT1 yli-ilmentyminen estää niiden kasvun koolonkarsinoomasoluissa riippuvainen β-kateniinin aktiivisuutta, estää lokalisaatio β-kateniinin tumaan, ja heikentää merkittävästi sen kykyä aktivoida transkriptiota. Näitä vaikutuksia ei havaittu SIRT1-HY mutantti osoittaa, että SIRT1 deasetylaasi toimintaa tarvitaan, ja nostamalla mahdollisuus, että SIRT1 suoraan kohdistettu β-kateniinin varten deasetylaatiolla.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että β-kateniinin on asetyloitu p300 /CBP ja asetyloitu muodossa proteiini on lisääntynyt transkriptionaalista aktiivisuutta. Tämä havainto merkitsee sitä, että mahdollinen deasetylaasi, joka estää p300 /CBP olisi käyttökelpoinen syövän terapeuttisena kohteena [32]. Tässä tutkimuksessa tunnistamme SIRT1 kuin deasetylaasin joka antagonisoi p300 /CBP ja deasetyloi β-kateniinin, mikä hidastaa solujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvu

in vivo

.

Yhdessä tietomme valottaa kyky SIRT1 estää β-kateniinin toimintaa ja antaa mekanistinen käsityksen antituumorigeenistä vaikutuksia SIRT1 hyvin ominaista paksusuolensyöpä malli. Koska SIRT1 keksittiin homologia pitkäikäisyys geenin, se on mielenkiintoista huomata kasvavaa näyttöä yhteydestä Wnt /β-kateniinin signalointi ja ikään liittyvien sairauksien. β-kateniinin on liitetty muiden ikään liittyvät maligniteetit kuten melanooma, multippeli myelooma, ja eturauhasen syöpä. Myös uusi keksintö, että säätelyä Wnt /β-kateniinin signalointi kiihtyy ikääntyminen hiiressä [23], [24]. Siten se on syytä tutkia, onko SIRT1 voi suojaa muilta ikääntymiseen liittyvien sairauksien vuoksi sen kyky tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signalointi.

Yhteenvetona käyttäen biokemia, hiiren genetiikka, ja kliininen kasvain yksilöt olemme havainneet, että SIRT1, ruokavalio-reagoiva geenin, on säätelijä β-kateniinin ja on tuumoria tukahduttavan funktion. Olemme päätellä, että nisäkkäiden pitkäikäisyys geenit anti-apoptoottiset toimintoja, yllättäen eivät välttämättä lisäisi kasvaimien syntyyn. Itse asiassa, löydämme päinvastainen todennäköisesti tapauksessa SIRT1. Nämä tutkimukset alkavat vastata tärkeä biologinen kysymykseen toiminnon keskeinen pitkäikäisyys geenin syövän kehityksen ja kasvun ja ehdottaa aiemmin tunnistamattomia terapeuttista potentiaalia SIRT1 aktivaattoreita syövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Jyrsijät

Cre-indusoituva SIRT1 ekspressiorakennelma syntyy jossa

loxP

reunustaa transkription STOP tekijä sisällytettäisiin väliin CAGGS promoottorin ja SIRT1 cDNA. Tämä rakenne oli suunnattu hiireen Kollageeni A1 lokuksen flp rekombinaasin välittämää genomisen integraation, kuten on kuvattu aiemmin (1). MES-solut kuljettavat yhden kopion SIRT1

STOP konstruktio tunnistettiin resistenssin merkki hygromysiini ja Southern blotting. PCR-alukkeet ja rakentaa kartat ovat saatavilla pyynnöstä. Kaksi kloonia ruiskutettiin blastokysteihin ja molemmat syntyy pentuja, ~90% josta näkyy ituradan siirto. Kasvain kantavaa hiirtä, jotka analysoitiin oli takaisinristeytettiin vähintään neljä sukupolvea osaksi C57 /BL6. APC

min /+ ja villiiniä-Cre siirtogeenisiä hiiriä kantoja Saatiin C57 /BL6 taustan Jackson Labs (Bar Harbor, ME). SIRT1

STOP eläimet takaisinristeytettiin kaksi sukupolvea C57BL /6-hiirten ennen rajan APC

min /+ tuottaa SIRT1

STOP; APC

min /+ kaksinkertainen transgeeniset. Nämä eläimet kasvatettiin villiiniä-Cre siirtogeenisiä hiiriä tuottaa kohortin SIRT1

ΔSTOP; Vil-Cre; APC

min /+ eläimiä. Eläimet pidettiin Harvard Medical School ja kokeet hyväksynyt Animal Care komitean Harvard Medical School.

Male Fischer-344 (F344) rottia kasvatettiin ja kasvatettu vivariums klo Gerontologian tutkimuskeskuksen (GRC, Baltimore, MD). Vieroituksesta (2 Wks), rotat pidettiin yksittäin vakiona muovihäkkeihin beeta siru puuta vuodevaatteet. Ohjaus eläimiä ruokittiin NIH-31 standardin ruokavalio ad libitum (AL). 1 kuukauden iässä kalorien rajoitettu (CR) eläimet tarjotaan vitamiineja ja kivennäisaineita väkeviä versio samasta ruokavalion tasolla 40% vähemmän ruokaa (painosta) kuin AL rotat kulutetaan edellisen viikon aikana. Suodatetaan ja happamaksi vettä oli saatavissa mielin määrin molemmissa ryhmissä. Vivariums pidettiin lämpötilassa 25 ° C, ilman suhteellinen kosteus 50% on 12/12 tunnin valo /pimeä sykli (valot päälle klo 06:00) Kaikki eläimet olivat 6 kuukauden ikäisiä ja uhrataan välillä 09:00 ja 11.00 suoli poistettiin nopeasti ja huuhdella huolellisesti jääkylmällä PBS: llä ja sijoitettiin nestemäistä typpeä, sitten säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes käsitellään Western blottaus käyttämällä standardimenetelmiä.

Animal Pathology, Histopatoloqia ja immunohistokemiallinen analyysi

brutto kasvain analyysiä, koko suolisto irrotettiin heti lopettamisen jälkeen avattava pituussuunnassa, ja pestiin kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), kun puristuksiin kiinteälle alustalle. Adenoomia suurempi kuin 0,5 mm proksimaalisesta (10 cm distaalisesti pylorus), distaalinen (10 cm proksimaalisesti umpisuoli) ja keskimmäinen (-50% koko suolen pituuden) ohutsuolessa sekä paksusuolessa pisteytettiin. Suolet valmistettiin käyttäen Kääretorttu menetelmällä kiertämällä niitä ympäri lasipipetillä kärki. Kudokset kiinnitettiin ja upotettiin parafiiniin käyttäen normaaleja histologisia protokollaa. Tarkka kasvaimen koko pisteytettiin mikroskooppisesti hematoksyliini /eosiinilla värjätään hiiren suoliston mikroskoopilla kanssa okulaarin mikrometrin. Immunohistokemiallinen analyysi jyrsijän kudosta suoritettiin kanin anti-SIRT1 vasta-ainetta (Upstate Biotechnology, cat # 07-131), kanin anti-β kateniinin (Abcam # 2982), hiiren anti-β-kateniinin (klooni 14, BD transduktio labs) ja rotan anti-hiiri-Ki-67 (Dako).

immunohistokemiallinen ja TILASTOANALYYSI

kudossiruina (TMA) rakennettiin aikaisemmin kuvatulla [33] käyttämällä Automated ryhmittäjällä (Beecher Instruments, Sun Prairie , WI USA). Sillä β-kateniinin ja SIRT1 Immunohistokemian antigeeni haku suoritettiin; parafiini kudosleikkeet käsiteltiin mikroaalloilla 15 minuutin ajan sitraatti- puskurissa (BioGenex, San Ramon, CA), joka paine liesi. Tissue leikkeitä inkuboitiin 3% H

2O

2 (15 min) endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi, sitten niitä inkuboitiin 10% normaalin vuohen seerumin (Vector Laboratories, Burlingame, CA) PBS: ssä (10 min), minkä jälkeen 10 min inkubaation seerumia proteiinia lohkon (DAKO, Carpinteria, CA). Primaarinen vasta-aine vastaan ​​β-kateniinin (klooni 14, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ) (laimennus 1:400) tai SIRT1 (# 1104; Epitomics) (laimennus 1:100) levitettiin 1 tunniksi huoneen lämpötilassa. Sekundaarinen vasta-aine (BioGenex) (20 min), ja sitten streptavidiinilla peroksidaasikonjugaattia (BioGenex) levitettiin (20 min). Osiot visualisoitiin diaminobentsidiiniä (DAB) (2 min) ja metyyli-vihreä vastavärinä. Nuclear ilmentyminen kirjattiin joko ei ilmaisua, heikko ilme tai kohtalaista /strong ilme. Positiivisuus nucleus määriteltiin kohtalainen /strong ilme. Kaikki β-kateniinin-värjätty TMA dioja tulkittiin patologi (S. O.) sokaissut muista kliinisistä ja laboratoriotuloksia. Kaikki SIRT1-värjätty TMA dioja tulkittiin patologi (R. F.) sokaissut muista kliinisistä ja laboratoriotuloksia. Tilastollista analyysiä, chi-neliö testi suoritettiin kategorisen datan käyttäen SAS-ohjelmiston (versio 9.1, SAS Institute, Cary, NC). P-arvo oli kaksipuolinen, ja tilastollinen merkitsevyys asetettiin p ≤ 0,05.

Plasmidit

pcDNA3-FLAG-SIRT1, pBabe-Puro-hSir2 (SIRT1), pBabe-Puro -SIRT1

ΔHY, pcDNA-HA-S33Y-β-kateniinin ja pBabe-Puro-S33Y- β-kateniinin on kuvattu aikaisemmin. SIRT1 RNAi plasmidit rakennettiin kloonaamalla sekvenssit osaksi pSUPER.retro plasmidiin (oligoEngine, Seattle, WA). Yksi TOPFLASH plasmidi ostettiin Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY), kun taas toinen oli tuotettu kloonaamalla tandem TCF sitoutumiskohdat ja TA-promoottori SUPER8xTOPFLASH (ystävällinen lahja Randall Moon) osaksi Luciferase-PEST plasmidi pGL4.15 (Promega , Madison, WI).

Solutransfektiot, Infektiot Immunosytokemia

293T, LN-CAP, DLD1, HCT116 ja RKO-soluja pidettiin suositellun soluviljelyelatusaineella (American Type Culture Collection ( ATCC), Manassas, VA) ja niitä kasvatettiin kosteutetussa inkubaattorissa, joka sisältää CO

2 (5% v /v) 37 ° C: ssa. Yli-ilmentyminen kokeissa, plasmidit transfektoitiin Fugene 6 menetelmä (Roche). Vakaan solulinjan tuottamiseen, DLD1 solut valittiin hygromysiini kahden viikon ajan, ja yksittäisiä pesäkkeitä poimittiin ja laajennettiin. Retroviruksen tuotannon, 293T-solut transfektoitiin yli-ilmentyminen tai RNAi plasmidit samanaikaisesti pakkaus plasmideilla gag-pol ja VSV-G tai PCL–ampho. Media sisältävät jälkeläiset virus vapautetaan 293T-soluihin otettiin talteen ja käytettiin infektoimaan soluja 3-6 tunnin ajan, kun läsnä oli 8 ug /ml polybreeniä (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Väliaine vaihdettiin ja soluja inkuboitiin vielä 24-48 tunnin inkuboinnin. Ne valitaan puromysiinin (Sigma Aldrich) 24-48 tuntia ja sitten ne trypsinoitiin ja kylvetään kokeita varten.

immunosytokemiassa, solut maljattiin 8 mm kuopan Teflon painetut kalvot (Elektronimikroskopian Sciences). Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun pinnoitus, solut kiinnitettiin inkuboimalla 4% paraformaldehydillä 30 minuutin ajan. Kiinnitettyjä soluja inkuboitiin sitten ensisijaisesti vasta-aineiden SIRT1 (# 1104; Epitomics (laimennus 1:100) ja aktiivisen β-kateniinin (05-665; Chemicon) (laimennus 1:100) 2 tunnin ajan, jota seuraa inkubointi sekundaarisia vasta-aineita (Alexa Fluor 488 vuohen anti-kani-IgG: n ja Alexa Fluor 568 vuohen anti-hiiri-IgG, Molecular Probes) (laimennus 1:400). soluja inkuboitiin 10 ug /ml Hoechst, pestiin ja asennettu peitelevy. ainakin 20 solua, pisteytettiin koetta kohti ja kuvan ottamisen suoritettiin käyttäen Olympus BX50 mikroskoopilla.

Protein Extraction ja immunosaostus

Soluekstraktit analysoitiin suoraan Western-blottauksella valmistettiin solujen hajottaminen in 1 × SDS latauspuskuria seurasi keittämällä ja Western-analyysi. solu-uutteet immunosaostukseen valmistettiin suspendoimalla fosfaattipuskuroitu suolaliuos-pestyt solupelletit 1 ml: aan Nonidet P-40 (NP-40) uuttopuskuria (50 mM Tris-HCI [pH 8,0], 150 mM NaCl: a, ja 1% Nonidet P-40), johon on EDTA-vapaa proteaasiestäjäseostabletit tablettia (Roche) kanssa 10 mM Nicotinamide (NAA) ja 5 uM Trichostatin-A (TSA). Inkuboinnin jälkeen jäillä 30 minuuttia, ei-uutettava materiaali poistettiin sentrifugoimalla 17000

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja poistetaan supernatantit käytetään immunosaostuksella. Lysaatit immunosaostettiin (2 h), pestiin 4 kertaa NP-40-puskuria ja käsiteltiin Western-blottauksella.

lisääntymismääritykset

DLD1, HCT116 ja RKO solulinjat infektoitiin sopivalla konstruktilla oli siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 10000 soluja.