Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

pentaphy (Gyp), tärkeimmät osat

Gynostemma pentaphyllum

Makino, käytetään laajalti perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä. Esillä Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia syövän vastaisen vaikutuksen ja taustalla olevien mekanismien Gyp ihmisen kolorektaalisyövän soluissa SW-480.

Materiaalit ja menetelmät

estovaikutus Gyp SW-480 solut arvioitiin MTT-määrityksellä. Apoptoottista solukuolemaa havaittiin ydin- Hoechst 33342 värjäytymistä ja DNA fragmentaatioanalyysillä. Apoptoosi analysoitiin käyttämällä anneksiini V-PE /7-amino-aktinomysiini D: värjäystä. Solukalvon eheys arvioitiin virtaussytometrillä seuraavien PI värjäystä. Muutokset mitokondrioiden membraanipotentiaalille (

Δψ

m) havaittiin kautta virtaussytometrillä analyysi rodamiini 123 (Rh123). Rooli reaktiivisen hapen (ROS) on Gyp solukuolema tutkittiin solunsisäisten ROS ja yleiseen ROS scavenger. Haavan paranemista määritys suoritettiin tutkimiseksi Gyp inhiboimatonta migraation SW-480-solujen

in vitro

. Lisäksi muutokset F-aktiini microfilaments analysoitiin FITC-leimatun phalloidin toksiini värjäys ja morfologisia muutoksia tutkittiin alla pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM).

Tulokset

jälkeen Gyp hoidon, solukalvon läpäisevyys SW-480 solua lisättiin,

Δψ

m laski huomattavasti, taso solunsisäisen ROS oli kasvanut, DNA: n fragmentoituminen ja apoptoottista morfologiaa havaittiin. Solut käsiteltiin Gyp aiheuttavat vakavia microfilamentti verkko romahtaa samoin kuin vähentynyt merkittävästi määrän mikrovillusten. Gyp indusoi muutoksia solun elinkelpoisuuden, solujen vaeltaminen, solunsisäinen ROS sukupolvi ja ydin- morfologia lievittyivät selvästi NAC.

Johtopäätös

Tulokset tässä tutkimuksessa merkitsi sitä, että ROS tärkeä rooli Gyp aiheuttama solu- myrkyllisyys ja apoptoosin, ja mitokondriot vahingot voivat olla ylävirtaan ROS jälkeisen Gyp hoitoa. Havainnot Tämän tutkimuksen tarjoavat uusia todisteita kasvaimia mekanismeja, joilla Gyp indusoi apoptoosia

in vitro

.

Citation: Yan H, Wang X, Niu J, Wang Y, Wang P Liu Q (2014) syövän vaikutusta ja taustalla olevien mekanismien pentaphy Human peräsuolen syövän SW-480 solut. PLoS ONE 9 (4): e95609. doi: 10,1371 /journal.pone.0095609

Editor: Nukhet Aykin-Burns, University of Arkansas for Medical Sciences; College of Pharmacy, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 joulukuu 2013; Hyväksytty: 27 maaliskuu 2014; Julkaistu: 21 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Yan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National ”kahdestoista viisivuotiseen” suunnitelma Science and Technology Support (2011BAI06B05). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti lähes miljoona uutta tapausta ja 500000 kuolemantapauksia CRC ympäri maailmaa joka vuosi [1], [2]. On olemassa monia riskitekijöitä CRC, kuten korkea ikä, tulehdukselliset suolistosairaudet, sairaushistoria hyvänlaatuisen adenomatoottisten polyyppeja, suvussa CRC, alhainen saanti vihanneksia ja hedelmiä, korkea saanti eläinrasvaa ja lihajalosteiden [3], [4] .

kliinisissä CRC hoidossa, perinteiset hoitomuodot kuten sädehoito, kemoterapia ja kirurgia eivät ole paras lääke menetelmä sen huonon ennusteen ja vakavia sivuvaikutuksia. Siksi etsivät uusia syöpähoidoissa on erittäin kiireellinen. Nyt luonnollinen lääke syövän hoidossa on herättänyt laajaa huolta kotona ja ulkomailla, koska sen turvallisuutta, effiiciency ja vähän sivuvaikutuksia [5].

pentaphy (Gyp), suosittu folk lääketieteen Kiinassa, on tärkeimpien komponenttien otteita

Gynostemma pentaphyllum

Makino. Se esiintyy lähinnä dammarane tyyppihyväksynnän triterpene glykosidit (kuvio 1). Gyp oli ollut tunnettu laaja myönteisiä vaikutuksia hepatiitin hoitamiseksi, hyperlipoproteinemian ja sydän- ja verisuonisairauksia [6] – [8]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että Gyp aktiivisuus on anti-inflammatorisia, anti-tromboottisia, antioksidanttisia ja syövän toimia [9] – [12]. Mutta tähän mennessä ei ole raportti Gyp aiheuttaman antituumorivaikutuksen ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpiin. Niinpä tässä tutkimuksessa, sytotoksisuus ja apoptoosin SW-480 solun aiheuttama Gyp tutkittiin. Rooli reaktiivisten hapen lajien (ROS) on Gyp solukuolema analysoitiin solunsisäisen ROS: n syntyminen ja ROS scavenger. Nämä tulokset voivat tarjota todisteita rooliin Gyp kuin voimakas anti-peräsuolen syövän agentti kliinisissä sovelluksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Gyp oli ystävällisesti ankang Pharmaceutical Institute of Beijing University. Jauhe liuotettiin 80% etanolia (EtOH), jolloin saat kantaliuos 100 mg /ml, joka oli steriloitu 0,22 um kalvon suodattamalla. 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-diphenyltertrazolium bromidi tetratsolium (MTT), rodamiini-123 (Rh123), Hoechst 33342, propidiumjodidi (PI) ja N-asetyylikysteiini (NAC) hankittiin Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). 2 ’, 7’- dichlorodihydrofluorescein-diasetaatti (DCFH-DA) ja FITC-phalloidine toimitti Molecular Probes Inc. (Carlsbad, CA, USA). Guava neksiini reagenssi saatiin Millipore Corporation (Billerica, MA, USA). Kaikki muut reagenssit olivat kaupallisia tuotteita analyyttistä laatua.

Cell Culture

Ihmisen paksusuolen syöpä SW-480 solut hankittiin solusta pankin Kiinan Academy of Science, Shanghai, Kiina. Solulinja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää, 1% penisilliini-streptomysiinillä (100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), ja 1% glutamiinia soluviljelmässä pulloon kostutetussa 5% CO

2 ja 95% ilma-atmosfäärissä 37 ° C: ssa.

solujen elinkelpoisuuden arviointi jälkeen Gyp hoito

vaikutuksen tutkimiseksi Gyp SW-480-solujen lisääntymisen, solut ympättiin 96-kuoppaisille levyt. Eri pitoisuuksina (0, 70, 100 ja 130 ug /ml; 80%: sta etanolia käytettiin liuottimena valvonta) Gyp lisättiin ja soluja inkuboitiin eri aikoja, tiheydellä 1 x 10

5 solua /ml, vastaavasti. Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä [13]. Absorbanssi 570 nm: ssä rekisteröitiin käyttämällä mikrolevyn lukijaa (Bio-Tek ELX800, USA). Solujen elinkelpoisuus Gyp käsiteltyjen näytteiden saatiin sitten vertaamalla kontrolliin.

virtaussytometria analyysi Cell Membrane Integrity

PI on fluoresoiva kalvoon läpäisemätön, joka värjää ytimille interkalatoivia välillä pinottu emäkset nukleiinihapon. Koska PI saapuu soluun vain, jos solukalvon tulee läpäisevä, sitä käytetään laajalti solukuoleman tutkimukseen mitata eheyden solukalvon. Kun sidottu nukleiinihappoja, absorptiomaksimi PI on 535 nm ja fluoresenssin emission maksimi on 617 nm [14]. Solut 24-kuoppalevyille käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden Gyp 6, 12, 24 ja 48 tuntia, vastaavasti. Sitten solut kerättiin ja huuhdeltiin kahdesti PBS: llä, värjättiin 5 ug /ml PI: 5 min pimeässä ja analysoitiin virtaussytometrialla. Aineisto analysoitiin FCS Express V3 (De Novo Software).

tutkiminen mitokondrion kalvon Potential (Δψ

m) B

Tutkia

Δψ

m muutoksia, solut värjättiin Rh123, jotka selektiivisesti tulee mitokondrioita, jossa on ehjä kalvojännite ja säilyy mitokondrioiden [15]. Kun mitokondriot kalvon potentiaali on menetetty, Rh123 on pestiin sen jälkeen ulos soluista. Solut 24-kuoppalevyille käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden Gyp 4 ja 8 tuntia. Solut otettiin talteen ja huuhdeltiin kahdesti PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan 1 ug /ml Rh123 ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä. Sitten näytteet havaita välittömästi virtaussytometrialla. Aineisto analysoitiin FCS Express V3 (De Novo Software).

virtaussytometria analyysi DNA Fragmentation

analysoimiseksi DNA pirstoutuminen, virtaussytometria havaitseminen DNA hypoploidy lisäämisen jälkeen PI kuolevan solujen ja läpäiseviksi ne jäädytys-sulatus suoritettiin [14]. Koko DNA-fragmenttien näkyy hypoploid DNA histogrammi. Tutkia vaikutuksen Gyp DNA vahinkoa SW-480-soluja, teimme oligonukleosomaalisiksi DNA: n fragmentoituminen virtaussytometrialla. Solut 24-kuoppalevyille käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla Gyp 6, 12, 24 ja 48 tuntia, vastaavasti. Sitten solut värjättiin 5 ug /ml PI ja analysoitiin DNA sisällön käyttämällä virtaussytometria.

Hoechst 33342 Värjäys

Jotta tarkkailla muutoksia ydinten morfologian kasvainsolujen jälkeen Gyp hoidon, Hoechst 33342 värjäystä on käytetty. Käsittelyn jälkeen ilmoitetun pitoisuuden Gyp 6, 24 ja 48 tuntia, solut värjättiin 10 uM Hoechst 33342: ssa 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten värjätyt solut huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä, ja havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia standardin herätesuotimet. Viritysaallonpituudella ja emissioaallonpituus olivat 346 nm ja 460 nm, vastaavasti.

Analyysi solukuoleman

Solun apoptoosia ei havaittu hoidon jälkeen ilmoitetun pitoisuuden Gyp 12 ja 24 h. Kvantitointi solu- apoptoosin mitattiin guava neksiini määrityksessä, jossa käytetään anneksiini V-PE havaita fosfatidyyliseriinin ulkoisen kalvon apoptoottisten solujen. Kalvo-läpäisemätön väriaine, 7-amino-aktinomysiini D, käytetään myös indikaattorina solukalvon eheyden. Lyhyesti, 100 ui soluja kutakin näytettä suspendoitiin seokseen, jossa oli 100 ui anneksiini V-PE ja 7-ADD sitovaa puskuria. Kun oli inkuboitu huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, näytteet analysoitiin virtaussytometrialla. Väestön erotettiin kolmeen ryhmään: elävät solut matalan tason fluoresenssi, apoptoottisten solujen aiemmissa vaiheissa vihreillä fluoresenssi, ja myöhäinen apoptoottisten solujen sekä punaisen ja vihreän fluoresenssin.

haavan paraneminen Assay

Solut ympättiin 24-kuoppalevyille ja niitä inkuboitiin 24 h. Sitten solut yksittäiset kolot haavoittui raaputtamalla pipetin kärjen ja käsitellään ilmoitetun pitoisuuden Gyp. 24 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen solut valokuvattiin faasikontrastimikroskoopilla.

hehkulangan Analyysi

jälkeen eri tavalla, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 PBS: ssa 7 minuutin ajan ja salvattiin 1% BSA PBS: ssä 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Kunkin vaiheen välillä edellä on kuvattu, solut pestiin kolme kertaa PBS: llä 5 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Seuraaja estämällä solut värjättiin 5 ug /ml FITC-phalloidine 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Kuvat saatiin laser skannaus -konfokaalimikroskoopilla (TCS SP5, Leica, Saksa).

pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM) Havainto

24 tunnin kuluttua seuraavien erilaisia ​​hoitoja, solut kussakin ryhmässä vahvistettu fosfaattipuskuroituun 2,5% glutaraldehydiä liuoksen, huuhdeltiin PBS: lla ja dehydratoitiin arvostellaan alkoholi, kriittinen piste-kuivattu nestemäisistä CO

2 ja kultaa sopersi. Pinnat Solujen havaittiin pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (S-3400N, Hitachi, Japani).

Detection of Solunsisäinen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) Generation ja sen rooli Gyp aiheuttamat Sytotoksisuus

sen määrittämiseksi muutoksia ROS tasolla mittaamme oksidatiivisen konversion herkän fluoresoiva koetin 2 ’, 7′-dikloorifluoreskiiniliuoksella-diasetaatti (DCFH-DA) loisteputki 2′, 7’-dikloorifluoreskiiniliuoksella (DCF). DCFH-DA helposti diffundoituu solukalvon läpi, ja entsymaattisesti hydrolysoitu solunsisäisten esteraasien muodostamiseksi fluoresoimaton DCFH, joka sitten nopeasti hapettuu muodostaen erittäin fluoresoivaa DCF: n läsnä ollessa ROS, ja fluoresenssin intensiteetti on verrannollinen ROS. Solut 24-kuoppalevyille käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden Gyp 4 ja 8 tuntia. Solut otettiin talteen ja huuhdeltiin kahdesti PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan 10 uM DCFH-DA, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä. Sitten näytteet havaita välittömästi virtaussytometrialla. Aineisto analysoitiin FCS Express V3 (De Novo Software).

tutkittiin miten ROS Gyp solukuolema ja apoptoosin, NAC (5 mM) käytettiin ROS estäjä lisätään elatusaineeseen ennen lastaus Gyp 1 h. Solu elinkelpoisuuden väheneminen, solunsisäinen ROS sukupolvi,

Δψ

m menetys, ydin- morfologisia muutoksia ja solujen kulkeutumistestis- varta analysoitiin edellä kuvatulla tavalla.

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Tilastollinen analyysi suoritettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä. Tilastollinen merkitsevyys perustettiin

p

0,05.

Tulokset

Effects of Gyp Cell Elinkelpoisuus

Kuva 2 osoitti, että Gyp esti SW-480 soluproliferaatiota annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Elinkelpoisuus väheni huomattavasti kun Gyp annos oli 70 ug /ml tai yli (

p

0,01) ja pitkittynyt inkubointi parannettu elinkelpoisuuden menetys. IC 50-arvot olivat noin 91,77 ja 83,8 ug /ml silloin, kun soluja inkuboitiin Gyp 24 ja 48 tuntia, vastaavasti.

SW-480 ympättiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin 0, 70, 100 ja 130 ug /ml Gyp 24 ja 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Kukin arvo on ilmaistu keskiarvona ± S.D. vähintään kolmen itsenäisen määrityksen. Yksisuuntainen ANOVA käytettiin vertailuissa useita ryhmä tarkoittaa mitä seurasi Dunnettin t-testi. **

P

0,01 verrattuna kontrolliryhmään. (Virhepalkkien = SD, n = 3).

Gyp aiheuttaman solukalvon vauriot SW-480 solut

PI-värjäyksellä yhdistettynä virtaussytometrialla käytettiin arvioimaan Gyp aiheuttamaa solumembraanivaurioita. SW-480-soluja, kalvo vahinkoa varhainen tapahtuma on Gyp indusoiman soluvaurion (kuvio 3). Kun oli inkuboitu 6 h, niiden solujen prosentuaalinen määrä, joilla on korkeampi PI fluoresenssi asteittain kasvoi 10,07%: sta 21,93%, kun solut altistettiin Gyp annosalue 70-130 ug /ml. Solut altistettiin 70 ug /ml Gyp eivät osoittaneet paljon lisääntynyt solumembraanivaurioita kanssa pitkäaikainen inkubaatioajan. Kun taas solut, kun 100 ug /ml ja 130 ug /ml Gyp hoidon solumembraanivaurioita lisääntyi suuresti, että pitkittynyt inkubointi aikaa, noin 46,27% ja 67,87% soluista näytetään korkean PI fluoresenssi 48 tuntia käsittelyn jälkeen, vastaavasti.

Soluja käsiteltiin Gyp 6, 12, 24 ja 48 (pystysuora akseli) vs. PI fluoresenssin (vaaka-akseli).

Gyp-indusoi Δψ

m menettäminen SW-480 solut

Rh123 värjäytymistä yhdessä virtaussytometrialla käytettiin arvioimaan Gyp aiheuttama

Δψ

m muutoksia. Kuten kuviossa 4 on esitetty, se osoittaa, että Gyp indusoi menetys

Δψ

m melko varhain ja aiheutti lasku

Δψ

m annoksesta ja aikaa riippuvaisella tavalla. 4 tunnin kuluttua inkuboinnin solujen prosenttiosuus, joilla

Δψ

m tappio kasvoi 9,9%: sta 28,8%: iin Gyp nousi 70 ug /ml 130 ug /ml. Kun inkubaatioaika kasvoi 4-8 h, prosenttiosuus solujen

Δψ

m tappio kasvoi 16,65%: sta 20,95%, kun Gyp oli 100 ug /ml.

Solut käsiteltiin Gyp 4, 8 h ja leimattiin rodamiini 123 ja analysoitiin virtaussytometrialla. Histogrammit osoittavat useita solun kanavan (pystysuora akseli) vs. rodamiini 123 fluoresenssi (vaaka-akseli).

Gyp aiheuttama DNA hajanaisuus SW-480 solut

Voit selvittää DNA vahingoittamatta aktiivisuus Gyp, prosenttiosuus vaurioituneiden solujen analysoitiin käyttäen PI-värjäyksellä virtaussytometrialla, kuten on kuvattu menetelmissä. Kuten on esitetty kuviossa 5, Gyp indusoi DNA: n fragmentoituminen oli annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla. Ei merkittävää DNA: n fragmentoituminen havaittiin eri annos Gyp hoidon jälkeen 6 h, samalla kun merkittävä määrä suuren mittakaavan DNA: n fragmentoituminen havaittiin, että suurempi annos Gyp (100, 130 ug /ml) 12 h inkubaation, ja DNA- vahinkoja pienempi Gyp annoksella (70 ug /ml) käsitellyissä soluissa ei ole parannettu pitkittyneen inkubaatioajan. 48 tunnin kuluttua inkubaation DNA-fragmentti kontrolliryhmässä on 2,37%, se nousi 10,03%, 26,33% ja 56,07%, kun Gyp concertration oli 70, 100 ja 130 ug /ml, vastaavasti.

Soluja käsiteltiin Gyp 6, 12, 24 ja 48 (pystysuora akseli) vs. PI fluoresenssin (vaaka-akseli).

Gyp aiheuttama morfologiset muutokset SW-480 solut

Kuva 6 osoittivat tulokset Hoechst 33342-värjäyksen SW-480-solujen käsitelty Gyp. Hieman sininen ja homogeeninen solujen havaittiin kontrolliryhmässä. Solut Gyp hoidetuissa ryhmissä osoitti parantamiseksi Hoechst 33342 värjäystä ja muutos solun morfologian on Gyp-annoksen ja inkubaation ajan riippuvaisella tavalla. Kun Gyp pitoisuus oli yli 100 mikrog /ml, SW-480-soluja vakavasti vaurioitunut kirkkaan sininen tumavärjäystä ja vaihe kuvien osoitti solut kutistunut epänormaaliin pyöreä tyyppiä, ja solujen määrä väheni huomattavasti.

Cells käsiteltiin Gyp ilmoitettuina pitoisuuksina 6, 24, 48 ”Materiaalit ja menetelmät”.

Detection of Cell Apoptosis käyttämällä virtaussytometria

apoptoottiset mitattiin anneksiini V -PE ja 7-ADD värjäyksen jälkeen 12,24 h seuraavan erilaisia ​​hoitoja. Jakeet solujen kussakin neljänneksessä analysoitiin neljänneksessä tilastoista [16]. Kuten kuviossa 7 on esitetty, prosenttiosuudet solut anneksiini V-positiivista värjäytymistä kasvoi vähitellen pitoisuudesta riippuvalla tavalla, kun Gyp hoidon, mikä viittaa siihen, että Gyp voivat aiheuttaa apoptoottista vastetta SW-480-soluja. Vuonna hoitamattomaan verrokkiryhmään, 94,85% soluista oli elinkelpoisia, 1,45% solupopulaatio oli alkuvaiheessa apoptoosin (alhaalla oikealla) ja 2,95% solupopulaation oli myöhäisessä vaiheessa apoptoosin (ylhäällä oikealla). Vaikka 12 h inkubaation Gyp, apoptoottisten solupopulaatio (alhaalla oikealla + ylhäällä oikealla) nousi 25,40%: sta 38,70%, kun lääkkeen pitoisuus nousi 70 ug /ml 130 ug /ml. Kun inkubaatioaika nousi 12-24 h, apoptoottisten solupopulaatio kasvoi 29,45%: sta 41,70%, kun Gyp oli 100 ug /ml.

dot plotit anneksiini V ja 7-AAD oton jälkeen osoitettuihin pitoisuuksiin SW-480-soluissa. Solut analysoitiin 12, 24 tunnin kuluttua hoidosta.

Gyp Inhibioitu Migration of SW-480 In vitro

varmistamiseksi edelleen estävää vaikutusta muihin Gyp SW-480 solujen vaeltamiseen, haavan paranemista määritys suoritettiin (kuvio 8). Haavanparantamislaite solujen kykyä heijastaa niiden liikkumista ja muuttoliike pinnalle, johon ne on ankkuroitu kasvun. Verrattuna 0 h jälkeen haavoittaen, kuluttua 24 h inkubaation, hyvin tiheä solujen valvontaa vähitellen kasvoi välitilassa haavojen, solujen 70 ug /ml Gyp käsitelty ryhmä osoitti Pieni ero ohjaus ero ohjaus, kun taas solut 100 ug /ml ja 130 ug /ml Gyp käsiteltyjen ryhmien harvoin kasvoi välitilassa haavan, ja solutiheys oli vakavasti vähentynyt.

solut 24-kuoppalevyillä haavoittui raaputtamalla pipetin kärjen ja soluja inkuboitiin jossa Gyp 24 tuntia. Solut valokuvattiin faasikontrastimikroskopiaan (x 200 suurennus).

Microfilamentti Analysis

On hyvin osoitettu, että solun tukirangan elementit olivat läheisesti solun liikkuvuuteen [17], [ ,,,0],18]. Muutokset F-aktiini microfilaments järjestö SW-480-solujen jälkeen Gyp käsitelty tutkittiin fluoresenssimikroskopialla käyttämällä FITC-leimattua phalloidin toksiinia. Kuten kuviossa 9 on esitetty, ohjaus- solut osoittivat säännöllinen joukko on määritelty aktiinifilamenttien läsnä pitkin solut, tasaisesti sytoplasmassa, kun taas solut, 100 ug /ml Gyp osoitti epäjärjestyksestä aktiinisäikeiden, joka on lisäys aktiinin stree kuitujen ja vihreä fluoresenssi täplät havaittiin. Soluja käsiteltiin 130 ug /ml Gyp osoitettu absoluuttisen vahinkoa aktiini-verkon ja täydellisen häviämisen aktiinisäikeiden.

Solut värjättiin phalloidin (vihreä) F-aktiini. Mittaviivat 10 pm.

SEM Observation

Morfologiset muutokset havaittiin SEM (kuvio 10). Kontrolliryhmässä, solut näyttivät epiteelin muodoltaan lukuisia mikrovillusten yli solun pinnalla. Vaikka 70 ug /ml, solut osoittivat merkittävää laskua määrän mikrovillusten pinnan monien solujen tulossa suhteellisen tasainen ilman selvää mikrovilluksia. Kun Gyp annos oli yli 100 mikrog /ml, SW-480-soluja vakavasti vaurioitunut näennäinen muodonmuutos, näivettynyt epänormaaliin pyöreä tyyppiä, ja solujen määrä väheni huomattavasti. Kun taas 130 ug /ml, jotkut papillous kohoumien havaittiin solujen pinnalla, jossa sytoplasmaan näytti ekstrudoidaan kalvon läpi rajan.

Suurennus kuvien oli 1500 ja 5000 x, vastaavasti. Mittaviivat: 30, 10 um.

ROS Mukana Gyp aiheuttama SW-480 sytotoksisuus

Solunsisäinen ROS tuotanto analysoitiin virtaussytometrialla DCFH-DA värjäystä. Tiedot on esitetty kuviossa 11 osoittavat, solunsisäisen ROS tasoa nostettiin jälkeen Gyp hoidon, 4 h käsittelyn jälkeen, oli noin 13,97%, 21% ja 13,07% soluista 70, 100 ja 130 ug /ml Gyp käsitellyissä ryhmissä osoitti kirkkaan DCF fluoresenssi, kun taas vain 5,43% soluista kontrolliryhmän osoitti kirkas DCF fluoresenssia. Kun inkubaatioaika kasvoi 4-8 h, solujen prosenttiosuus kirkkaan DCF fluoresenssi kasvoi 29,77%, 35,97% ja 33,43%, kun Gyp oli 70, 100 ja 130 ug /ml, vastaavasti. Löysimme ROS: n syntyminen on ensin kohosi lisääntyvän Gyp pitoisuus ja sitten hieman vähentynyt paljon suurempi Gyp annos, joka voi johtua enemmän solun hajoamista aiheuttama Gyp hoito suuremmilla lääkeaineen pitoisuus.

Soluja käsiteltiin Gyp varten 4, 8-DA, ja fluoresenssin voimakkuus hapetetun tuotteen DCF yksittäisissä soluissa havaittiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuus fluoresoivien solujen kussakin ryhmässä osoitettiin.

tarkastella edelleen, jos solunsisäinen ROS nousu oli mukana Gyp aiheuttama solukuolema, teimme myöhemmin määrityksiä. Tulos kuviossa 12A osoittaa, että vähentynyt solujen elinkelpoisuuden aiheuttama Gyp suuresti pelasti NAC (

p

0,05). Lisäksi Gyp aiheutti solunsisäisten ROS sukupolvi, kromatiinin kondensaatio ja solujen kulkeutumistestis- olivat kaikki näkyvästi ehkäistä NAC (kuvio 12B-D). Kuitenkin vähentynyt

Δψ

M aiheuttama Gyp eivät estäneet NAC (kuvio 12E). Nämä tulokset osoittavat, että ROS oli mukana Gyp aiheuttaman vaurion SW-480-soluihin ja

Δψ

m menetys voi olla tärkeä ylävirtaan aktivaattori ROS sukupolvi, ja lisääntynyt ROS saattaa stimuloida vaurioitunut mitokondrioita.

(A) solujen elävyys, (B) solunsisäinen ROS sukupolvi, (C) ydin- morfologisia muutoksia, (D) solumigraation, (E)

Δψ

m menetys varta analysoitiin kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät”.

keskustelu

syöpä on monimutkainen sairaus ja perinteisten syöpähoitojen eivät ole edenneet merkittävästi viime vuosina. Tärkeimmät rajoitukset leikkaus, kemoterapiaa ja sädehoitoa on se, että ne aiheuttavat vakavia sivuvaikutuksia ja huono ennuste toksisuudesta johtuva ei-syöpäkudokseen ja chemoresistance [19]. Kuitenkin luonnollinen lääke on herättänyt laajaa huolta alalla syövän kemoterapiassa turvallisuuteen, tehokkuuteen ja anti-monilääkeaineresistenssin.

Gyp on käytetty perinteinen kiinalainen rohdosvalmiste satoja vuosia, koska sen monenlaisia ​​terveysongelmia hyöty [20] – [22]. Esillä olevassa tutkimuksessa, Gyp indusoi apoptoosia ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän SW-480-soluja tutkittiin.

Tulokset osoittivat, että Gyp pieneni prosenttiosuus elinkykyisten solujen SW-480-soluja. Samaan aikaan, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että sytotoksista vaikutusta Gyp normaaleihin PBMC-soluissa oli paljon vähemmän [23]. Tulokset viittaavat siihen, että Gyp pystyy kohdistamaan erilaisia ​​vaihtoehtoisia sytotoksisuutta syöpäsoluja ja normaaleja soluja, jotka voivat olla mahdollisesti käyttökelpoisia syövän ennalta ehkäisevän tai käsittelyaineen.

solulinja SW-480, joka on saatu ensisijainen adenokarsinooma syntyneiden paksusuolen, oli Ankan vaiheessa B (Dukes B keinot syöpä on kasvanut läpi lihaksen kerroksen paksusuolen tai peräsuolen, hyökkäsi läpi kulhoon seinän mutta imusolmukkeiden selvä) [24]. Levitä on kautta paikallinen invaasio läpi kulhoon seinän ja kautta paikallisen lymphatics, veri (porttilaskimon maksaan) ja transcoelomic. Siksi etäpesäke on yksi suurimmista haasteista onnistuneen syövän hoitoon [25] ja syövän ehkäisemiseen etäpesäke on yhtä tärkeää tavoitteen määrittely potilaan ennustetta. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko Gyp voi estää migraation SW-480-soluissa. Tulokset kuviossa 8 ehdotettu Gyp esti migraation solutyypin on Gyp annoksesta riippuvaisella tavalla. Aktiinisytoskeletonin on rakenteellinen verkko proteiineja, jotka ovat välttämättömiä useita biologisia toimintoja, kuten solun kutistuminen, solun liikkuvuus ja rakkulan kaupan et ai [26], [27]. Muutokset solun osiin voi vaikuttaa dynamiikkaa soluadheesion [18]. Kuva 9 altistuvat muutokset microfilamentti, epäjärjestyksessä järjestely F-aktiini ja täydellistä häviämistä microfilamentti verkon havaittiin 100, 130 ug /ml Gyp. Sen lisäksi, kuten on esitetty kuviossa 10, useissa mikrovillusten väheni huomattavasti, kun Gyp annos oli 70 ug /ml tai sen yläpuolella. Tulokset viittaavat siihen, Gyp aiheuttaa microfilamentti verkko romahtaa, ja lopulta vahingoittaa solun muotoon ja muuttoliike kyky.

Apoptosis on tärkeä rooli homeostaasiin ja voidaan saada aikaan ja säätelevät monet signaali ärsyke polkuja [28], [29 ]. Dysregulation apoptoosin pidetään merkittävänä syövän tunnusmerkki, jotta apoptoosin induktio on todennäköisesti kaikkein voimakas puolustus syöpää vastaan ​​[30], [31]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että erilaisten yhdisteiden uutetaan kasveista voivat aiheuttaa apoptoosin monissa syöpäsoluissa [29], [32], [33]. DNA: n fragmentoituminen ja jotkut morfologiset ominaisuudet kuten kalvo kupliminen, solu kutistuminen, kromatiinin kondensaatio ja muodostumista apoptoottisten kappaleiden ovat tyypillisiä biokemiallinen piirre apoptoosin [34], [35]. Nykyisessä tutkimuksessa Gyp pystyi aiheuttaa ilmeistä DNA pirstoutumista SW-480-solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Lisäksi Hoechst 33342 värjäys määritys näkyy joitakin morfologisia ominaisuuksia jälkeen Gyp käsittely kuten solun kutistuminen, kromatiinin kondensaatio marginaatioon kromatiinin että tumakalvoa ja hajanainen pistemäinen sininen ydin- fluoresenssin SW-480-soluissa. Lopuksi, kuvio 7 ehdottaa Gyp voisi merkittävästi lisätä apoptoottisten solujen ja vähentää elävät solut, mikä osoittaa apoptoottisen vasteen selvästi voimistua jälkeen Gyp SW-480-soluissa. Näin ollen tulokset osoittavat, Gyp voisi indusoida apoptoosia SW480-soluissa.

vaurioituminen solukalvon järjestelmä aiheuttaa kalvon depolarisaation, disturbe epäsymmetria kalvon lipidien, indusoivat kalvon entsyymien, aiheuttaa menetti plasman kalvon eheyden [36 ], ja nämä solutoiminnoille voi lopulta aiheuttaa solujen apoptoosin palkkaamalla kuolemareseptorien [37]. Värjäys PI ja analysoitiin virtaussytometrialla osoittaneet, että Gyp aiheutti solumembraanivaurioita oli varhainen tapahtuma. Me spekuloida, että mekanismi pentaphy vuonna solukalvon vaurioita ehkä johtuu aglykonien että pentaphy [38] on sen paikallinen vaikutus solukalvon siten vahingollista solukalvon tai kirjoittamalla solujen estää kasvaimen kasvua.

mitokondriot tärkeä rooli etenemistä apoptoosin [39]. Siksi mitokondriot kalvo mahdollisten muutosten jälkeen eri pitoisuuden Gyp hoidon SW-480-soluissa mitattiin. Tutkimuksessa lasku

Δψ

m oli varhainen 4 h kuluttua Gyp hoidon ja parantaa lisäämällä pitoisuutta Gyp, mikä viittaa Gyp indusoi solujen apoptoosia SW-480-solut saattavat olla mitokondrioita riippuvainen.

lisäksi, Enhancement of ROS on liittynyt apoptoottisten indusoiman useita pro-apoptoottisten yhdisteiden [40]. Tuloksemme osoittivat Gyp hoito merkitsevästi kannustanut ROS sukupolvi SW-480-soluissa. NAC, raadonsyöjä ROS, käytettiin varmistamaan vaikutuksen ROS jälkeen Gyp hoidon. NAC huomattavasti pelastettiin Gyp aiheuttama SW-480 sytotoksisuus, solunsisäinen ROS sukupolvi, ydin- morfologisia muutoksia ja solujen kulkeutumistestis-, mutta ei

Δψ

m laskua, mikä ROS oli tärkeä rooli Gyp aiheuttama SW-480 solu myrkyllisyys ja apoptoosia, ja ROS sukupolvi oli alavirtaan mitokondrioita vahinkojen jälkeisen Gyp hoitoa, ja lisääntynyt ROS tuotanto saattaa stimuloida vaurioituneen mitokondrioiden meidän koejärjestelmässä.

Yhteenvetona esillä tutkimuksessa arvioitiin sytotoksisuus Gyp in SW-480 soluja, osoitti, että Gyp voivat aiheuttaa solukalvon eheyden vaurioita, vähennä

Δψ

m tasolle, aiheuttaa DNA: n fragmentoituminen ja aloittaa apoptoottisen vasteen SW-480-soluissa. ROS syntyy SW-480-soluilla on tärkeä rooli Gyp solukuolema. Ja se on spekuloitu, että Gyp indusoi solujen apoptoosia SW-480-solut saattavat olla kuolemareseptorien polku ja mitokondrioita riippuvainen. Lisäksi meidän tutkimus osoitti myös, että Gyp voisi käyttää estävää vaikutusta solujen vaeltamiseen

in vitro

ja vakava microfilamentti verkon romahdus sekä merkittävä lasku määrän mikrovillusten. Nämä tulokset viittaavat siihen, Gyp aiheuttaa hehkulangan verkko romahtaa ja vahingoittaa solun muotoon ja muuttoliike kyky. Nämä tutkimukset viittaavat siihen Gyp voi olla suuri arvo ihmisen peräsuolen syövän hoitomuotoja. Lisätutkimukset ovat tarpeen selittää molekyylitason mekanismeja Gyp syövän hoidossa.