PLoS ONE: Targeting GRB7 /ERK /FOXM1 signalointireitin heikentää aggressiivisuus munasarjasyöpäsoluja
tiivistelmä
Munasarjasyöpä on erittäin tappava tauti huonon ennusteen ja erityisesti korkea-asteen kasvain. Kehittyvät näyttöä on ilmoittanut, että poikkeava säätelyä ja aktivointi GRB7, ERK sekä FOXM1 liittyvät läheisesti aggresivenesss ihmisen syövissä. Kuitenkin välistä vuorovaikutusta näiden tekijöiden patogeneesissä ihmisen syöpien edelleen epäselvä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että GRB7 (
P
0,0001), ERK fosforylaatio (
P
0,0001) ja FOXM1 (
P
= 0,001) olivat usein lisääntyi ja liittyy korkea-asteen kasvaimet, sekä suuri taipumus yhdessä pitkälle munasarjasyövän immunohistokemiallisella analyysillä. Kiehtovan, ilmaukset GRB7 (
P
0,0001), ERK fosforylaatio (
P
0,001) ja FOXM1 (
P
0,001) osoittivat merkittävää vaiheittainen lisäys pattern pitkin Grade 1 palkkaluokkaan 3 munasarjojen syöpiä. Biokemialliset tutkimukset käyttäen western blot-analyysi osoitti, että täytäntöön ilmentymistä tai knockdovvn GRB7 osoitti GRB7 voisi nostaa tasoa ERK-fosforylaation ja FOXM1, kun taas täytäntöön ilmaus FOXM1 voinut muuttaa tasoa GRB7 ja ERK fosforylaatio. Mutta esto ERK opastinjärjestelmillä U0126 tai PD98059 voisi alentaa FOXM1 in GRB7 yliekspressoivia munasarjasyöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että GRB7, ERK ja FOXM1 säädellään hallitusti. Lisäksi esto ERK aktiivisuuden U0126 tai PD98059 tai vähentynyt FOXM1 ilmentymisen tiostreptonille esti merkitsevästi solujen vaeltamiseen /invaasio, kasvaimen kasvu
in vitro
ja
in vivo
. Yhdessä meidän havainnot antavat että kohdistaminen GRB7 /ERK /FOXM1 signalointiryöpyn voi olla lupaava molekyyli hoitovaihtoehto torjunnassa munasarjasyöpä.
Citation: Chan DW, Hui WWY, Cai PCH, Liu MX, Yung MMH, Mak CSL, et ai. (2012) Targeting GRB7 /ERK /FOXM1 signalointireitin heikentää aggressiivisuus munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 7 (12): e52578. doi: 10,1371 /journal.pone.0052578
Editor: Muy-Teck Teh, Barts London School of Medicine ja hammaslääketieteen, Queen Mary University of London, Iso-Britannia
vastaanotettu: 30 elokuu 2012; Hyväksytty: 20 marraskuu 2012; Julkaistu: 20 joulukuu 2012
Copyright: © 2012 Chan et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Wong Check Hän hyväntekeväisyysyhdistykseksi. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Munasarjasyöpä on tappavin tauti kaikkien gynekologisia maligniteetteja [1], [2]. Korkea kuolleisuus munasarjasyöpään on huonon ennusteen ja useimmiten havaitaan myöhäisessä vaiheessa. Munasarjasyöpä on heterogeeninen kasvain näytteille monenlaisia Sytologisten, kliiniset ja muuttunut geneettiset ominaisuudet [3], [4]. Munasarjojen korkealaatuisesta syöpiä on tunnusomaista korkea-asteen ytimet, korkea mitoosi-indeksi, lisää aggressiivisuutta, huonosti eriytetty, vähemmän reagoivien kemoterapiaa sekä alhainen eloonjäämisaste [4], [5], [6]. Suhteellisen huonompi synnyssä ja kliinis-patologinen ominaisuudet korkealaatuisesta munasarjasyöpiä heikentää kliinisen hoidon tämäntyyppisen taudin. Siksi ymmärtää niiden taustalla olevia molekyylitason mekanismit voivat auttaa kehittämään paremmin parantavaa hoitoa aggressiivisissa munasarjojen syöpiä.
kasvutekijän reseptorin sitoutunut proteiini 7 (GRB7) on signalointi sovitin, joka toimii kytkemään signaaleja solun pinnan reseptoreihin tiettyihin signalointipolkujen [7]. Kehittyvät todisteita ovat raportoineet, että GRB7 yli-ilmentyy ja yleensä mukana yliekspressioon erbB2 ihmisen syövissä [8], [9]. Kliinis analyysit ovat osoittaneet, että ilmen- tymisen lisääntymisen GRB7 liittyy metastasoituneen käyttäytymiseen [8], [10], [11], [12]. Lisäksi konstitutiivinen aktivointi ERK on liitetty erilaisia kasvaimia aiheuttavasta käyttäytymistä, kuten solujen lisääntyminen, erilaistuminen, etäpesäke, angiogeneesi, ja chemoresistance ihmisen syövissä [13], [14], [15], [16]. Lisäksi, Forkhead Box M1 (FOXM1) on todettu kasvaimia synnyttävää transkriptiotekijä, joka on usein säädelty useissa ihmisen syövissä, [17], [18], [19]. Me ja muut ovat äskettäin havainneet, että säätelyä FOXM1 parantaa solujen lisääntymistä, muuttoliike /invaasion ja erityisesti sen ilmentyminen on osallisena syövän etenemisessä [17], [20], [21], [22]. Mielenkiintoista, edellä mainitut kolme tekijää näyttävät lähentyvän aggressiivisen syövän ominaisuuksia, kuten korkea-asteen ja pitkälle kasvaimia, mutta suhde sääntelyjärjestelmiään mekanismia ei ole täysin selvitetty. Siksi rajaaminen vuorovaikutuksesta niiden sääntelymekanismeille auttaa tutkimaan potentiaalinen terapeuttinen tavoite munasarjasyöpä.
Tässä tutkimuksessa osoitamme, että ilmaukset GRB7, ERK ja FOXM1 merkittävästi korreloivat etenemistä munasarjasyöpä. Kuvaamme myös sääntelyn mekanismia GRB7 /ERK /FOXM1 signalointikaskadissa ja esto tämän signalointi käyttämällä joko kemiallisen inhibiittorin U0126 tai FOXM1 estäjä tiostreptonille voisi merkittävästi kumota munasarjasyövän solumigraatio /invaasio, ja
in vitro
ja
in vivo
kasvaimen kasvua. Tuloksemme korostavat, että GRB7 /ERK /FOXM1 väylän tuumorigeenisemmiksi ominaisuuksia ja väittävät tämän koulutusjakson lupaava terapeuttinen kohde korkealaatuista munasarjasyöpään.
Materiaalit ja menetelmät
Solulinjat ja Drugs
Kaksi munasarjasyövän solulinjoissa: A2780cp (lahja prof BK Tsang, Dept. of Obstetrics naistentautien, University of Ottawa) [23], ja OVCA433 (saatu American Type Culture Collection, Rockville, MD), sekä kaksi GRB7, jotka ilmentävät stabiilisti kloonit; C19 in OVCA433 ja C15 A2780cp joka kertyi aiemmin [12] otettiin mukana tässä tutkimuksessa. Kaikki kasvatettiin 37 ° C: ssa, 5% CO
2 minimum essential väliaineessa tai Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia. MAPK /ERK-kinaasin 1/2 (MEK1 /2) estäjät PD98059 ja U0126, ja FOXM1 estäjä tiostreptonia saatiin yhtiöstä Calbiochem (La Jolla, CA, USA).
Plasmidit ja Cell transfektio
pEGFP /GRB7 ilmentäviä plasmideja käytettiin kuten aiemmin [12]. Neljä shRNA hys 29mer shRNA rakentaa vastaan GRB7 in pGFP-V-RS vektori hankittiin Origene Technologies vakaata GRB7 pudotus soluja (Cat. No. TG312621, Origene Technologies, Inc., Rockville, MD, USA). Ei-tehokas 29-mer salattu shRNA (TR30013) (Origene Technologies) käytettiin negatiivisena kontrollina. Jotta pudotus ihmisen FOXM1, The TriFECTa® RNAi Kit, joka sisältää kolme siRNA kohdistaminen ihmisen FOXM1 ostettiin IDT (Integrated DNA Technologies, Inc., Iowa, USA). Cell transfektio suoritettiin käyttäen LipofectAMINE ™ 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ilmentymiskuviot analysoitiin Western-blottauksella. Emovektori pEGFP-C1 käytettiin tyhjän vektorin ohjaus.
immunohistokemiallinen ja Western Blot analyysit
immunohistokemiallinen (IHC) värjäys GRB7, ERK-fosforylaation ja FOXM1 suoritettiin munasarjasyöpäsolu kudoksen array (OVC1021) (Pantomics Inc, San Francisco, CA) käyttämällä ensisijaista polyklonaalista GRB7 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-fosfo-ERK (Chemicon International, Inc., Temecula, USA), ja anti-FOXM1 (Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA). Prosenttiosuus immunologiseen positiivisten solujen kasvaimia ja normaalissa epiteelissä arvioitiin osuudet immunologiseen positiivisten solujen vaihteli 10-100%, ja värjäytymisen intensiteetti pisteytettiin 0 (negatiivinen), 1 (heikko), 2 (kohtalainen) , 3 (voimakas) ja 4 (merkitty). Immunoreaktiivisuus kussakin tapauksessa pisteytettiin prosentteina suhteessa immunologiseen positiivisten solujen kerrottuna värjäytymisen intensiteetti. Kannen muutos kunkin värjäys saatiin jakamalla ekspressiotaso kunkin syövän näytteen keskiarvo immunoreaktiivisia värjäytyminen arvo normaalin munasarjat ja rajaa sekoitetaan cystadenoma. Määrällinen immunohistokemiallisella värjäyksellä teki sokkona ainakin kaksi riippumatonta tarkkailijaa.
Western blot -analyysiä varten, solut lyysattiin Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), joka sisältää proteaasi-inhibiittori Cocktail (Roche, Indianapolis , IN) ja PMSF: ää (fenyylimetyylisulfonyylifluoridi) (Sigma Chemical Co. St Louise, MO). Näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja elektroblotattiin Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore Corporation, Bedford, MA). Blotit blokattiin kuoritun maidon 5%, jonka jälkeen inkuboitiin anti-GRB7, FOXM1 (Santa Cruz), GFP (Abcam), fosfo-ERK, ERK (Cell Signaling), ja
β-
aktiini (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Blotteja inkuboitiin sitten vuohen anti-kani tai anti-hiiri-vasta-aine-konjugaatin kanssa piparjuuriperoksidaasiin (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH) ja visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssi- (ECL) (Amersham).
elinkykyyn analyysi
Solujen elinkelpoisuus mitattiin Cell Proliferation Kit II (XTT) 5 päivää mukaan valmistajan ohjeiden (Roche). Aineisto kerättiin vähintään kolmen erillisen kokeen.
Cell Migration ja Invasion Analyysit
määrällisesti solun muuttavien ja invasiivisia kapasiteetit munasarjasyövän solujen TranswellTM solu kulkeutumista ja solujen invaasiota määritys sarjat (Chemicon International, Inc., Temecula, CA), käytettiin tässä tutkimuksessa mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1,5 x 10
5 solut suspendoitiin uudelleen seerumittomassa elatusaineessa (tiostreptonia, PD98059 tai U0126 lisättiin tarvittaessa) ja ympättiin ylemmässä kammiossa, kun taas koko väliaine pantiin alempaan kammioon, kuten kemoterapia-houkuttimena . Levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 5% CO
2: ssa 12 tuntia solujen migraatiokokeessa, ja 48 tuntia solujen invaasiomääritys mahdollistaa solujen läpi huokosten kalvo. Solu muuttivat ja tunkeutuu laskettiin jälkeen solujen värjäytymisen ja laskenta käyttämällä vähintään kolmea eri alojen kunkin Transvvell- suodatin. Kokeet toistettiin kolmasti.
In vivo
tuumorigeenisyystesti Pitoisuus
tarkastella
in vivo
vaikutuksia U0126 ja tiostreptonille kasvainten kehitystä, 5 x 10
6 A2780cp soluja istutettiin sc osaksi
BALB /c nu /nu
naarashiiriä 3-4 viikon ikäiset ja viiden ryhmissä. Kasvain muodostumista nude-hiirissä seurattiin joka 3 päivä. 25-50 umol /kg U0126 tai 200-300 umol /kg tiostreptonia (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) annettiin i.p. kerran 3 päivän välein kanssa yhteensä 4 injektiota viiteen nude-hiiriin, kun jokainen kasvaimen koko tuli ~ 3 mm halkaisijaltaan. Koska kontrolliryhmän, DMSO yksinään hallitussa i.p. samaan aikaan hoidon. Kasvain koot mitattiin työntömitta ja laskettiin seuraavalla kaavalla: tilavuus = (leveys)
2 * pituus * π /6. Tuumorikasvun käyrät piirrettiin päässä keskimääräinen tilavuus ± SEM kasvainten 5 hiirillä. Sivuvaikutuksia kuten painon muutokset seurattiin tarkasti. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin University of Hong Kong komitea elävien eläinten käyttö opetuksessa ja tutkimuksessa (CULATR No.2560-11).
Tilastollinen analyysi
kliiniset parametrit olivat analysoitiin SPSS 13.0 ohjelmistolla (SPSS, Chicago, IL). Fisherin testiä (parametristen data) ja Mann-Whitneyn testi (ei-parametrinen data) käytettiin vertaamaan arvojen alaryhmien. Opiskelijan
t
-testi käytettiin analysoida solujen elinkelpoisuuden, muuttoliike /invaasion ja
in vivo
kasvaimen kasvua tuloksia.
p
-arvo katsottiin merkitseväksi kun alle 0,05.
Tulokset
GRB7, ERK-fosforylaation ja FOXM1 ovat usein koholla Munasarjasyöpä
aiemmin raportoitu, että GRB7 [12], ERK-fosforylaation ja FOXM1 [21] ovat yliekspressoituvat munasarjasyövän näytteistä erityisen korkealaatuista kasvaimia. Kuitenkin vuorovaikutus näiden tekijöiden munasarjojen syöpien ei ole vielä selvitetty. Immunohistokemiallisella (IHC) analyysi munasarjasyöpäsolu kudoksen array (OVC1021), huomasimme, että kaikki nämä tekijät yhteneväisesti yläreguloituja munasarjasyövän näytteitä, jotka oli yhdenmukainen aiempien havaintojen [12], [21]. Kuten odotettua, yli-ilmennetty GRB7 ( 4 taittuu) korreloi lisääntyneen ERK-fosforylaation ( 2 kippaa) (
P
0,0001, Fisherin testi) ja FOXM1 ( 3 taittuu) (
P
0,0001, Fisherin testi) (taulukko 1). Lisäksi GRB7 (
P
0,0001, Fisherin eksakti testi), ERK fosforylaatio (
P
0,0001, Fisherin testiä), ja FOXM1 (
P
= 0,001, Fisherin testiä) olivat merkitsevästi korreloi korkealaatuisesta kasvain ja oli suuri taipumus yhdessä pitkälle munasarjasyöpä (GRB7,
P
= 0.021; fosfo-ERK,
P
= 0,065, ja FOXM1,
P
= 0,065, Fisherin testi) (taulukko 1). Huomionarvoista oli se, että huomattava asteittainen kasvu GRB7 (
P
0,001, Mann-Whitneyn testi), ERK fosforylaatio (
P
0,001, Mann-Whitneyn testi), ja FOXM1 (
P
0,001, Mann-Whitneyn testi) ekspressiokuviota havaittiin Grade 1 palkkaluokkaan 3 kasvaimia (Fig. 1A ja 1B) ja vähemmän ilmeisiä kuvion aikaista myöhäisessä vaiheessa munasarjojen syöpiä (Kuva S1 ), mikä viittaa siihen, että nämä tekijät tärkeä rooli munasarjasyövän etenemiseen. Yhdessä nämä tiedot osoittavat on läheinen vuorovaikutus keskuudessa GRB7, ERK aktiivisuus ja FOXM1 säätelyssä munasarjasyövän oncogenesis erityisen korkealaatuista kasvain.
(EN) ilmauksia GRB7, ERK-fosforylaation ja FOXM1 arvioitiin immunohistokemiallisella analyysillä käyttäen spesifisiä vasta-aineita koskevasta munasarjasyöpä kudoksen array (OVC1021, Pantomics). (B) edustaja kuvissa asteittaisen lisäämisen GRB7, ERK-fosforylaation ja FOXM1 ilmauksia Grade 1 palkkaluokkaan 3 munasarjasyöpä (vakavien alatyyppi) (200 x suurennoksilla).
Molecular asetukseen GRB7 /ERK /FOXM1 Signaling in munasarjasyöpäsoluja
Koska lisääntynyt GRB7, ERK-fosforylaation ja FOXM1 merkittävästi korreloivat korkealaatuista munasarjojen kasvain, ne voidaan säädellä koordinoidusti, jotta välittäjänä onkogeenisen toimintoja munasarjasyövän etenemisen . Olimme siis kiinnostuneita tutkimaan sääntelymekanismiin Näistä tekijöistä vuonna munasarjasyöpäsoluja. Tätä tarkoitusta varten sekä A2780cp ja OVCA433 soluja ensin käsiteltiin U0126 MEK1 /2-estäjällä. Western blotting osoitti, että ERK-fosforylaation ja FOXM1 vähenivät huomattavasti, mutta mitään muutosta GRB7 ilmentyminen havaittiin (Fig. 2A). Lisäksi hoito tiostreptonia onnistuttu pienentämään tasolle FOXM1, vaikka tasot GRB7 ja ERK-fosforylaation olivat vielä ennallaan (kuvio. 2B). Jos haluat jättää epäspesifinen toiminta tiostreptonia korkean annoshoitoa, siRNA lähestymistapa välittämä FOXM1 knockdown suoritettiin A2780cp soluissa. Samanlainen kohtelu tiostreptonia, ehtymiseen FOXM1 ei muuttanut ilmaus GRB7 ja ERK-fosforylaation (kuvio. 2B). Tämä osoittaa, että tukahduttaminen ERK toiminta saattaa vähentää FOXM1 tasolla, kun taas vähentäminen FOXM1 ilmaisua ei vaikuta myöskään GRB7 ilmaisu tai ERK aktiivisuutta. Edelleen todistaa tämän havainnon, stabiilisti pudotus endogeenisen GRB7 on GRB7 korkea ilmentävää solulinjaa, OVCA433 käyttäen shRNA lähestymistapa osoitti selvästi, että ei ainoastaan GRB7 vaan myös ERK-fosforylaation ja FOXM1 vähenivät (Fig. 2C). Sen sijaan, täytäntöön ilmentyminen GRB7 lisääntynyt ERK-fosforylaation ja FOXM1 in A2780cp ja OVCA433 solut (Fig. 2D). Toisaalta, hoitoon joko U0126 tai PD98059 MEK1 /2-estäjät voisivat vähentää paitsi ERK-fosforylaation, mutta myös FOXM1 in GRB7 ectopic ilmentävien solujen (Fig. 2D). Yhdessä nämä havainnot antavat että GRB7 positiivisesti ylössäätelee ERK toimintaa, mikä puolestaan nostaa FOXM1 in munasarjasyöpäsoluja.
(A) Käsittely U0126 (5 uM) osoittivat merkittävää vähenemistä ilmaus ERK-fosforylaation mukana FOXM1 in munasarjasyöpäsoluja aika riippuvaa, kun taas mitään muutosta GRB7 ekspressio havaittiin A2780cp soluissa. (B) Hoito tiostreptonia (20 uM) vähensi huomattavasti ilmaus FOXM1 vain, mutta ei muutosta ilmauksia GRB7 ja ERK: n fosforylaatiota A2780cp soluissa (
jäljellä
). Ehtyminen FOXM1 siRNA Knockdown ei muuttanut ilmaus GRB7 ja ERK-fosforylaation (
oikea
). C, siRNA salattu ohjaus. SI1, SI2 ja SI3 siRNA kohdistaminen kolmella eri alueilla ihmisen FOXM1 ja pudotus ilmentymistä FOXM1 60%, 45% ja 70% vastaavasti. (C) Kaksi neljästä GRB7 shRNA rakentaa (SH1 ja SH2) osoittivat -70% knockdovvn GRB7 mukana vähenemiseen ERK-fosforylaation ja FOXM1 ilmaisuja OVCA433 soluissa. Salattu ohjaus (NC) käytettiin negatiivisena kontrollina. (D) pakotettu ilmentymä GRB7 lisääntynyt ERK-fosforylaation ja FOXM1. Kuitenkin hoito joko U0126 (10 uM) tai PD98059 (20 uM) hillitsevän aiheuttama ERK-fosforylaation ja FOXM1 vuonna A2780cp ja OVCA433 munasarjasyöpäsoluja.
vastustamisesta ERK Activity tai FOXM1 Expression Vähennykset Munasarjojen Cancer Cell Migration and Invasion
on dokumentoitu, että korkea-asteen munasarjakasvain näyttelyesineitä suuren kapasiteetin solumigraation /invaasiota [4], [24]. Niinpä pohti esto ERK toimintaa tai FOXM1 ilmaisun yksilöllisellä estäjät voivat vaikuttaa Solujen migraation ja invaasion munasarjasyöpäsoluja. Voit tarkistaa tämän hypoteesin, korkealaatuinen munasarjasyövän solulinja, OVCA433, näytetään korkea muuttavien ja invasiivisia kyvyt oli ektooppisesti ilmaista GFP /GRB7 ja käsiteltiin estäjillä. Tulokset osoittivat, että hoito tiostreptonia, PD98059 ja U0126 vähensi huomattavasti solujen maahanmuuttoluku OVCA433-GRB7 solut 3,5-kertaiseksi, 2,2-kertaiseksi ja 2,5-kertaiseksi verrattuna kontrolliin (Fig. 3A). Samoin hoito tiostreptonia, PD98059 ja U0126 myös merkittävästi vähentää solujen invaasiota nopeudella OVCA433-GRB7 solut 3,5-kertaiseksi, 2,6-kertaiseksi ja 2,9-kertaiseksi verrattuna kontrolli (Fig. 3B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että esto GRB7 /ERK /FOXM1 signalointi kykenee haittaavat Solujen migraation ja invaasion munasarjasyöpäsoluja.
OVCA433 solujen vakaa ilmentyminen GFP /GRB7 (OVCA433-GRB7) käsiteltiin DMSO kontrollina, tiostreptonia (20 uM), PD98059 (20 pM) ja U0126 (10 uM) 6 tunnin ajan ja analysoitiin (A) Transwell solumigraation määrityksessä. Edustaja kuvia ja pylväsdiagrammi osoittivat merkittävä väheneminen määrän vaeltavien solujen kautta Matrigel-pinnoitettu kalvo OVCA433-GRB7 käsiteltyjä soluja tiostreptonille, PD98059 ja U0126 kuin DMSO-kontrollin (*
P
0,02, Student
t
-testi) 8 tunnin; (B) TranswellTM solujen invaasiomääritys. Edustaja kuvia ja pylväsdiagrammi osoitti vähentää merkittävästi hyökkäyksen korko OVCA433-GRB7 käsiteltyjä soluja tiostreptonille, PD98059 ja U0126 verrattuna DMSO-kontrollin (*
P
0,05, Student
t
-testi) 15-tunnin.
kohdistaminen GRB7 /ERK /FOXM1 Estää munasarjasyöpä tuumorikasvun
in vitro
ja
in vivo
Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että konstitutiivinen aktivaatio ERK aktiivisuutta tai lisääntyneen ilmentymisen GRB7 ja FOXM1 liittyvät läheisesti kasvainten muodostumiseen erilaisten ihmisen syöpien [12], [16], [21], [25], [26]. Tämä viittaa siihen, että kohdistaminen Jos tässä signalointikaskadissa pitäisi teoriassa kumota kasvaimia ominaisuudet munasarjasyöpäsoluja. Todellakin, aiemmat julkaisut kertoi, että knockdovvn FOXM1 ja ERK voisi vähentää solujen kasvua ja invasiivisuus ihmisen syövistä [27], [28], [29]. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään kasvaimia muutokset käyttämällä farmaseuttista inhibiittorit erityisesti suunnattu GRB7 /ERK /FOXM1 signalointiryöpyn. Meillä on siis ensinnäkin arvioitiin estävä vaikutus soluproliferaatioon kaksi korkealaatuista vakavien munasarjasyövän solulinjoissa; A2780cp ja OVCA433 käyttäen U0126 (10 uM). XTT soluproleferaatiomäärityksessä, molemmat A2780cp (
P
= 0,02, Student
t
-testi) ja OVCA433 (
P
= 0,03, Student
t
-testi) osoitti vähentää merkittävästi solujen lisääntymisen korko verrattuna niiden valvontaa (Fig. 4A). Samoin käsittelemällä tiostreptonia (20 uM), A2780cp (
P
= 0,015, Opiskelijan
t
-testi) ja OVCA433 (
P
= 0,025, Opiskelijan
t
-testi) osoitti myös syvällinen vähenemistä solujen lisääntymisen korko verrattuna niiden valvontaa (Fig. 4B).
(A) XTT soluproliferaatiomäärityksissä osoittivat, että esto ERK fosforylaation U0126 (10 uM) merkittävästi kumosi soluproliferaatiota kurssi GRB7 ilmentävät stabiilisti OVCA433 solut (
P
= 0,020, Opiskelijan
t
-testi) ja A2780cp solut (
P
= 0,030, Opiskelijan
t
-testi) kuin niiden vektorin valvontaa. (B) XTT soluproliferaatiomäärityksissä osoittivat, että tukahduttamista FOXM1 ilmentymisen tiostreptonia (20 uM) vähensi solujen lisääntymisen kurssi GRB7 ilmentävät stabiilisti OVCA433 solut (
P
= 0,015, Opiskelijan
t
-testi) ja A2780cp solut (
P
= 0,025, Opiskelijan
t
-testi) kuin niiden vektorin valvontaa.
vieressä tutki
in vivo
tuumorigeenisia aktiivisuus GRB7 in A2780cp mukaan ihon alle rokotus GRB7 ja vektorisäätö ilmentävien A2780cp solujen yhteen kylkeen nude-hiirissä. Kuten odotettua, GRB7, jotka ilmentävät pysyvästi A2780cp solut osoittivat 30% nopeammin kasvaimen kasvun verrattuna vektorisäätö (
P
= 0,020, Opiskelijan
t
-testi) (kuvio S2). Seuraavaksi me tutkineet estävä vaikutus kasvaimen kasvuun GRB7 ilmentävät stabiilisti A2780cp kun hoitoon U0126 tai tiostreptonilla. Kun kasvaimen koko saavutti ~ 3 millimetriä tuumoreita nude-hiirissä 6. päivänä, U0126 25 ja 50 uM /kg oli i.p. ruiskutetaan vatsaonteloon nude-hiirten jokaiselle 3-päivä. Kun 4 kertaa U0126 injektio, huomasimme, että siellä oli 35% ja 72% vähennykset kasvaimen koon verrattuna DMSO-kontrollin päivänä 18, kun injektoitiin U0126 25 uM /kg (
P
= 0,032, Student
t
-testi) ja 50 uM /kg (
P
= 0,005, Opiskelijan
t
-testi) (kuvio 5A ja 5B). Sitä paitsi, kun hoito tiostreptonia 200 uM /kg ja 300 uM /kg 9. päivä, oli 47% ja 52% vähennys kasvaimen kasvua verrattuna DMSO-kontrollin päivänä 18 vastaavasti (
P
0,01, Student
t
-testi) (kuvio 5A ja 5B). Nämä havainnot korostavat, että säätelyä GRB7 voisi parantaa kasvaimen kasvua, kun taas joko U0126 tai tiostreptonille voivat tehokkaasti vähentää kasvaimen kasvua munasarjasyöpäsoluja sekä
in vitro
ja
in vivo
.
(EN) GRB7 stabiilisti ilmentäviä A2780cp soluja (AKT-GRB7) injektoidaan subkutaani- oikeaan kylkeen nude-hiirten. Hiiret jaettiin 5 ryhmiin (5 hiirtä per ryhmä) ja käsiteltiin joko DMSO: kontrollina, tai U0126 (25 tai 50 uM /kg) tai tiostreptonia (200 tai 300 uM /kg) joka 3.-päivä alkaen päivänä 6 (nuolet edustavat injektiot). Suhteellinen kasvaimen koko laskettiin suhteessa kuin ensimmäisenä päivänä hoidon (päivä 0) ja ovat edustettuina suhteellisen keskimääräisen koon (%) ± SE kussakin ryhmässä (*
P
= 0. 032, **
P
0,01 ja ***
P
= 0. 005, poikkeavat merkittävästi DMSO kontrolliryhmän, Student
t
-testi). (B) Edustaja kuvia ja pylväskaaviot tarkoittavat keskimääräistä kasvaimen painoa kustakin ryhmästä otettiin päivänä 18. (*
P
= 0. 043, **
P
= 0. 001, ja ***
P
0,02, poikkeavat merkittävästi DMSO kontrolliryhmän, Student
t
-testi).
keskustelu
tässä tutkimuksessa esitämme näyttöä siitä GRB7, ERK-fosforylaation ja FOXM1 lisääntyvät munasarjasyöpä. Mielenkiintoista, samanaikainen kasvu GRB7, ERK-fosforylaation ja FOXM1 liittyy korkealaatuisesta munasarjojen syöpiä. Mikä tärkeintä, me osoittavat, että nämä tekijät säädellään keskitetysti in GRB7 /ERK /FOXM1 signalointi akselin munasarjasyöpäsoluja. Toiminnallisesti, ERK aktiivisuuden U0126 tai PD98059 ja FOXM1 ilmaisun tiostreptonille huomattavan estävät munasarjasyövän solumigraatioon /invaasio ja kasvainten kasvua
in vitro
ja
in vivo
. Nämä havainnot selvästi näyttöä siitä, että aktivoitu GRB7 /ERK /FOXM1 signalointiryöpyn tärkeä rooli patogeneesissä korkealaatuisesta munasarjasyöpään.
konstitutiivisen aktivaation ERK signalointireitin on ollut mukana ihmisen syövän kehitykseen [30] , [31], [32]. Todellakin, kohdistaminen tämän reitin torjumiseksi ihmisen syövissä on herättänyt paljon vaivaa kehittää tehokkaita lääkkeitä viime vuosikymmenen aikana [15], [33], [34], [35]. Me ja muut ovat äskettäin havainneet, että GRB7 ja sen variantti, GRB7v, usein yläreguloituja munasarjasyöpiä ja pystyvät parantamaan solujen lisääntymistä, muuttoliike /invaasion kautta aktivoimalla ERK signalointireitille [12], [36], [37]. Toisaalta näkökohdan, uusien todisteita ovat havainneet, että poikkeava säätelyä FOXM1 transkriptiotekijän on mukana synnyssä erilaisten ihmisen syöpien [17], [21], [22], [38], [39]. Vaikka kaikki nämä poikkeavasti aktivoitu tekijät vallitsevasti liittyy syövän synnyssä ei ole raportti toistaiseksi mainita signalointiyhteyden keskuudessa GRB7, ERK aktiivisuus ja FOXM1 ihmisen syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa käyttämällä IHC analyysiä munasarjasyövän kudoksen array, osoitamme, että GRB7, ERK-fosforylaation ja FOXM1 ovat samanaikaisesti lisääntyneet munasarjasyöpä näytteissä. Kiehtovan, ilmeet näytteille asteittaisen lisäämisen pitkin kasvaimen munasarjojen syöpien. Itse asiassa, meidän kliinis korrelaatio analyysi antaa lisänäyttöä siitä, että niiden ilmen- tymisen lisääntymisen ilmaisuja liittyvät merkittävästi korkealaatuisesta kasvain. Kuten tiedämme, tämä on ensimmäinen raportti osoittaa ilmentymistilanne näiden tekijöitä etenemistä munasarjojen syöpien toistaiseksi. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat, että GRB7, ERK-fosforylaation ja FOXM1 muodostavat onkogeenisessä lähentyminen korkealaatuisesta munasarjasyöpä synnyssä. Siksi kohteekseen signalointiryöpyn voi saavuttaa hyvä tulos hoidettaessa tämän tyyppistä tautia.
GRB7 on tunnettu sovitin, joka välittää signaaleja solun pinnan reseptoreihin tiettyihin alavirran signalointikaskadien kautta proteiini-proteiini vuorovaikutus sen Src -homology 2 (SH2) domain erilaisiin tyrosiini- kinaasien [7], [40], [41]. Me ja muut ovat aikaisemmin raportoitu, että GRB7 on usein yli-ilmentynyt ja edistää solujen proliferaatiota ja kulkeutumista ja solujen invaasiota ihmisen syövistä [10], [12], [42]. Koska sen tärkeitä tehtäviä kuten signaalitransduktion molekyylien aktivoivat kasvaimia synnyttävän signalointireiteissä, lukuisat tutkimukset ovat yrittäneet kehittää estäjiä kohdistamista SH2 verkkotunnuksen GRB7 jotta estämällä poikkeava aktivaatio liittyvän signaloinnin toiminta ja poistaa syöpäsoluja [43], [44] , [45], [46]. Esimerkkejä, yhdistelmä GRB7 syklisen peptidin, G7-18NATE, jossa kemoterapia-lääkkeiden kykenivät estämään rintasyöpäsolujen kasvua [47], [48], tai spesifisen peptidin kanssa ligandin tukahduttaa GRB7-välitteisen etäpesäkkeiden haiman karsinooma jne [11], [49]. Kuitenkin spesifisyys ja affiniteetti ovat tärkeimpiä tekijöitä, joita kohdataan kehitys näissä estäjien GRB7 kohdistetut molekyyli terapeuttisia [26], [49], [50]. Täällä, meidän tiedot osoittavat, että GRB7 säätelee ERK aktiivisuutta ja FOXM1 ilmaisun hallittu ja hyväksyy aiemmat raportit [12], [21], mikä osoittaa, että yli-ilmennetty GRB7 lisää munasarjasyövän solujen kasvuun ja solumigraatio /invaasion kautta ylentävä ERK ja FOXM1 toimintaa. Siksi ehdotimme, että tukahduttamalla poikkeava aktivoitu ERK ja FOXM1 tulisi käyttää samanlaisia vaikutuksia käyttäen GRB7 estäjän inhiboinnissa edellä tuumorigeenisen ominaisuuksia munasarjasyöpäsoluja. Todellakin, meidän
in vitro
ja
in vivo
tuumorigeenisia tutkimukset osoittavat selvästi, että munasarjojen syöpäsolujen kasvua ja solumigraatio /invaasio on huomattavasti alennettu, kun hoitoja PD98059 tai U01260, ja tiostreptonille kautta kohdistaminen MEK /ERK ja FOXM1 toimeen. Vielä tärkeämpää on, tuumoria tukahduttavan vaikutukset, jotka ovat peräisin joko U0126 /PD98059 tai tiostreptonia ovat samanarvoisia. Nämä havainnot näyttävät tarjota vaihtoehtoinen lähestymistapa kehitettäessä GRB7 kohdistettuja hoitomuotoja munasarjasyövän.
Yhteenvetona, tämä tutkimus osoittaa, että poikkeava aktivaatio GRB7 /ERK /FOXM1 signalointiryöpyn merkittävästi korreloi kehitystä munasarjasyöpä . Kohteekseen signalointi akseli MEK /ERK tai FOXM1 estäjät voivat saada lupaava vaikutus signaalitransduktioon perustuva hoito tähän sairauteen.
tukeminen Information
Kuva S1.
immunohistokemiallinen analyysi osoitti lisääntynyt ilmauksia GRB7, ERK-fosforylaation ja FOXM1 liittyi pitkälle munasarjojen syöpiä.
doi: 10,1371 /journal.pone.0052578.s001
(TIF) B Kuva S2.
pakotettu ilmentymä GRB7 kasvaa kasvaimen kasvua hiiren ksenograftimallissa. GRB7 stabiilisti ilmentäviä A2780cp soluja (AKT-GRB7) ja tyhjät vektorisäätö A2780cp soluja (AKT-V) injektoidaan subkutaani- oikeaan kylkeen nude-hiirten (5 hiirtä ryhmää kohden). Tuumorin koko seurattiin joka 3. päivä. Edustaja kuvia ja pylväskaaviot tarkoittavat keskimääräistä kasvaimen painoa kustakin ryhmästä otettiin päivänä 18. (*
P
= 0,02, Student
t
-testi).
Doi: 10,1371 /journal.pone.0052578.s002
(TIF) B
Kiitokset
Kiitämme Prof. Guan Jun-Lin, osastot solu- ja kehitysbiologian, University of Michigan, tarjoamiseksi GRB7 täyspitkä cDNA.