Krooninen sairaus

tiivistelmä

Icaritin, eli yhdistettä

Epimedium Genus

, on selektiivinen estrogeenireseptorin (ER) moduloiva toimintaa, ja omaavansa anti-kasvain aktiivisuutta. Täällä tutkimme icaritin vaikutus solujen kasvuun ihmisen kohdun limakalvon syövän Hec1A solujen ja totesi, että icaritin esti voimakkaasti leviämisen Hec1A soluja. Icaritin-esti solukasvun liittyi kohonneeseen p21 ja p27 ilmaisun ja vähentää cyclinD1 ja cdk 4 ilme. Icaritin indusoi myös solujen apoptoosia liittyy kaspaasien aktivaatio osoituksena katkaisun endogeenisen substraatin Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), ja sytokromi c: n vapautuminen, joka on kumottu esikäsittely yleiseurooppalaisen kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk. Icaritin hoito indusoi myös ilmentymisen pro-apoptoottista proteiinia, Bax, joiden samanaikainen väheneminen Bcl-2: n ilmentymisen. Lisäksi icaritin aiheuttama jatkuva fosforylaation ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinase1 /2 (MAPK /ERK1 /2) in Hec1A soluissa ja U0126, erityinen MAP-kinaasin kinaasi (MEK1 /2) estäjä, esti ERK1 /2 aktivointi icaritin ja poistettava icaritin aiheuttama kasvun esto ja apoptoosin. Tuloksemme osoittivat, että icaritin aiheuttama jatkuva ERK 1/2 aktivointi ja esti kasvua kohdun limakalvon syöpä Hec1A soluja, ja tarjosi järkevää prekliininen ja kliininen arviointi icaritin varten kohdun limakalvon syövän hoidossa.

Citation: Tong JS, Zhang QH , Huang X, Fu XQ, Qi ST, Wang YP et ai. (2011) Icaritin Syyt Jatkuvia ERK1 /2 Aktivointi ja indusoi apoptoosia ihmisen kohdun limakalvon syöpä solut. PLoS ONE 6 (3): e16781. doi: 10,1371 /journal.pone.0016781

Editor: Syed Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 08 joulukuu 2010; Hyväksytty: 14 tammikuu 2011; Julkaistu: 08 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Tong et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Major valtion Basic Research Program of China QY Sun (2011CB94451). Tätä työtä tukee myös NIH avustuksen DK070016 kohteeseen Z.Y. Wang ja Nebraskan tupakka Settlement Biomedical Research Program Awards (LB-595 ja LB692) ja Z.Y. Wang. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpä on yksi yleisimmistä naisten lantion maligniteettien ja on neljänneksi yleisin syöpätyyppi Pohjois-Amerikan naiset takana keuhko-, rinta-, ja paksusuolen syöpiin, joissa 42160 uutta tapausta ja 7780 kuolemantapausta arvioitu vuonna 2009 [ ,,,0],1], [2], [3]. Noin 81500 naiset kärsivät vuosittain Euroopan unionissa ja esiintyvyys kasvaa. Mediaani-ikä esiintyminen on 63 vuotta, kun taas 90% naisista ovat vanhempia kuin 50 [4]. Vaikka potilaat diagnosoidaan ja hoidetaan alkuvaiheessa-tauti endomet- histologia nauttia suhteellisen hyvä eloonjäämisluvut, joilla on pitkälle (vaihe III tai IV, mukaan äskettäin tarkistetun järjestelmän International Federation of naistentautien ja synnytysten [FIGO]) tai uusiutuva kohdun limakalvon syöpä on huono ennuste [5]. Niille naisille alkuvaiheessa tauti, leikkaus yksilöllisillä käytön volyymi suunnatun sädehoidon on parantava [6]. Niille naisille pitkälle sairaus, ei ole mitään todellista mukaisen hoidon ja perinteisesti näitä naisia ​​hoidetaan kirurgian, kemoterapiaa ja säteily, yhden tai useamman yhdistelmät. Kun asetus edennyt tai uusiutuva sairaus, varsinkin kun se ei ole vastaanottavaisia ​​kirurginen resektio, tunnusmerkki hoito on kemoterapia [7]. Vaikka monet potilaat aluksi vastaamaan kemoterapian resistenssin ja kasvaimen uusiutumisen lopulta kehittää [5]. Siten on kiireesti kehitettävä uusia terapeuttisia aineita hoitamaan tehokkaasti tätä tappavaa tautia.

Icaritin (Fig. 1A) on hydrolyyttinen tuote icariin peräisin

Epimedium

, perinteinen kiinalainen kasviperäisten lääkeaineiden. Icaritin esittelee monia farmakologisia ja biologisia vaikutuksia, kuten stimulaatio hermosolujen ja sydämen erilaistumisen [8], [9], lisälaite osteoblastien ja tukahdutti osteoklastien erilaistumista ja toimintaa [10], ehkäisy steroidi liittyvä osteonekroosi [11], estämällä ihmisen eturauhassyövän PC-3 solujen kasvua [12], induktio ihmisen eturauhasen sileän lihaksen solujen apoptoosin kautta ERK1 /2-reitin [13], ja hermoja suojaava vaikutus [14]. Aiemmin on raportoitu, että icaritin osoittaa estrogeenin kaltaista aktiivisuutta estrogeenireseptorin-positiivisen rintasyövän MCF-7-solujen osa-mikromolaarisella pitoisuudet [15]. Tällä mikromolaarisella alueella, kuitenkin, icaritin esti kasvun eturauhassyövän PC-3-soluja [12]. Nämä tulokset osoittivat, että icaritin on sekä agonisti ja antagonisti toimintaa riippuen pitoisuuksista ja voi toimia estrogeenireseptorin modulaattori säätelemään solujen kasvua. Kuitenkin, ei ole raportoitu säätelevän icaritin vastaan ​​kohdun limakalvon syöpä.

(A) kemiallinen rakenne icaritin. (B) vaikutukset icaritin kasvuun esto Hec1A soluja. Soluja ylläpidettiin fenolipunaista media 2,5% hiilellä erotettua sikiön seerumia, 24 tunnin ajan, ja sitten se käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden icaritin. Solut kerättiin eri aikapisteissä, kun ilmoitettu ja leviämisen potentiaali arvioitiin MTT-määrityksellä. Tulokset kahdeksan itsenäistä kokeita laskettiin keskiarvo ja keskiarvo ± SEM. *,

P

0,05 verrattuna kontrollisoluihin.

mitogeeniaktivoidun proteiini (MAP) kinaasien osallistuu erilaisten solun toimintojen, kuten solujen lisääntymisen, solujen erilaistumisen, solun liikkuvuus, ja solukuolemaa [16]. On olemassa kolme suurta MAPK perhe alaryhmään: ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinase1 /2 (ERK1 /2), c-Jun N-pään stressiin aktivoitua proteiini kinases1 /2 (JNK1 /2) ja p38 proteiinikinaasien. Signalointi Cascades liittyy JNK ja p38, aktivoidaan solunulkoinen stressi signaaleja, ovat mukana solujen erilaistumista ja apoptoosia [17], [18]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ERK1 /2 on keskeinen rooli solujen lisääntymistä ja että jatkuva ERK1 /2 aktivointi indusoi solusyklin pysähtymiseen ja erilaistuminen [19], [20]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, tässä, että aktivointi ERK1 /2-signalointireitin välittää icaritin indusoiman apoptoosin Hec1A soluja.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että icaritin laukaisi mitokondrioissa-välitteisen Hec1A solujen apoptoosia ja pysyvät aktivoituminen MAPK /ERK1 /2 kautta. Meidän tulokset viittasivat siihen, että icaritin voisi olla käyttökelpoinen syövän vastaisena aineena kohdun limakalvon syövän hoidossa.

Tulokset

Icaritin inhiboi kohdun limakalvon syöpä Hec1A solujen

Aiemmin on raportoitu, icaritin esti voimakkaasti kasvua eturauhassyövän PC-3-solut, rintasyövän solujen ja hepatooma HepG2-soluissa [12], [15], [21]. Päätimme tutkia vaikutusta icaritin kasvuun kohdun limakalvon Hec1A soluja. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla icaritin 12 h, 24 h, ja 48 h, ja solujen kasvu mitattiin MTT-määrityksellä. Olemme havainneet, että oli annoksesta riippuvainen ja ajasta riippuvainen väheneminen kasvun Hec1A käsiteltyjen solujen icaritin (Fig. 1 B), mikä osoittaa, että icaritin inhiboi proliferaatiota Hec1A soluja.

koetin mekanismin taustalla icaritin indusoimaan solusyklin pysähtymiseen, suuret G1 vaihe sääntelyviranomaisten, kuten sykliini D1 /cdk4 ja sykliiniriippuvaisen estäjät WAF1 /p21 ja KIP1 /p27 tutkittiin. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, icaritin käsittely johti huomattavaan vähenemiseen ekspressiotasot sykliini D1 ja cdk4 ja kasvu WAF1 /p21 ja KIP1 /p27 ilmentymistä verrattuna soluihin, vehikkeliä (Fig. 2B). Nämä tiedot osoittivat, että icaritin kykeni indusoimaan solusyklin pysähtymiseen ja säännellä syklin-liittyviä efektoreja.

(A) Hec1A soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden icaritin 24 tuntia. Tasot sykliini D1 ja cdk4 määritettiin western blot. Proteiini tasot β-aktiini mitattiin myös kontrolleina. (B) Hec1A soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden icaritin 24 tuntia. Tasot p21 ja p27 määritettiin western blot. Proteiini tasojen β-aktiini mitattiin myös kontrolleina.

Icaritin indusoi Hec1A solujen apoptoosin

Seuraava testi onko icaritin myös indusoi apoptoottista solukuolemaa ihmisen kohdun limakalvon syövän Hec1A soluja. Hec1A soluja käsiteltiin icaritin ja apoptoosi määritettiin kahdella eri menetelmällä. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, määrä TUNEL-positiivisten solujen lisääntynyt kohonneet pitoisuudet icaritin. Nukleosomissa pirstoutuminen, indikaattori apoptoosin, määritettiin solukuoleman Detection ELISA vahvistivat lisäksi, että icaritin indusoi solun apoptoosin annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 3B). Lisäksi on anneksiini V-värjäyksen osoitti myös, että icaritin indusoi apoptoottista solukuolemaa, mutta ei kuolio Hec1A soluissa (Fig. 3C).

(A) visualisointi apoptoottisten solujen TUNEL-määrityksellä Hec1A soluissa. (B) DNA pirstoutuminen arvioitiin käyttämällä Cell Death Detection ELISA kit. Tiedot esitetään keskiarvo ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. *,

P

0,05 vertailuryhmän soluihin. (C) apoptoottiset tila määritettiin anneksiini V /PI värjäystä menetelmällä. Prosenttiosuudet negatiivinen (elinkelpoisten) soluja, anneksiini V-positiivisia (varhainen apoptoottisten) solujen, PI-positiivisia (nekroottisen) soluja tai anneksiini V ja PI kaksinkertainen positiivinen (myöhäinen apoptoottiset) solut olivat (keskiarvo kolmen erillisen kokeen), jonka virtaussytometria analyysi.

annoksesta ja ajasta riippuvaa vaikutukset icaritin on proteolyyttisen kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 tutkittiin. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, icaritin hoito johti merkittävään kasvuun aktiivinen muoto kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 Hec1A soluissa. Aktivointi kaspaasien on icaritin käsitelty Hec1A solujen vahvistettiin edelleen ilmaisemalla pilkkomisen PARP, endogeeninen substraatti aktivoitu kaspaasi-3 ja tunnusmerkki apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, hoito Hec1A solujen icaritin johti pilkkoutumisen PARP on 85 kDa: n fragmentti. Lisäksi olemme tutkineet solunosasijaintia sytokromi c: onko mitokondriot reitti on mukana icaritin: n indusoiman apoptoosin. Immunofluoresenssi sytokromi c: visualisoitiin konfokaalisella laser mikroskoopilla. Sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin 10 uM icaritin 24 tuntia, värjäysrintamaan sytokromi c tuli diffuusi ja näön (Fig. 4C) toisin kuin kompakti, plakin ulkonäkö sytokromi c valvonta-soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä, joka ilmaisee vapautuminen sytokromi c: n päässä mitokondriot sytosoliin in icaritin-käsitellyissä soluissa.

(A) Hec1A soluja käsiteltiin osoitetuilla icaritin pitoisuus tai ilmoitettuina ajankohtina, koko solu-uutteet valmistettiin ja alistettiin Western blot määritys tason mittaamiseksi pilkkoa-kaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-9. Proteiini tasot β-aktiini mitattiin myös kontrolleina. (B) Hec1A-soluja käsiteltiin osoitetuilla icaritin pitoisuus tai ilmoitettuina ajankohtina, koko solu-uutteet valmistettiin ja alistettiin Western blot -määritys käyttäen vasta-aineita PARP. Proteiini tasot β-aktiini mitattiin myös kontrolleina. (C) Hec1A solut kiinnitettiin ja leimattiin sytokromi c (punainen) ja DNA (sininen). (D) Hec1A soluja esikäsiteltiin 10 uM z-VAD-fmk: ssa 1 tunti, minkä jälkeen 10 uM icaritin 24 tuntia, ja DNA: n fragmentoituminen ja kaspaasi-3-aktiivisuus määritettiin. Tiedot esitetään keskiarvo ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. *,

P

0,05 vertailuryhmän soluihin. (E) Hec1A soluja esikäsiteltiin 10 uM z-VAD-fmk: ssa 1 tunti, minkä jälkeen 10 uM icaritin 24 tuntia. Proteiini-uutteet valmistettiin ja alistettiin Western blot -määritys käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​PARP. Proteiini tasot β-aktiini mitattiin myös kontrolleina.

edelleen merkityksen määrittämiseksi kaspaasin aktivaation icaritin: n indusoiman apoptoosin, käsittelimme Hec1A solujen pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk (10 uM) ennen icaritin hoitoa. Yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä z-VAD-fmk esikäsittely poisti kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja vähentää icaritin aiheuttama apoptoosin mitattuna nukleosomin pirstoutumista Hec1A soluissa (Kuva. 4D B, icaritin indusoi solujen apoptoosia tehokkaasti kumottu U0126, voimakas estäjä MEK1 /2, mutta p38-estäjän SB203580 ja JNK-inhibiittori SP600125 ei ollut mitään vaikutusta, mikä viittaa siihen, että aktivaatio ERK1 /2 signalointi on mukana icaritin: n indusoiman apoptoosin. Samoin ERK1 /2 esto sen spesifinen estäjä voisi tehokkaasti antagonisoida icaritin aiheuttama kaspaasi-3: n aktiivisuuden (kuvio. 7C). Lisäksi, Western blot-määritys paljasti, että U0126 inhiboi jatkuvasti ERK1 /2 aktivointi ja pilkkominen PARP icaritin käsiteltiin (Fig. 7D), kun taas kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk ei ollut vaikutusta icaritin-indusoidun aktivaation ERK1 /2 (kuvio . 7E). Nämä tulokset osoittivat, että pro-apoptoottinen vaikutus icaritin in Hec1A solut välittävät jatkuva aktivoituminen ERK1 /2 signalointireitin.

(A) Hec1A soluja käsiteltiin icaritin läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 uM U0126, 10 uM SP600125, tai 40 uM SB203580: ssa 24 tuntia, Cell kasvu määritettiin MTT. Palkit edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. *,

P

0,05 verrattuna varten icaritin saaneessa ryhmässä. (B) Hec1A soluja käsiteltiin icaritin läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 uM U0126, 10 uM SP600125, tai 40 uM SB203580 24 tuntia, ja DNA: n fragmentoituminen määritettiin. Tiedot esitetään keskiarvo ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. *,

P

0,05 verrattuna icaritin käsiteltyjä soluja. (C) Hec1A soluja käsiteltiin icaritin läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 uM U0126, 10 uM SP600125, tai 40 uM SB203580 24 tuntia, ja kaspaasi-3-aktiivisuus määritettiin kaspaasi-Glo määrityksessä. Tiedot esitetään keskiarvo ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. *,

P

0,05 verrattuna icaritin käsiteltyjä soluja. (D) Hec1A soluja esikäsiteltiin tai esikäsiteltiin 10 uM U0126 Sitten lisättiin DMSO: ta (vehikkeli) tai 10 uM icaritin 12 h, 24 h vastaavasti. Proteiini-uutteet valmistettiin ja alistettiin Western blot -määritys tason mittaamiseksi fosforyloidun ERK1 /2. Proteiini tasojen ERK1 /2 mitattiin myös kontrolleina. (E) Hec1A soluja esikäsiteltiin tai esikäsiteltiin 10 uM U0126 Sitten lisättiin DMSO: ta (vehikkeli) tai 10 uM icaritin 12 h, 24 h vastaavasti. Proteiini uutteet valmistettiin ja lohkaisu PARP analysoitiin Western pultilla. Proteiini tasot β-aktiini mitattiin myös kontrolleina. (F) Hec1A Soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman z-VAD-fmk (10 uM) inkuboitiin edelleen 10 uM icaritin 24 tuntia. Proteiini-uutteet valmistettiin ja alistettiin Western blot -määritys tason mittaamiseksi fosforyloidun ERK1 /2. Proteiini tasojen ERK1 /2 mitattiin myös kontrolleina.

Keskustelu

Täällä osoitimme, että icaritin, yhdiste puhdistettu lääkeyrtti Epimedium, indusoi kasvun estäminen ja apoptoottisen solukuoleman ihmisen kohdun limakalvon syövän Hec1A solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla.

on hyvin tunnettua, että solusyklin eteneminen on dynaamisesti ja tiukasti säännelty sisältävät kompleksit cdks ja sykliinejä jotka kaikki ovat kriittisiä normaalin etenemisen solun sykli ja inaktivaatio näiden proteiinien johtaa solusyklin pysähtymiseen [24], [25], [26]. Havaitut inhiboivia vaikutuksia icaritin ilmenemistä sykliini D1 ja cdk4 in Hec1A soluja viittasi siihen, että icaritin voi pysäyttää solusyklin tiettyyn vaiheeseen. Cdk toimintaa säädellään myös CDK-inhibiittorit kuten WAF1 /p21 ja KIP1 /p27 perheitä proteiineja. Tässä olemme myös osoittaneet, että icaritin indusoi ilmentymisen tasot WAF1 /p21 ja KIP1 /p27.

monissa solutyypeissä, apoptoosia on ominaista sukupolven DNA-fragmenttien toiminnan kautta endogeenisten endonukleaasien [27] , [28]. DNA apoptoottisten solujen pilkkoutuu multimeerien 180-200 bp fragmentit, jotka vastaavat oligonukleosomaalisiksi koon. Näin ollen, DNA-apoptoottisten solujen tyypillisesti kulkeutuu kuten tikkaita 180-200 bp multimeerien agaroosigeelillä. Terminal deoxynucleotidy transferaasi Biotiini-dUTP Nick End Labeling (TUNEL) menetelmä tunnistaa apoptoottiset solut in situ käyttämällä terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia (TdT) siirtää biotiini-dUTP näihin säikeen katkoksia on pilkkoa DNA [29]. ELISA-määritysmenetelmän sytoplasmisen histoni-associated DNA-fragmenttien (mono- ja oligonukleosomeja) jälkeen solukuolema [30]. Anneksiini V: käytetään määritetään kvantitatiivisesti solujen prosenttiosuus populaatiossa, jotka ovat aktiivisesti apoptoosin. Se vetoaa omaisuutta solujen menettää kalvo epäsymmetrian alkuvaiheessa apoptoosin. Apoptoottisissa soluissa, kalvon fosfolipidi fosfatidyyliseriini (PS) kulkeutua sisemmästä seloste plasmamembraanin ulompaan pakkausselosteessa, mikä altistaa PS ulkoiseen ympäristöön. Anneksiini V on kalsium-riippuvainen fosfolipidi-sitoutuva proteiini, jolla on korkea affiniteetti PS, ja on hyödyllistä tunnistaa apoptoottiset solut altistuvat PS. Propidiumjodidia (PI) on standardi virtaussytometrianalyysin elinkelpoisuus koetin ja sitä käytetään erottamaan elinkelpoisia alkaen käyttökelvottomaksi soluista. Elävät solut ja ehjät kalvot sulkea PI, kun taas kalvot kuolleiden ja vaurioituneiden solujen ovat läpäiseviä PI. Solut, joita pidetään kannattava ovat anneksiini V ja PI negatiivinen; solut, jotka ovat alussa apoptoosin ovat anneksiini V positiivisia ja PI negatiivisia; solut, jotka ovat myöhässä apoptoosin ovat sekä anneksiini V ja PI positiivinen; ja solut, jotka ovat kuolioituneita ovat anneksiini V negatiivisia ja PI negatiivinen [31]. Anneksiini V /PI-värjäys menetelmä erottaa apoptoosin soluissa ja kuolion soluja. Esillä olevassa tutkimuksessa, Hec1A soluja käsiteltiin icaritin ja apoptoosi määritettiin käyttämällä TUNEL ja ELISA-määritystä. Lisäksi anneksiini V-sitoutumismääritys osoittivat, että icaritin indusoi apoptoosin, mutta ei kuolio Hec1A soluissa.

Mitochondria on keskeinen rooli signaalin siirtoon apoptoosin [32]. Havainto icaritin-välitteisen kaspaasi-9, kaspaasi-3, myöhemmin lohkaisu PARP ja vapautumista sytokromi c: n, samoin kuin sillä seurauksella, että yleiseurooppalainen kaspaasi-inhibiittori z-ved-FMK esti lähes täysin icaritin indusoiman apoptoosin Hec1A soluja, mikä viittaa siihen, että mitokondrion-välitteisen kaspaasi cascade reitti on erittäin tärkeä rooli icaritin indusoiman apoptoosin [33].

Bcl-2-perheen proteiinien, mukaan lukien Bcl-2: n ja Bcl-2-liittyvät perheenjäsenten kuten Bcl-x L, Bad ja Bax, on tärkeä rooli apoptoosin säätelyyn. Ne voivat aktivoida tai inhiboida loppupään tekijät, kuten sytokromi c, joka johtaa kaspaasi-3 ja PARP suorittaessaan apoptoosin [34]. Bax kykenee pro-apoptoottista aktiivisuutta, jonka translokaatio päässä sytosoliin mitokondriot, jossa se indusoi sytokromi c: n vapautumisen, kun taas Bcl-2 kykenee sen anti-apoptoottista aktiivisuutta, ainakin osittain, estämällä translokaatio Bax mitokondriot [35] . On selvää, että suhde pro- ja anti-apoptoottisen proteiinin ekspressiota, kuten Bax /Bcl-2, on kriittinen apoptoosin, ja se päättää herkkyyttä solujen apoptoosin [36]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että käsittely Hec1A solujen icaritin johti merkittävään vähenemiseen Bcl-2-proteiinin ja kasvu Bax-proteiinin, mikä siirtää Bax /Bcl-2 -suhde hyväksi apoptoosia. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että icaritin säätelee ekspressiotasot Bcl-2-perheen, indusoi sytokromi c: n vapautumisen ja trigs kaspaasiriippuvaisen solujen apoptoottisen kuoleman.

perhe MAPK, ERK, SAPK /JNK1 /2 ja p38 näyttelee keskeinen rooli solujen lisääntymisen, erilaistumisen, selviytyminen, ja apoptoosin, mukaan lukien ekstrasellulaarisen sääntelemättömien kinase1 /2 [37], [38]. Yleensä lyhytaikaisessa ERK1 /2 aktivointi tapahtuu nopeasti ja pienenee 30-45 min, jonka katsotaan johtavan solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [39], mutta pysyviä tai jatkuvia ERK1 /2 aktivointi, jotka kestävät yli 12 tuntia on osallisena solujen erilaistumista ja kuolema [40], [41], [42], [43]. Dual toiminta ERK1 /2 sekä solujen lisääntymisen ja solukuoleman voidaan selittää useilla viimeaikaiset havainnot, jotka osoittavat, että fosforyloitu ERK: t voivat tuottaa erilaisia ​​tuloksia riippuen kestosta ERK kertyminen tumaan [44], [45]. Viime aikoina on raportoitu, että jatkuva ERK aktivaatio oli mukana kalsium-indusoidun apoptoosin linssin epiteelisolujen [46]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että icaritin indusoi aktivointi ERK ja p38-kinaasin alkion kantasoluja ja hermosolujen [8], [14]. Chen et ai. raportoitu, että icaritin indusoi kasvun esto ja apoptoosin ihmisen eturauhassyövän PC-3-solujen kautta ERK1 /2-signalointireitin [13]. Täällä Huomasimme myös, että icaritin aiheuttama jatkuva aktivoituminen ERK1 /2, mutta ei JNK ja p38 in Hec1A soluissa. U0126, spesifinen inhibiittori MEK (MAPK /ERK-kinaasi), esti tehokkaasti icaritin indusoiman ERK1 /2 aktivointi ja heikennettyjä icaritin-indusoitua apoptoosia, mikä viittaa siihen, että jatkuva aktivointi ERK1 /2-signalointireitin on yksi niistä mekanismeista.

Yhteenvetona olemme huomanneet, että icaritin esti solujen kasvua ja indusoi solujen apoptoosia Hec1A soluissa. Tutkimme myös taustalla olevien mekanismien mukana icaritin aiheuttaman apoptoosin. Tuloksemme osoittivat, että icaritin aiheuttama solukasvuneston liittyy vähennykset sykliini D1 ja cdk4 proteiinin ilmentymisen ja inductions p21 ja p27-proteiinin ilmentyminen. Tuloksemme osoittivat myös, että icaritin indusoiman apoptoosin liittyy kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 ja vapautumista sytokromi c. Huomasimme, että jatkuva ERK1 /2 aktivaatio vaadittiin icaritin indusoiman apoptoosin. Tuloksemme edellyttäen järkevä että icaritin voitaisiin kehittää potentiaalisena syöpälääke ihmisen kohdun limakalvon syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit ja reagenssit

Icaritin, jonka puhtaus on jopa 99,5% oli tri Kun Meng (shenogen Pharma Co Peking, Kiina). Kantaliuosta, (10 uM) valmistettiin liuottamalla icaritin DMSO: ssa (Sigma, St Louis, MO, USA) ja säilytettiin -20 ° C: ssa. MTT, DAPI, U0126, SP600125, SB203580, ja yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä (z-VAD-fmk) hankittiin Calbiochem (San Diego, CA). Vasta-aine pilkotaan kaspaasi-3 ostettiin Cell Signaling (Beverly, MA). Vasta-aineet ERK1 /2, fosfori-ERK1 /2, p38, fosfo-p38, JNK, fosfo-JNK, p21, p27, sytokromi c, Bcl-2, Bax, lohkaista kaspaasi-9, sykliini D1, cdk4, PARP ja β aktiini ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit I ostettiin Becton Dickinson (Pharmingen).

Solut kulttuuri ja solujen lisääntymistä essee

Ihmisen kohdun limakalvon syöpä solulinja Hec1A saatiin tri Li-Hui Wei (Peking yliopiston Kiinan Hospital, Peking) ja niitä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (Gibco-BRL, USA) väliaineessa, jossa oli 10% vasikan sikiön seerumia (Hyclone, UT), 5 ug /ml insuliinia, ja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Media muutetaan fenolipunaista media 2,5% hiilellä erotettua vasikan sikiön seerumia, 24 tuntia ennen kokeita tarvitaan.

Solut ympättiin 96-kuoppaisella alustalla lopulliseen pitoisuuteen 1 x 10

4 solua /kuoppa ja inkuboitiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% FCS: ää 24 tunnin ajan. Sitten Soluja viljeltiin fenolipunattomassa-DMEM: (Gibcol-BRL, USA) 2,5% hiilellä erotettua vasikan sikiön seerumia (Biochrom AG, Saksa), jota seuraa käsittely vaihtelevilla icaritin 12 h, 24 h, ja 48 h. Väliaine poistettiin ja tuoretta väliainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan yhdessä 20 pl MTT-liuosta (5 mg /ml). 4 tunnin kuluttua inkuboinnin 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyt luettiin aallonpituudella 490 nm käyttäen mikrolevylukijaa (Bioteck Powerwave

TM, USA). Kahdeksan kahdentaa kaivoja käytettiin kussakin käsittelyssä, ja kokeet toistettiin kolme kertaa.

Western blot -analyysi

Western blot suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [47], [48]. Soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden icaritin varten osoitetun ajan fenolipunattomassa-DMEM: (Gibcol-BRL, USA) 2,5% hiilellä erotettua vasikan sikiön seerumia (Biochrom AG, Saksa). Solut kerättiin jääkylmään PBS: ään, ja solu-uutteet valmistettiin RIPA-puskurissa proteinaasi inhibiittoricocktailia Sigmalta (St. Louis, MO). Proteiinipitoisuudet solulysaateista määritettiin ja keitetään geeli-latauspuskuria 10 minuuttia 100 ° C: ssa. Näytteet, jotka sisälsivät 30 ug kokonaisproteiinia ajettiin elektroforeesissa 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore, Temecula, CA). Siirron jälkeen kalvo blokattiin TBST (TBS, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä), joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa 2 h, mitä seurasi inkubointi yön yli 4 ° C: ssa sopivan primaarisen vasta-aineita. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa TBST: ssä, kalvoja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa 1:2000 piparjuuriperoksidaasikonjugoitua sopivan sekundäärisen vasta-aineita. Lopuksi kalvot visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (Amersham, Piscataway, NJ).

TUNEL-määritys

Mahdolliset DNA: n fragmentoituminen tutkittiin fluoresenssivärjäyksellä TUNEL (Terminal transferaasi dUTP Nick end Labeling) apoptoosin havaitseminen kit (Beyotime Biotech, Kiina) seuraten valmistajan ohjeita. Lyhyesti, soluja viljeltiin steriilissä lasi coverlips kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 10 minuutin ajan, ja sitten läpäiseviksi 0,4% Triton X-100: ssa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Soluja inkuboidaan reaktioseosta, joka sisältää biotiinia-dUTP ja päätelaitteen deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) ja 60 min ja sitten avidiini-FITC liuosta 30 minuutin ajan pimeässä. DAPI myöhemmin lisätty tumavärjäystä. Mikroskooppinen analyysi suoritettiin käyttäen konfokaalista laser-skannaus mikroskooppia (Zeiss LSM 710 META, Saksa).

Apoptosis Detection Cell Death entsyymi-immunoanalyysillä menetelmä

ELISA solut kylvetään 96-kuoppalevyille (1 x 10

4 solua /kuoppa) käsiteltiin icaritin, sitten apoptoottiset solut arvioitiin käyttämällä Cell Death Detection ELISA-kittiä (Roche Diagnostics, Mannhein, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Fotometrinen entsyymi-immunomääritys käytettiin määritetään kvantitatiivisesti muodostumista sytoplasmisen histoni liittyvien DNA-fragmenttien muodossa mononucleosomes jälkeen apoptoosin soluissa. Absorbanssi 405 nm: ssä mitattiin indikaattorina apoptoottisten solujen. Viittaus aallonpituus oli 490 nm. Rikastamista tekijä (kokonaismäärä apoptoosin) laskettiin jakamalla näytteen absorbanssi (A405 nm), jonka absorbanssi valvonnan ilman hoitoa (A490 nm).

anneksiini V /PI määritykset apoptoosin

anneksiini V /PI-määritykset, solut värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja PI, ja arvioidaan apoptoosin virtaussytometrialla mukaan valmistajan protokollan (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Lyhyesti, 1 x 10

6 solut pestiin kahdesti PBS: llä ja värjättiin 5 ui anneksiini V-FITC ja 10 ui PI (5 ug /ml) 1 ml: ssa sitomispuskurissa 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa tumma. Apoptoottisten solujen määritettiin käyttäen Becton-Dickinson FACScan cytoflurometer (Mansfield, MA, USA).

immunofluoresenssi

immunofluoresenssi käytettiin analysoimaan Subsellulaariset jakelu sytokromi c: in Hec1A indusoiman by Icaritin. Soluja viljeltiin steriilin lasi coverlips kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 10 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun oli kyllästetty 0,4% Triton X-100: ssa 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, solut blokattiin 4% BSA-täydennetty PBS: ssä 1 tunnin ajan ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-sytokromi c: vasta-aine. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa PBS: ssä, solut leimattiin TRITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. DAPI myöhemmin lisätty tumavärjäystä. Mikroskooppinen analyysi suoritettiin käyttäen konfokaalista laser-skannaus mikroskooppia (Zeiss LSM 710 META, Saksa).

Measurement kaspaasi-3: n aktiivisuuden

Soluja käsiteltiin icaritin puuttuessa ja läsnä eri estäjät, sekä kaspaasi-3 aktiivisuutta kirkastetut liuotteet mitattiin käyttämällä kaspaasi-3 Activity Assay Kit (Beyotime Biotech, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Luminesenssi kvantitoitiin käyttämällä ELISA-lukijaa. Tyhjät arvot vähennettiin, ja nousu kaspaasi-3 toiminta ilmaistiin kertainen lisäys ja lasketaan toimintaa mitattuna käsittelemättömät solut.