Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Transketolaasi kaltainen 1 (TKTL1) indusoi glukoosi hajoaminen kautta anaerobiset reittejä, vaikka hapen läsnä ollessa, suosien pahanlaatuinen aerobinen glykolyyttisen fenotyypin ominaisuus syöpäsoluja. Kuten TKTL1 näyttää olevan voimassa biomarkkereiden syövän ennustetta, jonka tavoitteena on nykyisen tutkimuksen tarkoituksena oli korreloi sen ilme kasvaimen vaiheessa todennäköisyys kasvaimen uusiutumisen ja eloonjäämisen, sarjassa peräsuolen syövän potilaista.

Methodolody /Keskeiset havainnot

Kasvain kudoksia 63 potilasta diagnosoitu kolorektaalisyöpä eri vaiheissa etenemistä analysoitiin TKTL1 immunohistokemiallisesti. Värjäys kvantifioitiin laskennallisen kuva-analyysi, ja korrelaatioita entsyymin ilmaisua, paikallinen kasvu, imusolmukkeiden osallistuminen ja etäpesäke arvioitiin. Korkeimmat arvot TKTL1 ilmentymisen havaittiin ryhmässä vaiheen III kasvaimia, jotka osoittivat merkittäviä eroja muiden ryhmien (Kruskal-Wallisin testi,

P

= 0,000008). Syvempi analyysit T, N ja M luokitukset paljasti heikko korrelaatio paikallisen kasvaimen kasvua ja entsyymi ilmaisun (Mann-Whitney testi,

P

= 0,029), merkittävän yhdistys entsyymin ilmentymisen kanssa imusolmukkeiden osallistuminen ( Mann-Whitney testi,

P

= 0,0014) ja merkittävä väheneminen TKTL1 ilmaisu liittyy etäpesäkkeitä (Mann-Whitney testi,

P

= 0,0004).

Johtopäätökset /merkitys

Tietääksemme harvat tutkimukset ovat tutkineet yhdistyksen välillä vaihtelut TKTL1 ilmentymisen primaarikasvaimen ja etäpesäkkeiden muodostumista. Kirjoittajat raportoivat downregulation entsyymin ilme, kun etäpesäke näkyviin, ja korrelaatiota entsyymin ilmaisun ja alueellisten imusolmukkeiden osallistumista paksusuolensyöpä. Tämä havainto saattaa parantaa ymmärrystämme etäpesäke ja johtaa uusiin ja tehokkaampia hoitoja syöpää vastaan.

Citation: Diaz-Moralli S, Tarrado-Castellarnau M, Alenda C, Castells A, Cascante M (2011) Transketolase- kuten 1 Expression moduloidaan aikana peräsuolen syövän eteneminen ja Metastasis Formation. PLoS ONE 6 (9): e25323. doi: 10,1371 /journal.pone.0025323

Editor: Michael Lisanti, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 elokuu 2010; Hyväksytty: 1. syyskuuta 2011; Julkaistu: 27 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Diaz-Moralli et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat alueellinen autonomisen hallituksen Katalonian (Generalitat) kautta ”Agencia de gestio ad’juts Universitaris i de Recerca” (2009 SGR 849 ja 2009 SGR 1308), Ministerio de Ciencia e Innovación-Espanjan hallituksen ja Euroopan aluekehitysrahasto (EAKR) ”Una manera de hacer Europa” (SAF2010-19273 ja SAF2011-25726) ”Instituto de Salud Carlos III” kautta ISCIII-RTICC (RD06_0020_0046) ja CIBEREHD, ja ”Asociación Española contra el Cancer” ( ”Fundación Científica y juntta de Barcelona ”). MC kuittaa saatu tuki kautta palkinnon ”ICREA Academia” huippuluokan tutkimukseen, rahoittamassa ICREA Foundation-Katalonian. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tuumorien kehittyminen on aiheuttanut peräkkäinen kertyminen geneettisten ja epigeneettisten muutoksia, jotka johtavat solujen monivaiheisen prosessin kautta, joka tekee terveitä soluja pahanlaatuisten [1] – [4]. Koko prosessin muutoksia, jotka suosivat muodostumista ensisijainen kasvaimia yleensä eroavat mukautusten pitkälle syövän synnyn [5] – [7]. Carcinogenesis alkaminen johtuu vapauttaminen solu-solu ja solu-matriisi kasvua estävän vuorovaikutukset ja kertymistä geneettisiä muutoksia, joka johtaa aktivoitumiseen proto-onkogeenien ja tuumorin-synnyssä [7], [8]. Sen jälkeen, kun nämä varhaiset tapahtumat, pahanlaatuisiksi edetessä, säätelee prosessi darwinilaisen valinnan aikana fenotyyppejä, pikemminkin kuin genotyyppejä, on valittu. Tämä antaa kasvainsoluja etu verrattuna ei-transformoitujen solujen. Tämä valinta fenotyyppejä, riippumaton liittyvän genotyyppien, on perusta korkea geneettinen heterogeenisyys syöpäsolujen, koska eri (epi) geneettisiä mekanismeja voivat lähentyä toisiaan vastaavia fenotyyppejä [7], [9]. Yksi tärkeimmistä ilmiasun syöpäsolujen on aerobinen Glykolyysivaiheen liittyy kohonnut, mutta tehoton, ATP tuotanto sekä korkeat tuotannon NADPH ja happojen (H

+) kuten laktaatti [10]. Tämä ilmiö, joka tunnetaan nimellä ”Warburg vaikutus”, kuvaili Otto Warburg vuonna 1924 [11]. Se muodostaa perustan positroniemissiotomografia (PET), joka on tekniikka, jota käytetään laajalti havaitsemaan muutoksia glukoosin kulutuksen syöpäpotilailla. Korkea glykolyyttisissä nopeus ei ole perusteltu energinen vaatimuksia, koska yli 80% ATP-synteesin kasvainsoluissa tapahtuu kautta oksidatiivinen fosforylaatio, ja vain noin 17% tapahtuu läpi Embden-Meyerhof reitin (EMP). Nämä osuudet ovat samanlaisia ​​kuin ei-tuumorisoluissa [12]. Toisaalta, NADPH muodostuminen on tärkeä tuumorin-solujen aineenvaihduntaa, koska se suojaa niitä oksidatiivista stressiä vastaan ​​ja antaa polttoaineen korotettua rasvahappojen synteesi ominaisuus syöpäsoluja. Lopuksi laktaattituotanto ja mikroympäristölle happamoitumisen antaa kasvainsoluja etulyöntiaseman terveitä soluja, tehostamalla niiden invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [7], [13] – [16]. Yllättäen ympäristön happamoitumista ei riipu EMP, koska Glykolyysivaiheen-alentunut soluissa tämä ilmiö on yhä havaittavissa [17], [18].

Lisäksi aerobinen Glykolyysivaiheen, pentoosifosfaattireitistä (PPP) on tärkeitä tuumorin aineenvaihduntaa, koska yli 85% riboosin tarpeen nukleiinihapposynteesille tuumorisoluissa syntyy suoraan tai epäsuorasti, mistä nonoxidative haara PPP [19]. Siksi PPP sijaitsee sen perusteella kasvain aineenvaihdunta sääntelyä. G6PDH ja TKT, jotka ohjaavat reitin, riittää selittämään perus metabolista ominaisuudet hankkima kasvainsolujen aikana muutosta. Kautta PPP, solut paitsi tiivistetään nukleiinihappo esiasteiden välttämätöntä säilyttää nopeutetussa proliferaationopeus ominaisuus syövän. G6PDH säätelee vuo oksidatiivisen haaran kautta, joka NADPH syntetisoidaan ja CO

2 vapautuu, mikä johtaa matrix happamuuden lisääminen hiilihappoanhydraasia. Tiamiinipitoisuus riippuva entsyymi TKT näyttää korkeimman valvonnan kerroin yli ei-oksidatiivisen haara koulutusjakson, paljastaen sen keskeinen rooli sääntelyn PPP [20], [21]. TKT on oletettu yhdistää PPP ja EMP syöpäsoluissa, jolloin happea riippumaton glukoosin hajoamista [22]. Toisaalta, rooli TKT kasvainten solujen aineenvaihduntaa on korostettu raportteja merkittävä lasku kasvaimeen soluproliferaatioon hoidon jälkeen erityisiä TKT estäjien, sekä

in vitro

ja

in vivo

[21] – [30]. Lisäksi, kun TKT aktivoidaan lisäämällä sen kofaktorin, tiamiini, kasvaimen kasvua stimuloidaan [31].

Yksi TKT ja kaksi transketolaasi kaltaisten geenien (TKTL1 ja TKTL2) on kuvattu ihmisen genomin [32 ]. Tämä havainto johti ekspression tutkimiseksi kaikki kolme entsyymien syöpäsoluja ja päätellä, että TKTL1 oli ainoa erityisesti yläreguloituja kasvaimissa [33]. Myöhemmät tutkimukset paljastivat, että TKTL1 on vastuussa noin 60%: n tai 70% transketolaasia vaikutus ihmisen hepatooma ja paksusuolen-syöpäsoluja [33] – [35], joka esittää tärkeää roolia tämän isoentsyymin näissä kasvaimissa. On oletettu, että TKTL1 voisi tuottaa asetyyli-CoA rasvahappojen synteesiin, joka yhdistää anaerobinen glukoosin hajoamista ja lipogeneesiin [32]. Lisäksi yli-ilmentyminen entsyymin on raportoitu useita kasvaimen soluissa ja kudoksissa, esim. paksusuolen ja uroteelisyöpä [33], [36], mahasyöpä [37], eri naistentautien syöpiin (munasarjan, granulose solua munasarja ja kohdunkaulan) [38] – [40], rintasyövän [41], [42 ], papillaarinen kilpirauhasen karsinoomat [43] ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [44]. On myös osoitettu, että spesifinen esto TKTL1 ekspression shRNA laukaisee apoptoosin ja estää kasvaimen kasvua [35]. Tämä korrelaatio yliekspressio TKTL1 ja kasvaimen kasvua, huono selviytyminen ja kasvaimen uusiutumisen lisäksi kanssa transkription säätelyä entsyymin ilmentymisen aiheuttaman promoottori demetylaation [45] johti Smithin ja työtovereiden ehdottaa entsyymin mahdollisena esikasvaintekijän [46 ]. Lisäksi se on myös ehdotettu, että TKTL1 indusoi pahanlaatuisten aerobisen glykolyyttisen fenotyyppi lisäämällä fruktoosi-6-fosfaatin ja glyseraldehydi-3-fosfaatti-tuotannon, mikä johtaa koholla vuot pyruvaatiksi ja laktaatin [16], [46]. Tästä huolimatta on tarpeen tarkempi tutkimus korrelaatio TKTL1 kanssa syövän etenemisen peräsuolen syövän, valaista rooliaan imusolmukkeiden koettu ja etäpesäke. Lisäksi tähän mennessä kuva määrällistä entsyymin ilmentymistä kudoksissa on suoritettu semikvantitatiivinen menetelmillä perustuu asiantuntijoiden havainnointi ja subjektiivinen arviointi [38], [47] jotka osoittavat tarvetta parantaa arviointijärjestelmä, jotka mahdollistavat saamiseksi tavoite tuloksia.

Tässä esittelemme uuden kuva-analyysi kvantitointimenetelmä arvioimiseksi immunostains joiden avulla voimme tarkastella, miten TKTL1 ilmaisu vaihtelee etenemisen vaihe sarjassa peräsuolen karsinoomat. Näytteet luokitellaan neljään ryhmään tai vaiheiden etenemistä (I-IV) mukaan American sekakomitean Cancer (AJCC) pysähdyspaikan käsikirja (kuudes painos), jossa otetaan huomioon transmuraalista laajennus, imusolmuke osallistuminen ja läsnäolo etäispesäkkeitä. Mahdolliset korrelaatioita TKTL1 ilmaisun ja syövän etenemiseen tutkitaan, määrittää sen rooli aikana kasvainten kehittymiseen.

Tulokset

Potilaat

Expression of TKTL1 analysoitiin immunohistokemiallisesti 63 potilailla, joilla on ensisijainen peräsuolen syöpä (CRC). Demografiset, kliiniset ja kasvaimen liittyvät ominaisuudet on esitetty taulukossa S1 ja Taulukko S2. Jälkeen seuranta-ajan mediaani oli 49 kuukautta, 26 potilasta oli kuollut.

immunohistokemiallinen havaitseminen TKTL1 ilmaisun

Ensisijainen kasvaimia inkuboitiin anti-TKTL1-vasta osoitti merkittäviä merkintöjä, kun taas kontrolli näytteitä ei osoittanut tahansa epäspesifinen merkinnät (kuva 1 ja kuva 2). Levene ja Cochrand testejä ei ole näyttänyt toteen, että tiedot olivat normaalijakautuneita (tuloksia ei esitetty) niin teimme nonparametric testejä merkityksen arvioimiseksi eroja. Soveltamalla Mann-Whitney U tai Kruskal-Wallis testejä, vahvistimme, että TKTL1 ekspressiota ei sukupuolen tai iän riippuvainen (tuloksia ei esitetty). Kliinis-patologisten ja immunohistokemiallista dataa on koottu taulukkoon S1.

Nämä värit valomikroskooppikuvat paljastavat sytoplasmista immunohistokemiallisella värjäyksellä (ruskea talletukset) varten transketolaasia kaltainen 1 (TKTL1) in Kolorektaalituumorien (alkuperäinen suurennos x 200). Oikeanpuoleisessa sarakkeessa (E-H) on värjätään kudosten eri vaiheissa etenemistä ja vasemmassa sarakkeessa (A-D) homologisia alueita negatiiviset kontrollit. Värjäys TKTL1 on havaittavissa kaikissa positiivista näytettä, mikä osoittaa sen ilmentyminen kasvaimen kudoksissa; korkein intensiteetti havaitaan vaiheessa III näytteissä.

Nämä yksivärisen valomikroskooppikuvat analysoitiin ImageJ ohjelmisto määrällisesti immunovärjäyksen ja arvioida TKTL1 lauseke (alkuperäinen suurennos x 200). Oikeanpuoleisessa sarakkeessa (E-H) on värjätään kudosten eri vaiheissa etenemistä ja vasemmassa sarakkeessa (A-D) homologisia alueita negatiivisessa kontrollissa.

TKTL1 vaihtelua kasvaimen vaiheesta

ilmaus TKTL1 vaihtelivat: 1,8-26,4 au (Keskiarvo, 13,3 ± 7,9) I vaiheessa kasvaimia, 4,0-37,3 A.U. (Keskiarvo, 20,8 ± 9,9) II vaiheessa, 17,3-50,0 A.U. (Keskiarvo, 32,9 ± 11,5) vaiheessa III ja 3,7-41,3 A.U. (Keskiarvo, 13,7 ± 8,7) IV vaiheessa (kuvio 3A). Nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen TKTL1 vaiheessa III kasvaimissa oli suurempi kuin missään muussa vaiheessa (Kruskal-Wallisin testi,

P

= 0,00003, kuvio 3B). Kuitenkin yksi näyte (id. # 7118) osoitti epänormaalin erittäin arvo (41,3) verrattuna muuhun näytteiden tämän ryhmän. Dixon Q-testi tunnistaa tätä arvoa Peränpitäjänä luottamustasolla 99,9% ja näin ollen se poistettiin analyysistä. Sen jälkeen jättäminen tämän otoksen, TKTL1 ilmaisu IV vaiheessa kasvaimissa vaihtelee 3,7-20,8 A.U. (Keskiarvo, 12,0 ± 5,1) ja ilmentyminen TKTL1 vaiheessa III kasvaimet entisestään eri (Kruskal-Wallisin testi,

P

= 0,000008).

Kaavioissa ilmaus transketolase- kuten 1 (TKTL1) CRC kudoksissa analysoitiin, jaettuna ryhmiin niiden vaiheeseen etenemistä. (A) Jokainen piste vastaa yhtä näytettä. Vuonna vaiheessa IV ryhmä risti edustaa Peränpitäjänä. Keskiarvot on merkitty vaakasuora musta viiva kussakin ryhmässä. (B) Tämä Rasia ja hiuksenhienosti juoni näyttää erot ryhmien. Ulompien vaiheen IV ryhmää edustaa musta neliö. Vaihe III ryhmä on merkittävästi erilainen kuin muualla ryhmien (Kruskall-Wallisin testi,

P

= 0,000008).

TKTL1 ilmaisun vaiheessa III kasvaimissa oli merkittävästi suurempi kuin millään muulla etenemisen vaiheessa. Lisäksi kun tarkastellaan erikseen, lähes jokainen yksittäinen vaihe ilmi varsin erilaisia ​​arvoja TKTL1 lausekkeen sekä edellisen ja seuraavan vaiheen: vaihe näytin taipumus olla pienempi kuin vaiheen II (U-testi,

P

= 0,06). Entsyymi ilmentyminen vaiheen II kasvaimissa oli merkittävästi alhaisempi kuin vaiheen III kasvaimet (Mann-Whitney testi,

P

= 0,02) ja vaiheen III-arvot olivat merkittävästi korkeampia kuin vaiheen IV (U-testi,

P

= 0,000003).

Korrelaatio läsnäolon etäpesäkkeiden ja kasvaimen TKTL1 ilmaisun

voimakas lasku primaarikasvaimen TKTL1 ilmentymistä havaittiin potilailla, joilla oli kaukainen etäpesäke. Todellakin, näytteitä potilailta, joilla etäpesäkkeitä (M0) oli ilmaus arvojen välillä 1,8 ja 50,0 A.U. (Keskiarvo 23,5 ± 12,4), kun taas arvot näytteitä potilaista, joille kehittyi etäpesäkkeiden (M1) vaihteli 3,7-20,8 A.U. (Keskiarvo 12,0 ± 5,1) (U-testi,

P

-arvo = 0,0004) (kuvio 4A). Kun otetaan huomioon erot M0 (ei-metastasoituneen) ja M1 (metastaattinen) kasvaimia, suoritimme seuraavat vertailut vain näytteitä M0 ryhmästä.

Nämä pylväsdiagrammein kuvaavat korrelaatio transketolaasi kaltainen 1 ( TKTL1) ilmaisun ja kasvainten luokittelun arvoja. (A) Kasvaimen TKTL1 ilmentymistä potilailla, jotka eivät esittäneet kaukaisiin etäpesäkkeitä (M0) on huomattavasti suurempi kuin ilmaus potilailla, jotka oli kehittänyt etäpesäkkeitä (M1) (U-testi,

P

= 0,0004) . (B) potilailla, jotka eivät olleet kehittyneet etäpesäke, ilmaus TKTL1 yleensä pienempi alkuvaiheen kasvaimissa suhteen transmuraalista invaasiota (T1-2) kuin kehittyneempiä kasvaimia (T3-4) (

P

= 0,029, U-testi). (C) Imusolmuke invaasio korreloi kasvun kanssa TKTL1 ilmentymisen primaarikasvaimen (U-testi,

P

= 0,0014).

TKTL1 osallistuminen syövän etenemiseen

osalta transmuraalista etenemisen varhaisessa vaiheessa kasvaimet (T1 ja T2) esitellään TKTL1 ilmaisu arvojen välillä 1,8 ja 45,5 au (Keskiarvo 16,5 ± 12,6), kun taas ekspressio entsyymin kehittyneempiä primaarikasvaimen (T3 ja T4) vaihteli 4,0-50,0 A.U. (Keskiarvo 25,5 ± 11,8). Nämä tiedot osoittavat hieman lisääntynyt TKTL1 ilme, kun paikallinen kehittäminen kasvain kasvaa (U-testi,

P

= 0,029, kuva 4B).

TKTL1 ilmaisun näytteissä ilman alueellista lymph- solmu osallistuminen (N0) vaihteli 1,8-37,3 au (Keskiarvo 18,6 ± 9,8), kun taas vastaavat arvot niille alueellisten imusolmukkeiden osallistuminen (N1 ja N2) vaihteli 17,3-50,0 A.U. (Keskiarvo 32,9 ± 11,5) (U-testi,

P

= 0,0014) (kuvio 4C).

TKTL1 ilmaisun ja selviytymisen

Univariate Kaplan-Meier-analyysi teki ei paljasta merkitsevästi yhteydessä TKTL1 värjäystä ja eloonjäämisen CRC kudosnäytteistä (Mantel-Cox log-rank testi,

P

= 0,37) (kuvio 5A). Toisaalta, kun hoito katsotaan erot syntyvät. Tuloksemme osoittavat merkitsevästi yhteydessä TKTL1 ilmaisun ja selviytymistä saaneilla potilailla 5-fluoroacyl (Mantel-Cox log-rank testi,

P

= 0,017) (kuvio 5B), tämä korrelaatio ei ole havaittu hoitamattomilla potilailla (Mantel-Cox log-rank testi,

P

= 0,993) (kuvio 5C).

(A) Kaplan-Meier juoni korreloivat TKTL1 ilmaisun ja eloonjäämisen potilailla, joilla on ei-metastaattinen CRC. (B) Kaplan-Meier juoni korreloivat TKTL1 ilmaisun ja eloonjäämisen hoitamattomilla potilailla. (C) Kaplan-Meier juoni korreloivat TKTL1 ilmaisun ja eloonjäämisen potilailla, joilla on CRC käsiteltiin 5-fluoroacyl. Yhtenäinen viiva edustaa niitä, joilla TKTL1 ilme alle keskiarvon, ja katkoviiva joilla TKTL1 ilme keskiarvon yläpuolelle kullekin ryhmälle.

validointi kuva-analyysi perustuu immunovärjäyty- kvantitointimenetelmä

validointi kuva-analyysin kvantifiointimenetelmän, 5 kuuluvien näytteiden vaiheessa I, II ja III etenemisen, ja eri TKTL1 ekspressiotaso analysoitiin western blot. Immunodetektio TKTL1 ja aktiinia latauskontrollina osoittivat selvää korrelaatiota TKTL1 ekspressio määritettiin Western blot ja immunohystochemical analyysi (kuvio 6).

TKTL1 proteiinia ja aktiini analysoitiin western blot käyttämällä spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita. TKTL1 /Laki edustaa kvantitatiivinen analyysi TKTL1 oikaistuna aktiini. TKTL1 IHC ilmentävät arvoja TKTL1 määritettiin immunohystochemical analyysi. Kaikki 5 paksusuolensyöpä näyte homogenaatteihin analysoidaan näytä vastaava ilmaisu arvot TKTL1 molemmissa analyyseissä.

Keskustelu

ilmentyminen TKTL1 on havaittu ja korreloivat useiden syöpätyyppien toistaiseksi . Useimmat kirjoittajat raportoinnissa nämä korrelaatiot seuraa protokollaa kuin on kuvattu nykyisessä paperin, käyttäen samaa vasta-ainetta ja kitti immunologista värjäytymistä. Kuitenkin tähän mennessä arvioinnin Immunovärjäyksen oli epätarkka, koska se on tehty käyttämällä semikvantitatiivinen järjestelmä perustuu toimeksiannon kymmenien tarkkailijan. Nykyinen käsikirjoitus kuvataan uusi ja objektiivinen järjestelmä määrällisesti värjäytyminen läpi laskennallisen kuva-analyysiin. Tämä tekniikka mahdollistaa saamisen kvantitatiivisia tietoja immunohystochemical värjäystä johtaa tarkempaan arviointiin entsyymin ilmaisua. Siksi raportoitu menetelmä paljastuu todella tehokas työkalu immunohystochemical kvantifiointiin proteiinin ilmentymistä, joka tarjoaa tavoite numeerisen tiedon sijasta mielivaltaisen tulokset.

tulokset antavat näyttöä siitä, että TKTL1 ilmaisun ensisijainen peräsuolen syöpä korreloi voimakkaasti syövän etenemiseen . Kyky hajota glukoosi anaerobisissa olosuhteissa on kriittinen kasvaimen kasvua, erityisesti primaarikasvaimen laajenee ja sisäiset solut kuljetetaan pois tyvikalvon ja hapen. Tässä tilanteessa TKTL1 yliekspressio edun, pahanlaatuisten solujen ja ne voivat kasvaa nopeammin. Tuloksemme osoittavat, että TKTL1 ilmaisu korreloi vahvasti paikallisten etenemiseen (T) ja alueelliset imusolmuke koettu (N). Tämä on ensimmäinen kerta, kun korrelaatio TKTL1 ilmaisun ja N luokitus on raportoitu CRC. Lisäksi osoitamme, että korrelaatio on vahvempi kuin välinen TKTL1 ilmaisun ja T luokittelu (kuvio 4B ja C), mikä osoittaa, että vaikutus entsyymin kasvaa kasvaimen edetessä. Tämä toiminta on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että yli-ilmentyminen TKTL1 suosii anaerobinen metabolization glukoosin lisääminen laktaattituotanto ja houkutella ympäristön happamoitumista, joka parantaa paikallista invasiivisuus. Vaikka tiedot eivät paljasta mitään merkittäviä assosiaatio kasvaimen TKTL1 värjäystä ja potilaan selviytymisen, yhden muuttujan Kaplan-Meier-analyysi esitetty kuvassa 5A pyrkisi ehdottaa, että suurempi näyte voisi paljastaa merkittävä korrelaatio. Lisäksi vaikka näytteiden määrä on pieni, korrelaatio TKTL1 ilmaisun ja eloonjäämisen potilailla, joille kemoterapia vaikuttaa selvältä. Havaittu korrelaatio viittaavat siihen, että 5-fluoroacyl voi olla tehokas hoidettaessa kasvaimia, joilla on korkea TKTL1, joilla on korkea paikallinen etenemisen (kuvio 5B). Kuitenkin kemoterapia ei ole mitään vaikutusta eloonjäämiseen potilaiden kasvaimet, jotka sisältävät pieniä määriä entsyymiä, kaikkein metastaattinen niitä (kuvio 5C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että TKTL1 tasoja voisi olla potentiaalinen biomarkkereiden ennustamiseksi tuumorivaste kemoterapiaa.

Nykyinen tutkimus osoittaa myös toinen mielenkiintoinen havainto, erittäin merkittävä lasku TKTL1 ilmaisun havaittu verrattaessa ei-metastaattinen potilasta (M0) metastasoitunutta niistä (M1). Downregulation entsyymin, kun etäpesäkkeitä esiintyy, kuten korrelaatio alueellisten imusolmukkeiden osallistuminen, ei ole raportoitu aikaisemmin. Tämä on ensimmäinen kerta, että ilmentyminen TKTL1 on korreloitu tuumorin luokitus ja etäpesäkkeiden muodostumista CRC. Mielenkiintoista, samanlainen käyttäytyminen on kuvattu ilmaantuvuuden mutatoitunut

ras

CRC: ilmaantuvuus mutaation nousee noin 7% alkuvuodesta adenooma on noin 55% väli- ja -60% lopulla karsinoomat, mutta laskee ~45% vuonna invasiivisia karsinoomia, mikä osoittaa implisiittisesti tämän mutaation solussa aggressiivisuutta mutta ei etäpesäkkeitä soluissa [7], [48].

säätely TKTL1 ilmentymisen kasvainsoluissa on paljolti hyödyntämättä, mutta on ehdotettu, että se voisi olla yliaktiivista vastauksena hypometylaatio [46]. Mekanismi vastaa työvoiman globaalista demetylaatio syöpäsoluissa edelleen tuntematon, vaikka Ras perheenjäsenet ovat sekaantuneet säätelyyn metylaation [49] – [52]. Useimmissa tapauksissa Ras-signalointi on liittynyt hypermetylaation ja tuumorin synnyssä. Kuitenkin on myös liittyviä demetylaatio joissakin tutkimuksissa [53] – [56]. Tässä ehdotamme uutta roolia Ras-signalointi kasvain muutos, joka koostuu aktivoitumisen hypometylaatio eri onkogeenien, kuten TKTL1 CRC.

On huomattava, Ras-superperheen jäsenet ovat sekaantuneet säätelyyn aerobinen Glykolyysivaiheen by lisäämällä glukoosin soluunottoa ja 6-phosphofructo-2-kinaasi /fruktoosi-2,6-bisphosphates 3 (PFKFB3) ilmaisu [57] – [59]. PFKFB3 toiminta aiheuttaa kertyminen fruktoosi-2,6-bisphosfate (F26bP) ja myöhemmin säätelyä 6-phosphofructo-1-kinaasi (PFK-1) aktiivisuus, joka lopulta johtaa koholla laktaatin tuotantoa. Metabolinen substraatti PFKFB3 ja PFK-1 reaktiot, jotka ovat välttämättömiä laktaatin, on fruktoosi-6-fosfaatti (F6P), yksi tuotteiden TKTL1. Lisäksi TKTL1 yliekspressio suosii normoxic vakauttaminen maligniteetin edistävien transkriptiotekijä hypoksia-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α) [16] ja säätelyä loppupään glykolyyttisten entsyymien, kuten glukoosi transporter 1 (GLUT1) ja PFKFB3 [16], [ ,,,0],60]. Kuten olemme nähneet, TKTL1 tärkeä rooli pyruvaatin ja laktaatin tuotannon kautta lopputuotteisiin, fruktoosi-6-fosfaatin ja glyseraldehydi-3-fosfaatti. Näin ollen, koska pyruvaatti ja laktaatti säädellä hypoksian indusoituva geeniekspression ja inaktivoivat HIF-1α rappeutuminen [61], [62], TKTL1 yli-ilmentyminen saattaa stimuloida kertymistä HIF-1α happiniukkaan riippumattomalla tavalla ja edistää ilmentymistä HIF-1 -regulated liittyvien geenien glykolyyttisissä aineenvaihduntaan, angiogeneesi ja solun selviytymisen.

Lyhyesti aikana syövän synnyn alkaminen, mutaatiot Ras jäsenet voivat kerääntyä ja aiheuttaa TKTL1 promoottori demetylaation ja aktivointi sen ilmaisua. Tämä ilmiö olisi valittu, koska TKTL1 aktiivisuus sallisi transformoitujen solujen kuluttaa glukoosia ilman happea, tuottaa laktaattia ja happamaksi niiden mikroympäristön, mikä vahvistaa sen invasiivisuus. TKTL1 voi myös johtaa hypoksinen riippumaton HIF-1α vakautus- ja myöhemmin yli-ilmentyminen useiden glykolyyttisiä ja angiogeenisten geenien, joka tarjoaa sopivan ympäristön syövän etenemiseen. Mitä etäpesäkkeiden muodostumista kaksi mahdollista mekanismit voisivat selittää havaittua tiedot: i) TKTL1 yliekspressio ei johda ainoastaan ​​syövän etenemiseen, mutta myös mahdollistaisi etäpesäkkeiden muodostumista, ja kun etäpesäke on perustettu, TKTL1 ei ole enää tarpeen, ja kuten esiintyvyys mutatoitunut

ras

, se pienenee. ii) TKTL1 on tarpeen syövän etenemisen situ ja paikallisten invasiivisuus, mutta kasvaimia, jotka eivät yli-ilmentävät entsyymin eivät pysty kasvamaan sen paikalliseen ympäristöön ja indusoivat metastaattisen käyttäytymisen kasvain selviytymisstrategiana kautta darwinilaisen valintaprosessissa.

Tämä raportti valottaa roolista TKTL1 kasvaimen etenemiseen, ja tavoitteena on olla ensimmäinen askel kohti uutta lähestymistapaa tutkimuksen etäpesäkkeiden ja syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

eettisen hyväksynnän tutkimukseen saatiin eettisen komitean on klinikka Barcelona, ​​kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja kaikki kliinisen tutkimuksen on tehty periaatteiden mukaisesti ilmaistu julistuksen Helsinki.

Potilaat

nykyisessä tutkimuksessa, 46 miestä ja 17 naista (70 ± 11 vuotta) kanssa kolorektaalisyöpää (CRC), joka leikattiin marraskuusta 2000 lokakuu 2001 olivat mukana. Mukaan TNM luokittelu paksusuolen ja peräsuolen syöpä amerikkalaisen sekakomitean Cancer (AJCC), 9 potilaista oli vaiheen I kasvaimia, 21 vaiheen II, 16 vaiheen III ja 17 kanssa vaiheessa IV.

Kaikki potilaat rekrytoitiin gastroenterologian osaston klinikka Barcelona, ​​ja olivat osa EPICOLON hanke, prospektiivinen monikeskustutkimus, maanlaajuinen, väestöpohjaisen tutkimus tarkoituksena on luoda ilmaantuvuutta ja ominaisuudet periytyvät ja familiaalinen peräsuolen syövän muodot Espanja [63]. Tässä projektissa kaikki äskettäin diagnosoitu CRC potilaiden kaikista osallistujamaista keskustassa aikana yhden vuoden aikana olivat mukana tutkimuksessa.

Kun kirurginen resektio, potilaalle tehtiin standardi terapeuttisia ja jatkotoimenpiteitä mukaan suositellaan ohjeita. Todellakin, leikkauksen jälkeinen adjuvanttia hoito 5-fluorourasiilin ja leukovoriinin rutiininomaisesti antaa potilaille, joilla vaiheen II ja III kasvaimet, ja sädehoito oli tarkoitettu potilaille, joilla peräsuolen syöpä. Leikkauksen jälkeiset valvonta koostui sairaushistoria, fysikaalinen tutkimus ja laboratoriotutkimukset mukaan lukien seerumin karsinoembryonaalisesta antigeeni (CEA) tasot kolmen kuukauden välein, vatsan ultraääni tai tietokonetomografian puolivuosittain, ja keuhkokuva ja koko kolonoskopia kerran vuodessa. Lisäksi kaikki kasvaimen uusiutumista havaitaan seurannan oli histologisesti varmennettu.

immunohistokemiallinen värjäys

Heti kirurgisen resektion, kasvaimet olivat snap-pakastettava ja pidettävä nestemäisessä typessä. Voit suorittaa värjäys, CRC osat saatiin käyttämällä vibrotom leikkauksia, oli kuivattuna hajoamisen estämiseksi ja pidettiin ympäristön laboratorio-olosuhteissa ennen käyttöä.

Paksusuolisyöpä näytteet leikattiin osiin 2-5 um, asetetaan dioja ja kiinteät paraformaldehydillä. Levyjä sammutettua huuhtelemalla ne pitoisuuksien alentamista etanolia. Antigeenin peittymisen Näytteitä kuumennettiin 65 ° C: aprox. 10 mM natriumsitraatti (pH 6,0) 5 minuutin ajan. Huuhtelun jälkeen in tislattu H

2O, estämällä endogeenisen peroksidaasin suoritettiin 10 min inkubaatio 3% H

2O

2. Objektilasit pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 3% BSA: lla PBS: ssa 15 min estää epäspesifisen värjäytymisen. Sen jälkeen leikkeitä inkuboitiin hiiren monoklonaalisella anti-TKTL1-vasta-ainetta (klooni JFC12T10) on kuvattu aiemmin Coy [32], jonka konsentraatio on 4 ug ml

-1 60 minuuttia kosteutetussa kammiossa huoneenlämmössä. Sen jälkeen, levyt pestiin PBS: llä, inkuboitiin biotinyloidun anti-hiiri-immunoglobuliineja (biotinyloitu Link, LSAB + -Kit, DakoCytomation, Hampuri, Saksa) 25 min ja sen jälkeen, kun uusi pesu PBS: llä, käsiteltiin streptavidiini-peroksidaasilla (Streptavidin-HRP , LSAB + -Kit, DakoCytomation, Hampuri, Saksa) 25 min lisää. Lopuksi näytteitä inkuboitiin 3-3′-diaminobentsidiiniä (DAB + Kromogeeni, DakoCytomation, Hampuri, Saksa) 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jolloin saadaan värjäystä.

TKTL1 ilmentyminen arvioitiin kuva-analyysin avulla LEICA DM 4000 B mikroskooppi (Leica Microsystems, Saksa), yksivärinen IEEE-1394 CFW-1312M kamera (Scion Corporation, Frederik, MD, USA) ja julkista NIH Imaging ohjelma ImageJ, saatavana Internetissä URL: http: //rsbweb .nih.gov /ij /. Intensiteetti mitattiin ”suhteellinen intensiteetti /alue” ja kvantifioidaan interpoloimalla osaksi kalibrointikäyrän piirrettynä käyttäen harmaasävyjen. Kunkin näytteen 3 tai 4 kuvaa eri alueita otettiin kiinni, ja värjäyksen homologia-alue on negatiivinen kontrolli, inkuboitiin 3% BSA: ta PBS: ssä ilman anti-TKTL1 vasta-ainetta, on vähennetty. Arvot on esitetty ”Suhteellinen arvo × 1000” mielivaltaista yksikköä (A.U.). Tällainen tietotekniikan kvantifiointi värjäys vaatii 8-bittinen monokromaattista kuvaa (kuva 2) ja kvantifioidaan harmaa intensiteetti sisällä kalibrointia mittakaavassa [64], [65] antaa arvion TKTL1 jolla voidaan huomattavasti objektiivisia näytteiden välillä kuin luokitusten mielivaltaiset tulokset.

Protein Extraction

Yhteensä proteiini puhdistettiin 6-19 mg jäädytettyä kirurgisista näytteistä. Näytteet sonikoitiin 4 ° C: ssa titaani koetin lyysipuskurissa, joka sisälsi 20 mM HEPES, pH 7,5, 10% (v /v) glyseroli, 0,4 M NaCl: a, 0,4% (v /v) Triton X-100, 10 mM EGTA: ta, 5 mM EDTA, 25 mM NaF, 25 mM Na-p-glyserofosfaatti, 1 mM DTT: tä, 1 x proteaasi-inhibiittorit, 0,4 mM Pefabloc SC: n ja 20 ug /ml Pepstatin. Sonikoinnin jälkeen näytteet sentrifugoitiin 4 ° C: ssa ja 16000 RCF 20 minuuttia.