Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Dexamethasone (DEX) co-hoito on osoittautunut hyödylliseksi NSCLC potilaat, parantaa kliinisiä oireita pelkistämällä sivuvaikutuksia kemoterapian jälkeen. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että DEX voisivat tehdä syöpäsolut enemmän tunteeton sytotoksisille lääkehoitoa, mutta ei tiedetä, onko DEX co-hoito voi vaikuttaa hoidon aiheuttama vanhenemista (TIS), ja tuntematon onko se p53-riippuvaisen tai p53-riippumattomalla tavalla.

Methods

tarkasteltu eri ihmisen NSCLC solulinjojen ja havaittiin solujen vanhenemista sisplatiinin jälkeen (DDP) käsittely läsnä ollessa tai ilman DEX.

in vivo

vaikutus yhdistelmän DEX ja DDP arvioitiin kasvaimen kasvu kokeellisesti ihmisen keuhkosyövän solulinjoja kasvaa ksenograftikasvaimina nude-hiirissä.

Tulokset

Samanaikainen käyttö DEX kemoterapian aikana NSCLC lisännyt kasvainsolun elinkelpoisuus ja esto TIS verrattuna DDP hoidetussa ryhmässä. DEX co-käsittelyä solut osoittivat laskua DNA-vaurion signalointireitin proteiineja, alempi p53 ja p21

CIP1, alempi solun eritys- ohjelma ja alas-säätely NF-KB: n ja sen signalointiryöpyn. DEX myös vähensi merkitsevästi DDP herkkyys

in vivo

.

Johtopäätökset

Tuloksemme korostavat, että DEX vähentää kemoterapiaan herkkyyttä tylpistäminen hoidon aiheuttamaa solujen vanhenemista jälkeen kemoterapiaa NSCLC, jotka voivat, ainakin osittain, on p53-riippuvainen tavalla. Nämä tiedot siksi herättävät huolta laajaa yhdistetty käyttö gluocorticoids (GC), jossa kasvainlääkkeiden kliinisessä hoidossa syöpäpotilailla.

Citation: Ge H, Ni S, Wang X, Xu N, Liu Y, Wang X, et ai. (2012) Dexamethasone Vähentää herkkyys Sisplatiini tylpistäminen p53-Dependent Cellular Vanheneminen in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (12): e51821. doi: 10,1371 /journal.pone.0051821

Editor: Maurizio D’Incalci, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Italia

vastaanotettu: 19 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 06 marraskuu 2012; Julkaistu: 18 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Ge et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia kolmas ohjelma National Project ”973” (joka Chunxue Bai), kolmas ohjelma National Project ”985” (joka Chunxue Bai), National Natural Key Science Foundation of China (30930090) (jotta Chunxue Bai), ja National Natural Science Foundation of China (30971306 /H0107) (jotta Songshi Ni) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

glukokortikoidit (GC), kuten deksametasonia (DEX) käytetään laajasti yhteistyössä hoidon kemoterapiaa, koska niiden tehokkuus estämään turvotusta, pahoinvointia ja toksinen aiheuttama reaktio sytotoksisen hoidon kasvain potilailla [1]. GC yhteistyö parantaa myös ruokahalua, laihtuminen ja lievittää luukipu [2]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että GC voi inhiboida kemoterapia ei ainoastaan ​​vahvistettu syöpäsolulinjoissa ja tuumoriksenografteja [3], [4], [5], mutta myös vasta eristettyjä soluja kirurgisen resektion kasvaimista eri alkuperää [6], [7], [8]. Lisäksi GC yhteistyössä hoito vähentää useiden kemoterapiaa huumeiden herkkyys, mukaan lukien DDP [3], paklitakseli [9], [10], trastutsumabi [4], gemsitabiini [6] ja camptothecin [11]. Yhä useammat todisteet ehdotti, että GC vähensi solujen herkkyys kemoterapia voi tapahtua useita mekanismeja, esimerkiksi tehostamalla DNA korjaus kapasiteetti, tukahduttaa isäntä anti-kasvain immuunivasteita, ja estämällä apoptoosin [5], [11], [12] . Kuitenkin molekyylitason mekanismit vaikutus GC ovat yhä suurelta osin tuntemattomia.

Maailmanlaajuisesti keuhkosyöpä laskee eniten uutta syöpätapausta ja syöpäkuolemaa vuosittain [13], ja suuri määrä todisteita osoittavat, että DDP-pohjainen adjuvanttihoitoa eloonjäämistä potilailla, joilla on täysin resektoitiin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [14], [15], [16]. Sytotoksiset lääkkeet kuten DDP voi aktivoida DNA-vaurioita signalointireitille [14], [17] ja tunnistus proteiinit, kuten γH2AX ja 53BP1, jotka ovat avainasemassa ajo solun vanhenemista [18], [19]. Cellular vanhenemista on tunnusomaista palautumaton pidättäminen solujen lisääntymistä siten, että se voi estää poikkeava ja rajoittamaton kasvainsolujen lisääntymistä [20]. Senescent soluilla laajentuneen morfologisia muutoksia ja vähemmän liikkuvuus kuin nuori soluja, jotka voivat edistää tukahduttaminen solumigraation, invaasiota ja etäpesäkkeiden [21]. Siksi solujen vanhenemista toimii merkittävä este syövän ja sillä on tärkeä rooli tuumorisuppressiogeeneksi.

analysoida, DEX voivat myös vähentää DDP herkkyyttä blunting solujen vanhenemista, tarkastelimme solujen vanhenemista eri ihmisen NSCLC solulinjoissa ja ksenografteissa jälkeen DDP hoidon läsnä ollessa tai ilman DEX. Olemme havainneet, että DEX oli voimakas anti-vanhenemista vaikutus käytetään karsinoomasoluja sekä ihmisen nude-hiirissä. Tämä johtui siitä, että NF-KB: n aktiivisuutta, joka johtaa tukkiminen p53 signalointireitin. Suora siirto p53 ja NF-KB palautettu vanhenemista herkkyys DEX-käsiteltyjen karsinoomia in NSCLC solulinjoissa. Nämä

in vitro

ja

in vivo

tiedot viittaavat siihen tarvitaan huolellisesti käytön huomioon ottaen DEX ja muiden GC yhdessä sytotoksisen hoidon hoidossa potilailla, joilla on keuhkosyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät ja stimulointi solujen

NSCLC solulinjoista A549, NCI-H292 ja NCI-H1299 ostettiin Cellular Institute of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kiina) [22], [23], [24]. A549-soluja kasvatettiin F12-K väliaineessa. H292 ja H1299-soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa. DDP (Sigma Aldrich) liuotettiin DMF: ään pitoisuutena 10 mM. 10 mM varasto DEX (Sigma Aldrich) valmistettiin kaksinkertainen tislattua vettä. Esikäsittelyn jälkeen DEX 24 tuntia, soluja käsiteltiin DDP 48 tuntia. Sitten solut pestiin poistamiseksi lääkkeitä ja niitä inkuboitiin vielä 3 päivää in tuoretta väliainetta.

leviämisen seulonta ja proliferaatiomääritystä

elävien solujen lukumäärä arvioitiin käyttäen Cell Counting Kit-8 ( Dojindo, Kumamoto, Japani) määritys, joka antoi tehokkaan ja toistettavan määritys proliferatiivisen aktiivisuuden soluja. Mitata proliferatiivista aktiivisuutta solujen 96-kuoppaisille mikrolevyille, CCK-8, lisättiin (10 ul /kuoppa), ja inkubointia jatkettiin 1 tunnin ajan. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Molecular Devices) viittauksella aallonpituudella 650 nm.

Alive mittaaminen Cell Bio-käyttäytymistä

Cell Bio-käyttäytymistä mitattiin reaali aika solu valvontajärjestelmä, käyttäen Cell-IQ soluviljelyprosessin alustan varustettu vaiheittain ohjaus mikroskooppi ja kamera [25]. Kuvat otettiin 5 minuutin välein 48 tuntia. Analyysi tehtiin kanssa vapaasti levitettävissä Image ohjelmisto (McMaster Biophotonics Facility, Hamilton, ON, Kanada), käyttäen Manuaalinen seuranta plugin luotu Fabrice Cordelières (Institut Curie, Orsay, Ranska). Käsitelty DDP: n läsnä ollessa tai ilman DEX, sitten A549 ja H292-soluja viljeltiin Cell-IQ, jossa 24-kuoppalevyillä 48 tunnin ajan. Cell-IQ automaattisesti syrjitty soluvaiheessa ja laskettuna koko solujen määrä. Kukin ryhmä sisälsi 6 jäljitellä kuva sivustoja.

Immunofluoresenssikoe

Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi 15 minuuttia ja läpäiseviksi PBS-0,2% Triton 10 min. Sen jälkeen estetty 1 tunti, primaaristen vasta-aineiden (γH2AX: 2212-1, epitomics, 1:100; 53BP1: AB36823, Abcam, 1:100, NF-KB: Cell Signaling Technology, 1:100) laimennettiin estopuskurissa ja inkuboitiin kiinnitettyjen solujen kanssa yön yli 4 ° C: ssa. Solut pestiin, niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineilla (Jackson, 1:100) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kaikki objektilasit vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI). Immunofluoresenssi suoritettiin käyttämällä CLSM: ää (Lecia) tai fluoresenssimikroskopialla (Olympus).

Apoptosis määritykset, BrdU

TUNEL Reaktio suoritettiin käyttämällä TUNEL in situ solukuoleman havaitseminen Kit- fluoreseiini (Roche sovellettu tiede, Laval, Quebec, Kanada) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydi 10 min. Sitten soluja läpäiseviksi 2 minuutin ajan jäillä ennen leimausta 50 ui TUNEL reaktioseosta ja inkuboimalla 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Sen jälkeen pesty, dioja kiinnitettiin ja tutkittiin fluoresenssimikroskopialla. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen laskettiin (TUNEL-positiivisia soluja /solua yhteensä) x 100%. Sisällytetty BrdU havaittiin BrdU-solujen lisääntymisen määrityksessä (QIA58, Calbiochem, Merck, Saksa). BrdU lisättiin ja inkuboitiin vielä 24 tunnin ajan, ja sitten kiinnitysainetta /denaturointi liuos lisättiin 30 min. Anti-BrdU-vasta-aine (1:100) lisättiin vuorovaikutuksessa sisällytetty BrdU 1 h huoneen lämpötilassa. Sitten soluja inkuboitiin anti-BrdU-vasta-ainetta (1:1000) 30 minuutin ajan. Sen jälkeen pestään, lopeta-liuosta lisättiin, ja absorbanssi mitattiin käyttämällä spektrofotometrisellä levynlukijalla kahdella aallonpituudella on 450-540 nm.

Vanheneminen liittyvä β-galaktosidaasi (SA-β-gal) Värjäys ja kvantifiointi

Solut pestiin poistamiseksi lääkkeitä ja niitä inkuboitiin vielä 3 päivää in tuoretta väliainetta. In situ värjäys SA-β-gal-solujen kanssa tai jääleikkeitä suoritettiin käyttäen vanhenemista-β galaktosidaasin -värjäyspakkausta (Beyotime Biotekniikan instituutti, Kiina) seuraten valmistajan ohjeita. Solut katsottiin positiiviseksi, kun solulimassa värjättiin SA-β Gal. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

FACS-analyysi

Solut kiinnitettiin 70%: isella jääkylmällä etanolilla ja värjättiin PBS: llä, joka sisälsi 50 ug /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich) ja 100 ug /ml RNaasi A: DNA-sisällön analyysi virtaussytometrialla analyysi FACSCalibur järjestelmä (BD). Solujen prosenttiosuus erilaisissa solusyklivaiheista laskettiin FlowJo ohjelmistoa (Puu tähti Inc., Ashland, OR, USA).

RNA ja Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy MINIKIT (QIAGEN, Hampuri, Saksa). RNA: ta (2 ug) käänteisesti transkriboidaan täydentäviä deoksiribonukleiinihappo ja 40 ng täydentäviä DNA: ita käytettiin templaattina real-time PCR. Monistussyklimenetelmän reaktiot (40 sykliä) suoritettiin seuraavasti: 5 sekuntia 95 ° C: ssa ja 30 sekuntia 60 ° C: ssa. Suhteellinen kvantifiointi arvot kohdegeenien oli standardoitu mukaan vertaileva kynnyssykli (2

-ΔΔCT).

Western Blot analyysi

Proteiinit (30 ug) että kokosolulysaattia oli erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin 3 kertaa 15 ml: lla TBS /0,1% Tween. Blotteja inkuboitiin sitten anti-PCNA (1:1000, Millipore), anti-triMe H3K9 (1:1000, Cell signalointi), anti-triMe H3K27 (1:1000, Cell signalointi), anti-53BP1 (1:1000; Abcam), anti-γH2AX (1:1000, Epitomics), anti-PCNA (1:1000; Sigma-Aldrich), anti-p53 (1:1000, Cell Signaling), anti-p21

CIP1 (1:1000 , Cell Signaling), anti-p27

KIP1 (1:1000, Cell signalointi), anti-pRb (1:1000, Cell signalointi), anti-sykliini A: ta (1:1000, Cell Signaling) ja anti-GAPDH ( 1:1000, Sigma-Aldrich). Membraanit pestiin ja inkuboitiin sitten sekundaarisen vasta-aineen (1:1000) 1 tunnin ajan. Kaistoja visualisoitiin kemiluminesenssin (ECL; Amersham), minkä jälkeen altistus röntgenfilmille (RX-U, Fujifilm). Bändit tiheys oli densitometrisesti kvantitoitiin käyttäen ImageJ (National Institutes of Health).

Luciferase Reporter Analyysit

pGL3-p53 ja pGL3-NF-KB tulikärpäsen lusiferaasireportteri plasmidit (lahja tri HO Liu) käytettiin yhdessä ohjaus pGL3-basic vektorin (Promega) ja sisäisen valvonnan plasmidi PRL-SV40 (Promega). Soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä 1 x 10

5 /hyvin yön yli ja transfektoidaan osoitetun plasmidilla käyttäen X-tremeGENE HP DNA transfektio Reagent (Roche, 06366236001) mukaan valmistajan ohjeiden. Solut kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen ja lysaatit analysoitiin firely ja renilla lusiferaasiaktiivisuus käyttäen Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI). Tiedot olivat edustettuina taitteen induktio verrattuna pGL3-Basic vektori. Kolme riippumatonta transfektio kokeet suoritettiin kolminkertaisina kunkin kokeellisen konstruktia.

Nude hiiret ja ksenoqraftit

eläinkoetta hyväksyttiin ja toteutettiin tarkka noudattaminen ja -sääntöjämme mainitsemat Fudanin animal Care ja käyttö komitea. Lyhyesti, 1 x 10

7 A549-soluja 100 pl PBS: ää injektoitiin kylki 4 viikon ikäisille nude-hiirissä. DDP 5 mg /kg intraperitoneaalisesti viikoittain ajan 4 viikkoa, kun kasvainten koko oli saavuttanut tilavuus 200 mm

3, läsnä ollessa tai ilman DEX. DEX 0,2 mg /kg annettiin letkulla kahdesti päivässä edeltävänä päivänä, päivä, ja seuraavana päivänä DDP annon. Kasvaimen kasvu sarjatuotantona seurattiin jarrusatulat mittaus kahden kohtisuorassa halkaisijaa. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa:. Hiiret inhimillisesti lopetettiin klo kasvainten kokoa 3000 mm

3.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Ryhmä erot arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA tai Studentin

t

-testissä tarvittaessa. Kaplan-Meier-analyysi käytettiin laskemiseen selviytymisen todennäköisyyksiä. Erot kokeellista ryhmien

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

DEX Co-hoito Lisääntynyt elinkykyyn in DDP Käsitellyt NSCLC Cell Lines

jotta vaikutusten tutkiminen DDP yksin tai plus DEX selviytymisen

in vitro

käytimme CCK8 määritys ja tutkitaan NSCLC solulinjoissa A549 ja H292. DDP voisi merkittävästi vähentää eloonjäämisen solumäärät annoksesta riippuvalla tavalla NSCLC soluissa. A549 ja H292-solulinjoja, IC50 oli 7,12 uM ja 5,44 uM vastaavasti. Samanaikainen käyttö 1 uM DEX huomattavasti selviytymistä solujen määrä ja IC50 (A549:15.78 uM, H292:11.60 uM) verrattuna DDP yksin ryhmä (

P

0,05) (kuvio 1A).

(A) havaitseminen IC50 CCK-8 määrityksessä. NSCLC solulinjoja viljeltiin väliaineessa, joka sisältää eri annoksia DDP (0 uM, 1 uM, 2 uM, 4 uM, 8 uM, 16 uM, 32 uM, 64 uM, 128 uM) esitettyjä poissa tai läsnä ollessa 1 uM DEX kaksi päivää, ja sitten solujen elinkelpoisuus seurattiin. (B) Solujen elinkyvyn vastauksena ilmoitettu DDP pitoisuuksina (0 M, 5 x 10

-7 M, 1 x 10

-6 M, 2 x 10

-6 M, 4 x 10

-6 M ja 8 x 10

-6 M) mitattiin CCK-8 määritys 5 päivää, mukaan lukien 2 päivää DDP hoidon ja lisäksi 3 päivää lääkkeettömän väliaineen inkuboinnin. (C) edustaja fluoresenssi mikroskooppiset kuvat A549 ja H292-soluissa jälkeen TUNEL määritys (vasemmalla) ja kvantitatiivinen analyysi apoptoosin (oikealla). (D) havaitseminen lisääntynyt prosenttiosuus kaikista solujen lukumäärät Cell-IQ: n ja CCK-8. Yhteensä solujen määrä A549 ja H292 mitattiin 72 tunnin kuluttua viljelty eri huumeita. (E) BrdU A549 ja H292-soluissa. BrdU inkuboitiin 24 tunnin ajan, ja sitten solut kiinnitettiin ja tunnistettiin BrdU. Sillä määrä analyysi BrdU, suhteellinen OD-arvot määritettiin verrattuna vehikkeliryhmässä. (F) Western blot-analyysi osoitti, PCNA proteiinin tasot A549 ja H292-soluissa ja määrää koskevia tietoja PCNA proteiinin tasoja. Tulokset edustavat avulla kuuden määrityksen ± keskivirhettä (SEM). *

p

0,05 ja **

p

0,01 analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).

inkubointi solulinjoista A549 ja H292-soluissa, joissa DDP 2 päivää sen jälkeen lääkkeettömän väliaineessa 3 päivää. Riippuen DDP pitoisuuksien lisääntymistä pidätyksen ja /tai solukuoleman seurauksena tapahtui. Valitsimme kuusi eri pitoisuusgradientit DDP (0 M, 5 x 10

-7 M, 1 x 10

-6 M, 2 x 10

-6 M, 4 x 10

-6 M ja 8 x 10

-6 M) ja tutkittiin CCK-8 määrityksessä. Pitoisuuksina vähemmän kuin 2 × 10

-6 M, DDP viivästynyt soluproliferaation, ja 2 x 10

-6 M, solujen määrä pysyi vakiona koko inkubaatiojakson viittaa peruuttamaton kasvun pysähtymisen, mikä tarkoitti vanhenemista . Sitä vastoin suurempi DDP pitoisuudet solukuolema (kuvio 1 B). Vahvista Tätä me valitsi edellä kuusi erilaista konsentraatiogradientti DDP ja arvioitiin A549 ja H292-soluissa kanssa TUNEL määrityksessä. Hoito DDP joissa pitoisuudet pienempi tai yhtä suuri kuin 2 x 10

-6 M eivät osoittaneet mitään merkittävää muutosta, kun taas DDP joka pitoisuus on yli 2 x 10

-6 M huomattavasti prosenttiosuutta Tunel-positiivisten solujen (kuvio 1C). Siksi käytimme 2 x 10

-6 M DDP joissa pitoisuus voi aiheuttaa solujen vanhenemista sijaan apoptoosin seuraavassa kokeessa.

Seuraavaksi arvioitiin vaikutuksia DEX yhteistyön kohtelu prosenttiosuus yhteensä solujen numerot Cell IQ A549 ja H292 solulinjoissa. Prosenttiosuus solujen kokonaismäärä väheni merkittävästi sen jälkeen, kun stimulaation DDP verrattuna ajoneuvoon. DEX co-käsittely lisäsi solujen kokonaismäärä mukaan 17,21%, 15,51% (0,1 uM DEX, A549, H292, vastaavasti), 95,06%, 118,43% (1 uM DEX, A549, H292, vastaavasti), 131,18%, 150,11% ( 10 uM DEX, A549, H292, vastaavasti), kun läsnä on DDP (kuvio 1 D). Koska pitoisuus 1 uM DEX tai korkeampi voi merkittävästi lisätä solujen kokonaismäärä, käytimme 1 uM DEX seuraavassa kokeessa. Esikäsittely glukokortikoidireseptorin (GR) antagonisti, RU486, voivat estää vaikutusta DEX, jotka viittaavat siihen, että DEX vähensi DDP herkkyys oli toimimalla GR. Lisäksi meillä on myös suoritettu CCK-8 määritys ja vahvisti DEX lääkitystä rooli (kuvio 1 D). Tehokkuutta eri annosten DDP (1 uM, 2 uM, 4 uM, 8 uM, 16 uM, 32 uM) läsnä ollessa tai ilman DEX havaittiin myös CCK-8. DEX samanaikainen lääkitys osoitti suojaavaa vaikutusta eri annoksilla DDP (2 uM, 4 uM, 8 uM) ja tehottomuus, kun annokset ylittivät 16 uM (kuvio 1 D).

pyritään täydentämään edellä havainto, tutkimme seuraavaksi cell leviämisen estämisen BrdU, tymidiinianalogi joka voi sisällyttää juuri syntetisoidun DNA S-vaiheessa. DDP väheni normaalia leviämisen A549 ja H292-soluissa taas DEX heikennettyjä tämä vähennys (kuvio 1 E). Lisäksi olemme havainneet ilmentymisen proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA), proteiinia, joka liittyy DNA: n replikaatioon ja DNA: n korjautumiseen, kautta Western-blot-analyysi. DDP myös vähensi proteiinin ilmentymistä PCNA, ja yhdistetyt DEX hoito voi vähentää tätä vähennys (kuvio 1 F). Nämä tiedot viittaavat siihen, että DEX co-hoidon lisäys solujen elinkelpoisuutta DDP käsiteltiin NSCLC solulinjat.

DEX Suojattu Kasvain, jonka inhibitio TIS

Koska 10 uM DEX yksin johti vähäistä estämistä solun kasvu A549 ja H292-soluissa (kuvio 1 D), kasvu selviytymisen solumäärän kun soluja yhdessä käsiteltiin DEX ja DDP ei johtunut kiihtyvyys solukasvun, mutta todennäköisesti johtui vaikuttaa TIS. Testata tätä todennäköisyys, me tutki vielä muutoksen solun vanhenemista A549 ja H292-soluissa kanssa DDP tai DEX yksin tai yhdistelmänä DEX ja DDP 48 tuntia. Ja tunnistimme senescent solujen perusteella useita ominaisuuksia. Ensinnäkin, olemme huomanneet, että DDP aiheutti huomattavaa ja ominaisuus morfologisten muutosten, kuten laajentuneen solujen koko ja litistetty muoto A549-soluja ja H292-soluissa, ja DEX yhteistyö hoidon heikennetty nämä morfologisten muutosten (kuvio 2A). DEX co-hoito vaikuttavat merkittävästi myös kasvua A549 ja H292 solulinjoissa (kuvio 2B).

(A) Soluja viljeltiin huumeeton väliaineessa, kiinteä, ja värjätään. Soluja visualisoitiin × 200 suurennus käyttäen faasikontrastimikroskopiaa. (B) Solujen proliferaatio analyysi suoritettiin sen jälkeen, kun lääkkeen pesun, ja solut laskettiin 5 päivää. (C) SA-β-gal aktiivisuus analysoitiin mikroskopialla päivänä 3, kun lääkkeen pesun (vasemmalla). Prosenttiosuus SA-β-gal-positiivisten solujen esitetty histogrammissa (oikealla). (D) edustaja kuvat SAHF muodostumista A549 ja H292-soluissa päivänä 3 kuluttua lääkkeen pesun. SAHF muodostuminen kvantifioitiin laskemalla 200 soluja 10 satunnaista kenttiä, ja tulokset näkyvät oikealla histogrammissa. (E) proteiinit A549 ja H292-soluja inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden trimetyloidaan lysiiniä H3K9 ja H3K27 ja analysoitiin western pultti. Expression of GAPDH otettiin sisäisenä latauskontrollina. Tulokset edustavat avulla kuuden määrityksen ± keskivirhettä (SEM). *

p

0,05 ja **

p

0,01 analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).

Seuraavaksi huomasimme laajasti hyväksytty markkeri, SA-β-gal toimintaa, joka värjää perinuclear osaston sininen. DDP indusoituu merkittävästi lisääntynyt SA-β-gal-aktiivisuuden, ja kiinnostavaa, DEX co-hoidon laski SA-β-gal-aktiivisuuden verrattuna DDP hoito yksinään (kuvio 2C). Lisäksi olemme myös havaittu selvää vanhenemista liittyvä heterochromatin pesäkkeitä (SAHF) muodostumista, jonka ajatellaan olevan vanhenemista ytimet biomarkkereiden, vuonna DDP käsitelty A549 ja H292-soluissa. Prosenttiosuus SAHF-positiivisten solujen lisääntyi merkitsevästi kanssa DDP hoitoon. DEX co-hoito voisi vähentää prosenttiosuus SAHF-positiivisten solujen verrattiin DDP hoito yksinään (kuvio 2D). Yhdistetty pesäkkeitä SAHF sisältävät metyloitua ja deasetyloitiin histoneita ja muita liittyviä proteiineja. Laajalti testattu markkereita tähän luokkaan kuuluvat metylaatio histoni 3 klo lysiiniä 9 ja 27 sekä fosforylaation H2AX histoni perheen jäsen X (γ-H2AX), jotka kaikki colocalize vuonna SAHF [19], [26]. Olemme havainneet ilmaus triMe H3K9 ja triMe H3K27 ja tulokset osoittivat samaa suuntausta SAHF (kuvio 2E).

DDP aiheuttama DNA Damage estyi läsnäolossa DEX

Koska DEX vaikutteita hoito aiheuttama ja monistus vanhenemista, ja DNA-vaurioita vastaus signalointi lla keskeinen rooli sekä, tutkimme seuraavaksi DEX moduloi DNA-vaurioita tarkistuspiste. Meillä seurataan hoidon aiheuttaman DNA-vaurion tutkimalla kaksi tavallista markkereita DNA-vaurioita, γH2AX ja 53BP1. DDP käsiteltyjä soluja, odotetusti, oli kasvu DNA-vaurioita yli ohjaus soluja, ja DEX yhtäaikainen käsittely DDP vaimenee aste DNA-vaurioita, arvioituna joko γH2AX tai 53BP1 (kuvio 3A, 3B ja 3C).

(A) Solut kiinnitettiin ja värjättiin γH2AX pesäkkeet (vihreä) 48 h kuluttua lääkkeen pesun. DAPI-värjäys suoritettiin havainnollistamaan ytimet (sininen). Prosenttiosuus γH2AX-positiivisten solujen on esitetty histogrammissa (oikealla). (B) Solut kiinnitettiin ja värjättiin 53BP1 pesäkkeet (vihreä) 48 tunnin kuluttua lääkkeen pesun. DAPI-värjäys suoritettiin havainnollistamaan ytimet (sininen). Prosenttiosuus 53BP1-positiivisten solujen on esitetty histogrammissa (oikealla). (C) Kun DDP hoidon 48 tunnin ajan, kun läsnä ollessa tai ilman DEX, solut pestiin ja niitä viljeltiin vielä 48 tunnin ajan. γH2AX ja 53BP1 proteiinin taso tutkittiin Western blot-analyysi. Expression of GAPDH otettiin sisäisenä latauskontrollina. (D) Cell cycle-analyysi suoritettiin 48 tunnin kuluttua lääkkeen pesun. Prosenttiosuudet G1, S ja G2 osoitetaan esitetyllä. Histogrammi suhteelliset muutokset G1 vaiheeseen verrattuna S-vaiheessa. (E) Expressions p21, P27, sykliini D1, CDK2 ja sykliini proteiinin taso tutkittiin Western blot-analyysi. Expression of GAPDH otettiin sisäisenä latauskontrollina. Tulokset edustavat avulla kuuden määrityksen ± keskivirhettä (SEM). *

p

0,05 ja **

p

0,01 analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).

senescent solut koskaan syöttää uudelleen solusyklin ja näyttävät laskevan DNA-synteesin, kasvun pidätys saadaan aikaan ja ylläpidetään joko G1 tai G2 /M vaiheessa solusyklin, osittain lisääntynyt spesifisten sykliiniriippuvaisen estäjät (CDKIs). Me tehdään FACS-analyysi ja löysi DDP hoito indusoi solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa mukana lasku prosenttiosuudet S vaiheen, ja DEX vähentynyt aste näiden muutosten (kuvio 3D). Havainnot senesenssiä liittyvän solusyklin säätelyproteiineihin löysi up-asetusten p21 ja p27, ja alas-asetusten sykliini D1 ja CDK2 DDP käsiteltyjä soluja, ja vastaavasti heikennetty suuntaukset DEX yhteistyössä käsiteltyjen solujen (kuvio 3E). Nämä tulokset tukevat oletusta DEX: n vaikutus DNA-vaurioita tarkistuspiste. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​DEX vaikuttaa vanhenemiseen vaikuttamalla aktivointi DNA-vaurioita tarkistuspisteen.

DEX Samanaikainen Alennettu DDP Herkkyys on p53-riippuvaisen Manner

p53-reitin on tärkeää luoda ja ylläpitää vanhenemista kasvun pysähtymisen aiheuttamia sytotoksisten stressistä. Siksi kysyttiin DEX co-hoito vaikuttaa kemoterapian herkkyyttä p53-reitin. Sen jälkeen DDP hoito, p53-proteiinin vähitellen kertynyt, ja vaikutus oli silmiinpistävän heikensi läsnäollessa DEX. Sama suuntaus havaittiin myös siitä proteiinin ilmentymistä p21

CIP1, vakiintunut transkription kohde- ja alavirtavaikuttajainhibiittorit p53 toiminnoilla solusyklin pysähtymiseen, vanhenemista induktio ja apoptoosin (kuvio 4A). Vahva induktio p21 odotetaan inhiboivan aktiivisuuden G1 sykliini /CDK-kompleksien johtaa hypophosphorylation retinoblastoomaa proteiinin (pRb) ja induktion epäonnistuminen S-vaiheessa Sykliinien (kuvio 4A). Samoin p53 mRNA-tasolla myös lisääntynyt jälkeen DDP hoidon, ja DEX yhteistyö hoidon heikennetty kasvusta (kuvio 4B). Lisäksi olemme myös käyttää lusiferaasireportterista määrityksissä havaitsemaan p53-promoottorin aktiivisuutta, ja analyysi osoitti DEX yhteistyössä hoito voisi myös heikentää p53-promoottorin aktiivisuutta verrattiin DDP hoidetun ryhmän (kuvio 4C). Nämä muutokset vahvistavat G1-vaihetta säilyttäminen havaittu DNA histogrammit ja pysyi sopusoinnussa peruuttamattomia G1 pidätyksen havaittu kemoterapiaindusoitu vanhenemista. Siten erilaiset biologiset vaikutukset DDP hoidon puuttuessa tai läsnä DEX syntyi ero sääntelyä p53 ja sen loppupään kohde p21.

(A) p53, p21 ja pRb lysaateissa valmistettu A549 ja H292-soluissa määritettiin Western-blot, vastaavaa proteiinia lastaus kaistojen vahvistettiin Western-analyysi GAPDH tasoilla. (B) muutokset mRNA: n ekspression tasojen p53 jälkeen DDP hoidon läsnä ollessa tai ilman DEX havaittiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR: llä. Kertamuutoksia laskettiin β-aktiini normalisoitu Ct-arvoja. (C) Soluja transfektoitiin p53: n kanssa promoottori-lusiferaasireportteriplasmidi. Lusiferaasin aktiivisuus kokosolulysaateista määritettiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo (± keskivirhettä) suhteen tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuudesta Renilla lusiferaasiaktiivisuuden ja normalisoitu suhde vehikkeliryhmässä. (D) A549 ja H292-soluissa, jotka oli transfektoitu p53: n ekspressiovektoriin (pcDNA3.1- /p53) käsiteltiin DDP: n läsnä tai poissa ollessa DEX. SA-β-gal aktiivisuus analysoitiin mikroskopialla päivänä 3 kuluttua lääkkeen pesun. Prosenttiosuus SA-β-gal-solujen esiteltiin histogrammissa. (E) H1299 (p53 geenittömän) soluja käytettiin havaitsemaan, onko DDP epäherkkyys tapahtunut p53 riippuvaisella tavalla CCK-8-määritys käyttäen erilaisia ​​annoksia DDP (0 uM, 1 uM, 2 uM, 4 uM, 8 uM, 16 uM , 32 uM, 64 uM, 128 uM). P53 tilat varmistettiin tarkastelemalla p21

CIP1 ja hdm2 ilmaisuja. (F) SA-β-Gal-aktiivisuutta havaittiin H1299: lla käsiteltyjen solujen DDP: n läsnä tai poissa ollessa DEX. (G) vaikutus siRNA: iden suunniteltu vastaan ​​p53 mitattiin western-blot A549-soluissa. SA-β-Gal-aktiivisuus havaittiin ja analysoitiin. Tulokset edustavat avulla kuuden määrityksen ± keskivirhettä (SEM). *

p

0,05 ja **

p

0,01 analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).

edelleen varmistamiseksi vaikutus p53 /p21

CIP1 koulutusjakson, A549 ja H292 soluja käsiteltiin pcDNA3.1- /p53. 2 vuorokauden kuluttua DDP hoidon kanssa tai ilman pcDNA3.1- /p53, tutkimme että yliekspressio p53 voisi estää väheneminen SA-β-Gal aktiivisuuden DEX yhteistyössä hoitoryhmässä (kuvio 4D). Lisäksi analysoida, DEX-liittyvä DDP insensitiivisyys riippuneet co-hoito vähentää DDP herkkyys on p53 riippuvainen, käytimme kahta solulinjaa eroavat p53-toiminto, A549 (p53 villityypin) ja H1299 (p53 puutteellinen tyyppi). P53 tila A549 ja H1299 solut vahvistettiin tarkastelemalla p21

CIP1 ja hdm2 ilmaisuja, ja CCK-8 määritys paljasti, että ei ollut merkittävää eroa DDP IC50 välillä DDP yksin ja DEX samanaikainen lääkitys ryhmän H1299 soluissa (kuvio 4E). Olemme myös todettu H1299 soluissa, DEX ei vaikuttanut SA-β-Gal aktiivisuutta (kuvio 4F). A549-soluja transfektoitiin p53 siRNA ja hallita siRNA. Western blot p53 vahvistanut tukahduttaminen p53 siRNA. Kuten odotettua, p53 siRNA voisi entisestään vähentää SA-β-Gal aktiivisuutta (kuvio 4G). Yhdessä tulokset osoittavat, että p53 voi aktivoida sytotoksisten stressi, ja DEX yhteistyö hoidon vaikutus TIS on p53-riippuvaista.

NF-KB oli tärkeä välittäjä DEX tehtävästä Kemoterapia sieto

edelleen karakterisoimiseksi onko NF-KB signalointi edistää tai kumoaa Vanheneminen, päätimme NF-KB aktiivisuuden NSCLC soluissa jälkeen DDP hoidon kanssa tai ilman DEX. Hoito DDP voimakkaasti aktivoitua NF-KB promoottorin aktiivisuutta A549, H292 ja H1299 soluja, ja hoito DEX vähentynyt NF-KB promoottorin aktiivisuutta vain A549 ja H292-soluissa (kuvio 5A). Seuraavaksi havaitsimme julkaistiin NF-KB-molekyylien tumaan seuraavat DDP hoitoon. DDP yksin ryhmä osoitti tumaansiirtymiseen NF-KB: n p65 ja DEX yhteistyössä hoito vähensi taso tumaansiirtymiseen (kuvio 5B). Ydin- translokaatio p65 varmistettiin lisäksi Western-blot. DDP hoito merkitsevästi edistänyt ydinvoiman lokalisointi p65, kun taas kokonaismäärä p65 sytoplasmassa oli muuttanut jonkin verran perustuen suhde p65 /GAPDH.