Krooninen sairaus

tiivistelmä

käyttö tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) vastaan ​​EGFR /c- Met ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on osoitettu olevan tehokas lisäämään potilaiden elinaika ilman taudin etenemistä (PFS), mutta niiden teho on rajallinen, koska resistenssin kehittymisen ja kasvaimen uusiutumisen. Siksi ymmärtäminen molekyyli- mekanismeista lääkeresistenssin kehittymisen NSCLC on välttämätöntä kehittää uusia ja tehokkaita hoitomenetelmiä parantaa potilaiden hoitotuloksiin. Tutkimuksen tavoitteena on ymmärtää mekanismia EGFR /c-Met tyrosiinikinaasiestäjä (TKI) vastus NSCLC. H2170 ja H358-solulinjoja on tehty kestävistä SU11274, c-Met: n estäjä, ja erlotinibi, EGFR-inhibiittorin kautta portaittain kasvaa TKI altistumista. IC

50 pitoisuuksia resistenttien linjojen näytteillä 4-5 ja 11-22-kertainen lisäys SU11274 ja erlotinibin vastaavasti verrattuna vanhempien linjat. Lisäksi mTOR ja Wnt signalointia tutkittiin molemmissa solulinjoissa määrittää niiden roolit välittämisessä TKI vastarintaa. Havaitsimme 2-4-kertainen säätelyä mTOR signalointia proteiinien ja 2- 8-kertaista voimistumista Wnt signalointia proteiinien H2170 erlotinibin ja SU11274 resistentit solut. H2170 ja H358-soluja käsiteltiin edelleen mTOR inhibiittorin everolimuusi ja Wnt-inhibiittori XAV939. H358 resistentit solut estyy 95%: iin kolminkertainen yhdistelmä everolimuusia, erlotinibin ja SU11274 verrattuna 34%: iin kaksinkertainen näiden yhdistelmä huumeita. Vanhempien H2170 soluilla ei herkkyyttä XAV939, kun taas resistentit solut estivät merkittävästi (39%), jonka XAV939 ainoana lääkkeenä sekä yhdessä SU11274 ja erlotinibin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin H358 resistentit solut. Tämä tutkimus viittaa siihen uutta molekyylitason mekanismi lääkeresistenssin keuhkosyöpään.

Citation: Fong JT, Jacobs RJ, Moravec DN, Uppada SB, Botting GM, Nlend M, et al. (2013) Vaihtoehtoiset signalointipolkujen mahdollisina terapeuttisina kohteina voittaminen EGFR ja c-Met Inhibitor Resistance in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (11): e78398. doi: 10,1371 /journal.pone.0078398

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 11 syyskuu 2013; Julkaistu 4 marraskuuta 2013

Copyright: © 2013 Fong. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Tutkimus raportoitu tämän julkaisun tukivat National Cancer Institute of National Institutes of Health alle palkinnon numero R21CA158965-01A1 https://www.nih.gov on Neelu Puri. Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut: Dr. Marie Nlend työskentelee Thermo Fisher Scientific . Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

EGFR ja c-Met molemmat voimakkaasti ilmaistuna NSCLC kasvaimia ja yhteisiä signalointireittejä [1] – [3]. Vaikka TKI vastaan ​​EGFR ja c-Met ovat huippuluokan syöpähoidon, niiden yksittäiset tehot ovat rajalliset [4] takia resistenssin kehittymistä [5]. c-Met vahvistus osuus on yli 20% Hankitun resistenssin EGFR TKI NSCLC sekä

in vitro

ja

in vivo

[6], [7]. Lisäksi kehittäminen toissijaisten ”portinvartijana” mutaatio T790M osuus 50% kaikista kehittynyt resistenssi EGFR TKI sekä

in vitro

ja

in vivo

[8]. Myös sen läsnäolo ennen käsittelyä TKI johtaa ensisijainen vastustuskykyä EGFR TKI-terapialle [9]. Siksi tutkia resistenssin on tärkeää tehdä ylimääräisiä

in vitro

tutkimuksissa määrittämiseksi kohdeproteiineja vastuussa TKI vastarinnan NSCLC.

SU11274 on ATP-kilpailukykyinen pienmolekyylisalpaaja- n katalyyttinen aktiivisuus c-Met [10] ja tehoaa NSCLC [11]. Tivantinib, c-Met TKI joka estää kasvaimen kasvua hiirissä [12], on parhaillaan vaiheen III kliinisissä tutkimuksissa ja on osoitettu lisäävän PFS 9,7-+16,1viikkoa kun sitä annetaan yhdessä erlotinibin [13], [14]. Näissä tutkimuksissa vain tietyt potilaiden alaryhmissä (KRAS mutantit, ei-levyepiteelikarsinooma histologia ja EGFR villityypin tila) osoitti merkittävästi lisääntynyt PFS [14], mikä viittaa siihen, että uusi TKI täytyy lisätä tämän yhdistelmän. Lisäksi hoito yhdistelmällä MetMab (anti c-Met mAb) ja erlotinibin vähensi kuoleman riskiä 3-kertaiseksi vain osaa potilaista positiivisia c-Met ilmaisun [15]. Vaikka käyttö yhdistelmähoidon yksityiskohtaiset säännöt saattavat rajoittaa mahdollisuutta kasvainten kehittää resistenssin [7], mekanismin ymmärtämisessä resistenssin on paras lähestymistapa parantaa täsmähoitoihin [16].

Studies ryhmämme ja muut osoittavat että c-Met ja EGFR on huomattavia ylikuulumisen mikä lisää tehoa TKI-yhdistelmä

in vitro

[1], [17]. Tämä johtuu siitä, että HGF voi transaktivoimaan EGFR ja fosforylaatio EGFR voi aktivoida c-Met: mikä synergistisiä vaikutuksia kasvaimen kasvuun [18] – [20]. Siksi tutkimme uusi terapeuttinen lähestymistapa voittamiseksi vastustuskykyä EGFR, c-Met ja EGFR /c-Met TKI yhdistelmähoidot NSCLC. Edelleen ymmärtää, miten solut kehittävät tämän resistenssin kehitimme H2170 ja H358 NSCLC solulinjoissa kehittynyt resistenssi TKI c-Met, EGFR ja molempia. Nämä solulinjat valittiin, koska ne ilmentävät korkeita EGFR ja c-Met, on synergistisesti inhiboi EGFR /c-Met TKI ja ei ole ennestään EGFR tai c-Met vastus aiheuttavia mutaatioita.

Edellinen tutkimukset ovat osoittaneet, lisääntynyt tehokkuus voidaan yhdistelmähoidot verrattuna monoterapioita [13], [14], [21] – [24]. MTOR-estäjä rapamysiini pystyy yhteistyötä c-Met estäjä PHA665752 NSCLC [25]. Edelleen, käyttämällä erlotinibi ja rapamysiinin tai everolimuusi (suun kautta otettava johdannainen rapamysiini) yhdistettynä on osoittanut synergiavaikutukset solujen elinkelpoisuuteen, jakaantumiseen ja autophagy [26], [27]. Tämä yhdistelmä oli myös osoittanut palauttaa gefitinibin herkkyys [28]. Nämä tutkimukset vain antaa EGFR ja mTOR estäjät yhdistelmässä. Meidän tutkimuksissa, olemme havainneet, että mTOR-inhibiittorit voivat lisätä tehoa EGFR /c-Met TKI yhdistelmähoitoa NSCLC

in vitro

. Lisäksi on ehdotettu, että ylikuuluminen välillä EGFR ja Wnt reitti voi osallistua puhkeamista ja etenemistä tumorigeneesin ja ylikuulumisen ligandien erillisten RTK välitteisten reittien voi helpottaa vastustuskykyä TKI [29]. Hyperaktiivisuus Wnt rintasyövän on osoitettu transaktivoimaan EGFR ja päinvastoin, aktivoitu EGFR voi edistää lisääntynyt vaikutus kanoninen Wnt-reitin [30] – [33]. Lisäksi tutkimukset potilaiden tuumorisektioiden ovat osoittaneet positiivista korrelaatiota EGFR aktivoivia mutaatioita ja ydinvoiman kertymistä β-kateniinin ensisijainen NSCLC [34]. On myös osoitettu, että Wnt /β-kateniinin reitin on merkittävä rooli solujen ylläpito, patogeneesi ja kestävyys seuraava EGFR esto NSCLC [35].

tiedot osoittavat, että lisäämällä Wnt inhibiittorien TKI SU11274 ja erlotinibin johtaa merkittävästi vähentynyt elinkelpoisuuden solulinjoissa kehittynyt resistenssi yhdistelmä EGFR /c-Met TKI-terapialle. Ehdotamme, että aktivointi vaihtoehtoisten signalointireittien on mahdollinen molekyylimekanismin lääkeresistenssin NSCLC, hyödyntäen c-Met, EGFR, mTOR ja Wnt-inhibiittorit voidaan parantaa huomattavasti keuhkosyöpään potilaan ennustetta ja olla perustana uuden kliinisissä tutkimuksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja vasta-aineet

SU11274: [(3Z) -N- (3-kloorifenyyli) -3 – ({3,5-dimetyyli-4 – [(4 -methylpiperazin-1-yyli) karbonyyli] 1 H-pyrrol-2-yyli} metyleeni) -N-metyyli-2-okso-2,3-dihydro-1 H-indoli-5-sulfonamidi] ja XAV939: [3,5, 7,8-tetrahydro-2- [4- (trifluorimetyyli) fenyyli] -4H-tiopyrano [4,3-d] pyrimidin-4-oni] saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Erlotinibin ja Everolimuusilla saatiin LC Laboratories (Woburn, MA). Tivantinib saatiin Chemietek (Indianapolis, IN). Kaikki inhibiittorit suspendoitiin DMSO: hon ja säilytetään 0,1 ml erinä -20 ° C: ssa. HGF saatiin Peprotech (Rocky Hill, NJ) ja EGF saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Fosfospesifiselle kani mAb: t ja p-EGFR (Tyr1068, Clone D7A5), p-mTOR (Ser2448, Clone D9C2) ja p-4E-BP1 (Thr37 /46, Clone 2855) saatiin Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA) . Fosfospesifiselle kanin polyklonaalisia vasta-aineita p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, 2532) ja p-p70S6K (Tyr421 /Ser424, 9208) saatiin Cell Signaling Technology. Kanin polyklonaalinen vasta-aine p-c-Met (Tyr 1003, 44882G) saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Hiiren mAb aktiivisille β-kateniinin (klooni 8E7, 05-665) saatiin Millipore (Billerica, MA). Sillä Wnt signalointia tutkimuksia, kaikki vasta-aineet hankittiin Wnt signalointia vasta-sampleri Kitin Cell Signaling Technology (2915). Fosforyloitumaton kani mAb: itä varten p70S6K (2708) ja mTOR (2983) saatiin Cell Signaling Technology. Fosforyloitumaton c-Met (C-12, sc-10) ja EGFR (1005, sc-03) saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Hiiren mAb β-aktiini (A5441) saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Hiiri (7076) ja kanin (7074) IgG-vasta-aineita saatiin Cell Signaling Technology. Kaikki vasta-aineita käytettiin, kuten on kuvattu valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Cell Lines and Cell Culture

H358 ja H2170 NSCLC solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD, CRL-5807 ja CRL-5928, vastaavasti) ja viljeltiin niiden ohjeiden. Solulinjat inkuboitiin 37 ° C: ssa ja 7% CO

2 ja ylläpidetään Roswell Park Memorial Institute (RPMI) väliaine (Thermo Fisher Scientific, Pittsburg, PA, Cat No: SH3002701) lisätty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) ja 1% (v /v) antibiootti /antimykoottia (Invitrogen, Cat No: 15240). Tutkittaessa vaikutuksia erlotinibin ja SU11274 yksittäisinä terapeuttisina aineina, samoin kuin yhdistelmänä, H358 ja H2170-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin 24 tunnin kuluttua. Sitten MTT-elinkyky määritykset ja western blotit suoritettiin, kuten alla on kuvattu. IC

50 arvot kullekin solulinjan laskettiin Sigma Plot V12.0 (SYSTAT Software, San Jose, CA).

MTT Cell Elinkykymääritykset

Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT kolorimetrinen väriaine väheneminen määrityksessä (Sigma, St. Louis, MO) käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin koe suoritettiin 96-kuoppalevyillä rinnakkaisnäytettä kuusi hoito-olosuhteilla, ja toistettiin kolme kertaa. Solut maljattiin 5000 solua /kuoppa ja käsiteltiin estäjillä 24 tunnin kuluttua kasvun. 96 tunnin jälkeen pinnoitus, prosenttia solujen elinkykyisyys laskettiin suhteessa valvoa mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 570 nm. Solut, jotka käsitelty tivantinib altistettiin vain 24 tuntia, minkä jälkeen lääkeaine poistettiin. Sitten solut pestiin ja niitä inkuboitiin vielä 72 tunnin ajan, kuten on kuvattu aiemmin tutkijat [12].

valmistaminen solulysaateista ja Western-blottaus

Soluja kasvatettiin ja hajotettiin kuten aiemmin on kuvattu [36] [37] puskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris (pH, 8,0), 150 mM NaCl, 10% glyserolia, 1% NP-40, 0,42% NaF, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 mM natriumortovanadaattia ja 10 mM proteaasiestäjäseostabletit (Sigma- Aldrich). Solulysaatit erotettiin 7,5% tai 10% SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa. Proteiinit siirrettiin sitten liikkumattomuudesta kalvoja (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Sitten membraanit tutkittiin edellä mainitun vasta-aineita. Blotit visualisoitiin käyttäen parannetun kemiluminesenssi-kittiä (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) ja kvantifiointi modulaation eri proteiinien suoritettiin käyttäen NIH ImageJ ohjelmistoa.

Erityisiä fosforylaation c-Met /EGFR ja muut signaalinvälitysreittien kautta HGF /EGF: n ja niiden inhibitio

Solut vietiin kasvutekijöiden inkuboimalla 24 tuntia seerumittomassa alustassa, joka sisälsi 0,5% BSA: ta tai ilman inhibiittoreita. Käsittelyn jälkeen soluja stimuloitiin 40 ng /ml HGF: 7,5 minuuttia tai 5 ng /ml EGF: ää 5 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Valmistamisen jälkeen lysaatit, western-blottaus suoritettiin, kuten edellä on kuvattu.

Immunofluoresenssi

10000 solut maljattiin lasin kammion dioja (Lab-Tek Scott Valley, CA) ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan seerumittomassa väliaineessa, jossa oli 0,5% BSA: ta. Sitten soluja käsiteltiin EGF: llä 15 minuutin ajan, kiinnitettiin 01:01 asetoni: metanolilla ja visualisoitiin p-EGFR (Y1068) primaarisen vasta-aineen, anti-kani-DyLight 488 (vihreä) sekundaarisella vasta-aineella (Thermo Fisher Scientific) ja Hoechst dye ydin- värjäys (sininen) käyttäen Zeiss Axio Observer Z1 fluoresenssimikroskoopilla. NIH ImageJ ohjelmistoa käytettiin mittaamaan koko solun fluoresenssi-intensiteetti yli 8 mikroskooppikentäs- olosuhdetta kohti ja otettiin keskiarvo.

DNA Sequencing

5000000 solut maljattiin 150 mm: n halkaisija ruokia ja annettiin kiinnittyä ja kasvaa media kuten edellä on kuvattu. DNA uutettiin käyttäen Qiagen DNeasy® Veren Tissue Kit (cat. No. 69504) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen suoritettiin PCR amplifioimiseksi eksonit 18-21 EGFR käyttäen alukkeita kuvanneet Paez et al [38], käyttämällä AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems, cat. No. 4327058). PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä GeneJET ™ PCR Purification Kit (cat. No. K0701) ja sitten sekvensoitiin University of Illinois DNA Services Facility.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen SPSS 17.0 ohjelmistolla. Toistuvat toimenpiteet ANOVA useita pareittain vertailuissa ja mukautettuja vastakohta Bonferronin säädöt tehtiin. Tilastollinen merkittävyys määritettiin α 0,05. Vahvista eroja hoitojen pariksi kahden tailed Opiskelijan

t

-testi käytettiin myös. Kaikkien analyysien p-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

perustaminen lääkkeille vastustuskykyiset solulinjat

Määritellä asianmukaiset pitoisuudet SU11274 , erlotinibi ja molempia TKI kehittämiseen resistenttien solulinjojen, H2170 ja H358-solulinjoja käsiteltiin asteittain kasvavia konsentraatioita SU11274 (2,5-17 uM) [1], erlotinibi (0. 5-14 uM) [39 ], tai molemmat SU11274 (1,25-13,5 uM) ja erlotinibin (0,25-9 uM) 96 tunnin ajan. H2170 ja H358-solulinjoja valittiin, koska niillä ei ole EGFR-TK tai c-Met mutaatioita. IC

50-arvot yksittäisille TKI tai yhdistelmä on määritelty jokaiselle solulinjaa (taulukko 1). Sitten soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla SU11274 [1], erlotinibi [39], tai yhdistelmää useita viikkoja, jonka jälkeen viisi yksittäistä resistentit kloonit eristettiin yksittäisistä soluista, laajennetaan ja sitten tarkistetaan vakaa vastus jokaisen serial passage (kerran viikossa ) [40]. Resistenttejä soluja kasvatettiin ilman TKI 12 kanavien (12 viikkoa) ja havaittiin säilyttää vastus. Resistenttien kloonien solulinjoista on kuvattu taulukossa 1, jossa IC

50 pitoisuuksia (määritetty kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät -osiossa) 4-5-kertainen varten SU11274, 11-22 kertaa suurempi varten erlotinibin, ja 6-8- kertainen varten SU11274 ja 15-30-kertainen varten erlotinibin yhdistelmä, eristettiin ja valittiin lisätutkimuksia varten. Pienemmät pitoisuudet olivat välttämättömiä yhdistelmä vastus, koska havaitsimme huomattavia vaikutuksia erlotinibin ja SU11274 kun niitä käytettiin yhdessä. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin muiden resistenttien kloonien (tuloksia ei ole esitetty).

SU11274 resistenttejä (SR) solut osoittavat alentunutta sensitiivisyyttä suun c-Met: n estäjä, tivantinib

vaikutus tivantinib, suun kautta c-Met: TKI tällä hetkellä kliinisissä kokeissa [12], [14], on solun kasvun estämistä vanhempien ja resistentit solut tutkittiin. Soluja käsiteltiin vaihtelevilla tivantinib 24 tuntia, minkä jälkeen lääkeaine poistettiin [12]. Sitten solut pestiin ja niitä inkuboitiin vielä 72 tuntia ja lopuksi MTT tehtiin elinkyvyn. Kuten on esitetty kuviossa. 1, 0,1 uM tivantinib, H2170 vanhempien solut estyy 32% verrattuna käsittelemättömiin emosoluista, kun taas resistenteistä soluista inhiboitui ainoastaan ​​10% verrattuna käsittelemättömiin resistenttien solujen (p 0,01). Munshi et al ovat osoittaneet herkkyys submikromo- laarisena pitoisuuksia tivantinib NSCLC kuin havaittu tutkimuksissamme [12]. 3-kertainen pieneneminen estyminen havaittiin H2170 resistenttien solujen verrattuna emo-soluja (n = 6, p 0,01). SR H358-soluja käsiteltiin 0,2 uM tivantinib, 3,7-kertainen pieneneminen estyminen nähtiin resistenttien solujen verrattuna emo-soluja (n = 6, p 0,01) (Fig1B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että SR-solut ovat resistenttejä myös tivantinib.

H2170 ja H358-soluja käsiteltiin tivantinib (+0,01-+0,4 uM) 24 tunnin ajan, tivantinib poistettiin, ja soluja inkuboitiin 72 tuntia, minkä jälkeen MTT tehtiin elinkyvyn. SR H2170-solut osoittivat 3,2-kertaisesti alentunut herkkyys anti-proliferatiivista vaikutusta tivantinib 0,1 uM tivantinib verrattuna vanhempien soluja. 3,7-kertaisesti alentunut kasvun estäminen havaittiin myös SR H358 solujen 0,2pM tivantinib verrattuna vanhempien soluihin. Esitetyt tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen, joka esittää samanlaisia ​​tuloksia (n = 6, p 0,01).

Euroopan T790M toissijainen mutaatio ei ole tarpeen, erlotinibi resistenssin

tulokset DNA Sanger sekvensointi PCR-tuotteiden eksonien 18-21 peräisin H2170 ja H358 vanhempien ja resistentit solut eivät osoittaneet toissijainen erlotinibi /gefitinibi T790M tai D761Y vastuksen pistemutaatioita [41]. Nämä tulokset vahvistavat, että solut eivät tienneet toissijaisia ​​mutaatioita, jotka aiheuttaisivat vastus. Täten mekanismi, jolla ne ovat vastustuskykyisiä voivat johtua vaihtoehtoisten signalointi kautta reseptorien muita kuin EGFR.

vaikutus EGF ja erlotinibin EGFR fosforylaatiota ja signalointi proteiineja kahta kestävää NSCLC mallia

jotta ymmärtää mekanismia erlotinibin vastarintaa, vertasimme kaksi erilaista erlotinibin resistenttejä solulinjoja, H2170 ER ja H358 ER, omien vanhempien solulinjoja. Soluja käsiteltiin joko laimentimen, EGF, erlotinibi tai EGF + erlotinibi. Erlotinibi resistenttejä (ER) H2170 solut näyttivät osoittavan konstitutiivisesti autofosforyloidun EGFR (Y1068) ilman sen ligandin, EGF: n (19-kertainen), kun taas ER-H358-solut osoittivat 6-kertainen lasku p-EGFR (Y1068) on EGF (kuvio 2A). Nämä tulokset tukevat immunofluoresenssilla joka osoitti minimaalinen vaikutus EGF on EGFR fosforylaatiota ER H2170 soluissa. Käsittelyn jälkeen on +/- EGF, H2170 vanhempien ja H2170-ER solut värjättiin käyttämällä erityistä ensisijainen anti-fosfo-EGFR (Y1068) vasta-aineen ja DyLight 488-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-aineen fosforyloidun EGFR (vihreä) ja tumat värjäytyivät sinisiksi Hoechstin kanssa väriainetta. Tämä viittaa siihen, autofosforylaation EGFR (kuvio 2B). Kun koko fluoresenssi yksikköä mitattiin, joka on 3.8- ja 1.7-kertainen lisäys fluoresenssin havaittiin läsnä ollessa ja puuttuessa EGF vastaavasti resistenttien solujen verrattuna emo-soluja (n = 8, p 0,01). Mielenkiintoista on, että ei ollut merkitsevää eroa fluoresenssin H2170 ER-solujen läsnä ollessa ja ilman EGF (p 0,01).

. EGFR autofosforyloidun ER H2170 ja vaimentua in H358-E4 resistenttejä solulinjoja. p-mTOR (S2448) ja sen alavirran signalointia proteiini fosfo-p70S6K (T389) on yläreguloituja molemmissa resistenttejä solulinjoja. H2170 ja H358 vanhempien ja resistenttejä solulinjoja nälässä yön yli 0,5% BSA: ta, ja käsiteltiin sitten tai ilman 7,0 uM erlotinibin 24 tunnin ajan ja soluja stimuloitiin 10 ng /ml EGF: ää 2,5 minuutin aikana. Korkeammat pitoisuudet erlotinibin käytettiin, koska nämä NSCLC solulinjoilla ei ole EGFR TK mutaatio. Autofosforylaation EGFR Y1068 nähtiin ilman EGF ER H2170-soluissa, joita ei nähty ER H358-E4-soluissa. Ylössäätely p-mTOR ja sen loppupään proteiini phosho-p70S6K (T389) nähdään H2170 resistenttien linjojen +/- erlotinibi. ER H2170 solut osoittavat lisääntynyt EGFR fosforylaatiota +/- EGF. Ylössäätely p-ERK (2-5-kertainen) havaittiin myös ER H2170 ja H358-solujen +/- erlotinibin B. Vahvista autofosforylaation EGFR, solut maljattiin kammion dioja, annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan ja sitten köyhdytetty yön yli. Soluja käsiteltiin sitten +/- EGF 15 minuutin ajan, kiinnitettiin asetonilla: metanolilla ja visualisoidaan p-EGFR (Y1068) primäärinen vasta-aine ja anti kanin DyLight sekundaarinen vasta-aine (Thermo Fisher Scientific) (vihreä) tai Hoechst väriaine tumavärjäystä ( sininen) Zeiss Axio Observer Z1 fluoresenssimikroskoopilla. Kaavio, jossa keskimääräinen suhteellinen koko solun fluoresenssi yksikköä 8 mikroskooppikentäs-. Oli 3,8-kertainen fluoresenssin verrattaessa vanhempien resistenttien solujen puuttuessa EGR H2170 soluissa.

lisäksi tutkittiin vaikutusta erlotinibin vastustusta mTOR koulutusjakson, keskeinen säätelijä syöpäsolujen kasvua [42], mittaamalla p-mTOR ja sen loppupään alustan p-p70S6K. ER H358 ja H2170-soluja, ilmentymisen lisääntyminen (2-4-kertainen) p-mTOR havaittiin läsnä erlotinibin (kuvio 2A). Lisäksi, ylössäätely (2-kertainen) p-p70S6K havaittiin myös ER H2170 ja H358-soluissa, kun läsnä on erlotinibin. Lisäksi p-ERK myös voimistunut (2-5-kertaisesti) ER H2170 ja H358-solujen läsnä ollessa ja puuttuessa erlotinibin (kuvio 2A). Ei modulaatio yhteensä mTOR, EGFR, p70S6K tai ERK havaittiin (Kuva S1). Tuloksemme osoittavat, että mTOR polku ja muiden reseptorien voisi upregulate p-p70S6K siten välittävien vastus kahden erillisen mekanismeja H2170 ja H358 NSCLC malleja.

vaikutus HGF ja SU11274 c-Metin fosforylaatiota ja signalointi proteiineja kahdessa NSCLC mallit

Ymmärtääksemme vastus mekanismin c-Met-inhibiittorit, loimme SR H2170 ja SR H358 solulinjojen ja käsittelimme ne laimentimen, HGF, SU11274 ja HGF + SU11274. SR H2170 ja SR H358 solut ilmensivät 4- ja 1,5-kertainen downregulation p-c-Met (Y1003) vastaavasti ilman muutoksia yhteensä c-Met tasot analysoitiin western-blottauksella (kuvio 3). Downregulation näyttää olevan täysin riippumaton kaikista SU11274 hoidon jälkeen downregulation havaittiin kuuden kohtia puuttuessa lääkkeen. Tämä voi osoittaa, että SR H2170 ja H358 eivät käytä p-c-Met keinona vastuksen mikä viittaisi siihen, erillinen mekanismi. Samanlaisia ​​ER-soluja, käsittelemättömästä SR H2170-soluissa, havaitsimme selvästi ilmentymisen lisääntyminen (20-kertainen) p-p70S6K, proteiini alavirtaan mTOR, joka on osallisena syövän solujen eloonjäänti [42], ja säätelyä havaittiin soluissa, joita käsiteltiin HGF ja SU11274 (kuvio 3). 2-kertainen säätelyyn ylöspäin p-4E-BP1, proteiini alavirtaan mTOR, joka edistää tuumorigeenisyyden, havaittiin sekä SR H2170 ja H358-soluissa (kuvio 3). Ei modulaatio yhteensä mTOR, EGFR, p70S6K tai ERK havaittu kummassakaan solulinjassa (kuvio S1). Nämä tulokset osoittavat, että mTOR reitti voi olla mukana välittämisessä vastus.

Solut nälässä yön yli ja sitten sitä käsiteltiin kanssa tai ilman 8,0 uM SU11274 24 tuntia. Soluja stimuloitiin 40 ng /ml HGF: 2,5 minuuttia, minkä jälkeen western blot-analyysi suoritettiin. Downregulation p-c-Met (Y1003) havaittiin molemmissa solulinjoissa. Ylössäätely p-p70S6kinase (S371) havaittiin SR H2170-soluissa. Ylössäätely p-4E-BP1 (T37 /46) havaittiin myös molemmissa soluissa linjat +/- SU11274.

Aktivointi Wnt koulutusjakson myötävaikuttaa EGFR /c-Met TKI vastus

Wnt koulutusjakson säätelee solujen lisääntymistä ja on avainasemassa kehityksessä keuhkosyövän [43], [44]. Koska β-kateniinin signalointi osoitettu aktivoivan ERK signalointireitin [45], tutkimme p-ERK (T202 /Y204) ja aktiivisen β-kateniinin vasteena HGF ajan SR H2170-soluissa. Olemme havainneet, että p-ERK pysyivät koholla vähintään 120 minuuttia SR H2170-soluissa, mutta ainoastaan ​​30 minuuttia vanhempien soluissa (kuvio 4A). Mielenkiintoista on, että ei-stimuloitujen solujen,-tasojen aktiivisen β-kateniinin (2-kertainen) ja p-ERK (5,6-kertainen) olivat korkeammat ja pysyi koholla 120 minuuttia sen jälkeen, kun HGF: n hoidon SR H2170-soluissa verrattuna emo-soluissa, sen jälkeen 60 minuutin inkuboinnin (n = 3, p 0,01) (kuvio 4A), mikä viittaa siihen, ylikuuluminen on c-Met, mTOR ja Wnt-reitin. Hoidon jälkeen SU11274 ja HGF, havaitsimme 3-8-kertainen nousu aktiivisen β-kateniinin läsnä ollessa ja puuttuessa SU11274 SR H2170-soluissa (kuvio 4B). 2-3-kertainen ylössäätely p-LRP6 läsnä ollessa ja puuttuessa SU11274 nähtiin myös. Säätelyä liittyvien proteiinien Wnt-reitin vahvistettiin ER H2170-soluissa. Havaitsimme 2-4-kertainen ja 3-5-kertainen nousu p-LRP6 puuttuessa tai läsnä erlotinibin, vastaavasti. LRP6 fosforylaation voi osoittaa aktivoitumisen Wnt-reitin [46]. Olemme myös havainneet 2-3,5-kertainen ekspression Axin1, säätelijänä LRP6, ja sen jälkeen Wnt-reitin [31] (kuvio 4C).

. SR H2170 soluissa, HGF aiheuttama lausutaan p-ERK signalointi verrattuna vanhempien soluihin. Soluja ilman ravintoa 48 tuntia, ja sitten stimuloitiin 40 ng /ml HGF: n. Western blotting in SR H2170 osoitti, että HGF- aktivoitu p-ERK (T202 /Y204) pysyi korkeana 120 minuuttia verrattuna vanhempien linjat. Pohjapinta tasoilla aktiivisen β-kateniinin olivat myös 2-kertainen ja pysyi korkeana (3,6-kertainen) 120 minuutin kuluttua HGF hoidon SR H2170 soluissa verrattuna vanhempien soluissa 60 minuutin inkuboinnin jälkeen. Nämä kokeet tehtiin kolmena kappaleena. Suhteellinen densitometrisesti p-ERK /β-aktiini SR H2170-soluissa kuvattu, joka on keskimäärin kolmen erillisen kokeen (n = 3, p 0,01). B. asetus proteiinien Wnt-signalointireitin käsittelyn jälkeen H2170 kanssa SU11274. Säätelyä pLRP6 (2-3,0-kertainen) ja β-kateniinin (3-8,0-kertainen) havaittiin vastustuskykyisten H2170-solujen läsnä tai poissa ollessa SU11274. C. asetus proteiinien Wnt signalointireitillä käsittelyn jälkeen ER H2170 solujen erlotinibin. Säätelyä LRP6 (2-5-kertaisesti), ja Axin1 (2-3,5-kertainen) havaittiin vastustuskykyisten H2170-solujen läsnä tai poissa erlotinibin.

kasvu H2170 ja H358 yhdistelmä resistenttejä (CR) solut estyvät everolimuusille ja XAV939

Koska mTOR reitti osallistuu syövän lääkeresistenssin [47], herkkyys mTOR inhibition CR H2170 ja H358-solulinjoja testattiin. Hoito 1 uM everolimuusiin esti H358 vanhempien soluissa 40% ja resistentit solut vain 20%. Mielenkiintoista on, että sama pitoisuus everolimuusin esti kasvun emosoluista kokonaan ja resistentit solut 95%, kun niitä käytetään yhdessä joko SU11274 (8 uM) tai erlotinibi (8 uM) (kuvio 5A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin CR H2170-soluja (99% kasvun estoa, tuloksia ei ole esitetty). Sitten testattiin vaikutusta Wnt inhibition resistentit solut. H2170 vanhempien ja CR solulinjoja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla XAV939 ja MTT tehtiin elinkyvyn. Mielenkiintoista on, että vanhempien soluista osoitti vähän tai ei lainkaan vastausta XAV939 kuitenkin CR solut inhiboi annoksesta reagoiva tavalla (kuvio 5B). Lisäksi kun XAV939 yhdistettiin SU11274 (8 uM) ja erlotinibin (8 uM), 85%: n lasku elinkelpoisuutta havaittiin CR soluissa. Tämä viittaa siihen, että Wnt signalointia on merkittävä rooli resistentit solut.

Soluja käsiteltiin 96% kasvun estämistä ei havaittu, kun Everolimuusin käyttää sekä SU11274 ja erlotinibi. B. Vanhempien H2170-solut osoittavat vähän tai ei lainkaan inhibitiota, kun sitä annetaan kasvavien pitoisuuksien XAV939. Toisaalta, CR H2170-soluissa, kun käsiteltiin XAV939, oli inhiboi annoksesta reagoiva tavalla. H2170 CR solut osoittavat 40%: n esto ja Wnt antagonisti XAV939 (10 uM) yksin, osoitti 85%: n esto kolminkertainen yhdistelmä XAV939, SU11274 ja erlotinibi (p 0,01). Jokainen koe kullekin käsittelylle kunnossa toistettiin kolme kertaa.

Keskustelu

molekyylirakennetta suunnattu TKI on tullut olennainen osa hoitoa käytetään lääkärit torjuntaan aiemmin untreatable NSCLC. Kuitenkin kehittynyt resistenssi TKI on rajoitti ankarasti missä määrin tämä hoito voidaan käyttää tehokkaasti. Toisin kuin aiemmissa tutkimuksissa, jotka ovat keskittyneet EGFR mutaatioita [8], [48], tutkimme mahdolliset vaihtoehtoiset signaalireaktioteissä lääkkeille vastustuskykyiset solulinjat. Tutkimme kaksi NSCLC malli solulinjoja, jotka osoittivat joko säätelyä (H2170) tai alisäätely (H358) p-EGFR ja downregulation p-c-Met (H2170 ja H358). Resistentit solut eivät näyttää joko T790M tai D761Y mutaatioita, mikä viittaa siihen, että käytetään vaihtoehtoisia signalointimekanismin voittamiseksi erlotinibi herkkyys. Mielenkiintoista sekä H2170 ja H358 resistenttien solujen näyttää ylössäätely mTOR kautta. Lisäksi H2170 resistenttejä solulinjoja osoitti modulaatio sekä mTOR ja Wnt väyliä mikä viittaa niiden roolit resistenssimekanismi.

Tällä hetkellä ei ole yhteyttä välille on luotu c-Met TKI kestävyys ja mTOR in NSCLC. Kuitenkin aiemmin tutkimukset viittaavat siihen, että inhibitio c-Met: kinaasiaktiivisuuden johtaa vähentyneeseen aktivaatioon PI3K /AKT /mTOR-reitin transformoiduissa soluissa [25]. Kuitenkin, esillä olevassa tutkimuksessa olemme havainneet fosforylaation c-Met: in H2170 ja H358 resistenttejä solulinjoja hoidetuilla SU11274. Tämä viittaa siihen, että SU11274, kun taas tehokas estäjä c-Met: n fosforylaation, on vain vähän vaikutusta mTOR ja sen alavirran signalointireittejä välttämättömiä solujen kasvua ja selviytymistä resistenttien linjojen [25]. Koska resistenttejä solulinjoja on osoitettu lisääntyä, kun läsnä on SU11274, suosittelemme vaihtoehtoisia väyliä on merkittävä rooli voittamisessa c-Met: inhibition ja lisäksi molekyyli kohdistaminen voi olla tarpeen estää solujen kasvua. Rooli mTOR väylän resistenssimekanismeja on osoituksena 2-4-kertainen p-mTOR vastustuskykyisten H2170 ja H358-soluissa verrattuna vanhempien soluihin vastauksena erlotinibi hoitoon.