Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Pään ja kaulan alueen syöpä (HNC) sijoittuu neljänneksi yleisin maligniteetti ja syöpäkuolemien miehiin Taiwanissa. Huolimatta viimeaikaisista terapeuttinen kehittyessä ennuste HNC potilaille on edelleen synkkä. Uusia strategioita tarvitaan pikaisesti parantamaan Chemosensiti- tavanomaisten kemoterapeuttisten ja kliiniset vasteet HNC potilaista. Tutkimukset ovat osoittaneet, että paikallisesti 5-aminolevuliinihapon välittämää fotodynaamiseen (ALA-PDT) on käytössä hoidettaessa erilaisia ​​ihmisen syöpää edeltävät ja pahanlaatuisten leesioiden joitakin rohkaisevia kliinisiä tuloksia. Kuitenkin molekyylimekanismeihin ALA-PDT terapeuttisen vaikutuksen HNC kasvainten synnyssä ja onko ALA-PDT kuin chemosensitizer varten HNC hoitoon jää epäselväksi. Kertyvät tiedot tukevat syövän kantasolut (CSCS) myötävaikuttaa kemiallis-resistenssi HNC. Edellisen perusteella tutkimusten tarkoituksena on tutkia vaikutusta ALA-PDT CSCS ja Chemosensiti- omaisuutta HNC.

Menetelmät /Principal löytäminen

CSCS merkki ALDH1 aktiivisuutta HNC solut ALA-PDT kohtelun arvioinut Aldefluor määrityksen virtaussytometria-analyysi. Toissijainen Sphere muodostava itseuudistumisen, stemness markkereita ilme, ja invaasiokyvyssä HNC-CSCS ALA-PDT hoidon esitettiin. Havaitsimme, että hoidossa ALA-PDT merkittävästi alas-säännellyt ALDH1 toimintaa ja CD44 positiivisuus HNC-CSCS. Lisäksi ALA-PDT vähensi itseuudistumiseen omaisuutta ja stemness allekirjoituksia ilmaisun (Oct4 ja Nanog) in palloja muodostavan HNC-CSCS. ALA-PDT herkistyneet erittäin tuumorigeenisia HNC-CSCS perinteisiin chemotherapies. Lopuksi synergistinen vaikutus ALA-PDT ja sisplatiinihoitoon heikennettyjä invasiivisuus /colongenicity kiinteistön HNC-CSCS.

Päätelmä /merkitys

tulokset tarjoavat oivalluksia kliininen mahdollisuus ALA-PDT kuin potentiaali chemo-adjuvanttihoito vastaan ​​pään ja kaulan syöpä poistamalla CSCS omaisuutta.

Citation: Yu CH, Yu CC (2014) fotodynaaminen hoito 5-aminolevuliinihapon (ALA) Heikentää kasvain lepotilaan ja Chemo-Resistance Kiinteistövälitys pään ja kaulan alueen syöpä-Derived Cancer Kantasolut. PLoS ONE 9 (1): e87129. doi: 10,1371 /journal.pone.0087129

Editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 joulukuu 2013; Hyväksytty: 22 joulukuu 2013; Julkaistu: 24 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Yu, Yu. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee tutkimusta avustusta National Science neuvoston (100-2632-B-040-001-MY3, 101-2314-B-040-016, 102-2628-B-040 -001 -MY3) kantavassa rahoittajat ollut mitään roolia in tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan alueen syöpä (HNC) on yksi yleisimmistä syövistä maailmassa ja yksi syövän syiden liittyvä kuolema johtuu usein toistumisen kemoterapian jälkeen vastus [1]. Huolimatta parannuksia diagnosointiin ja hoitoon HNC, pysyvyyttä ovat parantuneet vain vähän viime vuosikymmenen aikana [1]. Uusia lääkkeitä tai strategioita tarvitaan kiireellisesti parantaa Chemosensiti- tavanomaisten kemoterapeuttisten ja kliiniset vasteet HNC potilaista [2].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet kestävyys perinteisiin sädehoidot /kemoterapiaan, hoito on merkittävä kliiniset kriteerit kuvaavat syövän kantasolut (CSCS) kanssa itseuudistumiseen ja erittäin tumorigenenic kapasiteettia pahanlaatuiset kasvaimet mukaan lukien HNC [2] – [4] sekä intrasellulaarisen ALDH1 + ja CD44 + solut on ehdotettu näytteille CSCS ominaisuuksia ja on käytetty CSCS toiminnallinen markkereita pään ja kaulan alueen syöpä johdettu syövän kantasoluja (HNC-CSCS) [5] – [7]. Kuitenkin etsiminen tehokas lähestymistapa kohdistaminen HNC-CSCS parantamiseksi HNC -aiheiset syöpäsairauksia tarvitaan pikaisesti [7].

fotodynaaminen hoito (PDT) on kaksi erikseen myrkytön komponentteja, kevyt ja photosensitizer [8]. PDT on uusi hoito ja pitää huomattavaa lupaus monta kiinteitä kasvaimia [9]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että paikallisesti 5-aminolevuliinihapon välittämä PDT (ALA-PDT) on käytössä hoidettaessa erilaisia ​​ihmisen syöpää edeltävät ja pahanlaatuisten leesioiden joitakin rohkaisevia kliinisiä tuloksia [10] – [13]. PDT voi olla potentiaalia estämään etäpesäkkeiden epätäydellisesti käsitellyn HNC [14]. Kun hiiret Lewisin keuhkokarsinooma malli, ALA-PDT vähensi syövän metastaasia soluihin in vivo [15]. Lisäksi ALA-PDT lisää apoptoottisen kyky suun syöpäsolujen kautta NF-KB /JNK signalointi [16]. ALA-PDT myös kumottu muuttoliike kapasiteetti suun syöpäsolujen alas-säätely FAK ja ERK [17].

Perustuen aikaisempiin tutkimuksiin, tarkoituksena on tutkia vaikutusta ALA-PDT Chemosensiti- ja CSCS omaisuutta HNC. Kaiken kaikkiaan olemme ensimmäinen osoitti ALA-PDT vähentävät tehokkaasti CSC kaltainen ominaisuus kuten ALDH1 aktiivisuutta, CD44 positiivisuus, itseuudistumisen, invaasio, ja tehosti kemosensi- HNC. ALA-PDT olisi potentiaalinen chemo-adjuvanttihoito ja voi olla hyödyllistä anti-CSCS hoitoa HNC.

Materiaalit ja menetelmät

Ensisijainen viljeltyjen solujen HNC kudoksista

kirurginen kudosnäytteiden HNC potilaista kerättiin saatuaan kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen ja tämän tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board Chung Shan Medical University Hospital (CSMUH nro: CS10249). Ensisijainen HNC solut määritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [6], [18]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun kirurginen poisto HNC kudosten, kudokset pestiin 3 kertaa glukoosia sisältäviä HBSS, näytteet leikattiin paksuuteen 300 um ja viipaloitu kudokset upotettiin 0,1% (paino /paino), kollagenaasi, joka sisältää glukoosia sisältävät HBSS 15 minuuttia 37 ° C: ssa ja alistettiin kierto ravistelijaan ravistellen 125 rpm. HNC primaariviljelmän viljeltiin DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, jota oli täydennetty 1 mM natriumpyruvaattia, ei-välttämättömiä aminohappoja, 2 mM L-glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä tavanomaisissa viljelyolosuhteissa (37 ° C, kosteus 95% ilmaa, 5% CO

2).

Kemikaalit

5-aLA saatiin Sigma (St . Louis, MO, USA). Juuri ennen käyttöä, 5-ALA laimennettiin edelleen viljelmäväliaineella asianmukaisiin lopulliset pitoisuudet.

HNC solulinjojen viljely ja 5-ALA-pohjainen fotodynaamiseen

ALA-PDT tutkimuksissa solut inkuboitiin 5-ALA 3 tuntia, ja sitten säteilytetään punainen valo 635 ± 5 nm erilaisina annoksina.

rikastaminen palloja muodostavan HNC syövän kantasolut (HNC-CSCS) B

Spheres päässä HNC solut eristettiin väliaineessa, joka koostuu seerumitonta DMEM /F12-väliaineessa (GIBCO), N2 täydennys (GIBCO), 10 ng /ml ihmisen rekombinantti emäksinen fibroblastikasvutekijä (perus FGF), ja 10 ng /ml epidermin kasvua tekijä (EGF) (R kanin anti-GAPDH (MDBio, Inc., Taipei, Taiwan); ja hiiren anti-β-aktiini (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). Immunoreaktiivisia proteiinin vyöhykkeet havaittiin ECL tunnistusjärjestelmä (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, USA).

In vitro

soluinvaasiota Pitoisuus

transwell muuttoliike määrityksiä , 2 x 10

5 solua maljattiin yläosaan kammion transwell (Corning, Acton, MA, USA), jossa on huokoinen kalvo (8,0 um huokoskoko). Solut maljattiin alustassa, jossa alempi seerumin (0,5% FBS), ja jota on täydennetty korkeampi seerumin (10% FBS: ää) käytettiin kemoattraktantti alemmassa kammiossa. Soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja solut, jotka eivät muuttaneet huokosten läpi poistettiin pumpulipuikolla. Solujen alapinnalle kalvon värjättiin Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) tuman osoittamiseksi; fluoresenssi havaittiin suurennuksella 100x käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa). Määrän fluoresoivia soluja yhteensä viisi satunnaisesti valittua kenttää laskettiin. In vitro soluinvaasiota analyysi aikaisemmin kuvatulla [19].

Soft agar pesäkkeenmuodostuskyvyn määrityksessä

Jokaisessa hyvin (35 mm) kuusikuoppaisessa viljelymaljalle päällystettiin 2 ml pohja agar (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) seosta (DMEM, 10% (v /v) FCS: ää, 0,6% (w /v) agaria). Sen jälkeen, kun pohja kerros kiinteytyi, 2 ml top-agar-väliaineessa seos (DMEM, 10% (v /v) FCS: ää, 0,3% (w /v) agaria), joka sisälsi 2 x 10

4-soluja lisättiin, ja astiat inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 viikkoa. Levyt värjättiin 0,005% Crystal Violet sitten pesäkkeet laskettiin. Määrä yhteensä pesäkkeiden, joiden halkaisija ≥100 pm laskettiin yli viisi kenttää per hyvin yhteensä 15 kenttien kolmena kappaleena kokeissa [3].

Tilastollinen

Statistical Package of Social Sciences (versio 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) käytettiin tilastolliseen analyysiin. Opiskelijan

t

testiä käytettiin määrittämään tilastollinen merkitsevyys eroja koeryhmien;

p

-arvot olivat alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Taso tilastollista merkitsevyyttä asetettiin 0,05 kaikissa testeissä.

Tulokset

esto ALDH1 aktiivisuuden HNC soluilla ALA-PDT hoito

ALDH1, sytosolin isoentsyymiä, joka vastaa hapetus retinolia retinoiinihappo- alkupuolella kantasolujen erilaistuminen ovat molemmat osoittautuneet CSC merkkiaineiden pään ja kaulan alueen syöpä [20], [21]. Ensimmäinen, käytimme in vitro soluun, joka perustuu ALDH aktiivisuus koejärjestelmässä, joka on osoitettu niin HNC-CSCS markkeri, tutkia vaikutuksia ALA-PDT ALDH1 aktiivisuutta HNC solulinjoja ja primaarisia viljeltyjä HNC solujen virtaussytometrialla kuvattu materiaali- ja menetelmiin. Tuloksemme ehdotti ALA-PDT hoito vähentää merkittävästi ALDH1 aktiivisuutta HNC soluja (Fig. 1).

(A) HNC solulinjat (SAS ja Ca9-22) ja ensisijaisen HNC soluja (HNC-1 ja HNC- 2) ympättiin kuin 1 x 10

6 solua /kuoppa 6-kuoppaisille-levylle ja sitten esikäsitelty 1 mM ALA 3 tuntia sen jälkeen PDT punaisena annoksella 4 J /cm 2 tai ALA ainoa hoito kontrolliryhmä . ALDH + solut määritettiin Alderfluor määrityksellä ja elinkelpoisten solujen (7-AAD negatiivinen) käytettiin analyysiin. DEAB käsiteltyjä soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. (B) Kun määritellään Tulokset on esitetty pylväskaavio. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja edustavat tulokset on esitetty. Tulokset esitetään keskiarvoina ± SD *, p 0,05.

ALA-PDT eliminoi tehokkaasti kyky uusiutua, CD44 positiivisuus, ja stemness allekirjoitukset HNC-CSCS

Aiemmin selvitimme onnistunut pallon muodostumista yli peräkkäistä kertaa kulttuurin, yksi indeksit arvioimiseksi pysyviä itseuudistumisen ominaisuus syövän kantasoluja, ja osoitti, että kyky uusiutua kaikkien HNC-CSCS [22]. Vaikutuksen tutkimiseksi ALA-PDT ylläpitämisessä itseuudistumisen HNC-CSCS, arvioimme toissijainen palloja muodostavan kyky ALA-PDT hoitoa HNC soluissa. Hoito HNC solujen ALA-PDT häirinnyt aloilla kehon koon ja määrän HNC-CSCS (Fig. 2A). Virtaussytometrianalyysi of CD44 ilmaisun osoitti, että ALA-PDT vähensi prosenttiosuus sekä CD44 + soluja HNC-CSCS (Fig. 2B). Edelleen onko vähennys kasvaimen alalla muodostumiseen tehokkuutta ALA-PDT hoidon johtui vähentynyt stemness merkkiaineiden ilmentymisen, stemness geenit (Oct-4 ja Nanog) ja palloja muodostavan HNC-CSCS ohjaus- ja ALA-PDT hoidon määritettiin western blot-analyysi. Tulokset vahvistivat, että ALA-PDT hoidetun HNC-CSCS lyhensi merkittävästi lauseke transkripti (Fig. 2C) ja proteiini taso (Fig. 2D) on stemness geenien.

(A) itseuudistumisen analyysi, single solususpensio saatiin ensisijainen HNC-CSCS palloiksi Accutasella ruoansulatusta ja toissijainen pallo muodostumista kapasiteetti määritettiin ensisijainen pallo kulttuurin menettelyä paitsi pinnoituksessa solutiheys kuin 10000 solua /ml. (B): n ekspressio CD44 positiivisuus valvontaa ja ALA-PDT-hoitoa HNC-CSCS määritettiin virtaussytometrialla analysointia. Data on esitetty tässä ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *, P 0,05 vs. kontrolli. SAS tai Ca9-22 johdettuja HNC-CSCS käsitelty kontrolli tai ALA-PDT ja analysoidaan selostukset ja proteiinin taso Oct-4 ja Nanog reaaliaikaisella RT-PCR (C) ja immunoblottaus analyysi (D), tässä järjestyksessä. *, P 0,05 vs. kontrolli.

ALA-PDT hoidon toimitus parantaa tehoa kemoterapian HNC-CSCS

CSCS ovat suhteellisen resistenttejä kemoterapiaa [6]. Havainnot, että ALA-PDT hoitoa säädellään CSCS ominaisuudet ehdotti rooli ALA-PDT mahdollisena chemo-adjuvanttihoito. Solujen elinkelpoisuuden määritykset osoittivat, että sytotoksinen vaikutus HNC-CSCS on sisplatiini ja fluorourasiilin (5-FU) on merkittävästi lisääntynyt ja ALA-PDT yhdistelmähoitona (Fig. 3A). Virtaussytometria-analyysi monilääkeresistenssin (MDR) geenit osoittivat, että vähentynyt chemoresistance ALA-PDT kohtelun voidaan katsoa johtuvan vähentyneen ilmentymisen ABCG2 (Fig. 3B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ALA-PDT hoito lievittää huumetta vastus HNC-CSCS sisplatiinin ja fluorourasiilin (5-FU) hoidon kautta ABCG2 alassäätöä.

(A) HNC-CSCS ALA-PDT tai valvontaa käsittely suoritettiin käsittely eri sisplatiinin tai 5-FU. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. (B) Virtaussytometrianalyysi ilmentymisen taso lääkkeille vastustuskykyisten markkeri ABCG2 ilmaisun HNC-CSCS osoittamalla.

Samanaikainen ALA-PDT hoito ja sisplatiini kumotaan invasiivisuus ja kyky muodostaa klooneja HNC -CSCs

Koska CSCS näyttävät olevan merkittävä rooli kasvaimen aloittamaan toiminnan [3], pyrimme mittaamaan synergiavaikutuksen ALA-PDT yhdistettynä sisplatiinihoitoon päälle invaasio /kyky muodostaa klooneja HNC-CSCS. Yksisolususpensio ALA-PDT-hoitoa HNC-CSCS käsiteltiin kanssa tai ilman sisplatiinihoitoon käytettiin analyysi niiden hyökkäyksen /kyky muodostaa klooneja

in vitro

, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Sisplatiinihoidolle yksinään ei vaikuttanut hyökkäys kyky HNC-CSCS (Fig. 4A), yhdistelmä ALA-PDT ja sisplatiinihoitoon parannettu tehokkuus näistä hoidoista (Fig. 4A). Samaan aikaan samanlainen synergistinen vaikutus ALA-PDT hoidon ja kemoterapian hoito on havaittu myös pesäkemuodostusta (Fig. 4B). Yhdistelmä hoito osoitti synergistisen vaikutuksen kumoamisesta kyky muodostaa klooneja in HNC-CSCS. Nämä tulokset osoittavat, että tehokkuus Sisplatiinin solunsalpaajahoitoa HNC-CSCS voidaan parantaa ALA-PDT hoitoa.

(A) Invasion kyky ja (B) pesäkkeitä muodostavien kyky HNC-CSCS tutkittiin hoidon jälkeen joko ALA-PDT tai sisplatiinia kemoterapiaa tai molempia. *, P 0,05 ALA-PDT vs. valvonta; #, P 0,05 ALA-PDT + sisplatiini vs. ALA-PDT yksin.

Keskustelu

CSCS katsotaan olevan vastuussa aloittamisesta, leviämistä ja etäpesäkkeiden kasvainten [23 ]. Tärkeää on, että on olemassa CSCS saattaisi selittää syövän uusiutumisen, jopa sen jälkeen kliinisen hoidon joko sädehoitoa tai kemoterapiaa syövän potilaille [24]. Siksi etsiä uusi hoitostrategia kohdistaminen CSCS toivottavasti antaa meille uusia terapeuttisia lähestymistapoja. Esillä olevassa raportissa, me ensin osoitti ALA-PDT tarjosi terapeuttisen vaikutuksen HNC-CSCS estämällä CSCS kaltaisia ​​ominaisuuksia pään ja kaulan alueen syöpä, kuten stemness allekirjoitus, muuttoliike kyky, ja chemoresistance. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa kriittisen roolin ALA-PDT-pohjainen terapia kohdentamisessa HNC johdettuja CSC kaltaisia ​​soluja ja estää HNC-CSCS välittämää kasvain aloittamaan toiminnan.

Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on prosessi kriittinen asianmukaisen sikiön kehityksen ja se on myös uudelleen harjoittaa aikuisilla aikana tuumorigeneesin [25]. EMT on laajalti hyväksytty yhtenä CSCS ominaisuuksista, [26] ja Oct4 /Nanog signalointi on osoitettu olevan osallisena säätelyssä EMT ja etäpesäkkeiden [27]. Suun syöpä epiteelisolujen voi hankkia mesenkymaalisten piirteitä, jotka helpottavat maahanmuuttoa ja hyökkäyksen kautta EMT prosessi. [28] On tunnettua, että EMT voi aiheuttaa solujen kantasolujen ja syövän aloittamista kantasolujen ominaisuuksia, jotka ovat läpikäyneet EMT ovat siksi liikkuvia ja etäpesäkkeitä . [26]. Koska olemme havainneet, että vaikutus ALA-PDT invaasio kyky HNC-CSCS, tutkimalla, onko ALA-PDT välittämää CSCS ja hyökkäys valmiuksia riippuen EMT koulutusjakson tutkitaan tulevaisuudessa.

Kemoterapia nykyisen käyttöjärjestelmän hoitoon HNC potilaita metastasiaa [29]; kuitenkin, kemoterapeuttisen vaikutuksen on rajallinen, ja sen haittavaikutuksia pitkälti häiritä elämänlaatua potilailla. CSCS ovat kliinisesti ominaista resistenssi kemoterapiaa [29]. Läsnäolo CSCS johtaa alhainen tehokkuus syöpälääkkeiden ja epäonnistuminen kasvaimen poistamiseen ja lopulta johtaa kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäkkeiden [30]. HNC-CSCS olivat erittäin resistenttejä kemoterapia [18], ja chemoresistance näiden solujen inhiboitui merkittävästi, kun ne käsiteltiin ALA-PDT. On huomionarvoista, että ALA-PDT-hoito johti vähentyneeseen MDR-proteiinin tasot HNC johdettu CSCS jälkeen chemotreatment. Yksityiskohtaiset mekanismit sääntelyn välisen verkoston ALA-PDT kohtelu lääkeresistenttiä geenejä vaatii lisätutkimuksia.

Yhteenvetona esillä oleva tutkimus osoitti estäviä vaikutuksia ALA-PDT varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia ja chemoresistance in HNC . Erityisesti tässä on suuri tarve purkaa taustalla olevien mekanismien ALA-PDT-välitteinen väylän HNC-CSCS ja arvioitava edelleen terapeuttisia mahdollisuuksia ALA-PDT hoidon kliinisesti.