Krooninen sairaus

tiivistelmä

tyroidihormonireseptorin beeta (

THRB

) geeni on yleisesti vapautettu syövät ja, kuten vahvistettiin eläinmalleissa, oletetut pelata kasvaimen ehkäisevästä rooli. Aikaisemmat tutkimukset paljastivat downregulation

THRB

selvällä solussa munuaissyövän (ccRCC), mutta syyllinen mekanismeja ei ole täysin selvitetty. Koska epigeneettisellä asetus on yhteisen mekanismin vaikuttavia ilmaus tuumorisuppressorien, me arveltu, että downregulation

THRB

munuaisten syöpä johtuu epigeneettiset aberrances, mukaan lukien CpG metylaatio ja microRNA riippuvaa hiljentäminen. Tutkimuksemme osoitti, että ccRCC kasvaimia osoitti 56%: n lasku

THRB

ja 37%: n nousu DNA metyylitransferaasi 1 (DNMT1) ilmentyminen verrattuna pariksi ei-neoplastisia kontrollinäytteitä. Kuitenkin

THRB

CpG metylointianalyysi suoritetaan käyttämällä BSP, snapshot ja MSP-PCR paljasti johdonmukaisesti ei muutoksia metylaation välinen Hyväksytty kasvain ja kontrollinäytteitä.

In silico

analyysi johti tunnistamiseen neljä MikroRNA (miR-155, miR-425, miR-592, ja miR-599) mahdollisesti kohdistaminen

THRB

transkriptio. Lusiferaasianalyysissä osoitti suoran sitoutumisen miR-155 ja miR-425 3’UTR

THRB,

ja myöhemmin in vivo analyyseissä ilmeni, että transfektointi UOK171 solulinjan synteettisellä miR-155 tai miR-425 alensivat endogeenistä

TRHB

22% ja 64%, vastaavasti. Lopuksi, reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti merkittäviä ylössäätely miR-155 (354%) ja miR-425 (162%) vuonna ccRCC verrattuna verrokkeihin. Lisäksi microRNA tasot korreloivat negatiivisesti määrä

THRB

transkriptin kudosnäytteistä. Voimme päätellä, että CpG metylaatio ei ole tärkein mekanismi edistää laski

THRB

ilmentymistä ccRCC. Sen sijaan,

THRB

on kohdistettu MikroRNA miR-155 ja miR-425, jonka lisääntynyt ilmentyminen voi olla vastuussa downregulation

THRB

in ccRCC kasvaimia.

Johdanto-osan: Wojcicka A, Piekielko-Witkowska A, Kedzierska H, ​​Rybicka B, Poplawski P, Boguslawska J, et al. (2014) Epigeneettiset asetukseen tyroidihormonireseptorin Beta Munuaisten Cancer. PLoS ONE 9 (5): e97624. doi: 10,1371 /journal.pone.0097624

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 18 joulukuu 2013; Hyväksytty 23. huhtikuuta 2014; Julkaistu: toukokuu 21, 2014

Copyright: © 2014 Wojcicka et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat National Science Centre myöntää NN401611940 ja NN401047638 (AN), UNESCO /FEBS Collaborative Kokeellinen Scholarship Keski Itä-Eurooppa, 2010 (AW), ja National Science Centre Grant 2012/05 /B /NZ5 /01541 (APW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kilpirauhasen hormonin (TR): TR a ja TRp, ovat ligandia (3,5,3′-trijodityroniinin, T3) indusoitavissa transkriptiotekijöitä, jotka välittävät solujen vaikutuksia kilpirauhashormonien, nimittäin sen aktiivinen muoto – T3 . Koska T3-riippuvainen geeneistä kuuluu lukuisia tärkeitä säätelijöitä solusyklin, kuten MDM2, p53 ja retinoblastooma [1], [2], toimien TR edistävät ylläpitoon keskeisten solun prosessien kuten proliferaatiota, erilaistumista, apoptoosin ja aineenvaihdunta [3]. TR kuuluu 3 toiminnalliset proteiinit: TRα1, TRβ1 ja TRβ2, koodaama

THRA

ja

THRB

geenejä. TRα1 ja TRβ1 ilmentyvät lähes kaikissa kudoksissa, mutta niiden ekspressiotasot ja toimivuus riippuu solutyypistä ja kehitysvaiheen organismin. Häiriintynyt toiminta TR, jotka johtuvat aberrances ilmentymisen tai sekvenssejä koodaavien geenien TR on yleinen ilmiö ihmisen syövissä. Se johtaa häiriintynyt ilmentyminen T3-riippuvaisten geenien ja siten, että vaikeasti heikentynyt solujen homeostaasin. Ne havainnot johtivat hypoteesi kasvaimen tukahduttava rooli TRp edelleen vahvistettu useissa tyylikäs tutkimuksissa solulinjoissa ja hiiri malleja [4], [5].

Yksi syöpien jossa aberrances in TRp toiminto on todettu usein, on yleisin tyyppi munuaisten kasvaimia – kirkas cell munuaissyövän (ccRCC). Mitä mielenkiintoisinta,

THRB

geeni oleskelee 3p21-25 kromosomaalisen alueen, joka tunnetaan innokkaina mutaatioita geenien ccRCC synnyssä [6]. Syyllinen mekanismit tähän mennessä tunnistetuista sisältävät mutaatioita, poikkeava ilme ja vapautuneilla liitos [7], [8], [9].

On osoitettu, että ccRCC mukana epigeneettisellä aberrances jotka voivat suoraan edistävät tuumorigeenisia prosessiin päättää varhaisessa ja precancerous vaihe monivaiheisessa munuaisten tumorigeneesin [10]. Lukuisat viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että epigeneettisellä sääntelyn purkaminen on yksi suurimmista syistä suistui toimien tuumorisuppressorien syövissä, ja useimmin tunnistettu mekanismit ovat DNA metylaatio ja MikroRNA. DNA: n metylaatio koostuu lisäämällä metyyliryhmä on sytosiinin edeltävän guaniini (CpG) DNA-sekvenssi, ja katalysoi DNA: n metyylitransferaaseja (DNMTs): DNMT1, DNMT3A ja DNMT3B. DNMT3A ja DNMT3B ovat

de novo

metyylitransferaasit ilmaistuna vallitsevasti aikana varhaisessa kehitysvaiheessa [11], jotka ylläpitävät vanhempien metylaation. DNMT1 kutsutaan huolto metyylitransferaasi, koska se on vastuussa siitä, että metylaation aikana DNA: n replikaation [12]. Poikkeava metylaatio syövän johtuu heikentynyt ilmentymistä ja toimintaa DNMTs. Syöpäsolut yleensä osoittavat yleistä genomista hypometylaatio, mikä mikrosatelliittien epävakautta ja aktivointi liittyvien geenien metastaattisessa muutokset [13], [14]. Samalla vaikea hypermetylaatiota säätelyalueita kasvaimen supressors, DNA: n korjaukseen ja solusyklin kontrolli geenien johtaa etenemisen syövän [15]. Sillä ccRCC on osoitettu, että lukuisissa tapauksissa vaimentua ilmentymisen VHL tuumorisuppressorin, inaktivoitu n. 50% ccRCC potilaista, johtuvat hypermetylaatiota geenin promoottori [16].

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä RNA: ita, jotka estävät ilmentymistä proteiinia koodaavan geenien sitoutumalla täydentäviä sekvensseille 3’UTRs (Kääntämätön alueet ) niiden selostukset. Sekvenssi vastaa tästä tunnustamisesta kattaa nukleotidit 2-8 on miRNA ja sen on oltava täysin komplementaarinen kohdesekvenssin mRNA [17]. Lukuisia syöpiä esiintyy poikkeava ilmentyminen MikroRNA, mikä johti vakaviin muutoksia transcriptome ja proteomiin syöpäsolun. Sillä ccRCC, useita MikroRNA osoitettiin olevan vapautettiin kasvaimen [18] – [21]. Sekä DNA: n metylaatio ja microRNA -riippuvaisella sääntely on viime aikoina tuonut huomiota kaksi mekanismia suurimmat mahdollisuudet mahdollisimman hoitotoimenpiteiden [22]. On osoitettu, että tuumorisuppressorigeeneille, vaimennettu, koska DNA hypermetylaatio, voidaan aktivoida kanssa demetyloivan aineita. Lisäksi microRNA matkii ja inhibiittorit ovat parhaillaan arvioidaan terapeuttisia molekyylejä, jotka vaikuttavat lupaavilta henkilökohtaisen syöpälääke [23].

rooli epigeneettiset muutokset

THRB

häiriöitä syöpä on tutkittiin harvat tutkimukset. Mahdollista roolia mikroRNA riippuvaisten sääntelyn

THRB

hiljentäminen ehdotettiin varten ccRCC [9] reppu papillaarinen kilpirauhassyövän [24]. Useat muut tutkimukset viittasivat DNA hypermetylaation mekanismina osaltaan

THRB

hiljentämisen leukemiaa ja syöpää rinta-, keuhko-, ja kilpirauhasen [25] – [30].

Nämä tutkimukset sekä usein epigeneettiset sääntelyn purkaminen havaittu ccRCC [31], sai meidät analysoida mahdollisia vaikutuksia DNA: n metylaation ja microRNA riippuvaa asetusta

THRB

ilmentymistä munuaisen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaali

otettiin kudosnäytteet luvalla bioetiikan komitean keskuksen jatko Medical Education Varsovassa potilailla, joilla on selkeät cell munuaissolukarsinooma (ccRCC) (taulukko S1). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. Näytteet jaettiin kahteen ryhmään: syöpäkudoksissa (n = 35, T) ja valvonta kudoksissa (pariksi normaalin kudoksen vastakkaisesta napa pahanlaatuinen munuaisen ( 5 cm kasvain), jossa ei ole histologisia todisteita kasvaimen; n = 35 , C). ccRCC oli diagnosoitu histologisesti mukainen WHO: n kriteerien [32].

Seuraavat solulinjoja käytettiin tutkimuksessa: 1) HK-2 (ATCC nro .: CRL-2190), joka on proksimaalisten tubulusten solulinja normaalista munuaisen, kuolemattomiksi transduktio ihmisen papilloomavirus 16 (HPV-16) E6 /E7-geenit. 2) UOK171 (UOB tuumorisolulinja Repository, tri W Marston Linehan, NIH, NCI, Bethesda, USA, patentti E-033-2010 /0): johdettu IV vaiheessa ccRCC kasvain, spontaanisti kuolemattomaksi. 3) HeLa (ATCC nr CCL-kohdunkaula-adenokarsinooma. Kaikkia solulinjoja viljeltiin mukaan palveluntarjoajan ohjeita.

Reaaliaikainen PCR

-RNA eristettiin ja käänteiskopioitiin, kuten aiemmin on kuvattu [33]. 200 ng RNA: ta käytettiin käänteistranskriptioon. Reaaliaikainen PCR suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [33] käyttämällä spesifisiä alukkeita selostukset

THRB

(THRB-RT-F: GAACAGTCGTCGCCACATC ja THRB-RT-R: GCTCGTCCTTGTCTAAGTAAC) ja

DNMT1

(DNMT1-RT-F: TTATCCGAGGAGGGCTAC ja DNMT1-RT-R: GGCTTCACTTCTTGCTTG). Käänteinen transkriptio ja reaaliaikaisen PCR MikroRNA suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [34] käyttämällä Taq-man-koettimien spesifinen HSA-miR-155 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, kat. no. 002623) ja HSA-miR-425 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, kat. no. 001516). suhteellinen kvantitointi kunkin ilmaistuna miRNA laskettiin käyttäen standardin 2-ACt menetelmällä. assosiaatio microRNA ja

THRB

ilmentyminen kudosnäytteistä laskettiin R ympäristön [35] ja useita korrelaatioanalyysin kaavan mukaisesti:

5-atsa-2’deoxycytidine hoito

UOK-171-solut ympättiin 12-kuoppalevyille (Corning, NY, USA) määränä 5 x 10∧4 kuoppaa kohti. Soluja viljeltiin 24 tuntia vakio-olosuhteissa, minkä jälkeen lisätään 100 mM tai 10 mM 5-atsa-2’deoxycytidine (5-atsa-dC) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA). 24 tunnin kuluttua solut pestiin PBS: llä ja niitä käytettiin RNA: n eristämistä.

Analyysi

THRB

metylointi

metylointianalyysi, käytimme sekvenssin aiemmin julkaistu

THRB

promoottori [36], GenBank Acc. ei. S37458.1), päivitetään sekvenssiin kromosomissa 3 genomisen jatkumon (GenBank Acc. No. NT_022517.18). Koska disconcordance kahden talletettu sekvenssit, me kloonattiin ja sekvensoitiin suoraan DNA-alue, joka käsittää

THRB

promoottori.

Tämän saavuttamiseksi, genomi-DNA eristettiin ei-tuumori- munuaisen näyte kuten aikaisemmin on kuvattu [37]. Alueella, joka sisältää

THRB

promoottori monistettiin käyttämällä alukkeita THRB-Hindlll-PromU (CGTAAAGCTTCATATGGGTAACACTGAGGGCATAGC) ja THRB-Hindlll-PromL (CGTAAAGCTTACTCCTTGGGCGAAGAGAGGC) ja Hot Start Perpetual OptiTaq (EURx, Gdansk, Puola), seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C-10 min., 5 sykliä: [96 ° C-35: n, 62 ° C-30: n, 73 ° C-80 s], 40 sykliä: [96 ° C-40: n, 59 ° C-30 s, 72 ° C-80 s], lopullinen venymä: 72 ° C, 10 min. Saatu PCR-tuote kloonattiin pGEM-T-vektoriin (Promega, Madison, WI, USA) ja sekvensoitiin. Saatu sekvenssi talletettu GenBank (Acc no. KF669869).

Tunnistaa CpG-saarekkeiden, käytimme

in silico

analyysi käyttäen CpG Plot [38] ja CpG Island Etsijä [39], CpG-rikas alue havaittiin sekvenssi käsittää promoottorin ja 5’UTR (eksoni 1) ja TRp transkriptin.

analysoimiseksi metylaatio

THRB

CpG-saarekkeiden, 800 ng genomista DNA: ta oli rajana-muunnetaan Jälki DNA Modification Kit (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) mukaan manufecturer ohjeiden. Ennustaa nukleotidin muutokset johtuvat bisulfiittimassasta muuntamisen,

THRB

sekvenssi oli

in silico

muunnetaan käärmeenlumooja (https://insilico.ehu.es/restriction/two_seq/snake_charmer.html) ja käyttää suunnitteluun alukkeiden.

Jos haluat tehdä bisulfiittimodifiointi-Sequencing PCR (BSP), 100 ng bisulfiitin-muunnetun DNA: ta käytettiin yhdessä Perpetual Taq HOT START (EURx, Gdansk, Puola) polymeraasia ja alukkeita annettuja taulukossa S2, seuraavissa olosuhteissa: alkudenaturaation: 95 ° C, 10 min, 38 sykliä: [denaturointi: 95 ° C-15 s, pariutuminen 56 ° C tai 57 ° C-15 s, venymä: 68 ° C -30 s], lopullinen venymä: 75 ° C, 15 min, lopullinen inkubaatio 4 ° C: ssa. Hehkutus lämpötila vaihteli 56 ° C: sta 67 ° C: ssa, riippuen käytettyjen alukkeiden (taulukko S2). Saatu PCR-tuotteet sekvensoitiin suoraan kaupallinen palvelu (Genomed, Warsaw, Puola).

Metylaatiospesifinen PCR (MSP-PCR) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [26]. Sekvenssit alukkeiden on esitetty taulukossa S3.

SNaPshot analyysi suoritettiin käyttäen SNaPshot Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja alukkeita esitetään taulukossa S3 mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tuotteet analysoitiin kaupallinen palvelu (Biote21, Krakova, Puola).

spesifisyys käytettyjen alukkeiden metylointianalyysi analysoitiin MethPrimer [40].

Analyysi MikroRNA kohdistaminen

THRB

Transcript

MikroRNA mahdollisesti sitova

THRB

3’UTR ennustettiin käyttämällä miRecords ja DIANA-mirPath [41], [42] (taulukko S4). Seuraavaksi PubMed etsittiin löytää tietoa ilmaisun ennustetun MikroRNA in ccRCC. Vain MikroRNA molemmat raportoitu lisääntynyt ilmentyminen munuaisten kasvaimia ja mahdollisesti kohdistaminen

THRB

transkriptio otettiin lisäanalyysiä.

vaikutuksen analysoimiseksi MikroRNA alkuperäisväestöön

THRB

ilme , UOK171-solut ympättiin 12-kuoppalevyille (Corning, NY, USA) käyttäen 5 x 10∧4 solua kuoppaa kohti ja transfektoitiin 24 tunnin kuluttua. Transfektio seos valmistettiin seuraavasti: 1) 2 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) sekoitettiin 125 ui Opti-MEM (Gibco /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), ja 2) 50 pmol microRNA jäljittelee tai estäjien (Ambion /Life Technologies, Foster City, CA, USA, taulukko S5) sekoitettiin 125 ui Opti-MEM. Kun 10 minuutin inkubointi huoneen lämpötilassa liuokset yhdistettiin, inkuboitiin vielä 10 minuuttia, ja lisättiin kuoppiin. 6 tunnin kuluttua transfektion seokset korvattiin täydellä välineellä. 24 tunnin kuluttua solut kerättiin RNA: n eristämistä.

lusiferaasireportteri- määrityksiä, HeLa valittiin alhaisen endogeenisen ilmentymisen MikroRNA (kuvio S1). Solut ympättiin 12-kuoppalevyille (Corning, NY, USA) käyttäen 5 x 10∧4 solua kuoppaa kohti ja transfektoitiin 24 tunnin kuluttua. Transfektio seos valmistettiin seuraavasti: 1) 4 ui PEI 1 ug /ul (polyetyleeni-imiini, Polysciences, Warrington, PA, USA) sekoitettiin 125 ui Opti-Mem, ja 2) 1 ug pGL3-luc-3’UTR-THRB plasmidin (Jazdzewski et al., 2011) sekoitettiin 125 ui Opti-Mem. Vertailukohtana plasmidi, seuraavat seokset valmistettiin: 1) 2 ui PEI 62,5 pl Opti-Mem, ja 2) 100 ng PRL-TK-plasmidia (Promega, Madison, WI, USA) 62,5 ui Opti-Mem. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 20 minuuttia huoneen lämpötilassa liuokset yhdistettiin, inkuboitiin vielä 20 minuutin ajan ja lisättiin kulttuurin kuoppiin, jotka sisältävät 700 ui alustaa ilman FBS: ää. 6 tunnin kuluttua väliaine korvattiin transfektion seokset sisältävät microRNA mimics- valmistettu kuten edellä on kuvattu. Tiedot microRNA matkii ja estäjiä esitetään taulukossa S5. 6 tunnin kuluttua, transfektion seokset korvattiin täydellä väliaineessa; Solut lyysattiin 24 tunnin kuluttua ja analysoitiin Dual Luciferase Reporter Assay (Promega, Madison, WI, USA) käyttäen Synergia 2 luminometria (BioTek, Winooski, VT, USA).

Tulokset

Euroopan Expression of

THRB

ja

DNMT1

muutetaan Munuaisten Cancer

Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin ccRCC ja pariksi ei-tuumori- kontrollinäytteiden paljastanut merkittäviä muutoksia

THRB

mRNA: n ekspression (kuvio 1). Ilmaisu on

THRB

väheni 56% (p 0,0001) tuumoriin verrattuna kontrollinäytteitä. Tämä lasku ekspressio havaittiin 32 ulos 35 (91,4%) analysoitiin pariksi näytteistä.

.

THRB

ja

DNMT1

mRNA ilmaisun kudosnäytteistä: ei-tuumori- valvonta (C, n = 35) ja pariksi ccRCC näytteitä (T, n = 35). Tiedot esitetään prosentteina vertailusta (C). Reaaliaikainen PCR kullekin näytteelle suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Wilcoxonin sopiva pari testiä. **** P 0,0001. B. ilmentyminen

THRB

ja

DNMT1

mRNA solulinjoissa: HK2: proksimaalisten tubulusten solulinja on peräisin normaalin munuaisen, UOK171: ccRCC solulinja on johdettu IV vaiheessa kasvain, spontaanisti kuolemattomaksi. Tontit osoittavat tulokset viidestä riippumattomasta biologisia kokeita, mitattuna kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen t-testiä. ** P 0,01.

Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin cDNA munuaissolulinjoissa vahvisti vähentynyt ilmentyminen

THRB

munuaisten syöpään.

THRB

ilmentyminen oli 63% (p = 0,0036) alempi ccRCC UOK171 solulinjassa, kun verrataan ei-syöpä HK2-solut (kuvio 1).

Aikaisemmat tutkimukset analysoidaan DNA: n ekspression metyylitransferaasi 1 (DNMT1) munuaisten syöpä tuonut ristiriitaisia ​​tuloksia [43] – [45]. Siksi päätimme analysoida

DNMT1

ilmaus tutkimuksessamme. DNMT1 mRNA-tasot olivat lisääntyneet 22 ulos 35 analysoidaan ccRCC näytteistä verrattuna pariksi hallintalaitteet (kuvio 1). Keskimääräinen DNMT1 ilmentyminen tuumorikudoksissa korotettiin 38% verrattuna pariksi ohjaus kudosnäytteistä (p = 0,0098). Solulinjoissa, DNMT1 ilmentyminen kasvoi 27% vuonna UOK171 verrattuna ei-tumorous HK2 solulinja (p = 0,0059).

Nämä tulokset viittaavat siihen, lisääntynyt

DNMT1

tasot ccRCC näytteissä voi mahdollisesti johtaa kohonnut CpG metylaatio johtaa downregulation

THRB

ilme.

Analyysi

THRB

CpG-metylaation Munuaisten Cancer

Voit tarkistaa, onko väheni

THRB

ilmentyminen voi johtua CpG hypermetylaatio, UOK171 soluja viljeltiin läsnä ollessa tai puuttuessa DNMT1 inhibiittoria, 5-atsa-dC. Hoito 5-atsa-dC johti tilastollisesti merkitsevä (p = 0,0124), 37%: n kasvu on

THRB

ilmaisu verrokkiin verrattuna, käsittelemättömät solut (kuvio 2A).

. Vaikutus 5-atsa-2 ’deoksisytidiini (5-atsa-dC) on

THRB

mRNA: n ekspression UOK171 solulinjassa. Tulokset on esitetty prosentteina vertailusta (soluja viljeltiin ilman 5-atsa-dC täydentämistä). Juoni näyttää tulokset kolmen itsenäisen biologisen kokeissa mitattiin kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen t-testiä. * P 0,05. B. sekvenssi

THRB

geenin promoottorialue (GenBank Acc.no. KF669869). CpG-saarekkeen, joka käsittää promoottorin ja 1

st eksoni (alue -873-355) varjostaa sininen. TATA-boksi on lihavoitu. CpG-dinukleotidit on varjostaa harmaa. Pienet kirjaimet osoittavat 1

st eksonin TRp transkriptio. C. edustaja elektroforeettisen analyysin MSP-PCR. U: saadut PCR-tuotteet alukkeilla erityisiä metyloimatonta sekvenssi; M: saadut PCR-tuotteet alukkeilla spesifisiä metyloiduksi järjestyksessä. C: kontrollinäytteitä, T: kasvain näytteet.

Voit selvittää, onko palauttaminen

THRB

ilmentymistä munuaisen syöpä on suoraan säätelee promoottori metylaation,

THRB

sekvenssit analysoitiin CpG Plot ja CpG Island Searcher. Molemmat ohjelmat ennusti CpG-rikkaan alueen sisällä promoottorin ja 5’UTR

THRB

geenin, joka käsittää nukleotidit -873-355 (kuvio 2B). Seuraavaksi ennustettu alue analysoitiin käyttäen bisulfiitin sekvensointia PCR (BSP). Tätä varten DNA-näytteet 15 paria ccRCC kudosten ja vastaavat ei-tuumori- kontrolli munuaisten näytteet bisulfiitti-muunnetaan ja sekvensoitiin suoraan. Tehokas bisulfiitti muuntaminen varmistettiin PCR-reaktioissa käyttämällä alukkeita suunniteltu kohde native

THRB

promoottori eikä täydentää bisulfiitin muunnetun DNA. Ohjaus monistusreaktioita suoritetaan bisulfiitin muunnetun DNA ei tuottanut mitään monistustuotetta (kontrolli alukesekvenssit on esitetty taulukossa S2). Tämä analyysi paljasti puute eroja metylaatiovyöhykkeiden välillä pariksi ohjaus ja kasvaimen näytteitä samasta potilaasta (kuvio S2). Todentaa tulokset BSP, Bisulfiitilla muunnetaan DNA analysoidaan lisäksi käyttämällä SNaPshot ja MSP-PCR, joka on erittäin herkkä menetelmä mahdollistaa havaita 0,1% metyloituja alleeleja tietyssä CpG-saarekkeen lokuksen [46] (kuvio 2C). Nämä analyysit vahvistivat, että ei ollut muutoksia CpG metylaatiovyöhykkeiden ccRCC näytteissä verrattuna pariksi kontrollinäytteitä. Mielenkiintoista, MSP-PCR tulokset viittasivat siihen, että metylaation vaihteli eri potilailla, on melko potilaskohtaista kuin vaikuttavat sairauden tila.

Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikka muutokset DNMT1 toiminta voi edistää korjauksilla

THRB

ilmentymistä soluviljelmissä, häiriintynyt ilmentyminen

THRB

in ccRCC kudosnäytteistä on melko ole seurausta poikkeavasta, kasvain-spesifisen hypermetylaatiota geenin promoottori.

MikroRNA miR-155 ja miR-425 Suoraan Target

THRB

3’UTR

ennustaa MikroRNA mahdollisesti vaikuttavia

THRB

ilmentymistä munuaisen syöpään, kaksivaiheinen analyysi. Ensinnäkin, bioinformatiikan analyysi käyttäen miRecords (resurssi, joka yhdistää 11 bioinformatiikka ohjelmat) ja Diana-mirPath ennustetaan lähes 600 MikroRNA mahdollisesti kohdistaminen

THRB

3’UTR. Kuitenkin perustuu oletukseen, että hiljentäminen hyötysuhde on korkein MikroRNA jotka sijaitsevat lähimpänä kumpaankin päähän 3’UTR [47] me keskittyy erityisesti MikroRNA joka noudatti tätä sääntöä. Myöhemmät toimialalla PubMed sallittua valintaa MikroRNA jotka ilmoitettiin yli-ilmentyy munuais- syöpä [18] – [21]. Käyttämällä kaksivaiheisen lähestymistavan, neljä MikroRNA (miR-155, miR-425, miR-592, ja miR-599) valittiin lisäanalyysiä.

Jotta löydettäisiin onko valittu MikroRNA todellakin sitovasti 3’UTR

THRB

, HeLa-solut transfektoitiin käyttäen synteettisiä MikroRNA ja reportteri rakentaa pGL3-luc-3’UTR-

THRB

(kuvio 3). HeLa-solut valittiin tähän analyysiin alhaisen endogeenisen ilmentymisen

THRB

ja analysoitiin MikroRNA. Solujen transfektio pre-miR-155 tai pre-miR-425 aiheutti 32%: n tai 17%: n lasku lusiferaasin aktiivisuuden, vastaavasti, verrattuna ohjaus miRNA jäljittelee (p 0,001). Ei muutoksia lusiferaasiaktiivisuuden havaittiin transfektoiduissa soluissa ennalta miR-592 tai pre-miR-599. Pre-miR-221, aiemmin raportoitu kohdistaa

THRB

3’UTR [25], käytettiin positiivisena kontrollina ja vahvisti tehokkuutta miRNA-välitteisen hiljentäminen (kuva 3).

. Vaikutus mikroRNA jäljittelee aktiivisuudesta lusiferaasin ilmennetään reportteri pGL3-luc-3’UTR-THRB. HeLa-solut transfektoitiin käyttäen reportteriplasmidilla ja vastaavat microRNA jäljittelee: pre-miR-155, pre-miR-425, pre-miR-599, tai pre-miR-221. Tulokset on esitetty prosentteina kontrollista (Ctrl, transfektoitujen solujen ei-kohdistuksen pre-miR). Juoni näyttää tulokset kolmen itsenäisen biologisen kokeissa mitattiin kolmena rinnakkaisena. Suhteellinen aktiivisuus tulikärpäsen lusiferaasi normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen ANOVA, jota seuraa Dunnettin monivertailukoetta. *** P 0,001. B. Vaikutus miR-155 ja miR-425 endogeenisten

THRB

ilmentymistä munuaissyöpäsoluissa. UOK171 solut transfektoitiin käyttäen vastaavia microRNA jäljittelee (pre-MIRS) tai inhibiittorit (anti-Mirs), ja

THRB

mRNA: n ekspressio analysoitiin käyttäen reaaliaikaista PCR: llä. Tulokset on esitetty prosentteina vertailusta (transfektoiduissa soluissa ei-kohdistuksen pre-miR). Tontit esitetään tulokset kolmen itsenäisen biologisen kokeissa mitattiin kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen ANOVA, jota seuraa Dunnettin monivertailukoetta. * P 0,05, *** p 0,001. C. ilmentyminen miR-155 ja miR-425 nontumorous valvonta (C, n = 35) ja pariksi ccRCC kudosnäytteet (T, n = 35). Tulokset on esitetty prosentteina vertailusta. Reaaliaikainen PCR kullekin näytteelle suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Wilcoxonin sopiva pari testiä. * P 0,05, ** p 0,01.

miR-155 ja miR-452 vaikutus

THRB

ilmentäminen munuaissyöpäsoluissa

myöhemmin analysoida vaikutus miR-155 ja miR-425 endogeenisen

THRB

ilmaisu, munuaissyövän johdettu UOK171 solulinja transfektoitiin käyttämällä joko microRNA jäljittelee (pre-miR-155 tai pre-miR-425) tai microRNA estäjät ( anti-miR-155 tai anti-miR-425) (kuvio 3). Transfektio tilastollisesti merkitsevä lasku

THRB

ilmentymistä 22% edeltävään miR-155, p 0,05, ja 64% edeltävän miR-425, p 0,001, verrattuna ohjaus microRNA (kuvio 3). Transfektio solulinjojen kanssa microRNA estäjien ei aiheuttanut tilastollisesti merkittävää muutosta

THRB

ilmentymistä, vaikka suuntaus lisääntynyt ekspressio havaittiin (kuvio 3). Tämä havainto voi johtua siitä, että tasot miR-155 ja miR-425 ovat erittäin koholla UOK171 solulinjassa, mikä inspite lukuisia testatuissa pitoisuuksissa, määrä mikroRNA estäjät voivat olla riittämätön tehokkaaseen estäminen mikroRNA toimintaa.

Nämä tutkimukset ehdotti, että miR-155 ja miR-425 suoraan vaikuttaa

THRB

ilmentymistä munuaissyöpäsoluissa.

Expression of miR-155 ja miR-425 on koholla munuaisten Cancer ja korreloivat alentuneen ilmentäminen

THRB

jotta onko kasvainspesifisen muutokset miR-155 ja miR-425 voi vaikuttaa

THRB

ilmentyminen ccRCC kasvaimissa, ilmentyminen sekä MikroRNA analysoitiin 25 ccRCC kudosnäytteistä ja 25 vastaavat ei-tuumori- munuaisten näytteet (kuvio 3). Ilmaisu Molempien MikroRNA oli tilastollisesti merkittävästi (354%, p = 0,0072 Mir-155 ja 62%, p = 0,041 Mir-425). Samalla ilmaus molempien Mirs negatiivisesti korreloi ilmaus

THRB

. Vaikka korrelaatiokerroin oli heikko (R = 0,245, p = 0,0075) kontrollinäytteissa, korrelaatio oli huomattavasti vahvempi kasvaimet (R = 0,469, p = 0,0225). Samanaikaisesti oli myös merkittävä korrelaatio T /N suhde miRNA ja

THRB

lauseke (R = 0,396, p = 0,002). Nämä tulokset osoittavat, että

THRB

ekspressiotasot riippuvat miR-155 ja miR-425 ilmentymisen ja vapautuminen Mirs liittyy madallettu

THRB

tasoilla ccRCC (kuva S3).

keskustelu

tässä tutkimuksessa kolmella eri menetelmällä, osoitimme, että analysoidut näytteet munuaissyövän poikkeavien

THRB

ilmaisua ei johdu kasvain-erityisiä muutoksia DNA metylaatio

THRB

promoottorialueen. Pikemminkin ilmaus

THRB

vuonna ccRCC vaikuttaa MikroRNA, miR-155 ja miR-425, joka suoraan sitoutuvat

THRB

3’UTR, ehdottivat havainto, että kohonnut ilmentyminen nämä MikroRNA in ccRCC mukana downregulation

THRB

.

hypermetylaatiota

THRB

promoottori raportoitu useissa kasvaimet, mukaan lukien rinta-, kilpirauhasen ja keuhkosyövässä ja leukemia [25 ] – [30]. Mielenkiintoista, tutkimukset osoittivat, että metylaatio hinnat

THRB

vaihtelivat suuresti potilaiden joukossa, koska hypermetyloitunut

THRB

havaittiin 25-80% analysoiduista kasvaimia. Lisäksi vain puolet tutkimukset

THRB

metylaatio suoritettiin sekä kasvaimen ja pariksi ei-tumorous kontrollisilkkipaperia. Iwasaki et ai. tutkittiin 116 ei-pienisoluisen keuhkosyövän, mukaan lukien 6 näytettä, joiden pareittain vierekkäiset ohjaus kudosta analysoitiin. Niistä 116 kasvain näytteet, 54 paljasti hypermetylaatiota

THRB

. Kun 6 pariksi kasvain versus kontrolli näytteitä verrattiin,

THRB

metyloitiin kaikissa kasvaimia ja metyloitumaton kaikissa ei-tumorous kontrollinäytteitä. Kahdessa muussa tutkimuksessa analysoidaan rintasyöpä kasvaimia ja solulinjoissa [25], [29] hypermetyloitunut

THRB

havaittiin 80% -100% kasvaimista ja C. A. 37%: pariksi näytteistä. Lisäksi aste ja rakenteessa metylaation vaihteli näytteiden peräisin eri potilailla. Samanlaisia ​​välinen vaihtelu havaittiin myös tutkimuksessa suoritettiin kilpirauhasen kasvaimia [30], jossa pariksi normaalissa kudosnäytteet ole saatavilla ja siksi ei analysoitu. Tutkimuksemme osoitti myös, että

THRB

metylaatio merkittävästi vaihdelleet kudosnäytteitä peräisin eri potilailla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että puute pariksi ei-tuumori- kontrollinäytteiden voi johtaa harhaa ja aiheuta luokitusta potilaan-erityinen vaihtelut

THRB

Metylointia muutokset spesifinen syöpäkudoksessa.

Vaikka

THRB

ilmaisua ei näyttänyt olevan vaikutusta DNA: n metylaation meidän munuaisten syövän näytteitä, hoitoon UOK171 solulinja 5-atsa-2 ’deoksisytidiinin lisännyt ilmentymisen

THRB

geenin. Tämä viittaa siihen, että

THRB

ilmentäminen voidaan epäsuorasti vaikuttaa DNMT1 aktiivisuutta. Aiempien tutkimusten DNA metylaatio voi välillisesti vaikuttaa transkriptioon kohdegeenin useita mekanismeja [48] lukien geenisäätelyn jonka aktivoida transkriptiotekijä tai signaalinvälitysreitin, joka vaikuttaa DNA: n metylaatio. Mitkä näistä mekanismeista voi vaikuttaa

THRB

ilmentymistä munuaisen syöpä ei tällä hetkellä tiedetä. Lisäksi emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että muissa ccRCC potilaiden ja muissa ccRCC solulinjat,

THRB

promoottori metylaatio saattaa vaikuttaa

THRB

ilme. Tämä toivottavasti tulee todentaa tulevaisuudessa tutkimuksia ccRCC.

Toinen epigeneettiset mekanismi, joka vaikuttaa ilmaus kohdegeenien on microRNA riippuva säätely ilmaisun [49]. Yksittäinen geeni voidaan kohdistaa useita MikroRNA ja yhden microRNA voi säädellä lukuisia kohdegeenien. Tämän seurauksena vapautuminen miRNA ilmaisua, joka liittyy lukuisiin syöpiin johtaa vakavaan solun proteomista ja transcriptome. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin kaksi MikroRNA jonka suorasta sitoutumisesta

THRB

3’UTR vahvistettiin lusiferaasianalyysissä suoritettiin HeLa-solulinjassa, käytetään johtuen suhteellisen alhainen ekspressiotasoja sekä analysoidaan miRNA.