Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tetrandrine, bis-benzylisoquinoline eristetty alkaloidi kuivatusta juuresta Hang-Fang-Chi (

Stephania

tetrandra

S. Moore), on raportoitu omaavan anti-cancer vaikutuksia moniin kasvaimia. Tässä tutkimuksessa selvitettiin tetrandrine indusoiman apoptoosin ihmisen mahasyövän BGC-823-solujen

in vitro

ja

in vivo

. Tulokset osoittivat, että tetrandrine esti merkitsevästi solujen elinkelpoisuuden annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla ja indusoi apoptoosin. Se lisäsi apoptoosia; säätelyä Bax, Bak, ja Bad; ja downregulation Bcl-2 ja Bcl-XL BGC-823 soluja. Lisäksi tetrandrine lisäsi kaspaasi-3 ja -9, vapautuminen sytokromi

c

, ja säätelyä Rahastolla-1, mikä viittaa siihen, että tetrandrine: n indusoiman apoptoosin, jotka liittyvät mitokondrioiden kautta. Samaan aikaan esikäsittely yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä z-VAD-fmk in BGC-823-solujen vähensi tetrandrine aiheuttaman apoptoosin estämällä kaspaasien aktivaatio. Lisäksi tetrandrine esti kasvaimen kasvua kautta apoptoosin induktion, joka varmennettiin immunohistokemiallista analyysiä nude hiiren ksenograftimallissa. Yhdessä me päätellä, että tetrandrine merkittävästi inhiboivat mahasyövän BGC-823-solujen avulla mitokondrioita-riippuvaista apoptoosia, joka voi olla lupaava rooli mahalaukun syövän hoidossa.

Citation: Qin R, Shen H, Cao Y, Fang Y, Li H, Chen Q, et al. (2013) Tetrandrine indusoi Mitochondria-välitteistä apoptoosia in Human mahasyövän BGC-823 solut. PLoS ONE 8 (10): e76486. doi: 10,1371 /journal.pone.0076486

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 joulukuu 2012; Hyväksytty: 27 elokuu 2013; Julkaistu: 01 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Qin et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat seuraavat avustukset: avustuksina, National Natural Science Foundation of China (81070423 ja 81101677), avustuksina, Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (BK 2010332). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kiinassa, mahasyöpä, yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia, jotka johtuvat kertyminen geneettiset ja epigeneettiset tapahtumat, on edelleen korkea esiintyvyys ja kuolleisuus [1-3]. On olemassa useita tekijöitä, jotka aiheuttavat puhkeamista mahasyövän, kuten

Helicobacter pylori

infektio, ruokavalio, tupakointi, ja niin edelleen. [4] Olosuhteista riippuen, useimmat potilaat mahalaukun syövän tarvitse leikkausta, kemoterapiaa ja /tai sädehoitoa [5]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että mahasyöpä on monimutkainen geneettinen sairaus liittyvät oncogenes tai tuumorisuppressoreilla [6].

Tetrandrine (C

38H

42N

2O

6, MW 622,730 ) on bis-benzylisoquinoline eristetty alkaloidi kuivatusta juuresta Hang-Fang-Chi (

Stephania

tetrandra

S. Moore). Äskettäin erilaisia ​​biologisia aktiivisuuksia tetrandrine on tutkittu intensiivisesti, koska sen laaja käyttö niveltulehdus, rytmihäiriöt, tulehdus, silikoosi, erilaisten kasvainten, ja reverse monilääkeaineresistenssi [7,8]. On todettu, että tetrandrine tuntuvia vaikutuksia kasvainten myös hidastaa kasvaimen kasvua ja lisäämällä eläinten elinaika ja eloonjäämisaste [9-12]. Tetrandrine aiheuttaa G1 solusyklin salpaaminen ja indusoi apoptoosia erilaisissa solutyypeissä. Kuitenkin tarkka mekanismeja, joilla tetrandrine käynnistää apoptoosin ja estää solukasvua mahakasvaimen soluista on epäselvä [13]. On todettu, että codelivery paklitakselin (Ptx) ja tetrandrine mukaan nanopartikkelit voidaan tehokkaasti parantaa sytotoksisuuden Ptx peräkkäisellä estämällä ROS-riippuvaisen Akt-reitillä ja aktivointi apoptoottisten reittien perusteella hapettumista hoidon vastaan ​​mahasyövän [14]. Kuitenkin, kuten terapeuttisena aineena, Ptx väistämättä on vakavia sivuvaikutuksia, koska se epäspesifinen toksisia vaikutuksia ja erityisiä liuottimia, ja kasvainsolujen voi tulla vastustuskykyisiä Ptx: n indusoiman apoptoosin [15-17]. Aikaisempi tutkimus on osoittanut, että tetrandrine on synergistinen vaikutus kemoterapia-aineiden apoptoosiin mahasyövän solulinjojen [18]. Lisäksi johdannainen (H1) on tetrandrine kykenee hyvä anti-monilääkeresistenttisyyden aktiivisuus aloittamalla luontainen apoptoosireittiä ja inhiboimaan aktivaation Erk1 /2 ja Akt1 /2 [19]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että tetrandrine voisi korvata Ptx kuin ensimmäinen rivi kemoterapiaa mahasyövän.

Koska tetrandrine on suuret mahdollisuudet syövän hoitoon, on tärkeää tutkia järjestelmällisesti ymmärtää sen mekanismin. Siksi tässä tutkimuksessa olemme tutkineet mahdollisia mekanismeja tetrandrine ihmisen mahalaukun syöpäsoluja

in vitro

ja

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit ja reagenssit

Tetrandrine saatiin Jiangxi Yintao Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, Kiina). Vasta-aineet saatiin seuraavista lähteistä: vasta-aineita Bcl-2, Bax, Bcl-xl, Caspase-3, -8, -9, sytokromi

c

, Rahastolla-1, ja β-aktiini olivat Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); anti-Bad ja Bak olivat Bioworld Technology (St. Louis Park, MN, USA). Trizol reagenssipakkauksen ostettiin Invitrogen (Grand Island, NY, USA). MTT (3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Soluviljelmä

ihmisen mahalaukun syövän solulinja BGC-823 ostettiin Shanghai Cell Biology, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT, USA), 1% penisilliiniä ja 1% streptomysiiniä on kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Lyhyesti, solut siirrostettiin 96-kuoppalevyille tiheydeksi 1 x 10

4 solua /kuoppa. 36 tunnin kuluttua solut käsiteltiin tai ei tetrandrine eri pitoisuuksina 24, 48, ja 72 h; ja fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) toimi negatiivisena kontrollina. Sitten, 20 pl MTT-väriliuosta (0,5 mg /ml, liuotettiin PBS: ään ja suodatettiin 0,2 mm: n kalvo) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Sen jälkeen 150 ui dimetyylisulfoksidia lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 10 min. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä käyttäen 96-kuoppalevyn lukijaa. IC

50-arvo määritettiin lääkeaineen pitoisuus, joka estää 50% solukasvua kontrolliin verrattuna.

Western blotting

Mahasyöpää solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja sitten 100 ui RIPA Lysis Buffer (Beyotime, Kiina) lisättiin kuhunkin kuoppaan hajottamaan soluja, noin 20 min. Seuraavaksi seosta sentrifugoitiin 12000

g

15 min, ja supernatantti otettiin talteen. Proteiinipitoisuus havaittiin käyttäen BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonaisproteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla 8%, 10%, ja 12% polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin elektroforeettisesti päälle polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA). Blokkauksen jälkeen 2 tuntia tai yön yli 5% rasvatonta kuivamaitoa (liuotettuna Tris-puskuroitu suolaliuos, Tween 20 -puskurilla, TBST: ssä), membraaneja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (1: 500-1: 1000-laimennos) 2 h huoneen lämpötilassa tai yön yli 4 ° C: ssa ja pestiin sitten kolme kertaa TBST: llä (5 mM Tris-HCl, pH 7,4, 136 mM NaCl, 0,1% Tween 20) ennen reagoimaan piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua sekundaarisia vasta-aineita (1: 5000 -1: 10000) 1 h huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa 10 minuuttia kutakin TBST: llä, kalvoja käsiteltiin ECL Western-blottaus Detection Reagent.

Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

Solun kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia ( Invitrogen) noudattaen valmistajan protokollaa ja liuotettiin DEPC-käsiteltyyn veteen. Konsentraatio kokonais-RNA mitattiin UV-absorbanssilla spektroskopialla. Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas MBI, Waltham, MA, USA) valmistajan protokollan. Juuri syntetisoitu cDNA monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (Fermentas). Sekvenssit kutakin aluketta käytettiin tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa 1. Polymeraasiketjureaktio olosuhteet on lueteltu seuraavasti: 95 ° C 3 min, 95 ° C 5 min, 58 ° C: ssa 30 min, ja 72 ° C: ssa 30 min, jota seurasi 40 sykliä 94 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C 1 min. Kaikki testit suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Gene

Sense-aluke (5 ’: sta 3’) B-Antisense-aluke (5 ’ 3’)

bcl-2GGATCCAGGATAACGGAGGCCCAGATAGGCACCCAGGGTbaxACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTACAAACATGGTCACGGTCTGCbclxlGGCAGGCGACGAGTTTGACCCATCCCGGAAGAGTTCATβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCATable 1. sekvenssit alukkeiden geenien käytettiin tässä tutkimuksessa.

CSV Lataa CSV

anneksiini V-propidiumjodidilla sitoutumismääritys

Lyhyesti, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin eri pitoisuudet tetrandrine 24 tuntia, ja PBS toimi negatiivisena kontrollina. sen jälkeen solut suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan kylmää sitovaa puskuria. Solususpensiot värjättiin vastaan ​​anneksiini-V: n ja propidiumjodidilla (BD Pharmingen

TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) valmistajan ohjeiden ja sitten virtaussytometria-analyysi suoritettiin FACS (Coulter, Becton Dickinson).

kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys

Lyhyesti, solut inkuboitiin 6-kuoppalevylle pitoisuutena 4 x 10

5 /kuoppa ja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden huumeita. Yhtä suuri tilavuus PBS: ää käytettiin negatiivisena kontrollina. kaspaasi-3-aktiivisuus mitattiin käyttäen kaspaasi-3-aktiivisuus määritys kit (Beyotime, Kiina) seuraten valmistajan ohjeita. Absorbanssi mitattiin sitten 405 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

Ethics selvitys

Menettelyt, joissa käytetään eläimiä ja niiden hoito tehtiin mukaisesti NIH suuntaviivojen (NIH Pubi. No.85-23, tarkistettu 1996) ja oli hyväksynyt Animal Care ja käyttö komitea Affiliated kansan sairaalassa, Jiangsu yliopisto.

Eläinkokeet

Nainen karvattomia hiiriä (BALB /c nu /nu), 4-6 viikon ikäisiä, saatiin Experimental Animal Center of Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina) ja pidettiin erityinen patogeenivapaissa olosuhteissa biologisessa kaappiin laboratoriossa Animal Facility Jiangsu University. Eläimiä pidettiin 12 tunnin valo-pimeä sykli. Huoneen lämpötila pidetään noin 20 ° C, ja kosteus pidettiin noin 50% huoneen suodatetun tuloilman.

Tetrandrine hoidossa ihonalaisen BGC-823 hiirissä

Muodosta BALB /c-hiiren ksenograftimallissa ihmisen mahasyöpä, BGC-823-soluja pitoisuutena 5,0 x 106/150 ui injektoitiin oikeaan kylkeen kunkin BALB /c-nude-hiiri. Noin 10 päivää myöhemmin (kasvaimen koko saavutti 120-150 mm3) nude-hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään (N = 5) ja annetaan seuraavista hoidoista: ohjaus (käsitelty normaalilla suolaliuoksella), matalan annoksen ryhmässä (hoidettiin 40 mg /kg tetrandrine), ja suuren annoksen ryhmän (hoidettiin 120 mg /kg tetrandrine). BALB /c-hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti tetrandrine (200 ui, 40 mg /kg tai 120 mg /kg) tai yhtä suuri tilavuus fysiologista suolaliuosta, kerran päivässä 3 viikkoa, vastaavasti. Kasvaimen koko mitattiin joka 3. päivä kahdessa kohtisuorassa mitat noniusmittaharppia, ja kasvaimen tilavuus (TV) laskettiin kaavalla: TV = pituus (mm) x leveys

2 (mm

2) x 0,5 . Suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV) laskettiin seuraavan kaavan mukaan: RTV = TV

t /TV

0, jossa TV

0 on tuumorin tilavuus päivänä 0 ja TV

t on kasvain volyymi tiettynä päivänä t. Samaan aikaan, eläimet punnittiin kahdesti viikossa. Lopussa kokeen, kasvaimet leikattiin irti ja kiinnitettiin formaliiniin lisäanalyysiä.

immunohistokemiallinen analyysi

parafinoidut näytteet leikattiin BGC-823 nude-hiiriin värjättiin käyttäen seuraavia vasta-aineita : Bcl-2: n ja Bax (Boster), Bcl-xl, aktivoitu kaspaasi-3, ja aktivoitu kaspaasi-9 (Santa Cruz) immunohistokemiaa varten. Kuvat otettiin fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss).

Tilastollinen

Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa, ja kaikki tiedot esitettiin keskiarvoina ± keskihajonta (SD). Tilastollisia eroja määritettiin yksisuuntaisella ANOVA: lla käyttäen SPSS 16.0 ohjelmistoa. P-arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Sytotoksinen vaikutus tetrandrine on BGC-823 solut

kemiallinen rakenne tetrandrine on esitetty kuviossa 1A. Anti-proliferatiivista vaikutusta tetrandrine tutkittiin BGC-823-soluihin käyttäen MTT-määritystä. Kuten kuviossa 1B on esitetty, solut käsiteltiin 24, 48, ja 72 h eri pitoisuuksilla tetrandrine. Tetrandrine havaittiin merkitsevästi estävän kasvua BGC-823 solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. BGC-823-solut olivat merkittävästi inhiboi tetrandrine 10 ug /ml (

P

0,05). IC

50-arvo oli 6,104 ± 0,786, 4,471 ± 0,650 ja 3,744 ± 0,573 seuraavat 24, 48, ja 72 h tetrandrine hoitoa, vastaavasti. Näin ollen, 6, 8, ja 10 ug /ml määritettiin edustajana pitoisuudet seuraavat tutkimukset.

(A) kemiallinen rakenne tetrandrine. (B) Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määritys, ja BGC-823-soluja käsiteltiin eri pitoisuus tetrandrine 24, 48 ja 72 tuntia, vastaavasti. Inhibition määrä kontrolliryhmässä oli asetettu 0. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001 kontrolliryhmään verrattuna, vastaavasti.

induktio apoptoosin tetrandrine

Tetrandrine-välitteisen syövän kykyjä on raportoitu liittyvän apoptoosin [9-12]. Näin ollen tutkimme kyky tetrandrine indusoiman apoptoosin BGC-823-soluja käyttämällä virtaussytometria määrityksessä. Mitattuna virtaussytometrialla, vaikutukset tetrandrine on BGC-823 solujen apoptoosin on esitetty kuviossa 2A ja B, jossa 24-h tetrandrine hoidot 0, 6, 8, ja 10 ug /ml tuloksena 4,35%, 11,4% , 17,72%, ja 32,34% apoptoottisten solujen, vastaavasti, ja tetrandrine (8 ug /ml) 0, 12, 24, ja 48 h tuloksena 3,4%, 6,64%, 19,15%, ja 25,85% apoptoottisten solujen, vastaavasti (kuvio 2C ja D). Nämä tiedot osoittivat selvästi, että tetrandrine indusoi apoptoosia BGC-823 solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Numerot apoptoottisten solujen lisääntynyt yhdessä tetrandrine pitoisuus ja hoitoaika.

PI-anneksiini V-FITC: llä sitoutumisen määritystä käytettiin havaitsemaan apoptoosia BGC-823-soluja. (A) Soluja käsiteltiin tetrandrine 24 h 0, 6, 8, ja 10 ug /ml. (C) Soluja käsiteltiin 8 ug /ml tetrandrine 0, 12, 24, ja 48 h. (B, D) Pylväät edustavat keskiarvoja ± SD apoptoottisten solujen saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. **

P

0,01; ***

P

0,001 kontrolliryhmään verrattuna.

Tetrandrine-välitteisen ilmentymisen Bcl-2-perheen jäsenten

tutkimiseksi tarkemmin mekanismi apoptoosin induktion in BGC-823-soluihin tetrandrine, havaitsimme ilmaus apoptoosin liittyvien proteiinien Western-blottauksella ja niiden mRNA tasolla reaaliaikaisen (RT) -PCR. Tässä tutkittiin ekspressiota Bax, Bad, Bak, Bcl-2 ja Bcl-XL BGC-823-soluja käsiteltiin tetrandrine. 24 tunnin kuluttua altistumisesta tetrandrine, Bax, Bad, ja Bak-proteiinin ekspressio oli annoksesta riippuvaa kasvoi, kun taas Bcl-2 ja Bcl-XL-proteiinin ekspressio oli annoksesta riippuvaa laskua (kuvio 3A). Olemme myös havainneet, että tetrandrine voisi upregulate ilmaus Bax ja säätelevät vaimentaen ilmentymistä Bcl-2: n ajan riippuvalla tavalla (kuvio 3B). Sen määrittämiseksi, onko tetrandrine vaikuttaa geenin transkription bcl-2, Bcl-x L, ja bax, niiden mRNA: n ekspressio tutkittiin RT-PCR: llä (kuvio 3C). RT-PCR-tulokset osoittavat selvästi yhtenevät esitetty kuviossa 3A.

(A) Western blot -analyysi ekspression apoptoosiin liittyvien proteiinien BGC-823-soluja käsiteltiin 6, 8, ja 10 ug /ml tetrandrine 24 tuntia. (B) Western blot-analyysi bcl-2 ja bax käsiteltiin 8 ug /ml tetrandrine 12, 24, 48, ja 72 h. (C) vaikutukset tetrandrine on ekspressiotasot bcl-2, Bcl-x L, ja bax määritettiin käyttäen reaaliaikaista PCR: llä (1), ohjaus (2) 6 ug /ml (3) 8 ug /ml (4) 10 ug /ml. p-aktiinin ilmentymistä käytettiin sisäisenä kontrollina. Tiedot ilmoitetaan keskiarvoina ± SD vähintään kolmen kokeen. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001 verrattuna kontrolliryhmään.

Tetrandrine aiheuttaman apoptoosin kautta mitokondriaalisen väylän BGC-823 solut

Tutkitaan onko tetrandrine aiheuttama apoptoosi liittyy kaspaasi jäsentä, mittasimme ilmentymistä kaspaasien in BGC-823-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla tetrandrine Western-blottauksella. Tulokset osoittivat annoksesta riippuvaista nousua pilkottiin kaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-9 tetrandrine- käsitellyissä soluissa (kuvio 4A). Kuitenkin nondetectable tasot katkaistun kaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-9 havaittiin solujen puuttuessa tetrandrine hoitoon (tietoja ei esitetty). Edelleen merkityksen määrittämiseksi kaspaasin aktivaation tetrandrine: n indusoiman apoptoosin, BGC-823-soluja esikäsiteltiin pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk (10 gM) ja 4 h, ja sitten käsiteltiin 8 ug /ml tetrandrine 24 h. Kontrolliin verrattuna, suhteellisen toimintaa kaspaasi-3 nostettiin BGC-823-soluja käsiteltiin tetrandrine vain (kuvio 4B). Lisäksi, julkaisun sytokromi

c

lisääntyi annoksesta riippuvalla tavalla tetrandrine. Edustava virtaussytometrillä Tulos osoitti, että solut esikäsitelty z-VAD-fmk vähenee voimakkaasti tetrandrine-indusoitua apoptoosia ja että vain pieni määrä apoptoottisten solujen havaittiin (kuvio 4C). Seuraavaksi tarkastellaan ekspressiotaso sytoplasmisen sytokromi

c

, joka vapautuu mitokondriot sytoplasmaan apoptoosin aikana, toimi apoptoottisten proteaasi aktivoiva tekijä-1 (Rahastolla-1) lisäämällä sitoutumisen Apaf- 1 ATP /dATP, ja indusoi kaspaasi-9-riippuvaisen kaspaasi-3 [20-22]. Todettiin, että tetrandrine merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen sytoplasmisen sytokromi

c

ja Rahastolla-1 BGC-823-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4D). Yhdessä nämä havainnot ehdottivat, että mitokondrioiden-välitteisen kaspaasi cascade reitin oli mukana tetrandrine: n indusoiman apoptoosin.

(A) Western blot -analyysi ekspression prokaspaasi-3, pilkotaan kaspaasi-3, ja pilkottu caspase- 9 BGC-823-soluja käsiteltiin tetrandrine 6, 8, ja 10 ug /ml 24 h. (B) Soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk (10 gM) ja 4 tuntia, minkä jälkeen käsittelemällä tetrandrine 8 ug /ml 24 tuntia, ja suhteellinen kaspaasi-3 mitattiin käyttämällä kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys. (C) BGC-823-soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman z-VAD-fmk (10 gM) ja 4 tuntia, minkä jälkeen käsittelemällä tetrandrine 8 ug /ml 24 tuntia. PI-anneksiini V-FITC: llä sitoutumisen määritystä käytettiin havaitsemaan apoptoosia BGC-823-soluja. (D) Western blot analyysi ilmentymisen sytoplasmisen sytokromi

c

ja Rahastolla-1 BGC-823-soluja käsiteltiin tetrandrine 6, 8, ja 10 ug /ml 24 h. p-aktiinin ilmentymistä käytettiin sisäisenä kontrollina. Tiedot ilmoitetaan keskiarvoina ± SD vähintään kolmen kokeen. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001 verrattuna kontrolliryhmään.

Anti-kasvain vaikutus tetrandrine on BGC-823 nude mouse ksenografteissa

Koska tetrandrine havaittiin merkitsevästi estävän kasvua BGC-823-solujen

in vitro

, me arvioidaan edelleen anti-kasvain vaikutus tetrandrine

in vivo

vakiintuneiden ksenograftimalleissa. Kuten on esitetty kuviossa 5A, tetrandrine voitaisiin tehokkaasti estää kasvaimen kasvua, kun 24 päivän hoitoa. Lopussa 24 päivää keskimääräinen kasvaimen volyymit olivat 493,06 mm

3 ja 1243,00 mm

3 suuren annoksen ryhmässä ja pienen annoksen ryhmä, vastaavasti, mikä vastaa 80,52% ja 50,9% esto verrattuna kontrolliin ryhmä. Lisäksi tuumorin paino väheni seurauksena hoidon tetrandrine sekä pitoisuuksilla (kuvio 5B taulukko 2). Tämä tulos osoitti, että suuri annos tetrandrine oli vahvempi kasvaimen vastaisen vaikutuksen kuin pienen annoksen BGC-823 ksenograftimallissa.

BGC-823-soluja inokuloitiin subkutaanisesti BALB /c-nude-hiirissä vahvistaa ksenograftimallissa. (A) Kasvaimen kasvu seurataan ilmoitettuina ajankohtina, ja tuumorin tilavuus mitattiin joka 3 päivä. Alkamispäivää lääkehoidon määriteltiin päivä 0. Data edustaa keskiarvoja ± SD suhteellisen kasvaimen tilavuuden kullekin ryhmälle. (B) Kasvaimen paino mitattiin kokeen lopussa. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SD kasvaimen painoa kussakin ryhmässä. ***

P

0,001 verrattuna kontrolliryhmään.

Ryhmä (n = 5) B Kasvaimen tilavuus (mm

3) B inhibointimäärän (%) B Kasvaimen paino (g) B Inhiboiva korko (%) B control2531.78 ± 153.251.194 ± 0.10Tet (40 mg /kg) 1243,00 ± 55,19

*** 50.900.641 ± 0,06

*** 46.31Tet (120 mg /kg ) 493,06 ± 145,63

*** 80.520.298 ± 0,09

*** 75.04Table 2. esto tetrandrine (Tet) kasvaimen kasvua nude-hiirissä.

***

P

0,001

verrattuna

kontrolliryhmässä. CSV Lataa CSV

Tetrandrine aiheuttaman apoptoosin BGC-823 ksenografteissa

immunohistokemia analyysi kasvaimen kudokset leikattiin BGC-823 ksenosiirrettyjä nude-hiiriin vahvisti, että apoptoosin oli tapahtunut tetrandrine saaneilla kasvaimia ja että mitokondrioiden polku pelataan merkittävä rooli apoptoosin aikana. Oli viisi nude-hiirtä kussakin ryhmässä. Havaitsimme, että Bcl-2 ja Bcl-xl aleni, kun taas proteiinin tasot Bax, aktivoitu kaspaasi-3, ja aktivoitu kaspaasi-9 merkittävästi parantaa tetrandrine (kuvio 6). Kaikki nämä havainnot vahvasti tukenut tätä tetrandrine voivat aiheuttaa apoptoosin, sopusoinnussa

in vitro

tutkimuksessa.

immunohistokemiallinen värjäys apoptoosia sukuiset proteiinit: Bcl-2, Bcl-xl, Bax, aktivoitu kaspaasi -3, ja aktivoitu capase-9. Suurennus on 200 x. Edustavia mikrovalokuvia kolmesta on esitetty. DAB värjätään immunoreaktiivisten solujen (tummanruskea).

Keskustelu

Mahasyöpää, neljänneksi yleisimmin diagnosoitu kasvain takana keuhkosyövän, rinta-, paksusuoli-, ja peräsuolen aiheuttaa lähes miljoonaa vuosittain kuolemia ja on ollut toisen syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti [23-26]. Leikkaus, sädehoitoa, ja molekyylitason täsmähoitoihin ovat olleet tärkein hoitostrategioiden hoidossa mahasyövän [27]. Vaikka kirurginen resektio on tehokkain parantava hoito, tulokset ovat ristiriitaisia ​​ja rajoittaa kasvaimen uusiutumisen ja chemoresistance. Tavanomaisten kemoterapeuttisten lääkeaineiden, kuten Ptx, 5-fluorourasiili, sisplatiini tappaa kasvainsoluja indusoimalla apoptoosia ja autophagy; mutta kasvainsolut voivat muuttua vastustuskykyisiksi lääkkeen aiheuttamalle apoptoosin [17,28,29].

On todettu, että tetrandrine on vahva antituumorivaikutus sekä

in vitro

ja

vuonna vivo

monissa syöpäsolut, kuten A549 ihmisen keuhko- karsinoomasoluja, virtsarakon syöpä solut, paksusuolen syövän soluja, hepatoomasoluja, ja niin edelleen [9-12]. Aikaisempi tutkimus osoitti, että tetrandrine saattaisi olla lupaava asema, synergistinen vuorovaikutus kemoterapia-aineiden mahdollisesti niiden synergiavaikutukset aiheuttamaan apoptoosin ja vähen- tämisessä kemoterapeuttista ainetta liittyvien geenien MKN-28-solujen ja BGC-823-solujen [18]. Kuitenkin mekanismi tetrandrine ihmisen mahasyövän BGC-823 soluja ei ole tunnistettu. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että tetrandrine näytteillä voimakas antituumorivaikutus kohtaan ihmisen mahasyövän

in vitro

ja

in vivo

, selvittämiseen taustalla vaikutusmekanismeja.

Ensinnäkin meidän tulokset osoittivat, että tetrandrine esti BGC-823 solujen lisääntymistä määritettiin MTT annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Samaan aikaan IC

50s tetrandrine olivat noin 6,1, 4,5, ja 3,7 ug /ml BGC823 solujen 24, 48, ja 72 h, vastaavasti. Aiempien tutkimusten kemoterapeuttiset lääkkeet tappaa kiinteitä kasvaimia pääasiassa indusoimalla apoptoosin [30-32]. Olemme havainneet, että apoptoosi indusoitiin tetrandrine pitoisuudesta riippuvalla tavalla läpi virtaussytometria-analyysi lisääntynyt varhainen apoptoottisten solujen ja myöhäisen apoptoottisten solujen mahasyövän BGC-823-soluissa.

nisäkässoluissa, apoptoosi voidaan käynnistää ulkoisessa hyytymistiessä aktivoidaan kuoleman reseptori ja sisäisen reaktiotien säätelee Bcl-2-perheen jäsenten ja kaspaasi cascades että mitokondrioissa [33,34]. Tutkimuksessamme tetrandrine lisääntynyt ilmentyminen pro-apoptoottisten proteiinien Bax, Bad, ja Bak ja vähensi proteiinin tasot Bcl-2 ja Bcl-xl. Näin ollen, lisääntynyt suhde anti ja pro-apoptoottisen proteiinin ekspressiota, kuten Bax /Bcl-2-suhde, johtaisi mitokondrion kalvon potentiaalia. Toimintahäiriöiden mitokondriot julkaisut sytokromi

c

, joka kertyy sytosoliin ja muodostaa kompleksin Rahastolla-1. Sisäisessä reaktiotiessä, efektorina, kaspaasi-3 pilkotaan kaspaasi-9 [35-37]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 aktivoitiin tetrandrine. Yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä z-VAD-fmk vähensi apoptoosin BGC-823 soluja, mikä osoittaa, että mitokondrion polku on keskeinen rooli tetrandrine aiheuttaman apoptoosin.

On todettu, että tetrandrine voisi kääntää vastustuskyvyn monille kemoterapiaa huumeita, kuten Ptx ja doksorubisiinin KBv200 ja K562 nude mouse ksenograftimalleja [38,39]. Tetrandrine myös hallussaan vahva kyky estää angiogeneesiä glioomis- rotilla [40]. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että tetrandrine osoitti vahvaa tuumorin vastaista aktiivisuutta inhiboimalla kasvaimen kasvun ja apoptoosin indusoimiseksi perustettu BGC-823 paljaan hiiren ksenograftimallissa.

Lopuksi todettakoon, että tulokset osoittivat, että tetrandrine merkittävästi indusoi apoptoosia ihmisen mahasyöpä BGC-823-solut ja sen paljaan hiiren ksenograftimalleissa. Tetrandrine: n indusoiman apoptoosin aktivaatioon liittyviä luontaisia ​​apoptoosireittiä. Näiden tulosten perusteella, tetrandrine voisi olla suurta potentiaalia hoidettaessa ihmisen mahasyövän tulevaisuudessa.

Kiitokset

Haluamme kiittää jäseniä Kliininen laitos Jiangsu University heidän tekninen apu.