Krooninen sairaus

tiivistelmä

häiriöstä sonic hedgehog (Shh) signalointireitin on liittynyt syövän kantasoluja (CSC) ja osallinen aloittamisen haimasyövän. Haiman CSCS ovat harvinaisia ​​kasvainsoluja ominaista niiden kyky itse uudistaa, ja vastaavat kasvaimen uusiutumisen liitetään vastustuskyvyn nykyisten hoitomuotojen. Kuolleisuutta Näiden parantumaton, aggressiivinen ja invasiivisia haimatuumorien pysyy pelottava kliininen haaste. Siten tavoitteena oli tutkia roolia Shh väylän haimasyövän ja tutkia molekyylitason mekanismeja, joilla sulforaphane (SFN), aktiivinen yhdiste cruciferous vihannekset, estää kyky uusiutua ihmisen haiman CSCS. Mielenkiintoista on, me osoitamme tässä, että Shh reitti on erittäin aktivoidaan haiman CSCS ja sillä tärkeä rooli ylläpitää stemness jonka ekspressiota sääteleviä stemness geenejä. Koska vaatimus Hedgehog haimasyövän, me tutkimme, siili salpauksesta SFN voitaisiin kohdistaa kantasolujen väestön haimasyöpä. Eräässä

in vitro

mallissa ihmisen haiman CSCS peräisin palloset estivät merkittävästi käsiteltäessä SFN, mikä viittaa klonogeeniset ehtyminen CSCS. Mielenkiintoista, SFN esti komponenttien Shh koulutusjakson ja Gli transkriptioaktiviteettia. Interferenssi Shh-Gli signalointi merkittävästi estetty SFN-indusoidun inhiboivia vaikutuksia osoittaa vaatimus aktiivisen reitin kasvulle haiman CSCS. SFN esti myös alavirtaan tavoitteita Gli transkription tukahduttamalla ilmaus pluripotenttisuuden ylläpitäviin tekijöihin (Nanog ja Oct-4) sekä PDGFRα ja sykliini D1. Lisäksi SFN: n indusoiman apoptoosin inhiboimalla BCL-2 ja kaspaasien aktivaatio. Tuloksemme osoittavat tärkeän roolin Shh-Gli signaloinnin kontrollissa haiman CSCS. Ehdotamme, että haimasyövän ennaltaehkäiseviä vaikutuksia SFN voi johtua estämällä Shh reitin. Näin Sulforaphane mahdollisesti edustaa halpa, turvallinen ja tehokas vaihtoehto hallintaan haimasyövän.

Citation: Rodova M, Fu J, Watkins DN, Srivastava RK, Shankar S (2012) Sonic Hedgehog Signaling esto tarjoaa mahdollisuuksia Kohdennettu Therapy by Sulforaphane säätelyssä Haimasyöpä Stem Cell itseuudistumisen. PLoS ONE 7 (9): e46083. doi: 10,1371 /journal.pone.0046083

Editor: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 10, 2012; Hyväksytty: 27 elokuu 2012; Julkaistu: 28 syyskuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoittajat: Nämä kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa .

Johdanto

Haimasyöpä (PC) on yksi maailman köyhimmistä ennusteet kaikkien syöpien ja yleistä 5 vuoden pysyvyys on 3% [1], [2], [3]. Valitettavasti useimmissa tapauksissa haiman syöpä ei ole kokoisen aikaan diagnoosin. On rajoitetusti hoitomahdollisuuksia tämän taudin koska kemo- ja radio-hoidot ovat varsin tehoton, ja etäpesäkkeitä usein myös kehittää jopa leikkauksen jälkeen [4]. Siksi on kiireesti löytää uusia ja tehokkaita chemopreventive lähestymistapoja haimasyövän.

Syöpä kantasolut /kasvaimen aloittamista soluja (-lämpökameroissa) on ehdotettu olevan syynä syövän aloittamista, etenemistä ja kemoterapian epäonnistumisen useita ihmisen maligniteettien, mukaan lukien haimasyövän [5], [6], [7]. CSC: n hypoteesi ehdottaa, että ainoastaan ​​kantasolujen kasvaimissa kykenee rajoittamaton itseuudistumisen ja että poistaminen näiden solujen lopulta pysäyttää neoplastisten laajennus, kuten paremmin-erilaistuneita soluja on rajoitettu mitogeenisesta kapasiteettia eikä edistää pitkän aikavälin kasvaimen kasvua . Siksi on välttämätöntä suunnitella uusia strategioita perustuu ymmärtää paremmin signalointireittien jotka ohjaavat näkökohdat itseuudistumisen ja selviytymisen CSCS tunnistamiseksi uusia terapeuttisia kohteita näissä soluissa. Siten terapeuttisten strategioiden kehittämisen, jotka kohdistuvat erityisesti haiman CSCS voi olla tehokas hävittämään kasvaimet ja vähentää taudin uusiutumisen riski ja etäpesäkkeiden.

lisääntymisen merkkejä sonic hedgehog-reitin on osoitettu CSCS, mikä vaikutus syövän etenemiseen kuten muuttoliike , invaasio ja metastaasi. Asiatonta toimintaa Hh-signalointireitin on myös yhdistetty kasvaimen tyyppejä, joita syntyy satunnaisesti tai geneettisesti alttiita henkilöitä [8], [9]. SHH polku on varhainen ja myöhäinen välittäjänä tuumorigeneesiä epiteelisyövissä. Aktivointi Shh signalointi näyttää ennen muutosta haiman kudoksen kantasolujen haiman syöpä kantasoluja, jossa Gli transkriptiotekijän toimii välittäjänä ympäristön signaalit ja etenemisen haiman CSCS osaksi metastaattinen kasvainsoluihin. Shh signalointi käynnistetään sitomalla erittyvän Shh peptidin 12- span transmembraaniproteiini Patched (Ptch), aiheuttaen Ptch aktiivisuuden ja siitä fosforylaatio ja posttranskriptionaalisella vakauttaminen 7-span transmembraaniproteiiniksi smoothened (SMO), jäsen kiemurteleva reseptorit [10], [11]. Tämän seurauksena ekspression Hh kohdegeenien alustetaan kautta posttranslational aktivointi Gli perheen sinkkisormen transkriptiotekijöiden [12]. Gli-perhe on yksi kohdegeenin aiheutti johdonmukaisesti kun Shh reitti aktivoituu, joten tämä transkriptin luotettava merkki sekä fysiologisten ja patologisten Shh signalointi aktiivisuutta. Aktivointi Shh signalointireitin osallistuu säätelyyn leviämisen haiman CSCS. Näin ollen kohdistamalla signalointireittejä, jotka poikkeavasti aktivoidaan ja merkitystä ylläpitoon syövän kantasoluja voi johtaa kehittää uusia hoito-haimasyövän poistamalla haimasyövän CSCS [13], [14].

Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että lisääntynyt riski haimasyövän liittyy tupakkaa, liikalihavuutta ja korkea kulutus rasvaa, kalaa, sian- tai naudanlihaa, ja että vähenivät riskit liittyvät kulutusta cruciferous vihannekset. Tärkeä ryhmä aineita, joilla on tämä ominaisuus ovat organosulfur yhdisteitä, kuten isotiosyanaatit (ITC), runsaasti cruciferous vihannekset jonka kulutus on epidemiologisesti osoittanut käänteinen yhteys haimasyöpä. ITC on osoitettu näytteille useita mahdollisia chemoprotective toimintaa solu- ja eläinmalleissa [15], [16], [17], [18]. Olemme aiemmin osoittaneet, että suun kautta sulforaphane inhiboivat PC-3-solujen ortotooppisesti istutetaan eturauhasen nude-hiirten indusoimalla apoptoosin ja inhiboimaan kasvainsolujen proliferaatiota, etäpesäke ja angiogeneesiä [19]. Olemme myös viime aikoina osoittaneet, että SFN yksin ja yhdessä quercetin estää kasvun haimasyövän saatavien kantasolujen haimasyövän solulinjoissa

in vitro

kautta sääntelyn FOXO proteiinien [20]. Siten SFN erittäin lupaava kehitys sisällytetty chemopreventive /terapeuttista ainetta. Huolimatta näistä toteamuksen, ei ole olemassa tutkimuksia, jotka osoittavat sääntelyn haiman CSCS mukaan SFN, ja onko SFN voivat estää Shh reitin.

Näin Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia roolia Sonic hedgehog-reitin haiman syöpä ja tutkia molekyylitason mekanismeja, joilla sulforaphane (SFN), aktiivinen yhdiste cruciferous vihannekset, estää kyky uusiutua haiman CSCS. Alleviivatut molekyylitason mekanismia, joilla tämä vaikutus oli estämällä Sonic hedgehog-signalointireitin tasolla Gli transkription, proliferaatio, kantasolujen ominaisuuksia ja apoptoosin induktion. Nämä tiedot viittaavat siihen, että SFN voi olla hyödyllistä ainetta ehkäisyyn ja hoitoon haimasyöpä. Tällaista tietoa ei vain salli järkevä suunnittelu SFN perustuvia ehkäisy- ja /tai hoitoon haimasyövän mutta voisi myös helpottaa kehittämistä mekanismi perustuva protokollia optimaalisen kliinisen vaikutuksia.

Tulokset

Expression of sonic hedgehog-signalointireitin geenien haiman CSCS

Hedgehog (Hh) signalointireitin on kehityksen kannalta olennaisen tärkeää kudosten ja elinten [8]. Kuitenkin poikkeava aktivaatio sonic hedgehog (Shh) signalointireitin on merkittäviä rooleja kasvainten synnyssä ja etenemisessä useita kasvaimia [8], [9]. Arvioimaan mahdollisuutta, että Hh-signalointi on aktiivinen ihmisen haiman CSCS vertasimme mRNA: n ilmentymisen eri osien Shh reitin ihmisen haiman CSC (PanCSC) ihmisen haiman normaalin tiehyen epiteelisolujen (HPNE) ja ihmisen normaalit haiman kantasoluja ( HNPSC), käytettäessä

in vitro

soluviljelymalli ja kvantifioida qRT-PCR. Kuten on esitetty kuviossa. 1.A-C, havaitsimme vankka ilmaus avaintekijät Shh-Gli väylän haiman CSC verrattuna niiden normaaliin counter osat. Proteiinin ilmentymistä näiden komponenttien edelleen vahvistettiin Western-blottauksella, kuten on esitetty kuviossa. 1.d. Mielenkiintoista, osoitamme tässä, että Sonic hedgehog-reitin on erittäin aktivoidaan haiman CSCS viittaa siihen, että hyperaktiivinen Shh-Gli signalointi voi säädellä ilmentymistä stemness geenien haiman CSCS ja rooli solujen lisääntymistä ja etenemistä haiman CSCS.

(A-C), suhteellinen ekspressio eri komponenttien Shh reitin kvantitoitiin ihmisen haimasyövän kantasolut (PanCSC), ihmisen haiman normaalit kantasolujen (HNPSC) ja ihmisen haiman normaalin tiehyen epiteelisolujen (HPNE). Ilmentyminen Shh geenien kvantifioitiin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR reaaliaikainen määritys (q-RT-PCR), ja normalisoitiin GAPDH ilmentymisen. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja laskettiin perusteella ΔΔ

C

t menetelmällä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. %, Ja $ = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (D), Immunoblottaus on Gli1 /2, Smo ja β-aktiini ihmisen haimasyövän kantasolut (PanCSC), ihmisen haiman normaalit kantasolujen (HNPSC) ja ihmisen haiman normaalin tiehyen epiteelisolujen (HPNE).

Sulforaphane estää hedgehog-signalointireitin haiman CSCS

in vitro

siis pyrkinyt vaikutusten tutkimiseksi SFN ilmentymistä koskevat Shh reseptorin (Smothened) sekä -efektiboksejamme (Gli1 ja Gli2) by qRT-PCR ihmisen haiman CSCS. Kuten nähdään (Fig. 2.A-C), SFN esti ilmaus Smo, Gli1 ja Gli2. Koska olemme aiemmin osoittaneet Shh reitin aktivointi paneelissa ihmisen haiman solulinjoista [21], me myös pyrkinyt vaikutusten tutkimiseksi SFN ilmentymistä koskevat Shh reseptorin (Smothened) sekä -efektiboksejamme (Gli1 ja Gli2) by qRT-PCR haiman syöpäsoluissa ASPC ja PANC-1. Kuten on esitetty kuviossa. 3, SFN esti ilmentymisen Smo, Gli1 ja Gli2 näissä solulinjoissa sekä, mikä viittaa siihen, että SFN voi estää aktivointi Shh-signaloinnin haimasyövän.

(A-C), inhibitio komponenttien sonic hedgehog-reitin. Haiman CSCS käsiteltiin sulforaphane (0-20 uM) 24 tuntia. Ilmentyminen Gli1, Gli2 ja Smo mitattiin qRT-PCR ja normalisoitiin GAPDH ilme. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja laskettiin perusteella ΔΔ

C

t menetelmällä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. *, @ Ja $ = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05; (D), Immunoblottaus on Gli1 /2, Smo ja β-aktiini ihmisen haimasyövän kantasolut (PanCSC) käsiteltiin Sulforaphane (0-20 uM).

(A-B), Inhibition komponenttien sonic hedgehog-reitin. ASPC1 ja PANC1 käsiteltiin sulforaphane (0-20 uM) 24 tuntia. Ilmentyminen Gli1, Gli2 ja Smo mitattiin qRT-PCR ja normalisoitiin GAPDH ilme. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja laskettiin perusteella ΔΔ

C

t menetelmällä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. $, @, Ja = Merkitsevä ero ohjaus, P 0.05.

Lisäksi, koska läsnäolo ydinvoiman Gli ilmaisu on osoitus aktiivinen Hh signalointi, tutkimme vaikutuksia SFN ydinvoima translokaatiota Gli transkriptiotekijöiden avulla immunosolukemialliset (ICC). Haiman CSCS käsiteltiin SFN (0-20 uM) 24 tuntia. Sitten solut värjättiin anti-Gli ja Gli2 vasta-ainetta (vihreä fluoresenssi), ja DAPI (punainen fluoresenssi). Sulautuneen kuvat on esitetty, joka osoittaa, kelta-oranssi värjäys Gli 1 ja Gli2 tumassa johtuu yhdistää vihreän ja punaisen fluoresenssin. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, SFN esti ydin- translokaatiota Gli1 ja Gli2 mitattuna ICC. Nämä tiedot viittaavat siten siihen, että SFN estää Sonic hedgehog-reitin tasolla Gli aktivoinnin.

(A), ydinalan translokaatiota Gli1 ja Gli2, mitattiin immunosolukemiallinen. Haiman CSCS käsiteltiin sulforaphane (0-20 uM) 24 tuntia. Sitten solut värjättiin anti-Gli ja Gli2 vasta-ainetta (vihreä fluoresenssi), ja DAPI (punainen fluoresenssi). Sulautuneen kuvat on esitetty, joka osoittaa, kelta-oranssi värjäys Gli 1 ja Gli2 tumassa johtuu kolokalisaation vihreä ja punainen fluoresenssi. (B), Inhibition of Gli transkription. Haiman CSCS oli transdusoitiin Gli-reagoiva GFP /tulikärpäsen lusiferaasi viruspartikkelien (pGreen Fire1-Gli kanssa EF1, System Biosciences). Transduktion jälkeen, viljelyalusta vaihdettiin ja CSCS käsiteltiin sulforaphane (0-20 uM) 24 tuntia. Gli-reagoiva toimittaja aktiivisuus mitattiin käyttäen Luciferase Assay (Promega Corporation). Data edustaa keskiarvoa ± SD. @,%, Ja * = merkitsevä ero ohjaus, P 0.05.

Häiriöt Shh opastinjärjestelmillä Sulforaphane estää Gli reportteri toimintaa Haiman CSCS

Koska Gli transkriptiotekijän välittää vaikutuksia Shh jotka tärkeä rooli ylläpitämisessä stemness ja tuumorigeneesiprosessin me seuraava mittasi Gli transkriptionaalista aktiivisuutta (kuvio. 4B). Haiman CSCS oli transdusoitiin Gli-reagoiva GFP /tulikärpäsen lusiferaasi viruspartikkelien (pGreen Fire1-Gli kanssa EF1, System Biosciences). SFN esti Gli transkriptionaalista aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla. Nämä tiedot viittaavat siihen, että SFN voi säädellä haiman syövän synnyn, joka välittyy inhibition Shh signaloinnin.

inhibitio Gli, tehostaa sulforaphane on pallomainen muodostumiseen Haiman CSCS

Lisäksi, määrittää vaikutus SFN on Shh signaalin esto haiman CSC leviämisen ja itseuudistumiseen teimme pallo muodostumista määrityksessä. Haiman CSCS hoidettiin SFN (0-20 uM) 1 viikko ja arvioi sen luontainen kyky muodostaa ensisijaisen palloja kulttuuriin. Lopussa yhden viikon, yhteensä määrä palloja mitattiin ja kyky muodostaa toissijaisen palloja tutkittiin lisäksi toisen viikon. Ihmisen haiman CSCS johdettu palloset inhiboi merkittävästi käsiteltäessä SFN, mikä viittaa klonogeenisten ehtyminen CSCS (Fig. 5A).

(A), inhiboivat vaikutukset SFN CSC: n pallomainen elinkelpoisuuden. Haiman CSCS ympättiin, kuten yllä on kuvattu, ja sitä käsiteltiin SFN (0 ja 20 uM). Kun 7 ja 14 päivää, ensisijainen ja toissijainen sferoideina hajotettiin ja elävät solut laskettiin trypansininen määrityksessä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. @ Ja $ = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (B), haiman CSCS transdusoitiin joko salattu shRNA tai Gli1 ja Gli2 shRNA ilmentävät lentivirusvektoreita (pLKO.1), ja solulysaatit kerättiin ja Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen anti-Gli1 tai Gli2 vasta-aine. (C), CSC /salattu ja CSC /Gli shRNA ympättiin, kuten yllä on kuvattu, ja sitä käsiteltiin SFN (0-20 uM). Jälkeen 7 päivää, sferoidit kerättiin ja solujen suspensioita valmistettiin ja elävät solut laskettiin trypan blue-määrityksellä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. @,%, Ja * = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (D), Gli shRNA parantaa estäviä vaikutuksia SFN CSC: n pallomainen elinkelpoisuuden. CSC /salattu ja CSC /Gli shRNA ympättiin, kuten yllä on kuvattu, ja sitä käsiteltiin SFN (0 ja 20 uM). Jälkeen 7 päivää, sferoidit olivat photomicrographed.

Koska vaatimus Hedgehog signalointia haimasyövän, me tutkimme, Hedgehog salpauksesta sulforaphane voitaisiin kohdistaa kantasolujen populaation haimasyövän. Ymmärtää roolin Shh signaloinnin SFN indusoitua haiman CSC leviämisen, pyrimme estämään Shh signalointi haiman CSCS lakkauttamalla Gli transkriptiotekijä käyttäen lentiviraalinen välittämän transduktion Gli shRNA estämällä sekä Gli1 ja 2 ilme. Ilmaisu Gli haiman CSC tukahdutettiin lähes 100% käyttäen Gli1 ja Gli2 kohdistaminen shRNAs kuin määrällisesti Western blottauksella (kuvio. 5B). Kuten on esitetty (kuvio. 5C-D), prosenttiosuus alalla muodostavan kyky haiman CSCS väheni merkittävästi Gli knock-down-soluja verrattuna kontrollisoluihin. Lisäksi interferenssi Shh- Gli signalointi lentiviruksen – välitteisen hiljentäminen merkittävästi estetty SFN indusoi estävät vaikutukset osoittaa vaatimus aktiivisen reitin kasvun haimasyövän kantasoluja.

SFN estää ilmentymisen pluripotenttisuuden ylläpitämiseen transkriptiotekijöiden

Olemme äskettäin osoittaneet, että haiman CSC: n ilmentävien kantasolujen merkkiaineita CD133, CD44, CD24, ESA, ilmentävät korkeita pluripotenttisuuden ylläpitäviin tekijöihin, ja lääkeresistenssigeenejä MDR1 ja ABCG2 verrattuna normaaliin haiman soluja ja haimasyöpäsoluissa [22]. Siksi ominaista CSCS eristettiin ihmisen haiman kasvaimia virtauksen cytometery käyttää esillä olevassa tutkimuksessa. Kuten esitetään (Fig. 6A-D), Haiman CSCS ilmaista kantasolujen merkkiaineita CD44, ESA, CD133, ja CD24. Mielenkiintoista, Haiman CD44

+ ESA

+ CD133

+ CD24

+ CSCS ilmaisi CK19 (haimasyöpä erityinen epiteelin markkeri) ja ABCG2 lääkeresistenssigeenejä (Kuva. 6E-F).

(A-D), Expression of haiman kantasolujen merkkiaineita. Virtaussytometrianalyysin Haiman CSCS ilmentävien suoritettiin käyttäen kantasolujen merkkiaineita CD44 -PE, ESA-PerCP, CD133-APC, CD24-FITC ja asianmukaista valvontaa. (E-F), Expression haiman epiteelisolujen markkereita ja lääkeresistenssigeenejä. Virtaussytometrianalyysin Haiman CD44

+ ESA

+ CD133

+ CD24

+ CSCS ilmaisi CK19-PE ja ABCG2-PE vastaavasti.

Nanog on olennaista pluripotenttisuus, yhdessä muiden ES kuten allekirjoituksen tekijät, kuten Oct4 ovat myös kriittisiä haiman CSCS ja muiden syöpien [23], [24]. Ne hyväksytään Hh kohdegeeneissä samoin. Itse asiassa tasoa Oct4 voi aiheuttaa epiteelin dysplasiaa hiirissä, ja on liitetty eri ihmisen kasvaimissa, kuten myös säätelee Hh-Gli signalointi. Siksi, pyrki vaikutusten tutkimiseksi SFN ilmenemistä näiden tekijöiden

in vitro

. Kuten on esitetty (Fig. 7A-B), SFN inhiboi mRNA: n ekspression ja Nanog, ja Oct-4 haiman CSCS. Edelleen, kuten vahvistettiin Western blotting in (kuvassa. 7C), SFN esti proteiinin ilmentymistä Nanog, ja Oct-4 haiman CSCS. Nämä tiedot osoittavat, että Shh signalointi voi edistää haiman CSCS lisääntymistä tehostamalla solujen itseuudistumisen.

(A-B), vaikutukset SFN ekspressioon Hh kohdegeenien haiman CSCS. Reaaliaikainen PCR (q-RT-PCR) suoritettiin ekspression tutkimiseksi Nanog ja Oct4 ja tiedot normalisoidaan GAPDH. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja laskettiin perusteella ΔΔ

C

t menetelmällä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. @ Ja% = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (C), haiman CSCS käsiteltiin SFN (0-20 uM), ja solulysaatit kerättiin ja Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen anti Nanog, Oct4 tai β-aktiini-vasta-aine. (D-E), vaikutukset SFN ekspressioon Hh kohdegeenien osallistuvat solujen proliferaation haiman CSCS. Reaaliaikainen PCR (q-RT-PCR) suoritettiin ekspression tutkimiseksi PDGFRα ja sykliini D1, mukana ylläpitoon leviämisen analysoitiin ja normalisoitu GAPDH. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja laskettiin perusteella ΔΔ

C

t menetelmällä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. @,%, Ja $ = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (F), haiman CSCS käsiteltiin SFN (0-20 uM), ja solulysaatit kerättiin ja Immunobloted varten anti PDGFRα, sykliini D1 tai β-aktiini-vasta-aine.

Hedgehog signalointi blockadge by sulforaphane estää solun proliferaatiota ja indusoi apoptoosia Haiman CSCS

vieressä tutkittiin vaikutuksia SFN on mRNA: n ilmentymisen alavirtaan olevien geenien Gli transkription, jotka ovat mukana solujen lisääntymisen. Kuten esitetään (Fig. 7D-E), SFN esti alavirtaan tavoitteet Gli transkription sykliini D1 ja PDGFRα haiman CSCS joiden tiedetään Hh kohdegeenien mukana leviämisen. Edelleen, proteiinikinaasien ilmentymisen nämä tavoitteet SFN haiman CSCS vahvistettiin Western-blottauksella in (Fig. 7F). Nämä tiedot viittaavat siihen, että SFN voi säädellä haiman syövän synnyn estämällä Shh reitin ja sen loppupään tavoitteet.

Lisäksi olemme osoittaneet, että SFN-indusoidun apoptoosin haiman CSCS estämällä Bcl-2: n ilmentymisen ja sen kautta kaspaasi 3 /7 (Fig. 8A-B). Estyminen proteiinin ilmentymisen BCL2 ja ylössäätely pilkottiin kaspaasi-3, vahvistettiin western blottauksella, kuten on esitetty (kuviossa. 8C). Edelleen, virtaussytometria-analyysi, jossa PI-värjäyksen SFN-käsiteltyjen solujen (kuvio. 8D), kuvaa, että kasvavien annosten SFN parannettu apoptoosin haiman CSCS annoksesta riippuvalla tavalla. Nämä tiedot viittaavat siihen, että SFN voi estää soluproliferaatiota ja aiheuttaa apoptoosin haiman CSCS kohdentamalla Shh polku ja sen kohdegeenien.

(A), vaikutukset SFN on Bcl-2expression. q-RT-PCR suoritettiin ekspression tutkimiseksi Bcl-2. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja laskettiin perusteella ΔΔ

C

t menetelmällä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. @,% Ja $ = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (B), vaikutukset SFN on kaspaasi-3/7-aktiivisuus. Haiman CSCS käsiteltiin SFN (0-20 uM) 24 tunnin ajan, ja kaspaasi-3/7-aktiivisuus mitattiin kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Data edustaa keskiarvoa ± SD. @,%, Ja $ = merkitsevä ero ohjaus, P 0,05. (C), haiman CSCS käsiteltiin SFN (0-20 uM), ja solulysaatit kerättiin ja Immunobloted varten anti- BCL-2, pilkottiin kaspaasi 3 tai β-aktiini-vasta-aine. (D), vaikutukset SFN apoptoosiin. Haiman CSCS hoidettiin SFN (0-20 uM) 48 tuntia, ja apoptoosin mitattiin PI-värjäyksellä käyttämällä virtaussytometria.

Keskustelu

Haimasyöpä tulee kliinisesti ilmeiseksi myöhässä vaiheet ja se vastustaa kaikenlaista tavanomaisen kemoterapian ja sädehoidon [1], [2]. Olemme viime aikoina osoittaneet, että CSCS jakaa molekyyliominaisuudet normaalilla kantasolut (SCS) ja kriittisiä rooleja lääkeresistenssin ja syövän etäpesäkkeiden. Haiman CSCS osoittavat myös säätelyä molekyylien tärkeä kehityshäiriöitä signalointireiteissä, kuten Sonic hedgehog (Shh) kautta. Hallitsemattoman aktivaation Shh reitin on liitetty etenemistä ja ylläpito haiman adenokarsinoomat [25], [26]. Pathway aktivointi SMO näin voi tapahtua joko Hh proteiinistimulaatiotestiä tai menetyksen kautta Ptch aktiivisuuden, kuten nähdään satunnaista syöpiä tai jotka syntyvät familiaalinen syövän alttius oireyhtymä, BCNS (tyvisolusyöpä Luomi oireyhtymä, joka liittyy heterotsygoottinen mutaatio ihmisen Ptch geeni). Aktivointi Shh signalointireitin osallistuu säätelyyn leviämisen haiman CSCS [27]. Siten aineet, jotka estävät Shh polku on mahdollista estää taudin etenemistä ja metastaaseja [28]. Sekä lääkkeitä, jotka valikoivasti tavoite CSCS tarjoavat enemmän lupaus syövän ennaltaehkäisyyn ja hoitoon. Hanke perustuu olettamukseen, että SFN, luonnollinen yhdiste päässä cruciferous vihannekset, voidaan käyttää ehkäisyyn ja /tai hoitoon ihmisen haimasyövän. Täten päätavoitteena läsnä oli tutkia roolia sonic hedgehog-reitin haimasyövän ja tutkia molekyylitason mekanismeja, joilla sulforaphane estää haiman CSC ominaisuudet, ja arvioi sen chemopreventive /terapeuttista potentiaalia vastaan ​​haimasyöpä kohdistamalla CSCS.

SFN on luonnossa esiintyvä isotiosyanaatti lupaavia kemiallinen estoaktiivisuus [29]. Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ihmiset, jotka syövät cruciferous vihannekset ovat vähentänyt haimasyövän ja muita syöpiä. Testaa eläimillä ovat osoittaneet, että ruokinta SFN vähensi taajuus, koko ja lukumäärä kasvainten eri alkuperää. Se oli hyvin ja imeytyy nopeasti ja näytetään absoluuttinen hyötyosuus on 82% [30]. Se on vaihe 2 entsyymin indusoija [31], ja estää bentso [a] pyreenin-DNA: n ja 1,6-dinitropyrene-DNA additiotuotteiden muodostumisen. Se toimii antioksidanttina, antiproliferatiivinen, antituumori- ja anti-angiogeeninen aine, ja näin ollen uusi ehdokas kemopreventiolle [19], [32], [33], [34]. Joissakin viimeaikaisissa tutkimuksissa on haimasyöpä kantasoluja, jotka ovat peräisin ihmisen solulinjoissa on raportoitu, jossa he ovat osoittaneet, että SFN voi estää niiden kasvua inhibition kautta NFKB [35]. Nämä tutkimukset viittaavat vahvasti siihen, että SFN voivat moduloida geenien ilmentymisen tiedetään olevan rooleja karsinogeneesin prosessiin, ja siksi voi olla potentiaalinen aine kemopreventiolle vastaan ​​haimasyöpä. Parhaan tietomme tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa, että sulforaphane voi estää kasvun ensisijainen haiman CSCS peräisin ihmisen kasvaimista

in vitro

kautta estämällä Sonic hedgehog-reitin ja siten pidettävä erittäin romaani.

esillä olevassa tutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että syöpä ehkäisevä aine SFN estää ilmentymisen komponenttien Shh reitin ihmisen haiman CSCS. SFN esti ilmaus reseptorin molekyylin Smo sekä efektoreina Gli 1 ja 2, mikä viittaa kliininen merkitys Shh väylän haimasyövän etenemiseen. Pakkokeinoin aktivointi Shh tai estämiseksi Gli1 plus Gli2 ilmentymisen shRNA estetty estäviä vaikutuksia SFN, mikä viittaa siihen, vaikutukset SFN välittyvät inhibition Shh kautta. SFN estää kyky uusiutua ihmisen haiman CSCS estämällä pluripotenttisuus ylläpitäviin tekijöihin ja Shh polku. Erityisesti SFN estää kyky uusiutua haiman CSCS estämällä ilmentymistä pluripotenttisuuden ylläpitää transkriptiotekijöiden (Nanog ja Oct-4), komponentit Shh koulutusjakson, ja indusoi apoptoosia estämällä Bcl-2, sykliini D2, ja aktivoimalla kaspaasi -3 ja 7. yhdessä tämänhetkisiin tutkimukset viittaavat vahvasti siihen, että SFN on voimakas biologinen estäjä ihmisen haiman syövän synnyn, vähentää niiden proliferatiivinen ja invasiivisia toimintoja. Nämä tutkimukset herättää siitä näkökulmasta, että sulforaphane voi olla hyödyllistä ainetta ehkäisyyn ja /tai hoitoon haimasyövän suuntaamalla CSCS.

Koska CSCS /esisolujen pelata merkittävä rooli syövän aloittamista, etenemistä, uusiutumisen ja lääkeresistenssin esto CSC kasvun ja niiden kyky uusiutua sulforafaanilla voisi olla merkittävä hallintaan haimasyövän ja on hiljattain uudelleen vuonna useita asiakirjoja kuin chemopreventive strategia ruokavalion aineiden kohdentamiseksi syövän kantasoluja [36], [37]. Selvittäminen mekanismi (t) antiproliferatiivinen SFN on kriittinen yleisarvio sen mahdollinen kliininen hyödyllisyys. Tällaista tietoa ei vain salli järkevä suunnittelu sulforaphane perusteella ehkäisy- ja /tai hoitoon haimasyövän mutta voisi myös helpottaa kehittämistä mekanismiin perustuva protokollia optimaalisen kliinisen vaikutuksia.

Johtopäätökset

Olemme osoittaneet täällä ensimmäistä kertaa, että SFN esti kyky uusiutua haiman CSCS eristettiin ihmisen ensisijainen kasvaimia ja estää haiman CSC ominaisuudet. Estovaikutukset SFN välittyvät inhibition Shh kautta. SFN esti ilmentymisen transkriptiotekijöiden (Nanog ja Oct-4), jotka tarvitaan säilyttämään kantasolujen pluripotenttisuuden. SFN voimakkaasti eliminoi haiman CSCS ominaisuuksia vaikuttamalla clonogenecity, pallojakaantuminen muodostuminen yhdessä signalointi osallistuu apoptoosin vastuksen ja lisääntymistä. Näin ollen, sääntely Shh signalointireitin in CSCS ei-myrkyllisen aineen sulforaphane, voidaan pitää uutena strategia hoitoon ja /tai ehkäisyyn haimasyövän. Koska poikkeava Shh signalointi tapahtuu haiman kasvainten synnyssä, terapeuttisia että tavoite Shh reitti voi parantaa tuloksia potilaiden haimasyöpä kohdentamalla CSCS ja helpottaa myös kehittymistä mekanismiin perustuva protokollia optimaalisen kliinisen vaikutuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

Vasta-aineet GAPDH ja Gli ostettiin Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA). SFN hankittiin LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). Enhanced kemiluminesenssin (ECL) Western blot detektioreagensseja olivat Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL). Kaikki muut kemikaalit hankittiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Soluviljely

Ihmisen normaali haiman kantasolut (HPSC) ja ihmisen haimasyövän kantasolujen (CD133

+ /CD44

+ /CD24

+ /ESA

+) saatiin Celprogen Inc. (San Pedro, CA). Ne eristettiin primaarikasvaimista ja on kuvattu aiemmin [38]. Nämä CSCS koostuvat irtotavarana haimasyövän kantasolujen populaatio, joten niitä ei voida pitää solulinjassa. CSCS viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 1% N2 Supplement (Invitrogen), 2% B27 Supplement (Invitrogen), 20 ng /ml ihmisen verihiutaleiden kasvutekijä (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (Invitrogen) ja 1 % antibiootti-antimykoottia (Invitrogen) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2. Ihmisen haiman normaalissa ductal epiteelisolujen (HPNE) saatiin

Lonza, Clontetics ja pidettiin DMEM: ssä, jota on täydennetty kasvutekijän luodin kit.

Kasvaimen pallomainen määrityksessä

sferoidi muodostavat määrityksissä suoritettiin kuten muualla on kuvattu [22], [39].