Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Testasimme hypoteesia, että ilmaus MikroRNA (miRNA) syöpäkudoksen voi ennustaa tehokkuutta bevasitsumabia lisätään kapesitabiinin ja oksaliplatiinin (CAPEOX) metastasoituneen kolorektaalisyövän (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää).

Experimental suunnittelu

potilaat metastasoituneen kolorektaalisyövän hoidettiin ensin line CAPEOX ja bevasitsumabin (CAPEOXBEV): seulonta (n = 212) ja validointi (n = 121) ikäluokat tai CAPEOX yksin: ohjaus kohortti (n = 127), tunnistettiin takautuvasti ja arkistointia primaarikasvaimen kerättiin. Expression 754 miRNA analysoitiin Seulonnassa kohortin käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR) paneelit ja ekspressiotasoja liittyivät aika taudin etenemiseen (TTP) ja kokonaiseloonjääminen (OS). Merkittävät miRNA alkaen seulonta tutkimuksessa analysoitiin kaikissa kolmessa kohortit käyttämällä mukautettuja PCR paneelit.

In situ

-hybridisaatio (ISH) tehtiin valittujen miRNA.

Tulokset

seulonta tutkimuksessa, 26 miRNA merkittävästi korreloivat lopputulokseen monimuuttuja analyysit. Kaksikymmentäkaksi miRNA valittiin jatkotutkimuksiin. Korkeampi miR-664-3p ilmaisun ja alemman miR-455-5p ilmentyminen oli ennustavia parantunut tulos on CAPEOXBEV kohortit ja osoitti merkittävää vuorovaikutusta bevasitsumabi tehokkuutta. Vaikutukset olivat vahvin OS. Molemmat miRNA osoitti voimakasta ilmentymistä stroomasoluissa. Korkeampi ilmentymä miR-196b-5p ja miR-592 ennusti parantunut tulos riippumatta bevasitsumabia hoidon, joilla on sama vaikutus arvioihin kaikissa kolmessa ikäryhmät.

Johtopäätökset

Olemme tunnistaneet mahdollisesti ennakoivan miRNA Bevasitsumabin tehokkuutta ja lisää miRNA jotka voisivat liittyä kemoterapia vaikuttavuutta tai ennusteeseen potilailla, joilla metastasoituneen kolorektaalisyövän. Meidän havainnot on vielä validointi suuret ikäluokat, edullisemmin valmistunut satunnaistettua tutkimusta.

Citation: Boisen MK, Dehlendorff C, Linnemann D, Nielsen BS, Larsen JS, Österlind K, et al. (2014) Tissue MikroRNA kuin ennustavat tulos metastasoituneen peräsuolen syövän Hoidettu ensimmäinen rivi Kapesitabiini ja Oksaliplatiini tai ilman Bevasitsumabilla. PLoS ONE 9 (10): e109430. doi: 10,1371 /journal.pone.0109430

Editor: Ratna B. Ray, Saint Louis University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 22 elokuu 2014; Julkaistu: 15 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Boisen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että hyväksyttyjä syistä, jotkut pääsy rajoitukset koskevat tietojen taustalla havainnot. Tiedot ovat saatavilla Institutional Data Access /eettinen komitea on Syöpätautien, Herlev yliopistollisen sairaalan tutkijoita varten, jotka täyttävät pääsyä luottamuksellisia tietoja. Tiedot tulee lähettää professori Julia S. Johansen klo [email protected].

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee rajoittamattoman avustusta Roche Tanska (www.roche.dk), The Herlev Hospital Research Foundation (www.herlevhospital.dk), ja proof-of-concept avustuksen Technical University of Denmark (www.dtu.dk). Kaikki avustukset annettiin MKB yksin tai molemmille MKB ja JSJ. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja laatijat käsikirjoituksen ovat seuraavat kilpailevia edut: BVJ: Roche, konsultti /neuvoa-antava rooli; SEN: Roche, konsultti /neuvoa-antava rooli; PP: Roche, konsultti /neuvoa-antava rooli; JSJ: Roche, palkkiot ja tutkimusrahoitusta; MKB: Roche, tutkimusrahoitus. JSJ ja MKB ovat yhdessä keksijöiden patenttia-sovellus liittyy mainittujen miRNA. Patenttihakemus tiedot: Name ”MikroRNA ennustamiseksi hoidon tehoa ja ennusteen syöpäpotilaiden”; Hakemuksen numero ”PCT /DK2013 /050015”. BSN työskentelee kaupallinen yritys (Bioneer). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on johtava syy syöpään liittyvien kuolleisuus kaikkialla maailmassa [1]. Useimmat kuolemista tapahtuu seurauksena kehittämiseen metastaattisen CRC (metastasoituneen kolorektaalisyövän). Standard potilashoidon metastasoituneen kolorektaalisyövän, jotka eivät voi rajuihin resektio etäpesäkkeitä on järjestelmän kemoterapian kanssa tai ilman kohdennettu agentti [2]. Bevasitsumabi on monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoo ligandin ”vaskulaarinen endoteelikasvutekijä” (VEGF-A), ja estää siten kyky syöpien tuottaa uusia verisuonia olemassa oleviin aluksiin, prosessin, jota kutsutaan angiogeneesiä. Bevasitsumabi on osoittanut tehoa potilailla, joilla on metastasoitunutta kolorektaalisyöpää kun sitä käytetään yhdessä tavanomaisen kemoterapian, mutta hyöty on vaatimaton, kun sitä käytetään unselectively ja bevasitsumabin lisää merkittävää toksisuutta ja kustannuksia hoidon [3] – [7]. Siksi tunnistaminen ennakoivan biomarkkereita bevasitsumabi on tullut merkittävä tavoite biomarkkereiden tutkimusta potilailla, joilla metastasoituneen kolorektaalisyövän. Koska sen yleistymistä tavallisena ensimmäisen tai toisen linjan hoitona [8], kyky yksilöllisen bevasitsumabi hoitoon olisi suuri vaikutus kliiniseen käytäntöön. Lukuisat tutkimukset ovat tutkineet mahdollisia biomarkkereita muodossa RNA, DNA: ta tai proteiinia [9], [10]. Mikään niistä ei ole tehnyt sitä osaksi klinikalla. Tällä hetkellä ei ole kaupallisesti saatavilla testi voi tunnistaa potilaat, jotka hyötyvät bevasitsumabi.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ~22 nukleotidin pituisia, ei-koodaavat RNA: t osallistuvat posttranskriptionaalisen geenin ilmentymisen säätelyyn. Ne on intensiivisesti tutkittu biomarkkereina syöpäpotilailla koska niiden ekspressiotasot ovat väärin säädellystä syöpäsoluissa, ne voivat vaikuttaa syövän käyttäytymiseen, ja ne ovat suhteellisen resistenttejä hajoamiselle käytetään yleisesti näytteenotto tiedotusvälineet [11] – [16]. Useissa tutkimuksissa on todettu häiriöstä miRNA CRC kasvainkudoksessa ja verinäytteistä potilailta CRC; ja jotkut tunnistetuista miRNA myös liittynyt ennustavat tekijät, kuten syvyys hyökkäystä, vaiheen, ja imusolmukemetastaaseja [17]. Lisäksi tärkeitä molekyylien ominaisuuksia CRC kuten mikro-satelliitti epävakaus (MSI) ja

BRAF

mutaatiostatuksesta riippumatta on osoitettu liittyvän erillisen miRNA ekspressiokuvioiden [18]. Näin ollen on vahva perusta on tutkittu niiden käyttökelpoisuutta miRNA ilmaisun kuin ennakoiva tai prognostista biomarkkereiden potilailla, joilla on CRC. Tähän mennessä ei julkaistu tutkimus on tutkinut ennustearvo miRNA lauseke bevasitsumabi tehokkuutta kokonaisvaltaisesti.

tavoitteena oli tunnistaa miRNA jotka olivat ennustavia lopputuloksen potilailla metastasoituneen kolorektaalisyövän hoidettu ensimmäinen rivi kapesitabiinia ja oksaliplatiinia ja bevasitsumabin (CAPEOXBEV /CAPEOX) ja mitkä näistä miRNA voisi ennustavan vaikutuksen bevasitsumabia lisäksi kemoterapiaa.

Methods

Tutkimuksen suunnittelu

seulonta, jossa käytettiin erilaisia ​​lähestymistapaa suoritettiin ensisijaisesti CRC kudosnäytteitä saaneilla potilailla CAPEOXBEV (seulonta kohortti) tunnistaa ehdokas miRNA kanssa ekspressiotasoja liittyviä lopputulokseen. Tämän jälkeen ekspressiotasot kartoitetut miRNA mitattiin käyttämällä tarkempaa menetelmää rinnakkaiskokeiden kolmessa ikäluokat: alaryhmä seulonnan kohortin; validointi kohortti, joka oli riippumaton ryhmä, jossa potilaita hoidettiin CAPEOXBEV; ja ohjaus kohortin koostuu hoidetuilla potilailla CAPEOX yksin.

Potilaat, tiedon louhinta, ja loppupisteet

BETmiRC (Bevasitsumabilla Tissue MikroRNA kolorektaalisyövässä) tutkimuksessa jälkikäteen osallistui potilaita, joilla metastasoituneen kolorektaalisyövän hoidettu jossa ensimmäinen rivi CAPEOXBEV 10 Tanskan sairaaloissa 2006-2011, ja potilailla, jotka saavat ensilinjan CAPEOX at Herlev sairaalassa tai satunnaistetussa tutkimuksessa 2003-2006 [19], ennen kuin bevasitsumabi hyväksyttiin, kuten aiemmin on kuvattu [20] kantavassa loppua Pisteet aika taudin etenemiseen (TTP) ja kokonaiseloonjääminen (OS) mitattiin hoidon aloittamisesta taudin etenemiseen tai kuolema mistä tahansa syystä, vastaavasti (yksityiskohtainen määritelmä File S1). Vital tila päivitettiin 5. heinäkuuta 2013.

kudosnäytteitä

Formaliinifiksoidusta parafinoidut (FFPE) kudosblokeista sisältäviä näytteitä ensisijainen kasvaimia palauttaa käyttämällä National Pathology rekisterin. Kontrollinäytteitä potilailta resektoitiin tulehduksellinen suolistosairaus, otettiin myös mukaan. Kokenut ruoansulatuskanavan patologi (DL) on valittu joka kudosblokeista hakea ja teki lohkot kasvainsolun prosenttiyksikköä. Kolme 10-um: n leikkeitä leikattiin kustakin lohkosta ilman mikro- tai makrotason leikkely ja osat pantiin steriiliin Eppendorf-putkissa. Kaikki kudosnäytteet otettiin ennen mitään systeemistä hoitoa tai sädehoitoa.

miRNA ilmentymisen analyysi

RNA puhdistettiin käyttämällä miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) käyttäen valmistajan ohjeita. Puhdistaminen tilaus satunnaistettiin validoimiseksi ja valvontaa kohortin näytteitä. Ei-inhimilliset miRNA ATH-miR-159 lisättiin kuhunkin näytteeseen ennen cDNA-synteesi, kuten piikki-hallinnassa.

TaqMan Human MicroRNA taulukkoon A ja B kortit Set v3.0 (Applied Biosystems) käytettiin määrällisesti ilmaus 754 ihmisen miRNA yhdellä määritykset seulonta tutkimuksessa. Myöhemmässä tutkimuksessa alennetun screening-, validation-, ja ohjaus kohortteja miRNA ilmentyminen mitattiin käyttäen TaqMan Custom LDA-kortteja (Applied Biosystems) profilointi 22 on valittu miRNA kahtena 8 näytettä kunkin kortin. 22 miRNA valittiin seulontatutkimuksen ja mikro-fluidisen kortteja ennalta määritetty valmistajan mukaan laitteen vaatimukset. Näytteet analysoitiin satunnaistetussa järjestyksessä Mukautettu LDA kortteja.

Ohjeet ja reagenssit valmistajan käytettiin kaikissa vaiheissa (https://www.products.appliedbiosystems.com). RNA purification- ja miRNA ilmaisun tutkimukset suoritettiin AROS Applied Biotechnology (Aarhus, Tanska). Yhtiö sokeita kaikkien kliinisten tiedot.

Mirna

in situ

-hybridisaatio

In situ

-hybridisaatio (ISH) suoritettiin käyttäen kaksois-FAM ( karboksifluoreseiinia) leimattu lukittu nukleiinihappo (LNA [21]) antureista (Exiqon, Vedbæk, Tanska) miR-185-5p, miR-455-5p, miR-592, miR-664-3p, miR-21-5p, ja miR-126-3p, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Kaikki ISH tutkimukset suoritettiin Bioneer (Hørsholm, Tanska).

Tilastollinen

Ei otoksen koon laskenta tehtiin ennen tutkimuksen aloittamista. Tavoitellut suurimman otoskoko mahdollista ja samansuuruisia kolmen ikäryhmät.

Mirna ilmaisun analyysit – seulonta tutkimus.

Raw syklin kynnys (C

t) kunkin miRNA tarkistettiin for vieraita havaintoja ja tulokset korjattiin käyttämällä piikki-arvoissa. Eräässä univariate valintatapa, jokaisen näistä miRNA liittyi TTP ja käyttöjärjestelmän käyttämällä Coxin suhteellisten riskien (CPH) malli [23], [24]. Ehdokas miRNA sisällytettiin Monimuuttuja CPH malli ikä-, sukupuoli, histologia, metastaasien lukumäärän, primäärikasvain sijainti, ja ennen adjuvanttihoitona, joka yksinkertaistaa käsittävän taaksepäin poistaminen menettely perustuu Akaike Information Criterion [25]. Analyysi toistettiin sitten tietokokonaisuuksien normalisoitui käyttämällä quantile- ja tarkoittaa normalisointi. Lopuksi 22 miRNA valittiin lisätutkimuksia perustuttava ensisijaisesti niiden suorituskykyä monimuuttuja analyysit. Määrä miRNA sisällyttää toisessa tutkimuksessa valittiin käytännöllisesti koska se mahdollistaa kahden mittauksen mukautetun alustalla.

Mirna ilmaisun analyysit – screening-, validation-, ja valvonta ikäryhmät.

Mean C

t kaksoiskappaleen mittausten laskettiin ja muuttuu 40-C

t. Jos toinen kahdesta mittauksesta oli määrittelemätön, C

t muiden mittausta on käytetty. Jokaisessa kolmessa kohorttien ilmaus 22 miRNA liittyi TTP ja käyttöjärjestelmän avulla CPH malleja oikaistu iän, sukupuolen, primäärikasvain sijainti, ennen hoitona, ja metastaasien lukumäärän. Tulokset ilmoitettiin hazard ratio (HR) per välinen neljännekseen alueella kasvu ilmentymisen tasolla 95%: n luottamusväli (CI) kantavassa mahdollista vuorovaikutusta miRNA ekspressiotason ja bevasitsumabin hoitovaikutus testattiin kolmessa ikäluokat yhdistetty käyttäen uskottavuusosamäärä .

Koska tulos saaneista potilaista bevasitsumabilla vaihteli suuresti riippuen primaarikasvaimen sijainnin [20], myös suorittaa vuorovaikutusta analyysit läheisten ja etäisten primaarisyöpien erikseen.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkittävä eikä virallisia korjauksia monimuuttujille tehtiin. Tilastollinen ohjelmistopaketteja R [26] (www.r-project.org) ja GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc) käytettiin kaikissa analyyseissä.

Target ennustus

in silico

ennustettu geenikohteet valittujen miRNA tunnistettiin käyttäen avoimen pääsyn DIANA-microT-CDS työkalu (https://www.microrna.gr/microT-CDS) [27].

Ethics

tutkimus hyväksytty maakunnan tieteellinen eettinen komitea Pääkaupunkialue (https://www.regionh.dk/vek, hyväksyntänumero: H-1-2010-081). Koska tämä retrospektiivinen tutkimus ei olisi mitään vaikutusta hoidon ja koska suurin osa osallistujista oli kuollut, kirjallinen suostumus ei saatu, ja tämä on hyväksynyt eettinen komitea.

Tulosten raportointi oli laadittu HUOMAUTUS suuntaviivat [28], [29].

lisätietoja kuvataan File S1.

tulokset

Mirna ilmentyminen mitattiin 460 FFPE näytteissä. Näytteiden määrä kussakin kohortissa oli: seulonta kohortin = 212, vähennetään seulonta kohortti = 155, validointi kohortti = 121, ja valvonta kohortti = 127 (kuva S1 File S1).

Potilaat sisältyvät alennettu screening- ja validointi miRNA ikäluokat poikkesi potilaista ei sisälly. He olivat todennäköisemmin: resektoitiin primaarikasvaimen, yksi metastaattinen sivuston, suorituskyky tila 0, ja ennen adjuvanttihoito. Ne myös kokenut pidemmän TTP ja OS (taulukko 1). Potilaat kontrolliryhmässä kohortti olivat samanlaisia ​​kuin potilailla, jotka eivät sisälly lukuun ottamatta niistä ovat todennäköisesti ollut primaarikasvaimen resektoitiin.

Screening tutkimus

yhdeksän näytettä tunnistettiin harha perustuu pieni määrä miRNA havaittujen ja nämä jätettiin pois, jättäen 203 näytteiden tuloksista laskelmia. Kaksikymmentäkuusi miRNA liittyi TTP tai OS Monimuuttuja-analyysissä käyttäen raw- kvantiiliinformaatio-normalisoitu tai keskiarvo-normalisoitu ilmentymisen (taulukko S1 File S1). Kaksikymmentä kaksi näistä valittiin jatkotutkimuksiin: miR-1, miR-15a-5p, miR-17-3p, miR-22-3p, miR-29b-3p, miR-145-3p, miR-155-5p , miR-185-5p, miR-193B-5p, miR-196b-5p, miR-204-5p, miR-214-5p, miR-338-3p, miR-382-5p, miR-449A, miR-455 -5p, miR-497-5p, miR-501-5p, miR-545-3p, miR-552-3p, miR-592 ja miR-664-3p.

Kohdennettu miRNA paneeli – miRNA liittyy TTP

Yksitoista miRNA liittyi merkittävästi TTP joko screening- tai validointi kohortin muttei molempien kohortteja eikä merkittäviä yhteisvaikutuksia ei havaittu välillä miRNA ilmaisun ja bevasitsumabin vaikutus (taulukko 2).

Kaplan-Meier -käyrät TTP mukaan kvartiileihin miR-664-3p- ja miR-455-5p ilmaisu on esitetty kuvassa S2 ja S3 File S1.

Kohdennettu miRNA paneeli – miRNA liittyvä OS

Kaksitoista miRNA liittyi merkittävästi OS yhdessä tai useammassa screening-, validation- ja hallita kohortteja (taulukko 3). Korkeampi miR-664-3p ilmentyminen liittyi pidempi OS seulontaan ja validointi kohortteja käyttää raaka ilmaisua: HR 0,64 (CI ,48-,86) ja 0,60 (CI 0,44-0,82); ja normalisoitu ilme: HR 0,66 (CI 0,49-0,91) ja 0,55 (CI ,39-+0,79). Ei assosiaatio miR-664-3p ilmaisun ja OS havaittiin valvonnassa kohortissa. Merkittävä vuorovaikutus miR-664-3p ilmaisun ja bevasitsumabin vaikutus havaittiin käyttämällä sekä raw- ja normalisoitu ilmaisun (

P

= 0.02 ja

P

= 0,02). Kaplan-Meier -käyrät OS mukaan kvartiileihin miR-664-3p ilmaisu on esitetty kuvassa 1.

Kaplan-Meier tontteja näkyvät hoidetuilla potilailla CAPEOXBEV käyttää raaka (A) tai keskimääräinen-normalisoitu (B ) ilmaisun ja hoidetuilla potilailla CAPEOX yksinään käyttää raaka (C) ja keskimääräinen-normalisoitu (D) lauseke. Hazard suhde (HR) ovat korjaamattomissakin luottamusväli (CI) lasketaan bootstrap. Ilmaisu välein näkyy oikeassa yläkulmassa ovat 40-C

t, joten suuremmat arvot vastaavat suurempia ilme. Musta viiva = huonoin kvartaali; punainen viiva = toisen neljännekseen; vihreä rivi = kolmannen neljännekseen; sininen viiva = korkein neljänneksessä.

Higher miR-455-5p ilmentyminen liittyi lyhyempi OS yhdistettyyn bevasitsumabia saaneista kohortti käytettäessä normalisoitu ilmaisua: HR 1,24 (CI 1,06-1,45) , mutta ei kontrolli kohortissa. Oli merkittävä vuorovaikutus bevasitsumabilla vaikutus (

P

= 0,02). Kaplan-Meier -käyrät OS mukaan kvartiileihin miR-455-5p ilmaisu esitetään kuviossa 2.

Kaplan-Meier tontteja näkyvät hoidetuilla potilailla CAPEOXBEV käyttää raaka (A) tai keskimääräinen-normalisoitu (B ) ilmaisun ja hoidetuilla potilailla CAPEOX yksinään käyttää raaka (C) ja keskimääräinen-normalisoitu (D) lauseke. Hazard suhde (HR) ovat korjaamattomissakin luottamusväli (CI) lasketaan bootstrap. Ilmaisu välein näkyy oikeassa yläkulmassa ovat 40-C

t, joten suuremmat arvot vastaavat suurempia ilme. Musta viiva = huonoin kvartaali; punainen viiva = toisen neljännekseen; vihreä rivi = kolmannen neljännekseen; sininen viiva = korkein neljänneksessä.

Higher miR-592 ilmentyminen liittyi pidempi OS vuonna screening- ja validointi kohortteja käyttää raaka ilmaisua: HR 0,69 (CI 0,69-0,92) ja 0,76 (CI 0.60- 0,95); ja validointi kohortin käyttämällä normalisoitua ilmaisua: HR 0,76 (CI ,63-0,93), joilla on samanlainen suuntaus seulonta kohortin käyttämällä normalisoitua ilmaisua: HR 0,77 (CI ,59-+1,00). Korkeampi miR-592 ilmentyminen liittyi myös pidemmän OS verrokkiryhmässä käytettäessä normalisoitu ilmaisua: HR 0,71 (CI +0,53-,96).

korkeamman miR-196b-5p ilmentyminen liittyi enää OS käyttäen raw- ja normalisoitu ilmaisun sekä yhdistetyn bevasitsumabia saaneista kohortti: HR 0,77 (CI 0,66-0,90) ja 0,79 (CI +0,64-+0,97); ja kontrolliryhmässä: HR 0,78 (CI 0,62-0,98) ja 0,73 (CI ,58-+0,93).

Kohdennettu miRNA paneeli – primaarikasvaimen sijainnin ja toisen linjan tuloksista

analyysit ositettu varten primaarikasvaimen sijainnin, merkittävä vuorovaikutus bevasitsumabilla vaikutus havaittiin mir-664-3p ilmentymisen sigmoid paksusuolen ja peräsuolen ryhmä sekä TTP käyttää raaka ilmaisua ja OS käyttää raw- ja normalisoitu ilme. Ekspressiotasoja kaikista miRNA mukaan primaarikasvaimen sijainnin esitetään kuviossa S4 File S1.

Potilailla jatkuvan Bevasitsumabin toisella rivillä, korkea miR-664-3p ilmentyminen liittyi pidempi TTP (HR 0,30,

P

= 0,04) ja korkea miR-455-5p ilmentyminen liittyi suuntauksena lyhyempiä TTP (HR 2,72,

P

= 0,09), kun taas tällaista yhdistysten havaittiin potilailla, jotka tekivät ei jatka bevasitsumabi (kuva S5 File S1).

Mirna

in situ

-hybridisaatio

intensiivinen miR-664-3p ISH-signaalin, ensisijaisesti sytoplasminen lokalisointi, oli nähdään alaryhmien kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä, fibroblastit ja endoteelisolut sijaitsevat invasiivisia rajalla (kuvio 3). Heikko miR-664-3p ISH-signaalin havaittiin kasvaimen epiteelisoluissa, mutta samanlainen värjäys havaittiin hajotus- koetin, mikä viittaa epäspesifinen sitoutuminen koettimen näihin soluihin. MiR-455-5p ISH signaali havaittiin eräissä lymfosyytti kaltaisia ​​stromasoluja puolessa näytteistä, kun taas kasvain epiteelisolut olivat negatiivisia (kuva S6 File S1). Ei ISH saatu signaalia koettimilla vastaan ​​miR-185, miR-449A tai miR-592. Positiivinen kontrolli koettimia miR-21-5p ja miR-126-3p osoittivat kohtalaisesta voimakas värjäytyminen fibroblasteissa ja endoteelisoluissa, vastaavasti, kaikissa tapauksissa.

Kentät A ja B esittävät esimerkkejä miR-664-3p ISH tunkeutuvia lymfosyyttejä (A) ja fibroblasteissa (B). Peräkkäiset leikkeet värjättiin LNA koettimet vastaan ​​miR-664-3p, miR-126-3p ja ryntäily järjestyksessä. MiR-664-3p ISH signaali nähdään tunkeutuvia lymfosyyttejä (A, nuolet, B, punainen nuoli) ja fibroblasteissa (B, mustat nuolet), kun taas ei ISH signaalia saadaan ryntäily anturi. Vahva ISH signaali nähdään endoteelisolujen kanssa positiivisen kontrollin koetin miR-126-3p. ”A” paneelissa B osoittaa valtimon.

Target ennustus

Taulukko S2 File S1 osoittaa 20 korkein ennustettu geenikohteet Mir-196b-5p, asennuspalveli- 455-5p, miR-592, ja miR-664-3p, ja viittaus siihen julkaistaan ​​artikkeleita koskevat funktion ja ekspressiotaso näiden miRNA syövässä.

keskustelu

Tämä on ensimmäinen kattava tutkimus of miRNA ennustaviksi biomarkkereita bevasitsumabi tehokkuutta CRC. Niistä 22 miRNA valittu seulonnasta tutkimuksen miR-664-3p ja miR-455-5p osoittivat suurimmat mahdollisuudet ennustaviksi biomarkkereita bevasitsumabin tehoa.

välinen yhteys miR-664-3p ja OS erosivat merkittävästi välillä hoidetuilla potilailla bevasitsumabin ja saaneilla potilailla kemoterapiaa yksinään: lisääminen miR-664-3p ilmentymistä primaarisessa CRC kudos liittyy pidempi OS molemmissa kohorteissa saaneista potilaista bevasitsumabia yhdistettynä CAPEOX mutta ei kohortin kemoterapiaa yksinään. Lisääntyvä miR-664-3p ilmentyminen liittyi myös pidempi TTP hoidetuilla potilailla bevasitsumabi, mutta vuorovaikutus testi oli merkittävä vain potilaiden alaryhmässä sigmoid colon- ja peräsuolen primaarikasvaimia. Olemme aikaisemmin arveltu, että tässä potilasryhmässä voitaisiin todennäköisemmin hyötyvät hoidon bevasitsumabia kuin potilailla, joilla on enemmän proksimaalisen primaarikasvainten [20]. MiR-664-3p ilmentyminen oli myös korkeampi näillä potilailla kuin potilailla, joilla on enemmän proksimaalisen primaarikasvainten (kuva S4 File S1). Pienessä kohortin potilaalla, joiden toisella rivillä tulos data, korkea miR-664-3p ilmentyminen liittyi myös pidemmän TTP vain potilailla jatkuvan bevasitsumabi, joka tukee yhteyden miR-664-3p ilmaisun ja bevasitsumabin tehoa.

havaittu korkea ilmentyminen miR-664-3p in stroomasolujen, mukaan lukien endoteelisolujen, joka on sopusoinnussa rooli miR-664-3p angiogeneesissä. Hyvin vähän tietoja on julkaistu tästä miRNA (taulukko S2 File S1). Mielenkiintoista, joukossa ennustettu tavoitteita miR-664-3p ovat neuroligin 1 (NLGN1), MDGA2, ja gephyrin, jotka ovat kaikki mukana samassa synaptogenic prosessin hermostossa [30], [31]. Äskettäin neuroligin ja sen sitoutumispartneri neurexin on osoitettu laajasti ilmaistuna verisuonistoon ja angiogeneesiin liittyvien [30]. Yliekspressio neuroligin 1 endoteelisoluissa kasvatettu kasvaimia ympäristön lisääntynyt angiogeneesi, ja pudotus on neurexin vähentää fibroblastikasvutekijää 2 angiogeneesiä [32]. Vuonna seeprakala alkio malli angiogeneesin, VEGF-A: n tai neuroligin aiheutti samanlaisia ​​suuruuksia verisuonten vikoja, mutta inhibitio sekä johti yli lisäaineen anti-angiogeeninen vaikutus [33]. Hypoteettisesti, vaikutus miR-664-3p ilme tulos saattaa siis selittää sen vaimennussäätely neuroligin järjestelmän ja tuloksena synergia VEGF-A estosta bevasitsumabi.

Lisääntyvä miR-455-5p ilme oli liittyy lyhyempi OS yhdistettyyn bevasitsumabi käsitelty kohortti kun taas mitään tällaista yhdistys havaittiin kohortin kemoterapiaa yksinään. Havaitsimme korkea ilmaus tästä miRNA lymfosyyttien kaltaisia ​​soluja sijaitsee strooman ympärillä syöpäsoluja. MiR-455-5p on raportoitu olevan väärin säädellystä syövän; kuitenkaan yksikään vahvistettu tavoitteita ole havaittu (taulukko S2 File S1).

Lisääntyvä ilmentymistä sekä miR-196b-5p ja miR-592 liittyi enää OS kaikissa kolmessa ikäluokat, joilla on samankaltainen vaikutus arvioihin. Molemmat miRNA on osoitettu vaimentua sisään CRC vajaisiin mismatch korjaus (dMMR) [34]. Korkeampi miR-592 ilmaisu on osoitettu liittyvän parannettu OS saavilla potilailla pelastus EGFR käsittely ja korkeampi miR-196b-5p ilmentyminen on yhdistetty vastaus neo-adjuvanttia 5-FU ja sädehoidon potilailla, joilla on paikallisesti edennyt peräsuolen syöpä [35], [36]. MiR-592 ilmaisu on raportoitu olevan suurempi vasemman puoleinen verrattuna oikeanpuoleista CRC [37], jota esiintyy myös tutkimuksessamme. Emme voi tahrata meidän kudosleikkeitä miR-592, mutta ilmentyminen sekä miR-592 ja miR-196b-5p on aiemmin osoitettu olevan 2,5-3,7 kertaa suurempi CRC epiteelin kuin CRC strooman [38]. Toiminta miR-592 ei ole kuvattu. MiR-196b-5p on väärin säädellystä monissa pahanlaatuinen kasvain on syöpään liittyvät ennusteeseen, ja tavoitteet c-myc, ERG, MEIS1, FAS, ABL1, BCL-2 ja useita HOX-geenit (taulukko S2 File S1).

on tärkeää rajoituksia harkitsemaan koskien tuloksia. Tutkimme takautuvasti tunnistettu kohortteja eri aikaväleillä, mikä lisää riskiä bias, koska erot muu kuin hoitoja käytetään voisi olla välillä ikäryhmät. Käytimme keskiarvo lausekkeen normalisoinnin, mutta koska miRNA laskemisessa käytettävä keskimääräinen liittyivät tulos, tämä on optimaalinen. Vaikka yhdessä tulos joidenkin miRNA tunnistettiin kaksi tai kolme itsenäistä ikäluokat, ennakoivan vaikutus liittyvät bevasitsumabi jää un-validoitu. Emme korjaa useita testejä, mutta miR-664-3p olisi edelleen merkitsevästi yhteydessä OS validointi kohortissa, vaikka korjaamisen jälkeen 22 miRNA testattu. Myös vaikutus arviot olivat samanlaisia ​​ikäluokat, mikä viittaa ei-satunnainen -alueella. Vahvuuksia Tutkimuksemme ovat suuri otoskoko, ensimmäinen kattava seulonta tutkimuksessa käyttämällä kolmea riippumatonta kohortteja, ja satunnaistaminen purification- ja miRNA ilmentymisanalyysiä järjestyksessä.

Kaiken kaikkiaan tämä on ensimmäinen tutkimus tutkia mahdollisuuksia miRNA ilmentymisen primaarikasvainten ennustaa eduksi bevasitsumabin metastasoituneen kolorektaalisyövän. Olemme tunnistaneet miR-664-3p ja miR-455-5p mahdollisimman ennustavan biomarkkereita bevasitsumabi. MiR-592 ja miR-196b-5p olivat ennustaneet tuloksen sekä ilman bevasitsumabin ja nämä voivat olla prognostisia biomarkkerit tai biomarkkerit liittyvät kemoterapiaan tehokkuutta. Näitä havaintoja on validointi itsenäisessä kohortteja – mieluiten satunnaistettua tutkimusta ja käyttämällä vakaa miRNA normalizers -Ennen ne voidaan toteuttaa kliinisessä päätöksenteossa. Selvittäminen solujen alkuperästä ja biologisia toimintoja näiden miRNA on perusteltua.

tukeminen Information

Tiedosto S1.

tiedosto sisältää täydentäviä menetelmiä, täydentävät Taulukko S1 ja S2, ja täydentävät kuvio S1-S6.

doi: 10,1371 /journal.pone.0109430.s001

(PDF) B

Kiitokset

Haluamme kiittää: Jørgen Hansen, MD osastolta onkologian Aalborg sairaalassa, Tanska apua hankintaa koskeva potilastietoja; Mel Heeran, PhD erinomaisesta tekninen apu, jonka leikkauksessa on FFPE kudosnäytteiden; Jakob Z. Johansen, MD syöttämiseksi kliinisten tietojen BETmiRC tietokannassa; Mogens Kruhøffer, PhD, mistä AROS Applied Biotechnology A /S, Tanska apua kanssa miRNA analyysien ja Tanskan CancerBiobank (DCB) biologisen materiaalin ja tietojen käsittelyyn ja varastotiloihin.